專利名稱：一種可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌及其誘變育種方法和發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種冬蟲夏草的真正無性型蝙蝠蛾被毛孢真菌及其誘變育種方法和發(fā) 酵工藝，尤其涉及一種可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌及其誘變育種方法和發(fā)酵工藝。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草(CorG^c印s w'"ey^i's 0erU5"acc.)是麥角科蟲草屬真菌寄生于蝙蝠 蛾幼蟲體內(nèi)形成的復合體(簡稱蟲草)，為我國特有名貴藥用真菌。產(chǎn)于四川、貴州、 云南、青海、西藏等3500 5000米高山上。由于冬蟲夏草在醫(yī)藥保健方面的顯著療效， 以及天然資源的過度采集，現(xiàn)在天然蟲草資源已經(jīng)瀕臨枯竭。導致蟲草的價格在近幾年 成倍增長，目前優(yōu)質(zhì)天然的野生蟲草的價格每公斤已經(jīng)高達10萬元以上，普通百姓難以 問津。人工培養(yǎng)蟲草是解決這一難題的重要途徑，但技術(shù)上難度極大，迄今尚無大規(guī)模 成功的報道。由于很多研究結(jié)果都證實通過液體發(fā)酵產(chǎn)生的蟲草菌絲體在有效成分和療 效方面和天然蟲草相似，因此當前解決冬蟲夏草資源匱乏的主要途徑是利用液體深層發(fā) 酵方法工業(yè)化生產(chǎn)蟲草菌絲體。
蟲草的液體深層發(fā)酵是一種無性繁殖過程，因此首先需要明確的問題是冬蟲夏草的 無性型究竟是哪種真菌。人們已經(jīng)先后從天然蟲草上分離到10個屬共11個種的蟲草無性 系菌株，其中的幾個菌株己經(jīng)被當作冬蟲夏草的無性型開發(fā)成藥品和保健食品。如金水 寶、寧心寶、百令膠囊等。其中使用最廣泛的菌株是蝙蝠蛾擬青霉，該菌株也是著名的 蟲草產(chǎn)品金水寶所采用的生產(chǎn)菌株。但最新的研究結(jié)果表明，包括蝙蝠蛾擬青霉菌種在 內(nèi)的很多所謂的蟲草無性型都不是真正的冬春夏草無性型，只有蝙蝠蛾被毛孢或中國被 毛孢(二者是同種異名菌)才是蟲草真正的無性型(魏鑫麗、印象初等，菌物學報，2006， 25 (2) : 192 — 202)，是目前國內(nèi)唯一得到學術(shù)界公認且可通過"生物還原法"驗證 的冬蟲夏草的真正無性型。
目前國內(nèi)外蟲草的液體深層發(fā)酵研究及生產(chǎn)，大部分采用的菌株都是蝙蝠蛾擬青 霉，而采用蝙蝠蛾被毛孢或中國被毛孢(和蝙蝠蛾被毛孢是同一種真菌的不同命名形式) 所進行的液體深層發(fā)酵研究極為少見。主要原因是蝙蝠蛾擬青霉可以在常溫下生長，而
境和培養(yǎng)基的要求不高，因此生產(chǎn)成本和技術(shù)要求都不 高。而冬蟲夏草真正的無性型蝙蝠蛾被毛孢由于常年生長在海拔3000-4000米的高山上, 適宜的生長溫度較低，而且生長十分緩慢，對人工發(fā)酵的技術(shù)條件要求很高，發(fā)酵周期 往往長達20 40天，這無疑大大提高了工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的成本和技術(shù)難度，因此關(guān)于蝙 蝠蛾被毛孢的液體深層發(fā)酵的研究很少，目前只有三項相關(guān)的專利。專利"一種中國被 毛孢液體菌種發(fā)酵工藝方法"(申請?zhí)?3131904.1)提供了一種蝙蝠蛾被毛孢同種異名 菌株一中國被毛孢的液體低溫發(fā)酵工藝，采用從蟲草中分離出的中國被毛孢RCEF0273天 然菌株在19 2(TC溫度下進行菌種培養(yǎng)和多級發(fā)酵生產(chǎn)，由于該菌株沒有經(jīng)過任何誘變 育種，因此只能在低溫下緩慢生長，且從搖瓶種接種到放罐的發(fā)酵周期長，約49 51天。 另一個相關(guān)的專利是"一種中國冬蟲夏草真菌一蝙蝠蛾被毛孢的發(fā)酵生產(chǎn)方法"(申請 號200710016703.3),其特點是將蝙蝠蛾被毛孢在13 — 18。C低溫下進行發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵 周期長達45—60天。最后一個相關(guān)專利是"中國冬蟲夏草真菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法"(專利 號ZL97110448.4)，該方法也是在12—20。C的低溫下對中國被毛孢進行發(fā)酵生產(chǎn)，每 一級發(fā)酵大約需要5—8天，因此推測其10噸規(guī)模的發(fā)酵周期大約需要15 — 24天。由上可 見，目前已經(jīng)報道的蝙蝠蛾被毛孢的發(fā)酵生產(chǎn)由于使用的都是原始的、未經(jīng)誘變的菌種， 因此其發(fā)酵生產(chǎn)工藝都是在低于20。C的溫度下進行，而且生產(chǎn)周期長，能耗高，產(chǎn)業(yè)化 生產(chǎn)的成本很高，抑制了蝙蝠蛾被毛孢應用產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，使其不能得到最大的經(jīng)濟和社 會效益。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的第一個目的是提供了一種可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢 真菌。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種獲得常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌的誘變育種方法。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種應用所得的常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌進行發(fā) 酵生產(chǎn)的工藝。
