專利名稱：使發(fā)射體的光譜發(fā)射特性產(chǎn)生改變的發(fā)射體結(jié)合肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)射體結(jié)合肽(Emitter-bindende Peptide)，在其抗原結(jié)合口袋與發(fā)射體相互作用時(shí)其使發(fā)射體的光譜發(fā)射特性產(chǎn)生改變。本發(fā)明的發(fā)射體結(jié)合肽特別是抗體或抗體片段的組分。
背景技術(shù)：
為診斷檢測某些物質(zhì)及確定其濃度，現(xiàn)在很多情況下使用的是體外診斷測量方法，其基于對(duì)于要測定的物質(zhì)具有高親和力的生物分子，如例如肽、蛋白質(zhì)、抗體或寡核苷酸。為此，優(yōu)選使用蛋白質(zhì)和肽，特別優(yōu)選使用抗體和抗體片段。
某些體外診斷方法，如例如電化學(xué)發(fā)光是基于針對(duì)要測定物質(zhì)的不同抗體的組合，其中一種抗體用于從所研究的樣品中分離要測定的物質(zhì)，而另一種抗體攜帶診斷用的檢測信號(hào)分子。在電化學(xué)發(fā)光的診斷方法中，標(biāo)記的抗體被光學(xué)檢測Grayeski，M.L.，Anal.Chem.1987，59，1243。
除了電化學(xué)發(fā)光，光誘導(dǎo)的磷光和熒光也可以作為分子的光學(xué)特性用于診斷測量方法。與電化學(xué)發(fā)光和磷光相比，特別是將熒光作為分子的光學(xué)特性在大的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)具有測量信號(hào)的高檢測靈敏性和高線性的優(yōu)點(diǎn)。
為檢測熒光團(tuán)的熒光，發(fā)展了在熒光方法中應(yīng)用不同原理的多種測量方法。已有的測量方法應(yīng)用例如偏振光弱化(熒光偏振＝FP)，測量光子使用壽命(熒光使用壽命測量-FLM)，漂白特性(熒光光漂白恢復(fù)-FRR)和不同熒光團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移(熒光-共振-能量轉(zhuǎn)移-FRET)Williams，A.T.，et al，Methods Immunol.Anal.1993，1，446；Youn，H.J.et al，Anal.Biochem.1995 Oswald，B.et al，Anal.Biochem.2000，280，272；Szollosi，J.et al，Cytometry 1998，34，159。
其它檢測方法基于偏振面或檢測磷光的改變。
上述方法中，使用的抗物質(zhì)抗體實(shí)現(xiàn)了不同的目的。一方面，它們用于從所述樣品中分離要測定的物質(zhì)，而另一方面，它們也可實(shí)現(xiàn)對(duì)應(yīng)用于待檢測物質(zhì)上的不同信號(hào)遞質(zhì)進(jìn)行定位的目的。為檢測例如樣品中的抗體，主要的光學(xué)和放射性測量方法已被建立，而且也已知聲學(xué)(見例如Cooper，M.A.et al，Direct and Sensitive Detection of aHuman Virus By Rupture Event Scanning.Nat Biotechnol.2001 Sep；19(9)833-7)和磁學(xué)測量方法。光學(xué)測量方法獲得了最廣泛的應(yīng)用Nakamura，R.M.，Dito，W.R.，Tucker，E.S.(Eds.).ImmunoassaysClinical Laboratory Techniques for the 1980s.A.R.Liss，NewYork.Edwards，R.(ed.).ImmunoassaysEssential Data，1996，WileyEurope。
在多數(shù)已有的測量方法中，抗物質(zhì)抗體用一種熒光團(tuán)標(biāo)記。這個(gè)標(biāo)記通過特異的和非特異的化學(xué)偶聯(lián)完成。標(biāo)記的抗體過量加入要研究的樣品中。為了結(jié)合所有測定的物質(zhì)分子，這是必需的。另外，這個(gè)方法通?；谝环N抗物質(zhì)抗體用于分離要測定的物質(zhì)而在另一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)檢測要研究物質(zhì)的另一種抗物質(zhì)抗體用信號(hào)分子標(biāo)記。這樣，可以避免由于未結(jié)合的、但是產(chǎn)生信號(hào)的抗體造成的測量結(jié)果的歪曲。然而，由于存在分離步驟，這個(gè)方法需要較復(fù)雜的方法學(xué)和技術(shù)要求以及較高的花費(fèi)。較復(fù)雜的技術(shù)要求阻止了這個(gè)方法用于高速診斷，被證明是特別不利的。
