專利名稱：血小板糖蛋白IB－α變體融合多肽及其用法的制作方法
背景技術(shù)：
與血管相關(guān)的疾病的負(fù)面作用，比如中風(fēng)、心臟病、動(dòng)脈硬化，被認(rèn)為至少部分是由血管炎癥及其修復(fù)反應(yīng)所引起的。血管炎癥及修復(fù)反應(yīng)包括血液循環(huán)中的多種類型細(xì)胞之間的交互粘附作用。此方面的例子可能出現(xiàn)在血小板、白細(xì)胞和血管內(nèi)表面(也就是血管內(nèi)皮)之間。在流體剪向沖擊力較大的條件下，血小板會(huì)通過(guò)其表面的Ib-IX-V糖蛋白復(fù)合體和位于血管內(nèi)皮外膜的血管性血友病因子之間的交互作用而粘附在血管的內(nèi)皮上。此外，附著在血管內(nèi)皮上的血小板還會(huì)在v-WF(血管性血友病因子)作用的范圍內(nèi)粘附血管血液中的其他血小板，從而使血小板層疊形成的血栓增厚。由GPIb-IX-V形成的GPIα鏈也使得α-凝血酶更容易附著到血小板的表面，從而加強(qiáng)了GPV和活性蛋白酶受體(PARs)的凝血酶促進(jìn)分裂。
與此相對(duì)的是，白血球也可以直接粘附于活性血管內(nèi)皮，或間接得通過(guò)由vWF固定的血小板附著.在這兩種情況下，白血球細(xì)胞表面的粘附在選擇蛋白或整聯(lián)蛋白組粘合受體的分子都會(huì)促進(jìn)這樣的粘附過(guò)程.一般認(rèn)為，白血球-血小板之間的粘合，至少部分是由于，白血球表面的整聯(lián)蛋白分子MacI和血小板表面的GPIb-IX-V聯(lián)合體成分的交互作用而出現(xiàn)的。
在血管疾病出現(xiàn)時(shí)，比如動(dòng)脈硬化斑破裂，或者由血管成形術(shù)、動(dòng)脈狹窄、心肺替代管手術(shù)、局部缺血損傷或狹窄引起的機(jī)械損傷，發(fā)生時(shí)，白血球或血小板會(huì)在損傷部位堆積并且由于彼此可作為另一層的底層使這種堆積成倍增長(zhǎng)。白血球和血小板的這種堆積會(huì)產(chǎn)生多種因子，包括促細(xì)胞分裂原、細(xì)胞因子和趨化因子，這些因子促使血管疾病向著不理想的方向進(jìn)一步發(fā)展。
包括來(lái)自于GPIα的v-WF粘合區(qū)域的用于治療的多肽已經(jīng)被公開(kāi)。其中之一的多肽基于這樣一個(gè)序列，該序列是包含兩個(gè)氨基酸取代物(G233V，M239V)的野生型人類的GPIα氨基酸序列。一個(gè)Ig融合蛋白包含290個(gè)細(xì)胞外氨基酸，受v-WF粘合作用主導(dǎo)的這種變異體能夠抑制冠狀動(dòng)脈血栓。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了一種糖蛋白IB-α高級(jí)變體多肽，可用于作為血管疾病的治療藥物。在不同的實(shí)施方案中，這種變體至少表現(xiàn)出一種下述一種性質(zhì)低聚合性、強(qiáng)穩(wěn)定性以及對(duì)凝血酶的弱束縛作用。這種變體的作用之一是作為融合蛋白用以治療與血管炎癥、血栓、動(dòng)脈硬化以及血管成形術(shù)后的再狹窄相關(guān)的血管癥狀。
一方面，相對(duì)于，具有人類自然的GPIα氨基酸序列(序列代碼1)的多肽，或者相對(duì)上述序列包含了兩個(gè)氨基酸取代物G233V和M239V的名為GPIb2V的多肽，這兩者與α凝血酶的粘附而言；本發(fā)明的多肽與α凝血酶的粘附具有較低的免疫親合力。當(dāng)多肽與α凝血酶的粘附具有較低的免疫親合力時(shí)，更多的凝血酶可用于血栓形成過(guò)程，在某一過(guò)程中可減少不希望的流血。顯示出可以減少凝血酶粘附作用的多肽的例子，是那些包括一個(gè)、兩個(gè)或者三個(gè)氨基酸取代物Y276F、Y278F、Y279V的代碼為1和2序列，或者其保守變體。
