專利名稱：用于序列飽和誘變(SeSaM)的方法
前言受到達(dá)爾文自然界進(jìn)化的啟發(fā)，已經(jīng)開發(fā)了隨機誘變方法以根據(jù)我們的需要用于剪裁蛋白質(zhì)(tailoring proteins)和闡明結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系(1)。創(chuàng)造遺傳水平上的多樣性是基因改組(gene shuffling)的輔助工具，因為這可創(chuàng)造導(dǎo)入新突變的機會以使蛋白質(zhì)適應(yīng)生物工程方法中的非天然環(huán)境。真正隨機文庫的序列間隔在其性質(zhì)上并不受在生理條件下對功能預(yù)選擇的限制?；蚋慕M實驗中所用的親本基因通過在生理條件下功能的自然進(jìn)化而優(yōu)化。
在隨機誘變方法中，基于基因不準(zhǔn)確擴增的易錯PCR方法由于其簡單性和通用性而最常使用。易錯PCR方法可分為3種A)通過使核苷酸濃度不平衡和/或加入二氯化錳以降低聚合酶的保真度的方法(2-4)，B)使用核苷酸類似物的方法(5、6)，和C)組合方法(A和B；(7))。
詳述本發(fā)明涉及具有(+)鏈和互補(-)鏈的n個堿基對的雙鏈多核苷酸序列(主序列)誘變的方法，其包括步驟(i)產(chǎn)生主序列(+)鏈的單鏈片段集合，其中該集合的所有成員具有相同的5’末端并且具有3’末端缺失，從而該集合代表具有n-1、n-2、n-3......個核苷酸長度的(+)鏈；(ii)在步驟(i)中產(chǎn)生的(+)鏈的3’末端導(dǎo)入至少一個通用核苷酸或簡并核苷酸；(iii)利用(-)鏈或其片段作為延伸的模板鏈，將步驟(ii)中產(chǎn)生的(+)鏈延伸至主序列的全長；
(iv)通過使用步驟(iii)中產(chǎn)生的(+)鏈作為模板鏈合成(-)鏈，從而與主序列相比，在(-)鏈中前面的通用核苷酸或簡并核苷酸位置實現(xiàn)突變。
通用核苷酸是能夠與所有四種標(biāo)準(zhǔn)核苷酸配對的核苷酸。例如脫氧肌苷三磷酸(dITP)當(dāng)摻入多核苷酸鏈時可與腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶堿基配對。
優(yōu)選的通用核苷酸是脫氧肌苷、3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。
簡并核苷酸是可與少于所有四種標(biāo)準(zhǔn)核苷酸配對的核苷酸。優(yōu)選的簡并核苷酸是N6-甲氧基-2，6-二氨基嘌呤(K)、N6-甲氧基-氨基嘌呤(Z)、羥基氨基嘌呤(HAP)、2’-脫氧核糖核苷三磷酸(dyTP)、6H，8H-3，4--二氫嘧啶醇[4，5-c][1，2]嗪-7-酮(P)、N4-氨基胞苷、N4-羥基-2’-脫氧胞苷、N4-甲氧基-2’-脫氧胞苷和8-氧代脫氧鳥苷三磷酸(8-氧代-G)。
具有混雜堿基配對性質(zhì)的核苷酸類似物指基于在其一個或多個官能團(tuán)上得到修飾的嘌呤或嘧啶結(jié)構(gòu)(如A、G、C、T)的核苷酸，其能使與多于一種(如與兩種、三種或四種核苷酸)的其它核苷酸堿基配對。術(shù)語具有混雜堿基配對性質(zhì)的核苷酸類似物也包括通用核苷酸和簡并核苷酸。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是如以上所述的方法，其中通式p(U)a(N)b*(S)c[TERM]的寡核苷酸，其中p＝5’-磷酸或羥基或能形成二酯鍵的任何化學(xué)基團(tuán)；U＝通用或簡并堿基；a＝0至10000的任意整數(shù)，優(yōu)選1-100；N＝四種堿基(A/T/G/C(標(biāo)準(zhǔn)核苷酸))混合物；b＝0至100的任意整數(shù)，優(yōu)選1-10；*＝可裂解基團(tuán)，例如硫代膦酸酯(phosphothioate)核苷酸中的硫代膦酸酯鍵；S＝標(biāo)準(zhǔn)核苷酸或核苷酸類似物；c＝0至100的任意整數(shù)，優(yōu)選1-10；[TERM]＝防止寡核苷酸延伸的染料終止子或任何基團(tuán)，附加條件是a+b＞0，優(yōu)選＞1，更優(yōu)選＞2，用于步驟(ii)中以將通用或簡并堿基引入步驟(i)中產(chǎn)生的單鏈片段集合中?？