本發(fā)明的第一目的是通過以下技術(shù)措施來實現(xiàn)的
一種可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌，該真菌分類學命名為蝙蝠蛾被毛孢
(〃/rsute//a / 印,'a/,' O en ef S/ 印)BS-1 ，其由以下方法誘變而得從天然冬蟲夏草
(Cbroyc印s幻'/7ey7S&0e/vy5^cc.〕子座分離出的蝙蝠蛾被毛孢菌株中提取原生質(zhì)體，
對原生質(zhì)體在15 60W紫外燈下距離10 50cm，照射l 300s，然后接種于MYG再生培 養(yǎng)基上放置在25 28'C恒溫箱中培養(yǎng)；取誘變培養(yǎng)得到的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在 25 28'C下進行10代以上的馴化后，分別測定有效成分含量，選擇生長旺盛、菌粉得 率高、有效成分含量高的菌株，最后得到能夠在常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢菌株。 本發(fā)明的第二個目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
一種可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌的誘變育種方法從青海采集的冬蟲夏草
(CorQyc印s si/7e/7W's^e/vy5"acc.)子座分離出的蝙蝠蛾被毛孢菌株(AV/rst/te〃a /jep/'a//' C/7即ef Srten)中提取原生質(zhì)體，對原生質(zhì)體在15 60W紫外燈下距離10 50cm，照射l 300s，然后接種于MYG再生培養(yǎng)基上放置在25 28。C恒溫箱中培養(yǎng)；取誘變培養(yǎng)得到的 菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25 28'C下進行10代以上的馴化后分別測定有效成分含 量，選擇生長旺盛、菌粉得率高、有效成分含量高的菌株，最后得到能夠在常溫發(fā)酵的 蝙蝠蛾被毛孢菌株。
所述的馴化蝙蝠蛾被毛孢誘變株的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為每1000重量份水中含 以下重量份成分葡萄糖1 3份，黃豆餅粉2 4份，玉米粉2 3份，KH2P040.1 0.5 份，MgS04. 7H20 0. 05-0. 20份，pH值5. 5 6. 5。
所述的恒溫箱應處于黑暗避光環(huán)境。所述的原生質(zhì)體的濃度應為105 108個/1111， 濃度太小，長出的誘變株很少，很難篩選所需菌株；濃度太大，長出的誘變株太多，連 成一片，很難進行單菌落的篩選。
所述的提取原生質(zhì)體的具體步驟為取蝙蝠蛾被毛孢菌株，接種于MYG液體培養(yǎng)基 中，18 2(TC培養(yǎng)15 20天，然后離心，去上清液，并用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌；取提取原 生質(zhì)體用的復合酶，以滲透壓穩(wěn)定劑溶解，經(jīng)微孔濾膜過濾除菌后加入到菌株中在28 35。C酶解3 4小時，將酶解液過濾，離心，去上清液，用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌，得純化的 原生質(zhì)體。
所述的復合酶液的加入量按每300 500mg濕菌絲加lml酶液計算。 所述的MYG液體培養(yǎng)基配方為每100重量份水中含以下重量份成分麥芽糖8 12 份，葡萄糖2 6份，酵母粉3 5份，pH自然。
所述的MYG再生培養(yǎng)基配方為甘露醇中含以下質(zhì)量體積比的成分麥芽糖8 12 %，葡萄糖2 6%，酵母粉3 5%， pH自然。所述的甘露醇濃度為0. 6 0. 8mol/L。
所述的滲透壓穩(wěn)定劑為濃度為0.6 0.8mol/L甘露醇。所述的復合酶組成為質(zhì) 量百分比分別為2 4%的溶壁酶和0.2 0.8%的崩潰酶按1: 1的比例的混合而成。 本發(fā)明的第三個目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的 一種可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛
孢真菌的發(fā)酵工藝，包括以下步驟
(1) 一級搖瓶菌種的培養(yǎng)
將蝙蝠蛾被毛孢菌種接種于裝有一級種子培養(yǎng)基的三角瓶中，放入25'C 28'C恒溫
搖床，以150 200rpm培養(yǎng)48 72小時，待菌絲長滿三角瓶后即可；
(2) 二級搖瓶菌種的培養(yǎng)
將長好的一級搖瓶培養(yǎng)所得的種子接種到裝有二級種子培養(yǎng)基的三角瓶中，并置于 25。C 28。C恒溫搖床，以180 200rpm培養(yǎng)48 72小時；待菌絲長滿三角瓶后即可；
(3) —級種子罐生產(chǎn)
將一級種子罐培養(yǎng)基裝入攪拌式發(fā)酵罐中，滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)pH值到5.5 6.5， 將二級搖瓶種子接入一級種子罐中，保持培養(yǎng)溫度為25 28°C，攪拌速度為150 220rpm，通氣量為1 : 0. 4V/V min l: 1.0V/V min，罐壓0. 03 0. 06 MPa，經(jīng)24 60h培養(yǎng)，菌種完成對數(shù)生長期即可；
(4) 二級種子罐生產(chǎn)
將二級種子罐培養(yǎng)基裝入攪拌式發(fā)酵罐中，滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)pH值到5.5 6.5， 將一級種子罐培養(yǎng)好的液體種子全部接入二級種子罐中；保持培養(yǎng)溫度為25 28°C，攪 拌速度為150 220rpm，通氣量為1 : 0. 4V/V min l: 1. OV/Vmin，罐壓0. 03