在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于包含代碼為1和2的氨基酸序列的多肽的聚合性來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的多肽的聚合性低。在某些例子中，細(xì)胞中本多肽合成過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)具有低聚合性。一個(gè)這方面的例子是，包含了C65S氨基酸取代物的多肽或其保守變體，相對(duì)于代碼為1和2的氨基酸序列來(lái)說(shuō)，具有低聚合性。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽相對(duì)于包含代碼為1和2的氨基酸序列的多肽，對(duì)蛋白質(zhì)水解具有較強(qiáng)的耐性。一個(gè)這方面的例子是包含了K237V的氨基酸取代物的多肽或其保守變體，相對(duì)于代碼為1和2的氨基酸序列，對(duì)蛋白質(zhì)水解具有較強(qiáng)的耐性。
本發(fā)明的多肽的合適例子是那些，相對(duì)于代碼為1和2的氨基酸序列，包含下述氨基酸序列取代物Y276F，Y276FK237V，Y276FC65S，Y276FY278FY279F，Y276FY278FY279FK237V和Y276FY278FY279FC65S。
本發(fā)明的多肽可以作為融合蛋白。例如，糖蛋白Ibα融合蛋白可以包括一條包含至少糖蛋白IB-α多肽變體一部分的多肽，與第二條肽鏈連接。在一些例子中，這個(gè)第二條肽鏈形成多聚體，比如二聚體。在另一些例子中，這個(gè)第二條肽鏈至少包括免疫球蛋白多肽鏈的一部分。
本發(fā)明同樣提供了糖蛋白-Ibα變體多肽的核酸編碼，及載體、細(xì)胞和用糖蛋白-Ibα變體多肽編碼核酸表達(dá)這種糖蛋白-Ibα變體多肽的方法。本發(fā)明同樣進(jìn)一步提供了，糖蛋白-Ibα變體融合多肽的的核酸編碼，以及這種編碼的核酸的載體，以及一種含有這種載體或核酸的細(xì)胞。
本發(fā)明也提供了一種通過(guò)連接與糖蛋白Ibα融合多肽的而抑制白血球粘合到生物組織的方法。大量的白血球被連接足以抑制白血球和生物組織的粘附。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種治療與血小板活化有關(guān)的血管疾病的途徑。這個(gè)途徑包括在某一過(guò)程中使用有效劑量的糖蛋白Ibα融合多肽。
本發(fā)明還包括了，用于治療的，包括糖蛋白Ibα變體多肽或糖蛋白Ibα變體融合多肽的化合物。
除非另有說(shuō)明，本文中所有的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)的含義均為本發(fā)明所屬領(lǐng)域的通用含義。盡管多種方法，和近似或等同于本文中的原料，可以用于實(shí)踐或檢驗(yàn)本發(fā)明，下面將會(huì)描述合適的實(shí)施方式。本申請(qǐng)中對(duì)所有出版物、專利申請(qǐng)文件、專利，和其他參考文獻(xiàn)，都作為整體來(lái)參考。除非有沖突，其所用的描述包括定義，有約束力。此外，本申請(qǐng)中所提到的材料、方法和實(shí)施例僅是用來(lái)說(shuō)明，而不用來(lái)限制。
本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，將在以下的詳細(xì)說(shuō)明和權(quán)利要求中，顯現(xiàn)出來(lái)。


圖1表示GPIbα嵌合體對(duì)瑞斯托菌素引起的人體血小板凝集作用的抑制作用。Y軸代表野生型GPIbα(“正?！?和GPIbα-IgWT、GPIbα-290/2V-Ig，GPIbα-290/2V/FFF-Ig的嵌合體的光透過(guò)率。