梢允欠乐股鲜龉押塑账嵫由斓娜魏位鶊F(tuán)，優(yōu)選氫或染料終止子。優(yōu)選的染料終止子是香豆素、6-FAM、熒光素、熒光-dT、JOE、OregonGreen、ROX、TAMRA或Texas Red-X。
本發(fā)明另外一個優(yōu)選實施方案是根據(jù)步驟(i)通過將α-硫代膦酸酯核苷酸，優(yōu)選dATPαS、dGTPαS、dTTPαS、dCTPαS摻入PCR產(chǎn)物并隨后在堿性條件下通過碘裂解硫代膦酸酯鍵，制備主序列(+)-鏈的單鏈片段集合。
根據(jù)本發(fā)明方法的另外一個優(yōu)選實施方案是用于步驟(iii)的下列方法從含有主序列的雙鏈質(zhì)粒開始，用可在主序列(+)-鏈下游退火的引物合成(-)單鏈質(zhì)粒多核苷酸序列。該(-)單鏈質(zhì)粒多核苷酸序列與步驟(ii)中產(chǎn)生的(+)-鏈退火。用(-)-鏈作為模板延伸(+)-鏈直至主序列全長。圖3顯示了該方法。
權(quán)利要求中公開了更優(yōu)選的實施方案。
步驟(i)產(chǎn)生具有長度分布的DNA片段庫在第一個步驟中，在標(biāo)準(zhǔn)核苷酸和α-硫代膦酸酯核苷酸的存在下使用生物素化正向引物和非生物素化反向引物進(jìn)行PCR。α-硫代膦酸酯核苷酸類似于普通核苷酸，只是α-磷酸酯的氧原子被硫原子替代。硫代膦酸酯鍵對堿性條件中的碘裂解敏感。由于硫代膦酸酯在DNA中隨機分布，所以可在單次PCR中產(chǎn)生停在每單個堿基的片段文庫。如果兩個互補鏈之間的結(jié)合牢固，那么可形成缺口。使用鏈霉親合素包被的生物磁珠分離生物素化的片段。然后用DNA解鏈液(0.1M NaOH)除去非生物素化鏈和不需要的片段。通過在0.1％ SDS溶液中煮沸，可容易地從生物磁珠上釋放生物素化片段。圖1a顯示第一步的圖，圖1b顯示相應(yīng)的實驗數(shù)據(jù)。
步驟(ii)酶促延伸可以使用兩種方法延伸具有通用堿基或簡并堿基(圖2)的DNA片段。在第一種方法中，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶已經(jīng)用于在3’末端摻入多義堿基(通用堿基或簡并堿基)。第二種方法需要在DNA片段和“特別的”oligo之間的單鏈DNA連接。將該“特別的”oligo進(jìn)行5’-磷酸化以利于連接。用熒光素終止以避免分子內(nèi)和分子間連接和定量摻入。在該oligo中有3種不同部分1)含有通用堿基或簡并堿基的“突變部分”，2)由三個堿基組成的“粘合部分”，其通過在oligo合成中使用等摩爾的A/T/G/C而包括所有64種可能。該部分被設(shè)計在隨后用于全長基因合成的PCR中幫助退火。通過硫代膦酸酯鍵將“冗余部分”連接至“粘合部分”，該硫代膦酸酯鍵允許其被碘法裂解。用ThermoPhage RNA連接酶II(Prokaria)完成ssDNA連接。ThermoPhage RNA連接酶II催化單鏈DNA或RNA的5’磷酸和3’羥基末端之間磷酸二酯鍵的依賴ATP的分子內(nèi)和分子間形成。該酶來源于可感染嗜熱真細(xì)菌Thermus scotoductus的嗜熱噬菌體TS2126。該熱穩(wěn)定酶與來源于噬菌體T4的RNA連接酶同源。同T4RNA連接酶相比，它在ssDNA連接中表現(xiàn)更高的效率。連接效率可通過將熒光素標(biāo)記的oligo連接至單鏈DNA模板來確定。連接后，“冗余部分”通過在堿性條件中碘裂解而除去。