0. 06MPa，經(jīng)24 60h培養(yǎng)，菌種完成對數(shù)生長期即可；
(5) 發(fā)酵罐生產(chǎn)
將液體培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐，滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)pH值到5.5 6.5，將二級種子罐培 養(yǎng)好的液體種子全部接入發(fā)酵罐培養(yǎng)；保持培養(yǎng)溫度為25~28°C，攪拌速度為150 220rpm，通氣量為1 : 0. 4V/V min l: 1. OV/V min，罐壓0. 03 0. 06MPa，經(jīng)60 96h培養(yǎng)，當發(fā)酵液變得粘稠，培養(yǎng)基菌pH降到3.4 4.2，發(fā)酵液中出現(xiàn)大量小菌球 并且菌絲體的濃度達到15 22g濕菌絲/100mL，顯微鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲開始衰老、斷裂和自 溶的時候，結(jié)束發(fā)酵放罐。
所述步驟(3)中二級搖瓶種子接入一級種子罐中的接種量為培養(yǎng)基和二級搖瓶種子 混合物總重量的5 1()Q^。
所述一級搖瓶種子培養(yǎng)基和二級搖瓶種子培養(yǎng)基配方均為每1000重量份水中含以 下重量份的成分葡萄糖1 4份，黃豆餅粉0.5 3份，玉米粉1 3份，麩皮0.1
1. 0份，K跳O. 05 0. 2份，MgS04. 7H20 0. 01 0. 1份，VB1 0. 005 0. 05, pH值5. 5 6. 5。
所述的一級種子罐培養(yǎng)基、二級種子罐培養(yǎng)基和發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方均為每iooo重
量份水中含以下重量份的成分葡萄糖1 4份，黃豆餅粉1 4份，蠶蛹粉0.5 2.0 份，玉米粉1 4份，麩皮0. 1 2份，KH2P04 0. 1 1.0份，MgS04.7H20 0. 01 0. 1份， VB1 0.005 0. 05， pH值5.5 6.5。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果
(1)誘變培育所得蝙蝠蛾被毛孢菌株可在常溫下快速生長，而且其發(fā)酵周期比現(xiàn)有 報道的蝙蝠蛾被毛孢的發(fā)酵周期大大縮短，因而使得生產(chǎn)成本大大降低，使產(chǎn)品更具市 場競爭力。
(2)目前關(guān)于蝙蝠蛾被毛孢液體發(fā)酵的研究比較少，而且報道的蝙蝠蛾被毛孢的 發(fā)酵生產(chǎn)工藝均沒有注明發(fā)酵菌粉的得率和有效成分的含量。目前關(guān)于蟲草無性型發(fā)酵 研究最多的是蝙蝠蛾擬青霉，該領(lǐng)域最著名的產(chǎn)品是金水寶，其菌粉中腺苷和甘露醇的 含量分別達到2%和4.3%左右。而本發(fā)明中蝙蝠蛾被毛孢菌株不但發(fā)酵菌粉得率高，可 達到2%以上，而且菌粉中腺苷和甘露醇的含量也非常高，平均分別達到約O. 26%和4. 52 %的水平。由于本發(fā)明所生產(chǎn)的蝙蝠蛾被毛孢是真正的冬蟲夏草無性型，而且其得率和 有效成分含量都不低于目前蟲草發(fā)酵行業(yè)的著名品牌金水寶，因此本專利所生產(chǎn)的蝙蝠 蛾被毛孢可作為冬蟲夏草的替代品應用于醫(yī)藥和保健品行業(yè)，產(chǎn)生良好的經(jīng)濟和社會效
、
(3)本發(fā)明提供的獲得可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢菌株的誘變育種方法及發(fā)酵工 藝簡單、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，發(fā)酵周期短，不需要低溫培養(yǎng)，發(fā)酵參數(shù)容易控制，成功率 高，可進行大批量的培養(yǎng)發(fā)酵，生產(chǎn)成本低，適于蝙蝠蛾被毛孢的工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式
實施例一 使用的材料
馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PM)斜面培養(yǎng)基蒸餾水、20%馬鈴薯浸汁、2%葡萄糖和2 %瓊脂粉構(gòu)成。
MYG液體培養(yǎng)基100ml蒸餾水中含有麥芽糖10g，葡萄糖4g，酵母粉4g， pH自然； 復合酶質(zhì)量百分比濃度分別為2.5%的溶壁酶和0.5%崩潰酶按1: l的比例混合
而成；2.5X溶壁酶(Lywallzyme，購自廣東省微生物研究所)，0. 5%崩潰酶(Driselase，
購自FLUKA AG， CHEM);
滲透壓穩(wěn)定劑0.6mol/L甘露醇；
MYG再生培養(yǎng)基100ml濃度為0. 6 mol/L甘露醇中含有麥芽糖10g，葡萄糖4g，
酵母粉4g， pH自然；
液體發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖2%，黃豆餅粉2%，玉米粉1.5%，KH2P040. l%，MgS04. 7H20 0.05%，蒸餾水1000ml， pH值6.0;
一級搖瓶種子培養(yǎng)基或二級搖瓶種子培養(yǎng)基:葡萄糖1.5%，黃豆餅粉2%，玉米 粉1.5%，麩皮0.5%， KH2P040. 1%， MgS04. 7H20 0. 05%， VB1 10mg/L，蒸餾水1000ml， pH值6. 0;
一級種子罐培養(yǎng)基、二級種子罐培養(yǎng)基或發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基葡萄糖2%，黃豆餅 粉2%，蠶蛹粉1%，玉米粉1.5%，麩皮0.5%， KH2P04 0. 1%， MgS04. 7H20 0.05%， VB1 10mg/L，蒸餾水1000ml， pH值6.5。 誘變培育方法
