專利名稱：蝙蝠蛾幼蟲內(nèi)源加壓人工感染中國被毛孢培養(yǎng)蟲草的方法
技術領域：
本發(fā)明屬冬蟲夏草的人工培養(yǎng)技術領域，具體為冬蟲夏草培育過程中蝙蝠蛾幼蟲內(nèi)源加壓人工感染中國被毛孢的方法。
背景技術：
冬蟲夏草是一種十分名貴的藥用真菌，它是昆蟲蝙蝠蛾幼蟲感染中國被毛孢 (Hirsutalla sinensis)后，形成的蝙蝠蛾幼蟲的真菌感染體。受該真菌感染的蝙蝠蛾幼蟲，因感染后體內(nèi)長滿該真菌而死亡，之后在特殊環(huán)境條件下，從蝙蝠蛾死后幼蟲體上長出的“草”是真菌中國被毛孢的子實體一子座。真菌中國被毛孢在分類學上屬子囊菌亞門Ascomycotina，核菌綱Pyrenomycetes， 麥角菌目Clavicipitales。也有許多文獻資料將中國被毛孢用于蟲菌感染復合體冬蟲夏草。中國被毛孢已被人工從冬蟲夏草蟲體上分離并廣泛培養(yǎng)。真菌中國被毛孢的培養(yǎng)方法及菌株生物學等研究工作已有大量報道?，F(xiàn)在人工培養(yǎng)冬蟲夏草的報道較多。蛹蟲草又稱北冬蟲夏草，是蛹草菌 (Cordyceps militaris)寄生在夜蛾科等昆蟲的蛹上。蛹蟲草與冬蟲夏草不僅感染的對象不同，真菌的種類差別也大。在冬蟲夏草人工培養(yǎng)方面，多數(shù)是中國被毛孢培養(yǎng)的報道。對蝙蝠蛾幼蟲人工感染方法及之后的特殊環(huán)境培養(yǎng)子實體的報道較少。蝙蝠蛾幼蟲人工感染是人工培養(yǎng)冬蟲夏草過程的關鍵環(huán)節(jié)。只有蝙蝠蛾幼蟲感染中國被毛孢后，才可能進一步在特殊的環(huán)境條件下培養(yǎng)，讓感染體長出子實體一子座。現(xiàn)已公開的感染方法有兩種，一是用真菌中國被毛孢的孢子噴灑于幼蟲體表，孢子萌發(fā)后有可能感染蝙蝠蛾幼蟲；二是讓蝙蝠蛾幼蟲在大量培養(yǎng)真菌中國被毛孢的環(huán)境中生活，讓其自然感染。上述兩種方法隨機性大，感染率很低，周期長，成本高，有失商業(yè)或人工大規(guī)模培養(yǎng)的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的上述缺點，為冬蟲夏草的人工培養(yǎng)提供一種具有商業(yè)價值的方法，即蝙蝠蛾幼蟲內(nèi)源加壓人工感染中國被毛孢培養(yǎng)蟲草的方法。本發(fā)明方法包括以下步驟
1、制作無菌感染原液，將以下重量比的成分混合
家蠶蛹28 ；34%，
馬鈴薯5 7%，
硫酸鎂0. 008 0. 01%,
磷酸二氫鉀0. 035 0. 05%,
余量為水，
經(jīng)煮沸，過濾，滅菌制成無菌感染原液。制作無菌感染原液的最佳方法是家蠶蛹500克+馬鈴薯100克+硫酸鎂0. 15克+磷酸二氫鉀0. 7克+水1000克，煮沸時間大于30分鐘，用25 28號絹網(wǎng)過濾，濾液如果少于500毫升，用蒸餾水定容至500毫升，濾液如果大于500毫升，將濾液加熱濃縮至500 毫升，濾液經(jīng)滅菌后制成無菌感染原液。2、制作感染源菌液，采用中國被毛孢為感染菌源，用接種針挑離其純菌絲體放于無菌感染原液中，放入量為每5毫升無菌感染原液中放入10 15針所挑離的中國被毛孢， 研磨后制成感染源菌液。真菌中國被毛孢的培養(yǎng)方法為已有技術。取真菌的純菌絲體放于液體中的操作過程為本專業(yè)人員所知曉。最好是從長滿中國被毛孢的培養(yǎng)瓶壁上，挑離純菌絲體于無菌感染原液中，在缽中研磨1分鐘以上制得感染源菌液。 