針對(duì)低分子量分子的抗體和肽是已知的。這些也包括針對(duì)染料分子的抗體和肽。Simeonov，A.et al.，Science 2000，290，307-313描述了針對(duì)芪的抗體(“藍(lán)色熒光抗體”)。這些抗體催化特異的光化學(xué)異構(gòu)化過程并導(dǎo)致UV-VIS光譜范圍內(nèi)的紅移吸收和熒光最大值(吸收移動(dòng)最大12nm，熒光移動(dòng)22nm)。然而，對(duì)于在600-1200nm波長范圍內(nèi)保持花青染料的熒光量子產(chǎn)額時(shí)的紅移，Simeonov，A.et al.沒有提供任何有關(guān)的提示。
Watt，R.M.et al.(Immunochemistry 1977，14，533-541)描述了已知的抗熒光素抗體構(gòu)建體的光譜特性。結(jié)合熒光素后，在可見光譜范圍內(nèi)抗體發(fā)生了吸收和熒光最大值的移動(dòng)，但是只有12nm或5nm。另外，熒光量子產(chǎn)額急劇減少(大約90％)。
Rozinov，M.N.et al.(Chem.Biol.1998，5，713-728)描述了從噬菌體文庫中選擇12聚體(12-mer)肽，其結(jié)合染料德克薩斯紅(TexasRed)、羅丹明紅(Rhodamine Red)、Oregon Green 514和熒光素。對(duì)于德克薩斯紅，觀察到了吸收和熒光的紅移，但只有2.8nm或1.4nm。
另外，針對(duì)不同染料的抗體已經(jīng)可以商業(yè)獲得，例如針對(duì)熒光素、四甲基羅丹明、德克薩斯紅、Alexa fluorine 488、BODIPY FL、螢光黃(Lucifer Yellow)和Cascade Blue、Oregon Green的抗體(MolecularProbes Company，Inc.，USA)。然而，這些是用于生物分析目的的多克隆IgG抗體，其具有某種不可控程度的交叉反應(yīng)性且其不是從嚴(yán)格的選擇過程中生產(chǎn)的。
還需要適用于上述測量方法的改良的發(fā)射體結(jié)合肽，特別是特異性的抗體。此時(shí)，特別是那些在600-1200nm波長范圍內(nèi)，在保持花青染料的熒光量子產(chǎn)額時(shí)產(chǎn)生紅移的發(fā)射體結(jié)合肽是有利的。
這個(gè)目標(biāo)本發(fā)明是通過如下實(shí)現(xiàn)的，一種發(fā)射體結(jié)合肽，其特征在于所述肽在其抗原結(jié)合口袋與發(fā)射體相互作用時(shí)改變發(fā)射體的光譜發(fā)射特性，一種生產(chǎn)本發(fā)明的發(fā)射體結(jié)合肽的方法，包括用一種發(fā)射體免疫適當(dāng)?shù)纳矬w，包括一種選自選自聚次甲基染料，如二羰菁、三羰菁、靛三羰菁(indotricarbocyanine)、部花青、苯乙烯基、squarilium和氧雜菁染料及羅丹明染料、吩噁嗪或吩噻嗪染料的染料以及相應(yīng)應(yīng)用本發(fā)明的發(fā)射體結(jié)合肽、核酸、宿主細(xì)胞或抗體或綴合物作為診斷試劑用于體外診斷。在從屬權(quán)利要求中引用了適當(dāng)?shù)膶?shí)施方案。
因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種發(fā)射體結(jié)合肽，其特征在于所述肽在其抗原結(jié)合口袋與發(fā)射體相互作用時(shí)改變發(fā)射體的光譜發(fā)射特性。
優(yōu)選的是本發(fā)明的發(fā)射體結(jié)合肽，其中發(fā)射體包含一種在700至1000nm的光譜范圍內(nèi)具有至少一個(gè)吸收最大值和/或熒光最大值、優(yōu)選在750至900nm的光譜范圍內(nèi)具有至少一個(gè)吸收最大值和熒光最大值的染料。