圖2表示GPIbα嵌合體，在冠狀動(dòng)脈血栓的犬牙Folts’模型下的，抗血栓形成的效能。(Y軸LCX blood)。圖3表示在由PFA-100評(píng)估的冠狀動(dòng)脈血栓犬牙模型下，GPIbα-290/2V-Ig和GPIbα-290/2V/FFF-Ig對(duì)血小板功能的抑制作用。
本發(fā)明詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明，糖蛋白Ibα衍生的多肽具有對(duì)α凝血酶的低粘附性、低聚合性，和/或?qū)Φ鞍踪|(zhì)水解的高抵抗力，可以作為治療制劑用于多種情況，可以抑制由活性血小板細(xì)胞與血管細(xì)胞上的血管性血友病因子的粘附。在一些情況中，本多肽可以用作融合多肽。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)變體具有低凝血酶粘合性，可減少流血。凝血酶和血小板GPIbα受體的粘附是血液凝結(jié)所必須的。凝血酶與治療性的可溶解GPIb的粘附，由于將凝血酶與血小板GPIbα受體隔離開(kāi)來(lái)減少了凝血酶誘導(dǎo)的血小板凝集，增加了有機(jī)體內(nèi)的出血。本發(fā)明的蛋白質(zhì)變體顯示出了對(duì)凝血酶的低親合力，這就使得更多的凝血酶可參與與血小板GPIbα受體間的交互作用，從而加強(qiáng)了血液凝結(jié)。
合適的這樣的多肽包括這樣的氨基酸序列，相對(duì)于下述的，包含65-279個(gè)氨基酸的，代碼1的原生GPIbα蛋白序列和代碼2的氨基酸序列所代表的GPIb2V變體來(lái)說(shuō)，在其間具有1到15個(gè)氨基酸被取代、缺失或插入。在一個(gè)或多個(gè)例子中，這種多肽表現(xiàn)出下面的一種或多種活性(i)相對(duì)于包含代碼為1和2的人體的氨基酸序列的多肽來(lái)說(shuō)，對(duì)α凝血酶具有較低的粘附性；(ii)相對(duì)于包含代碼為1和2的人體的氨基酸序列的多肽來(lái)說(shuō)，具有低聚合性；或(iii)相對(duì)于包含代碼為1和2的人體的氨基酸序列的多肽來(lái)說(shuō)，具有較強(qiáng)的抗蛋白質(zhì)水解的性能。
由于不希望圍于理論，這些性質(zhì)被認(rèn)為是基于，包含GPIb2V變體序列(序列代碼2)的多肽在目標(biāo)區(qū)域被取代的結(jié)果。在65位點(diǎn)(也就是，C65S)的半胱氨酸被取代為絲氨酸殘基，抑制了GPIbα分子的聚合作用，尤其是在重組體產(chǎn)生的過(guò)程中。在276、278和279位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的酪氨酸殘基往往被翻譯并修飾為硫化酪氨酸，這樣產(chǎn)生了與α凝血酶之間的陽(yáng)離子靜電交互作用。通過(guò)將他們轉(zhuǎn)化為苯丙氨酸，有選擇的排除這些酪氨酸殘基(即，Y276F、Y278F和Y279F取代物)降低了與α凝血酶的粘合性(Marchese et al.，J.Biol Chem.2709571-78)，并且仍能夠保持與vWF的期望的粘附性。在這個(gè)位點(diǎn)上的賴氨酸被纈氨酸取代能夠阻止重組體產(chǎn)生過(guò)程中的水解。
原生人體的糖蛋白Ibα鏈的290氨基酸序列片斷如下HPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQGVDVKAMTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVR(SEQ ID NO1)GPIb2V變體的氨基酸序列如下面代碼2所述。這種變體在
發(fā)明者格雷·肖, 黛安妮·S·薩科, 雷文德里·庫(kù)瑪, 徐瑾 申請(qǐng)人:韋思公司