A、 原生質(zhì)體的制備
按常規(guī)方法從青海采集的冬蟲夏草〔Car辦ceps w'/7e/L^'s但ei^^acc.)子座分離 出的蝙蝠蛾被毛孢菌株，并將菌株接種到PDA斜面培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。
取PDA斜面培養(yǎng)基上生長旺盛的蝙蝠蛾被毛孢菌絲，取指甲大小的一塊，接種于 400ml MYG液體培養(yǎng)基中，18。C培養(yǎng)20天，然后將發(fā)酵液以3000rpm離心10分鐘，去上清 液，并用0.6mol/L甘露醇將菌絲體洗滌三次。稱量好復合酶，以0.6mol/L甘露醇溶解， 經(jīng)O. 22nm微孔濾膜過濾除菌后，按每300mg濕菌絲加lml酶液計算向菌絲體中加入復合酶 液，在30'C酶解3.5小時，將酶解液用滅過菌的G3砂芯漏斗過濾，4000rpm離心10分鐘， 去上清液，再用0.6mol/L甘露醇洗滌兩次，得純化的原生質(zhì)體。
B、 紫外誘變
將制備好的原生質(zhì)體稀釋至106個/mL ，取5mL放于無菌的9cm平皿內(nèi)，15w紫外燈， 距離30cm,照射約45s，然后取lmL樣品分別稀釋10倍、50倍、IOO倍后，分別取O. lml 涂MYG再生培養(yǎng)基平板上，于28 。C黑暗閉光的恒溫箱中培養(yǎng)至再生菌落長出。然后隨機 挑取不同的再生菌株進行下面的篩選。
C、 突變株的篩選
將上述經(jīng)過誘變后的菌株，接種到400ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28 。C連續(xù)進行10代 以上的馴化，分別測定有效成分含量，然后選擇生長旺盛、菌粉得率高、有效成分含量 高的菌株，接種到PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，作為液體發(fā)酵工藝的生產(chǎn)菌株。 發(fā)酵生產(chǎn)
取上述步驟中選育出的可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢菌種，進行搖瓶菌種培養(yǎng)和三級
發(fā)酵，具體步驟如下
(1) 菌種搖瓶培養(yǎng)
A、 一級搖瓶種的培養(yǎng)
在500 ml三角瓶中裝入100ml—級搖瓶種子培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，取斜面培養(yǎng)基上 指甲大小的一塊菌絲接種于一級種子培養(yǎng)基中，放入25。C恒溫搖床，以150 — 200rpm培 養(yǎng)48小時，然后轉(zhuǎn)接到二級種子培養(yǎng)基中；
B、 二級搖瓶種的培養(yǎng)
在1000ml三角瓶中裝入400ml 二級搖瓶種子培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，按20%的接種 量將長好的100mL—級種子接種到400ml二級種子培養(yǎng)基中，并置于25'C恒溫搖床，以 180—200rpm培養(yǎng)56小時，然后轉(zhuǎn)接到一級種子罐中。
(2) 菌種的發(fā)酵
A、 一級種子罐生產(chǎn)
在100L攪拌式發(fā)酵罐中裝入50L—級種子罐培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)pH值到6.5， 按10%的接種量將上述培養(yǎng)好的二級搖瓶種子接入一級種子罐中，接種后一級種子罐中 的培養(yǎng)基總體積約為60L。保持培養(yǎng)溫度為25'C，攪拌速度為150rpm，通氣量為l : 0.4V/V'min，罐壓O. 05MPa，經(jīng)36h培養(yǎng)，菌種完成對數(shù)生長期，再轉(zhuǎn)接到二級種子罐 中；
B、 二級種子罐生產(chǎn)
在1T攪拌式種子罐中裝入600L二級種子培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)pH值到6.5， 將一級種子罐培養(yǎng)好的60L液體種子全部接入二級種子罐中，接種后二級種子罐中的培 養(yǎng)基總體積約為660U保持培養(yǎng)溫度為25°C，攪拌速度為180rpm，通氣量為1 : 0.6V/V .min，罐壓0.05MPa，經(jīng)48h培養(yǎng)，菌種完成對數(shù)生長期，再轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中；
C、 發(fā)酵罐生產(chǎn)
在10T發(fā)酵罐中裝入6T液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)pH值到6.5，將二級種子 罐培養(yǎng)好的液體種子660L全部接入發(fā)酵罐培養(yǎng)，接種后發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基總體積約為 6660L。保持培養(yǎng)溫度為25。C，攪拌速度為220卬m，通氣量為1 : 1. OV/V min，罐壓 0.06MPa，經(jīng)76h培養(yǎng)，當發(fā)酵液變得粘稠，培養(yǎng)基菌pH降到3.6，發(fā)酵液中出現(xiàn)大量 小菌球并且菌絲體的濃度達到18.9g濕菌絲/100mL，顯微鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲開始衰老、斷裂 和自溶的時候，結(jié)束發(fā)酵放罐。 實施例二-
使用的材料
馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面培養(yǎng)基蒸餾水、20%馬鈴薯浸汁、2%葡萄糖和2
%瓊脂粉構(gòu)成。
MYG液體培養(yǎng)基100ml蒸餾水中含有麥芽糖8g，葡萄糖4g，酵母粉3g， pH自然； 復合酶由質(zhì)量百分比2%的溶壁酶與0.2%的崩潰酶按1: l的比例混合而成；溶