3、用無菌2 4毫升注射器，吸取所得感染源菌液，將針頭從蝙蝠蛾幼蟲排泄口插入后，壓入幼蟲腸道感染源菌液0. 3 0. 5毫升，再將該幼蟲于無光，17 21°C，相對濕度 78 85%的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間大于15天。本發(fā)明的有益效果感染率高達90%以上，周期短，成本低，在規(guī)?；囵B(yǎng)蟲菌復合體冬蟲夏草的過程中，具有很好的應用前景。
具體實施例方式按照本發(fā)明方法給出的以下步驟，在所給條件范圍內(nèi)變化，從而分別進行具體試驗，結(jié)果表明均能實現(xiàn)發(fā)明目的
1、制作無菌感染原液，將以下重量比的成分混合
家蠶蛹28 ；34%，
馬鈴薯5 7%，
硫酸鎂0. 008 0. 01%,
磷酸二氫鉀0. 035 0. 05%,
余量為水，
經(jīng)煮沸，過濾，滅菌制成無菌感染原液。2、制作感染源菌液，采用中國被毛孢為感染菌源，用接種針挑離其純菌絲體放于無菌感染原液中，放入量為每5毫升無菌感染原液中放入10 15針所挑離的中國被毛孢， 研磨后制成感染源菌液。3、用無菌2 4毫升注射器，吸取所得感染源菌液，將針頭從蝙蝠蛾幼蟲排泄口插入后，壓入幼蟲腸道感染源菌液0. 3 0. 5毫升，再將該幼蟲于無光，17 21°C，相對濕度 78 85%的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間大于15天。以下為其中的一些實例。實施例1，按以下步驟進行
(1)制作無菌感染原液。把以下重量比的原料家蠶蛹31%，馬鈴薯6%，硫酸鎂0. 009%, 磷酸二氫鉀0. 045%，余量為水，混合后煮沸、過濾，滅菌后得無菌感染原液。(2)制作感染源菌液采用分離培養(yǎng)獲得的純培養(yǎng)中國被毛孢為感染菌源，用接種針在潔凈工作臺上，從純培養(yǎng)的中國被毛孢培養(yǎng)瓶中，分離不帶培養(yǎng)基的純菌絲體10針于上步獲得的無菌感染原液5ml中，在缽中研磨1分鐘后制得感染源菌液。本實施例所說分離培養(yǎng)獲得的純培養(yǎng)中國被毛孢為感染菌源是將在云南省怒江州丙中洛鄉(xiāng)采集的野生冬蟲夏草，用組織分離法，在加富PDA的培養(yǎng)基上進行分離培養(yǎng)。(3)取采集到的蝙蝠蛾幼蟲10條，幼蟲平均長5. 3厘米。用3毫升無菌注射器吸取上步獲得的感染源菌液，從幼蟲排泄口插入0. 5 0. 8厘米，壓入幼蟲腸道感染源菌液 0.3毫升。再將該幼蟲置于無光，18°C，相對濕度80%的可控溫、濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天，取出觀察，一條腐敗，九條外形彎曲，顏色正常。將九條幼蟲縱剖，用鑷子分別取九條幼蟲體內(nèi)組織狀做成水封片，顯微鏡下均觀察到真菌中國被毛孢菌絲體，其中一條幼蟲的菌絲較疏，其余八條的菌絲緊密。實施例2，按以下步驟進行