步驟(iii)全長基因合成第三步是將延伸的片段延長至全長(圖3)。這里，我們使用單鏈模板以避免野生型擴增。用反向引物合成單鏈模板。甲基化和半甲基化親本基因通過Dpn I消化得以除去。該過程類似于QuikChange Site-DirectedMutagenesis(Stratagene)，只是僅僅使用一種非誘變引物而不是一對誘變引物。延伸的片段由于互補而與單鏈模板退火，并延長單鏈直至全長。該PCR反應(yīng)中的反向引物僅僅與新合成的全長單鏈而不是單鏈模板退火。反向引物結(jié)合后，將合成雙鏈全長基因。雙鏈DNA將在一條鏈中含有核苷酸類似物，在另外一條鏈中含有標(biāo)準(zhǔn)核苷酸。
如果雙鏈模板而不是單鏈模板用于該PCR中，我們將觀察到反向引物結(jié)合它的互補模板，擴增不含有核苷酸類似物的雙鏈DNA。
步驟(iv)核苷酸替代在最后的PCR中，將含有核苷酸類似物的鏈作為模板以替代具有標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的核苷酸類似物(圖4)。在限制性消化后，將突變基因克隆入合適的表達(dá)載體，在大腸桿菌(E.coli)中轉(zhuǎn)化并表達(dá)。挑取隨機選擇的克隆并在小培養(yǎng)管(5ml；LBamp)中生長。分離的質(zhì)粒DNA隨后進(jìn)行測序。100個克隆的初步測序結(jié)果證實正確的替代，并表明對肌苷預(yù)期的偏好性(圖5和圖6)。
使用SeSaM方法可在1-2天內(nèi)完成突變文庫的制備。SeSaM方法具有下列優(yōu)點0)能夠使用所有20種可能的天然存在的氨基酸飽和序列的每個位置。
0)如果使用真正的通用堿基，那么在突變譜內(nèi)無偏好性。
0)使用轉(zhuǎn)換偏愛或顛換偏愛的簡并堿基可操縱突變譜。
0)通過設(shè)計合適的特別oligo可控制突變區(qū)的長度。
0)通過用Sp-dATPαS/Sp-dTTPαS/Sp-dGTPαS/Sp-dCTPαS或它們的組合，可以控制片段大小分布。
材料與方法使用的化學(xué)品都是分析試劑級或更高品質(zhì)，可購自Sigma-AldrichChemie GmbH(Taufkirchen，德國)、Applichem GmbH(Darmstadt，德國)或Carl Roth GmbH+Co(Karlsruhe，德國)。pEGFP質(zhì)粒購自BDBiosciences(Heidelberg，德國)。
在所有的PCR中使用循環(huán)變溫器(Mastercycler gradient；Eppendorf，Hamburg，德國)和薄壁PCR管(Mμlti-Ultra tubes；0.2ml；Carl RothGmbH+Co.，Karlsruhe，德國)。所有PCR的反應(yīng)體積總是50μl。(預(yù)備步驟I)單鏈pEGFP制備
對于每次PCR，使用5U Pfu Turbo聚合酶(Stratagene，Amsterdam，荷蘭)、0.2mM dNTP混合物(New England Biolab，F(xiàn)rankfurt，德國)、12.6pmol反向引物(5′-GACCGGCGCTCAGTTGGAATTCTAG-3′)以及48.6-54.3ng質(zhì)粒pEGFP(Miniprep，Qiagen，Hilden，德國)。PCR(1循環(huán)的95℃ 30秒，40循環(huán)的95℃ 30秒/55℃ 1分鐘/68℃ 4分鐘)后，加入40U的DpnI，隨后于37℃溫育3小時。使用NucleoSpinExtract(Macherey-Nagel，Düren，德國；35μl洗脫體積用于200μl的PCR產(chǎn)物)進(jìn)行產(chǎn)物回收。