壁酶(Lywallzyme):購自廣東省微生物研究所；崩潰酶(Driselase):購自FLUKAAG，
CHEM;
滲透壓穩(wěn)定劑0.8mol/L甘露醇；
J4YG再生培養(yǎng)基100ml濃度為0.8mol/L甘露醇中含有麥芽糖8g，葡萄糖4g，酵 母粉3g， pH自然；
液體發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖1.5%，黃豆餅粉2.5%，玉米粉1%, KH2P04 0.05%， MgS04. 7H20 0. 05% ，蒸餾水lOOOml， pH值6. 5;
—級搖瓶種子培養(yǎng)基或二級搖瓶種子培養(yǎng)基:葡萄糖1%，黃豆餅粉2.5%，玉米 粉1%，麩皮0.2%, KH2PO40. 05%， MgS04. 7H2O0. 05%， VB1 20mg/L，蒸餾水1000ml， pH值6.5;
一級種子罐培養(yǎng)基、二級種子罐培養(yǎng)基或發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基葡萄糖2%，黃豆餅 粉2%，蠶蛹粉1%，玉米粉1.5%,麩皮0.5%， KH2P04 0. 1%， MgS04. 7H20 0 . 05%， VB1 10mg/L，蒸餾水1000ml， pH值6. 5。
誘變培育方法
A、 原生質(zhì)體的制備-
按常規(guī)方法從青海采集的冬蟲夏草(Co/^yce;^ w'/7e/ sA傷e/^5"acc.〕子座分離 出的蝙蝠蛾被毛孢菌株，并將菌株接種到PDA斜面培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。
取PDA斜面培養(yǎng)基上生長旺盛的蝙蝠蛾被毛孢菌絲，取指甲大小的一塊，接種于 400ml MYG液體培養(yǎng)基中，20。C培養(yǎng)15天，然后將發(fā)酵液以3000rpm離心10分鐘，去上清 液，并用0.8mol/L甘露醇將菌絲體洗漆三次。稱量好復合酶，以0.8mol/L甘露醇溶解， 經(jīng)O. 22pm微孔濾膜過濾除菌后，按每300mg濕菌絲加lml酶液計算向菌絲體中加入復合酶 液，在28'C酶解4小時，將酶解液用滅過菌的G3砂芯漏斗過濾，4000rpm離心10分鐘，去 上清液，再用O. 8mol/L甘露醇洗滌兩次，得純化的原生質(zhì)體。
B、 紫外誘變-
將制備好的原生質(zhì)體稀釋至108個/mL ，取5mL放于無菌的9cm平皿內(nèi)，25w紫外燈， 距離25cm，照射約38s，然后取lmL樣品分別稀釋10倍、50倍、IOO倍后，分別取O. lml 涂MYG再生培養(yǎng)基平板上，于27。C黑暗閉光的恒溫箱中培養(yǎng)至再生菌落長出。然后隨機 挑取不同的再生菌株進行下面的篩選。
C、突變株的篩選
將上述經(jīng)過誘變后的菌株，接種到400ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在27i:連續(xù)進行10代 以上的馴化，分別測定有效成分含量，然后選擇生長旺盛、菌粉得率高、有效成分含量 高的菌株，接種到PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，作為液體發(fā)酵工藝的生產(chǎn)菌株。 發(fā)酵生產(chǎn)
取上述步驟中選育出的可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢菌種，進行搖瓶菌種培養(yǎng)和三級
發(fā)酵，具體步驟如下
(1) 菌種搖瓶培養(yǎng)-
A、 一級搖瓶種的培養(yǎng)
在500 ml三角瓶中裝入100ml—級搖瓶種子培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，取斜面培養(yǎng)基上 指甲大小的一塊菌絲接種于一級種子培養(yǎng)基中，放入28'C恒溫搖床，以150—200rpm培 養(yǎng)54小時，然后轉(zhuǎn)接到二級種子培養(yǎng)基中；
B、 二級搖瓶種的培養(yǎng)-
在1000ml三角瓶中裝入400ml 二級搖瓶種子培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，按20%的接種 量將長好的100mL—級種子接種到400ml二級種子培養(yǎng)基中，并置于28'C恒溫搖床，以 180—200rpm培養(yǎng)50小時，然后轉(zhuǎn)接到一級種子罐中。
(2) 菌種的發(fā)酵-
A、 一級種子罐生產(chǎn)
在100L攪拌式發(fā)酵罐中裝入50L—級種子罐培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)pH值到6.2， 按照培養(yǎng)基重量10%的接種量將上述培養(yǎng)好的二級搖瓶種子接入一級種子罐中，接種后 一級種子罐中的培養(yǎng)基總體積約為60L。保持培養(yǎng)溫度為28'C，攪拌速度為160rpm，通 氣量為l : 0.45V/V.min，罐壓O. 04MPa，經(jīng)38h培養(yǎng)，菌種完成對數(shù)生長期，再轉(zhuǎn)接到 二級種子罐中；
B、 二級種子罐生產(chǎn)
在1T攪拌式種子罐中裝入600L 二級種子培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)pH值到6. 5， 將一級種子罐培養(yǎng)好的60L液體種子全部接入二級種子罐中，接種后二級種子罐中的培 養(yǎng)基總體積約為660L。保持培養(yǎng)溫度為28°C，攪拌速度為180rpm，通氣量為1 : 0.6V/V .min，罐壓0.05MPa，經(jīng)48h培養(yǎng)，菌種完成對數(shù)生長期，再轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中；