(1)制作無菌感染原液。把以下重量比的原料家蠶蛹28%，馬鈴薯7%，硫酸鎂0. 01%, 磷酸二氫鉀0. 037%，余量為水，混合后煮沸、過濾，濃縮，定容，滅菌后得無菌感染原液。(2)制作感染源菌液采用分離培養(yǎng)獲得的純培養(yǎng)中國被毛孢為感染菌源，用接種針在潔凈工作臺上，從純培養(yǎng)的中國被毛孢培養(yǎng)瓶壁上，挑離不帶培養(yǎng)基的純菌絲體15針于上步獲得的無菌感染原液每5ml中，在缽中研磨2分鐘后制得感染源菌液。(3)取采集到的蝙蝠蛾幼蟲20條，幼蟲平均長5. 2厘米。用2毫升無菌注射器吸取上步獲得的感染源菌液，從幼蟲排泄口插入0. 4 0. 7厘米，壓入幼蟲腸道感染源菌液各 0. 5毫升。再將該幼蟲置于無光，200C，相對濕度85%的可控溫、濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20天，取出觀察，20條均不同程度彎曲，顏色正常。取幼蟲體內(nèi)組織狀物水封片鏡檢，20條均均有中國被毛孢菌絲體濃密生長。實施例3，按以下步驟進行
(1)制作無菌感染原液。把以下重量比的原料家蠶蛹；34%，馬鈴薯5%，硫酸鎂0. 008%, 磷酸二氫鉀0. 05%，余量為水，混合后煮沸、過濾，濃縮，定容，滅菌后得無菌感染原液。(2)制作感染源菌液采用分離培養(yǎng)獲得的純培養(yǎng)中國被毛孢為感染菌源，用接種針在潔凈工作臺上，從純培養(yǎng)的中國被毛孢培養(yǎng)瓶中，分離不帶培養(yǎng)基的純菌絲體14針于上步獲得的無菌感染原液每5ml中，在缽中研磨1. 5分鐘后制得感染源菌液。(3)取采集到的蝙蝠蛾幼蟲50條，用4毫升無菌注射器吸取上步獲得的感染源菌液，從幼蟲排泄口插入0. 6 0. 9厘米，壓入幼蟲腸道感染源菌液各0. 4毫升。再將該幼蟲置于無光，17°C，相對濕度78%的可控溫、濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22天，取出觀察，1條腐爛，49條均不同程度彎曲。取幼蟲體內(nèi)組織狀物水封片鏡檢，49條均有中國被毛孢菌絲體較濃密生長。實施例4，按以下步驟進行
(1)制作無菌感染原液。把以下重量比的原料家蠶蛹30%，馬鈴薯6%，硫酸鎂0. 085%, 磷酸二氫鉀0. 041%,余量為水，混合后煮沸、過濾，濃縮，定容，滅菌后得無菌感染原液。(2)制作感染源菌液采用分離培養(yǎng)獲得的純培養(yǎng)中國被毛孢為感染菌源，用接種針在潔凈工作臺上，從純培養(yǎng)的中國被毛孢培養(yǎng)瓶中，挑離不帶培養(yǎng)基的純菌絲體12針于上步獲得的無菌感染原液每5ml中，在缽中研磨2. 5分鐘后制得感染源菌液。(3)取采集到的蝙蝠蛾幼蟲15條，用3毫升無菌注射器吸取上步獲得的感染源菌液，從幼蟲排泄口插入0. 5 0. 8厘米，壓入幼蟲腸道感染源菌液各0. 4毫升。再將該幼蟲置于無光，21°C，相對濕度85%的可控溫、濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21天，取出觀察，15條均不同程度彎曲，顏色正常。取幼蟲體內(nèi)組織狀物水封片鏡檢，15條均有中國被毛孢菌絲體濃密生長。實施例5，按以下步驟進行
(1)制作無菌感染原液。家蠶蛹500克+馬鈴薯100克+硫酸鎂0. 15克+磷酸二氫鉀0. 7克+水1000克，煮沸時間大于30分鐘，用25號絹網(wǎng)過濾，濾液如果少于500毫升， 用蒸餾水定容至500毫升，濾液如果大于500毫升，將濾液加熱濃縮至500毫升，濾液經(jīng)滅菌后制成無菌感染原液。(2)制作感染源菌液采用分離培養(yǎng)獲得的純培養(yǎng)中國被毛孢為感染菌源，用接種針在潔凈工作臺上，從純培養(yǎng)的中國被毛孢培養(yǎng)瓶中挑離純菌絲體，每5ml無菌感染原液中挑離放入不帶培養(yǎng)基的純菌絲體15針，在缽中研磨1分鐘后制得感染源菌液。