(預(yù)備步驟2)克隆載體的制備首先在100μl反應(yīng)混合液中用30U的EcoR I(New England Biolab)消化24.3-27.1μg質(zhì)粒pEGFP(Miniprep；QIAGEN)。反應(yīng)混合液在37℃溫育3小時。用NucleoSpin Extract(Machery-Nagel；50μl洗脫體積用于100μl反應(yīng)混合物)純化線性化的質(zhì)粒。在50μl反應(yīng)體積中，4.9-5.6μg線性化的質(zhì)粒pEGFP用20U Age I(New England Biolab)進(jìn)行第二次消化。在37℃溫育3小時后，雙重消化的質(zhì)粒用NucleoSpinExtract(Macherey-Nagel；35μl洗脫體積用于50μl反應(yīng)混合物)進(jìn)行純化。雙重消化的pEGFP用于隨后的克隆。
(步驟1)使用dATPαS的PCR對于每次PCR(1循環(huán)的94℃ 3分鐘，31循環(huán)的94℃ 1分鐘/59.5℃ 1分鐘/72℃ 75秒，1循環(huán)的72℃ 10分鐘)，使用2.5U的Taq DNA聚合酶(Qiagen)、0.2mM dNTP混合物(New England Biolab)、0.2mMSp-dATPαS(Biolog Life Science Institute，Bremen，德國)、12.6pmol 5′-生物素化正向引物(5′-GACCATGATTACGCCAAGCTTGC-3′)、12.6pmol反向引物(5′-GACCGGCGCTCAGTTGGAATTCTAG-3′)以及242.9-271.4ng質(zhì)粒pEGFP(Miniprep；Qiagen)。
(步驟2)硫代磷酸二酯主鏈的碘裂解硫代膦酸酯鍵(phosphothiate bond)通過碘(溶于乙醇中；在PCR管中終濃度2μM)裂解?；旌衔镌谑覝販赜?小時。
(步驟3)不同長度單鏈DNA片段的制備使用Dynabeads MyOne Streptavidin(DYNAL Biotech，Oslo，挪威)于室溫下分離來自正向引物的生物素化DNA片段。50μl的生物磁珠(10mg/ml)用100μl的2×B&W緩沖液(10mM Tris-HCl，pH 7.5；1.0mMEDTA；2.0M NaCl)洗滌兩次。將洗過的生物磁珠重懸浮于100μl的2×B&W緩沖液中，并加入100μl裂解的PCR產(chǎn)物。溫育20分鐘后，將生物素化DNA片段固定于生物磁珠上，并通過100μl的2×B&W緩沖液洗滌以除去碘。在100μl的DNA解鏈液(0.1M NaOH)于37℃溫育10分鐘后隨后用100μl的DNA解鏈液和100μl的1×B&W緩沖液洗滌，可釋放非生物素化的DNA片段。洗滌過的Dynabead在60μl的0.1％SDS中煮沸，以從固相支持體釋放DNA片段。含有DNA片段的上清液立即轉(zhuǎn)入另一個管中。
(步驟4)從洗脫的單鏈DNA片段除去SDS鹽使用NucleoTrap試劑盒(Macherey-Nagel，Düren，德國)進(jìn)行脫鹽。將400μl緩沖液NT2加入100μl洗脫的DNA，隨后加入15μl NucleoTrap懸浮液?；旌衔镌谑覝販赜?0分鐘，并每2-3分鐘輕柔振動。然后將樣品以10000g離心30秒鐘，棄去上清液后，用500μl緩沖液NT3洗滌磁珠。后面的步驟重復(fù)一次。沉淀物在37℃風(fēng)干15分鐘，以除去殘余乙醇，重懸浮于55μl Tris/HCl緩沖液(5mM；pH 8.5)并為了DNA洗脫在50℃溫育5分鐘用于DNA洗脫。將懸浮液移入NucleoSpin Microfilter，并以10000g離心30秒以從含有DNA的溶液中分離磁珠。