C、 發(fā)酵罐生產(chǎn)
在10T發(fā)酵罐中裝入6T液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)pH值到6.5,將二級種子 罐培養(yǎng)好的液體種子660L全部接入發(fā)酵罐培養(yǎng)，接種后發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基總體積約為6660L。保持培養(yǎng)溫度為28。C，攪拌速度為200rpm，通氣量為1 : 1. 1V/V min，罐壓 0.06MPa，經(jīng)84h培養(yǎng)，當發(fā)酵液變得粘稠，培養(yǎng)基菌pH降到3. 4，發(fā)酵液中出現(xiàn)大量 小菌球并且菌絲體的濃度達到20.5g濕菌絲/100mL，顯微鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲開始衰老、斷裂 和自溶的時候，結(jié)束發(fā)酵放罐。
實施例三 使用的材料-
馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面培養(yǎng)基蒸餾7jC、 20%馬鈴薯浸汁、2%葡萄糖和2
%瓊脂粉構(gòu)成。
MYG液體培養(yǎng)基100ml蒸餾水中含有麥芽糖10g，葡萄糖2g，酵母粉2g， pH自然；
復合酶由質(zhì)量百分比3%的溶壁酶與0.8%的崩潰酶按1: l的比例混合而成；溶
壁酶(Lywallzyme)，購自廣東省微生物研究所，崩潰酶(Driselase)，購自F隠AG， CHEM;
滲透壓穩(wěn)定劑0.7mol/L甘露醇；
MYG再生培養(yǎng)基100ml濃度為0.7 mol/L甘露醇中含有麥芽糖10g，葡萄糖2g, 酵母粉2g， pH自然；
液體發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖1%，黃豆餅粉2%，玉米粉2%， KH2P040. 1%， MgS04. 7H20 0.05%,蒸餾水1000ml， pH值6. 5;
一級搖瓶種子培養(yǎng)基或二級搖瓶種子培養(yǎng)基:葡萄糖1%，黃豆餅粉2%，玉米粉2 %，麩皮1.0%， KH2P040. 1%， MgS04.7H20 0.05%， VB1 50mg/L，蒸餾水1000ml, pH 值6.5;
一級種子罐培養(yǎng)基、二級種子罐培養(yǎng)基或發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基葡萄糖1%，黃豆餅
粉2%，蠶蝻粉1%，玉米粉2%，麩皮1.0%， KH2P040. 1%， MgS04.7H20 0. 05%， VB1
50mg/L，蒸餾水1000ml， pH值6.5。
誘變培育方法
A、原生質(zhì)體的制備
按常規(guī)方法從青海采集的冬蟲夏草〔&royc印s wV7e/wis傷er^;6^cc.〕子座分離 出的蝙蝠蛾被毛孢菌株，并將菌株接種到PDA斜面培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。
取PDA斜面培養(yǎng)基上生長旺盛的蝙蝠蛾被毛孢菌絲，取指甲大小的一塊，接種于 400mlMYG液體培養(yǎng)基中，18。C培養(yǎng)20天，然后將發(fā)酵液以3000卬m離心10分鐘，去上清 液，并用O. 7mol/L甘露醇將菌絲體洗滌三次。稱量好復合酶，以O. 7mol/L甘露醇溶解， 經(jīng)O. 22pm微孔濾膜過濾除菌后，按每300mg濕菌絲加lml酶液計算向菌絲體中加入復合酶 液，在35。C酶解3小時，將酶解液用滅過菌的G3砂芯漏斗過濾，4000rpm離心10分鐘，去 上清液，再用O. 8mol/L甘露醇洗滌兩次，得純化的原生質(zhì)體。
B、 紫外誘變
將制備好的原生質(zhì)體稀釋至10s個/mL ，取5mL放于無菌的9cm平皿內(nèi)，30w紫外燈， 距離25cra，照射約28s，然后取lmL樣品分別稀釋10倍、50倍、IOO倍后，分別取O. lml 涂MYG再生培養(yǎng)基平板，于25'C黑暗閉光的恒溫箱中培養(yǎng)至再生菌落長出。然后隨機挑 取不同的再生菌株進行下面的篩選。
C、 突變株的篩選
將上述經(jīng)過誘變后的菌株，接種到400ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25C連續(xù)進行10代 以上的馴化，分別測定有效成分含量，然后選擇生長旺盛、菌粉得率高、有效成分含量 高的菌株，接種到PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，作為液體發(fā)酵工藝的生產(chǎn)菌株。 發(fā)酵生產(chǎn)
取上述步驟中選育出的可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢菌種，進行搖瓶菌種培養(yǎng)和三級 發(fā)酵，具體步驟如下-
(1) 菌種搖瓶培養(yǎng)
A、 一級搖瓶種的培養(yǎng)
在500 ml三角瓶中裝入100ml—級搖瓶種子培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，取斜面培養(yǎng)基上 指甲大小的一塊菌絲接種于一級種子培養(yǎng)基中，放入27'C恒溫搖床，以150 — 200rpm培 養(yǎng)54小時，然后轉(zhuǎn)接到二級種子培養(yǎng)基中；
B、 二級搖瓶種的培養(yǎng)
在1000ml三角瓶中裝入400ml 二級搖瓶種子培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，按20%的接種 量將長好的100mL —級種子接種到400ml 二級種子培養(yǎng)基中，并置于27'C恒溫搖床，以 180—200rpm培養(yǎng)50小時，然后轉(zhuǎn)接到一級種子罐中。
(2) 菌種的發(fā)酵-
A、 一級種子罐生產(chǎn)