(3)取蝙蝠蛾幼蟲30條，用4毫升無菌注射器吸取上步獲得的感染源菌液，從幼蟲排泄口插入0. 3 0. 8厘米，壓入幼蟲腸道感染源菌液0. 3毫升。再將該幼蟲置于無光， 18°C，相對濕度80%的可控溫、濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天，取出觀察，均外形彎曲，顏色正常。將幼蟲縱剖，用鑷子幼蟲體內(nèi)組織狀做成水封片，顯微鏡下均觀察到真菌中國被毛孢菌絲體， 全部幼蟲的菌絲濃密。以上實施例僅僅是為了對發(fā)明方法作進一步說明，而本方法的范圍不受所舉實施例的局限。
權(quán)利要求
1.蝙蝠蛾幼蟲內(nèi)源加壓人工感染中國被毛孢培養(yǎng)蟲草的方法，其特征在于包括以下步驟(1)、制作無菌感染原液，將以下重量比的成分混合 家蠶蛹28 ；34%，馬鈴薯5 7%， 硫酸鎂0. 008 0. 01%, 磷酸二氫鉀0. 035 0. 05%, 余量為水，經(jīng)煮沸，過濾，滅菌制成無菌感染原液；(2)、制作感染源菌液，采用中國被毛孢為感染菌源，用接種針挑離其純菌絲體放于無菌感染原液中，放入量為每5毫升無菌感染原液中放入10 15針所挑離的中國被毛孢，研磨后制成感染源菌液；(3)、用無菌2 4毫升注射器，吸取所得感染源菌液，將針頭從蝙蝠蛾幼蟲排泄口插入后，壓入幼蟲腸道感染源菌液0. 3 0. 5毫升，再將該幼蟲于無光，17 21°C，相對濕度 78 85%的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間大于15天。
2.如權(quán)利要求1所說的蝙蝠蛾幼蟲內(nèi)源加壓人工感染中國被毛孢培養(yǎng)蟲草的方法，其特征在于其中的步驟(1)為取家蠶蛹500克+馬鈴薯100克+硫酸鎂0. 15克+磷酸二氫鉀0. 7克+水1000克，煮沸時間大于30分鐘，用25 觀號絹網(wǎng)過濾，濾液如果少于500 毫升，用蒸餾水定容至500毫升，濾液如果大于500毫升，將濾液加熱濃縮至500毫升，濾液經(jīng)滅菌后制成無菌感染原液。
3.如權(quán)利要求1所說的蝙蝠蛾幼蟲內(nèi)源加壓人工感染中國被毛孢培養(yǎng)蟲草的方法，其特征在于其中的步驟(2)所說挑離是從長滿中國被毛孢的培養(yǎng)瓶壁上挑離，所說研磨是在缽中研磨1分鐘以上。
全文摘要
蝙蝠蛾幼蟲內(nèi)源加壓人工感染中國被毛孢培養(yǎng)蟲草的方法，屬冬蟲夏草的人工培養(yǎng)技術領域。將以下重量比的成分混合家蠶蛹28～34%，馬鈴薯5～7%，硫酸鎂0.008~0.01%，磷酸二氫鉀0.035~0.05%，余量為水，經(jīng)煮沸，過濾，滅菌制成無菌感染原液。以中國被毛孢為感染菌源，用接種針挑離其純菌絲體放于無菌感染原液中，每5毫升無菌感染原液中放入10～15針所挑離的中國被毛孢，研磨后制成感染源菌液。用注射器吸取感染源菌液，針頭從蝙蝠蛾幼蟲排泄口插入，壓入幼蟲腸道感染源菌液0.3～0.5毫升，再將幼蟲于無光，17～21℃，相對濕度78～85%條件下培養(yǎng)大于15天。感染率高達90%以上，周期短成本低，對規(guī)模化培養(yǎng)蟲草有很好應用前景。
文檔編號A01G1/04GK102498947SQ201110347959
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月7日
發(fā)明者許繼宏 申請人:許繼宏