(步驟5)具有通用堿基的DNA片段的酶促延伸每次延伸反應(yīng)的總反應(yīng)體積是50μl。在每次反應(yīng)中，使用5U末端轉(zhuǎn)移酶(New England Biolabs)、0.25mM CoCl2、0.4μM dITP(AmershamBiosciences Europe GmbH，F(xiàn)reiburg，德國)，以及18μl來自步驟4的脫鹽DNA。在延伸反應(yīng)(37℃ 30分鐘，并在70℃下加熱10分鐘失活轉(zhuǎn)移酶)中摻入通用堿基之后，根據(jù)QIAquick Nucleotide RemovalKit(QIAGEN；25μl洗脫體積用于50μl反應(yīng)混合物)方法純化產(chǎn)物。
(步驟6)全長基因合成對于每次PCR(1循環(huán)的94℃ 3分鐘，30循環(huán)的94℃ 1分鐘/59.5℃+0.2℃(每循環(huán)增加0.2℃)1分鐘/72℃ 3分鐘，1循環(huán)的72℃ 10分鐘)，使用2.5U的Taq DNA聚合酶(Qiagen)、0.2mM dNTP混合物(New EnglandBiolab)、13.3μl延伸的DNA片段、20pmol反向引物(5′-GACCGGCGCTCAGTTGGAATTCTAG-3′)以及0.66-0.76μg單鏈反向模板(預(yù)備步驟1)。合成全長基因后，用NucleoSpinExtract(Macherey-Nagel；35μl洗脫體積用于150μl PCR產(chǎn)物)實施純化步驟。
(步驟7)通用堿基替代對于每次PCR(1循環(huán)的94℃ 3分鐘，30循環(huán)的94℃ 1分鐘/52℃ 1分鐘/72℃ 75秒，1循環(huán)的72℃ 10分鐘)，使用2.5U的Taq DNA聚合酶(Qiagen)、0.2mM dNTP混合物(New England Biolab)、20pmol正向引物(5′-GACCATGATTACGCCAAGCTTGC-3′)、20pmol反向引物(5′-GACCGGCGCTCAGTTGGAATTCTAG-3′)以及2.5μl全長基因(步驟6)。PCR產(chǎn)物用NucleoSpin Extract(Macherey-Nagel；50μl洗脫體積用于150μlPCR產(chǎn)物)進(jìn)行純化。
(步驟8)PCR產(chǎn)物消化在通用堿基取代后，40μl純化的PCR產(chǎn)物(步驟7)用30U EcoR I(NewEngland Biolab)在37℃消化3小時。然后消化物中加入20U的AgeI(NewEngland Biolab)，并將混合物在37℃另外溫育3小時。消化產(chǎn)物用NucleoSpin Extract(Macherey-Nagel；25μl洗脫體積)進(jìn)行純化。
(步驟9)連接和轉(zhuǎn)化消化的PCR產(chǎn)物(步驟8)和pEGFP克隆載體(預(yù)備步驟2)用T4DNA連接酶(Roche，Mannheim，德國)于室溫連接1小時，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL2Blue(Stratagene，Amsterdam，Netherlands)細(xì)胞。在2ml TSS緩沖液(10gPEG 6000；5ml DMSO；0.6g MgSO4；100ml LB)中重懸浮50ml培養(yǎng)液(OD5780.4-0.5)的細(xì)胞沉淀以制備感受態(tài)細(xì)胞。將5μl連接混合物加入200μl等份細(xì)胞，隨即冰浴20分鐘，42℃熱激45秒并冰上另外冷卻2分鐘。加入0.8ml LB后，培養(yǎng)液在37℃以170轉(zhuǎn)/分鐘振蕩1小時。細(xì)胞通過以3000g室溫離心2分鐘進(jìn)行收集。棄去900μl上清液，并將細(xì)胞溫和重懸浮于剩余的100μl上清液中。然后將細(xì)胞在LB/Amp平板上接種，于37℃過夜溫育。


圖1a)步驟(i)產(chǎn)生隨機片段大小分布；b)上邊和中間凝膠照片在碘裂解之前(左泳道)和之后(右泳道)的PCR產(chǎn)物。下邊凝膠照片在不同濃度Sp-dATPαS(位于泳道較低部分)的DNA解鏈和純化后DNA片段大小分布。