在100L攪拌式發(fā)酵罐中裝入50L—級種子罐培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)pH值到6.5， 按照培養(yǎng)基重量10%的接種量將上述培養(yǎng)好的二級搖瓶種子接入一級種子罐中，接種后 一級種子罐中的培養(yǎng)基總體積約為60L。保持培養(yǎng)溫度為27'C，攪拌速度為140rpm，通 氣量為l : 0.55V/V.min，罐壓O. 045MPa，經(jīng)48h培養(yǎng)，菌種完成對數(shù)生長期，再轉(zhuǎn)接到 二級種子罐中；
B、 二級種子罐生產(chǎn)
在1T攪拌式種子罐中裝入600L二級種子培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)pH值到6.5， 將一級種子罐培養(yǎng)好的60L液體種子全部接入二級種子罐中，接種后二級種子罐中的培 養(yǎng)基總體積約為660L。保持培養(yǎng)溫度為27°C，攪拌速度為170rpm，通氣量為1 : 0.65V/V *min,罐壓0. 05 MPa，經(jīng)48h培養(yǎng)，菌種完成對數(shù)生長期，再轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐 中；
C、發(fā)酵罐生產(chǎn)
在10T發(fā)酵罐中裝入6T液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)pH值到6.5，將二級種子 罐培養(yǎng)好的液體種子660L全部接入發(fā)酵罐培養(yǎng)，接種后發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基總體積約為 6660L。保持培養(yǎng)溫度為27。C，攪拌速度為210rpm，通氣量為1:1.2V/V min，罐壓 0.06MPa，經(jīng)71h培養(yǎng)，當發(fā)酵液變得粘稠，培養(yǎng)基菌pH降到3.4，發(fā)酵液中出現(xiàn)大量 小菌球并且菌絲體的濃度達到21.5g濕菌絲/100raL，顯微鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲開始衰老、斷裂 和自溶的時候，結(jié)束發(fā)酵放罐。
權(quán)利要求
1.一種可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌，其特征是該真菌分類學命名為蝙蝠蛾被毛孢(Hirsutella hepiali Chen et Shen)BS-1，其由以下方法誘變而得從天然冬蟲夏草〔Cordyceps sinensis(Berk)Sacc.〕子座分離出的蝙蝠蛾被毛孢菌株中提取原生質(zhì)體，對原生質(zhì)體在15～60W紫外燈下距離10～50cm，照射1～300s，然后接種于MYG再生培養(yǎng)基上放置在25～28℃恒溫箱中培養(yǎng)；取誘變培養(yǎng)得到的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25～28℃下進行10代以上的馴化后獲得。
2、 一種可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌的誘變育種方法，其特征是從天然冬蟲 夏草〔6broyce;w w'/7e/7W's 0erA>) 5"acc.〕子座分離出的蝙蝠蛾被毛孢菌株(Ay/'rst/te//a /7印/a/Z Crte" ef S/7en)中提取原生質(zhì)體，對原生質(zhì)體在15 60W紫外燈下距離10 50cm， 照射l 300s，然后接種于MYG再生培養(yǎng)基上放置在25 28'C恒溫箱中培養(yǎng)；取誘變培 養(yǎng)得到的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25 28'C下進行10代以上的馴化后獲得。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌的誘變育種方法，其特 征是所述的馴化蝙蝠蛾被毛孢誘變株的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為每1000重量份水中 含以下重量份成分葡萄糖1 3份，黃豆餅粉2 4份，玉米粉2 3份，KH2P040. l 0. 5份，MgS04. 7H20 0 . 05-0 . 20份，pH值5. 5 6. 5。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌的誘變育種方法，其特 征是所述的原生質(zhì)體的濃度應為105 108個/1111。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌的誘變育種方法，其特 征是所述的MYG液體培養(yǎng)基配方為每100重量份水中含以下重量份成分麥芽糖8 12份，葡萄糖2 6份，酵母粉3 5份，pH自然；所述的MYG再生培養(yǎng)基配方為甘露 醇中含以下質(zhì)量體積比的成分麥芽糖8 12%，葡萄糖2 6%，酵母粉3 5%， pH 自然；所述的甘露醇的濃度為0. 6 0. 8mol/L。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌的誘變育種方法，其特征 是所述的提取原生質(zhì)體的具體步驟為取蝙蝠蛾被毛孢菌株，接種于MYG液體培養(yǎng)基 中，18 2(TC培養(yǎng)15 20天，然后離心，去上清液，并用滲透壓穩(wěn)定劑洗漆；取提取原 生質(zhì)體用的復合酶，以滲透壓穩(wěn)定劑溶解，經(jīng)微孔濾膜過濾除菌后加入到菌株中在28 35。C酶解3 4小時，將酶解液過濾，離心，去上清液，用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌，得純化的 原生質(zhì)體。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌的誘變育種方法，其特征 是所述的復合酶液的加入量按每300 500mg濕菌絲加lml酶液計算；所述的滲透壓穩(wěn) 定劑為O. 6 0. 8mol/L甘露醇。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌的誘變育種方法，其 特征是所述的復合酶組成為質(zhì)量百分比分別為2 4%的溶壁酶和0.2 0.8%的崩潰 酶按l: l的比例的混合而成。