圖2a)步驟(ii)用通用或簡并堿基延伸的DNA片段；b)下邊左側(cè)的凝膠照片使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，通過在3’末端具有不同濃度的脫氧肌苷的引物延伸的PCR。下邊右側(cè)的凝膠照片使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，通過在3’末端具有不同濃度的5-硝基吲哚的引物延伸的PCR。
圖3步驟(iii)含有核苷酸類似物的全長基因的合成。
圖4步驟(iv)標(biāo)準(zhǔn)核苷酸替代核苷酸類似物。
圖5100個隨機挑選的克隆的測序結(jié)果。
圖6100個測序克隆的突變的隨機分布參考文獻(xiàn)0.Arnold，F(xiàn).H.，Wintrode，P.L.，Miyazaki，K.and Gershenson，A.(2001)Trends Biochem.Sci.，26，100-106.
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權(quán)利要求
1.用于具有(+)鏈和互補(-)鏈的n個堿基對的雙鏈多核苷酸序列(主序列)誘變的方法，步驟包括(i)產(chǎn)生主序列(+)鏈的單鏈片段集合，其中該集合的所有成員具有相同的5’末端并且具有3’末端缺失，從而該集合代表具有長度為n-1、n-2、n-3……個核苷酸的(+)鏈；(ii)在步驟(i)中產(chǎn)生的(+)鏈的3’末端導(dǎo)入至少一個通用核苷酸或簡并核苷酸；(iii)利用(-)鏈或其片段作為延伸的模板鏈，將步驟(ii)中產(chǎn)生的(+)鏈延伸至主序列的全長；(iv)通過使用步驟(iii)中產(chǎn)生的(+)鏈作為模板鏈合成(-)鏈，從而與主序列相比，在(-)鏈中前面的通用核苷酸或簡并核苷酸位置實現(xiàn)突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過摻入核苷酸類似物并隨后在堿性或酸性溶液中裂解制備步驟(i)中的單鏈片段集合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中核苷酸類似物是α-硫代膦酸酯核苷酸，并且通過碘在硫代膦酸酯鍵實現(xiàn)氧化裂解。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(ii)包括利用通用堿基或簡并堿基通過酶促或化學(xué)方法延伸步驟(i)中產(chǎn)生的單鏈片段集合。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中將末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶或DNA聚合酶或DNA/RNA連接酶用于延伸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將脫氧肌苷、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或具有混雜堿基配對性質(zhì)的核苷酸類似物用作步驟(ii)中的通用核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將N6-甲氧基-2，6-二氨基嘌呤(K)、N6-甲氧基-氨基嘌呤(Z)、羥基氨基嘌呤(HAP)、2’-脫氧核糖核苷三磷酸(dyTP)、6H，8H-3，4-二氫嘧啶醇[4，5-c][1，2]嗪-7-酮(P)、N4-氨基胞苷、N4-羥基-2’-脫氧胞苷、N4-甲氧基-2’-脫氧胞苷和8-氧代脫氧鳥苷三磷酸(8-氧代-G)或具有混雜堿基配對性質(zhì)的核苷酸類似物用作步驟(ii)中的簡并核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通式p(U)a(N)b*(S)c[TERM]的寡核苷酸，其中p＝5’-磷酸或羥基或能形成二酯鍵的任何化學(xué)基團(tuán)；U＝通用或簡并堿基；a＝0至10000的任意整數(shù)；N＝四種堿基(A/T/G/C(標(biāo)準(zhǔn)核苷酸)混合物；b＝0至100的任意整數(shù)；*＝可裂解基團(tuán)，例如硫代膦酸酯核苷酸中的硫代膦酸酯鍵；S＝標(biāo)準(zhǔn)核苷酸或核苷酸類似物；c＝0至100的任意整數(shù)；[TERM]＝防止寡核苷酸延伸的染料終止子或任何基團(tuán)，附加條件是a+b＞0，用于步驟(ii)中以將通用或簡并堿基引入步驟(i)中產(chǎn)生的單鏈片段集合中。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述寡核苷酸按這樣的方式設(shè)計使得在誘變的多核苷酸序列集合中避免(a)終止密碼子和/或，(b)破壞二級結(jié)構(gòu)的氨基酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述寡核苷酸按這樣的方式設(shè)計使得在誘變的多核苷酸序列集合中實現(xiàn)(a)轉(zhuǎn)換突變或(b)顛換突變。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中步驟(i)中產(chǎn)生的不與所述寡核苷酸連接的單鏈片段用外切核酸酶除去。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過PCR反應(yīng)實現(xiàn)步驟(iii)中的延伸。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(iii)包括使用在主序列(+)鏈下游退火的引物從含有主序列的雙鏈質(zhì)粒合成(-)-單鏈質(zhì)粒多核苷酸序列，將該(-)-單鏈質(zhì)粒多核苷酸序列與步驟(ii)中產(chǎn)生的(+)鏈退火，和延伸該(+)鏈。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(iii)包括在尿嘧啶和標(biāo)準(zhǔn)核苷酸存在下使用與主序列(+)鏈的下游退火的引物合成含有該主序列的(-)-單鏈質(zhì)粒，并在延伸步驟(ii)中產(chǎn)生的(+)鏈之后，用尿嘧啶糖基化酶消化攜帶尿嘧啶的(-)單鏈質(zhì)粒。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(iii)后使用PCR擴增，以便合成與步驟(iii)中產(chǎn)生的(+)鏈互補的(-)-鏈，從而實現(xiàn)攜帶突變的雙鏈主序列。
全文摘要
具有(+)鏈和互補(－)鏈的n個堿基對的雙鏈多核苷酸序列(主序列)誘變的方法，其包括步驟(i)產(chǎn)生主序列(+)鏈的單鏈片段集合，其中該集合的所有成員具有相同的5’末端并且具有3’末端缺失，從而該集合代表具有n－1、n－2、n－3……個核苷酸長度的(+)鏈；(ii)在步驟(i)中產(chǎn)生的(+)鏈的3’末端導(dǎo)入至少一個通用核苷酸或簡并核苷酸；(iii)利用(－)鏈或其片段作為延伸的模板鏈，將步驟(ii)中產(chǎn)生的(+)鏈延伸至主序列的全長；(iv)通過使用步驟(iii)中產(chǎn)生的(+)鏈作為模板鏈合成(－)鏈，從而與主序列相比，在(－)鏈中前面的通用核苷酸或簡并核苷酸位置實現(xiàn)突變。
文檔編號C12N15/10GK1860227SQ200480028565
公開日2006年11月8日 申請日期2004年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月2日
發(fā)明者U·施瓦內(nèi)貝格 申請人:巴斯福股份公司