9、 一種權(quán)利要求1所述的可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌的發(fā)酵工藝，其特征是， 包括以下步驟(1) 一級搖瓶菌種的培養(yǎng)將蝙蝠蛾被毛孢菌種接種于裝有一級種子培養(yǎng)基的三角瓶中，放入25。C 28。C恒溫 搖床，以150 200rpm培養(yǎng)48 72小時，待菌絲長滿三角瓶后即可；(2) 二級搖瓶菌種的培養(yǎng)將長好的一級搖瓶培養(yǎng)所得的種子接種到裝有二級種子培養(yǎng)基的三角瓶中，并置于 25'C 28。C恒溫搖床，以180 200rpm培養(yǎng)48 72小時；待菌絲長滿三角瓶后即可；(3) —級種子罐生產(chǎn)將一級種子罐培養(yǎng)基裝入攪拌式發(fā)酵罐中，滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)pH值到5.5 6.5， 將二級搖瓶種子接入一級種子罐中，保持培養(yǎng)溫度為25 28'C，攪拌速度為150 220rpm，通氣量為1 : 0. 4V/V min l: 1. OV/V min，罐壓0. 03 0. 06 MPa，經(jīng)24 60h培養(yǎng)，菌種完成對數(shù)生長期即可；(4) 二級種子罐生產(chǎn)將二級種子罐培養(yǎng)基裝入攪拌式發(fā)酵罐中，滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)pH值到5.5 6.5， 將一級種子罐培養(yǎng)好的液體種子全部接入二級種子罐中；保持培養(yǎng)溫度為25 28'C，攪 拌速度為150 220rpm，通氣量為1 : 0. 4V/V min 1: LOV/V min'罐壓0. 03 0.06MPa，經(jīng)24 60h培養(yǎng)，菌種完成對數(shù)生長期即可；(5) 發(fā)酵罐生產(chǎn)將液體培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐，滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)pH值到5.5 6.5,將二級種子罐培 養(yǎng)好的液體種子全部接入發(fā)酵罐培養(yǎng)；保持培養(yǎng)溫度為25 28°C，攪拌速度為150 220rpm，通氣量為1 : 0. 4V/V min l: 1. OV/V min，罐壓0. 03 0. 06MPa，經(jīng)60 96h培養(yǎng)，當發(fā)酵液變得粘稠，培養(yǎng)基菌pH降到3.4 4.2，發(fā)酵液中出現(xiàn)大量小菌球 并且菌絲體的濃度達到15 22g濕菌絲/100mL，顯微鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲開始衰老、斷裂和自 溶的時候，結(jié)束發(fā)酵放罐。
10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌的發(fā)酵工藝，其特征是: 所述一級搖瓶種子培養(yǎng)基和二級搖瓶種子培養(yǎng)基配方均為每1000重量份水中含以下重 量份成分葡萄糖1 4份，黃豆餅粉0.5 3份，玉米粉1 3份，麩皮0.1 1.0份， KH2P040. 05 0. 2份，MgSO" 7H20 0. 01 0. 1份，VB1 5 50mg/L， pH值5. 5 6. 5;所述 的一級種子罐培養(yǎng)基、二級種子罐培養(yǎng)基和發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方均為每1000重量份水中 含以下重量份成分:葡萄糖1 4份，黃豆餅粉1 4份，蠶蛹粉0.5 2.0份，玉米粉l 4份，麩皮0. 1 2份，KH2P040. 1 1. 0份，MgS04. 7H20 0. 01 0. 1份，VB1 5 50mg/L， pH值5. 5 6. 5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌，該真菌分類學命名為蝙蝠蛾被毛孢(Hirsutella hepiali Chen et Shen)BS-1，其由以下方法誘變而得從天然冬蟲夏草〔Cordyceps sinensis(Berk)Sacc.〕子座分離出的蝙蝠蛾被毛孢菌株中提取原生質(zhì)體，對原生質(zhì)體在15～60W紫外燈下距離10～50cm，照射1～300s，然后接種于MYG再生培養(yǎng)基上放置在25～28℃恒溫箱中培養(yǎng)；取誘變培養(yǎng)得到的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25～28℃下進行10代以上的馴化后，分別測定有效成分含量，選擇生長旺盛、菌粉得率高、有效成分含量高的菌株，最后得到能夠在常溫發(fā)酵的蝙蝠蛾被毛孢菌株。本發(fā)明還公開了該真菌的誘變育種方法和發(fā)酵工藝。所述的蝙蝠蛾被毛孢菌株可在常溫下快速生長，而且其發(fā)酵周期短，生產(chǎn)成本低，使產(chǎn)品更具市場競爭力。
文檔編號C12R1/645GK101372672SQ20081019893
公開日2009年2月25日 申請日期2008年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月28日
發(fā)明者剛 李 申請人:剛 李