更優(yōu)選的是本發(fā)明的發(fā)射體結(jié)合肽，其中發(fā)射體部分的發(fā)射特性的改變選自偏振面改變、熒光強(qiáng)度改變、磷光強(qiáng)度改變、熒光使用壽命改變和吸收最大值和/或熒光最大值的紅移。本發(fā)明不限于這些光譜現(xiàn)象，然而術(shù)語“發(fā)生特性改變”在本發(fā)明的范圍內(nèi)包括所有的物理現(xiàn)象或作用，其中發(fā)射體發(fā)生的高能輻射在其特性上改變并且此時(shí)這種改變定量性的依賴于物質(zhì)-發(fā)射體綴合物或物質(zhì)-檢測試劑-發(fā)射體-綴合物與其發(fā)射體結(jié)合配偶體和物質(zhì)的結(jié)合/非結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)例如是肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸以及特別是抗體或抗體片段。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述抗體片段是那些包括至少含有所謂“互補(bǔ)性決定區(qū)”(CDR)的抗原結(jié)合區(qū)域的片段。此時(shí)，抗原結(jié)合區(qū)域最優(yōu)選包括完整的可變鏈VL和VH。
在本發(fā)明發(fā)射體結(jié)合肽的一個(gè)特別優(yōu)選的方面中，抗體或抗體片段選自多克隆或單克隆抗體、人源化抗體、Fab片段，特別是單體Fab片段、scFv片段、合成和重組抗體、scTCR鏈及其混合物。
在合成和重組抗體或抗體片段時(shí)特別優(yōu)選的是來自HuCAL文庫的那些(WO 97/08320；Knappik，(2000)，J.Mol.Biol.296，57-86；Krebs et al.J Immunol Methods.2001 August 1；254(1-2)67-84)。這些可以是天然形式之一的完整的免疫球蛋白或抗體(IgA，IgD，IgE，IgG，IgM)或者是抗體片段，其中抗體片段包括至少VL氨基酸位置4至103和VH的5至109，優(yōu)選VL的氨基酸位置3至107和VH的4至111及特別優(yōu)選完整的可變鏈VL和VH(VL的氨基酸位置1至109和VH的1至113)(編號(hào)根據(jù)WO 97/08320)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體或抗體片段包括至少一個(gè)CDR區(qū)域，其包含在序列SEQ-ID No.1、2、5、6、9、10、13、14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和39中(VLCDR1位置24-34，CDR2位置50-56，CDR3位置89-96；VHCDR1位置26-35，CDR2位置50-65，CDR3位置95-102)，特別是VL CDR3或VH CDR3。此時(shí)特別優(yōu)選的是包括一個(gè)可變鏈VL的抗體，所述可變鏈包含在序列SEQ-ID No.2、6、10、14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和39中或者包含在序列SEQ-ID No.1、5、9和13之一之中(或這種抗體的片段)。最優(yōu)選的是包括包含在以下序列對(duì)中的一個(gè)VH/VL對(duì)的抗體，所述序列對(duì)為SEQ-ID No.1+2；SEQ-ID No.5+6；SEQ-ID No.9+10；SEQ-ID No.13+14；SEQ-ID No.5+17；SEQ-ID No.5+19；SEQ-ID No.5+37；SEQ-ID No.9+21；SEQ-ID No.9+23；SEQ-ID No.9+25；SEQ-ID No.9+27；SEQ-ID No.9+29；SEQ-ID No.9+31；SEQ-ID No.9+33；SEQ-ID No.9+39；SEQ-ID No.13+35(或這種抗體的片段)。此時(shí)特別優(yōu)選的是Fab片段MOR02628、MOR02965、MOR02977、MOR02969、MOR03263、MOR03325、MOR03285、MOR03201、MOR03267、MOR03268、MOR03292、MOR03294、MOR03295、MOR03309、MOR03293和MOR03291。從本發(fā)明所述的抗體開始，獲得示出本發(fā)明特性的新的修飾的抗體的多種可能性對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知特別是重鏈和輕鏈的CDR區(qū)域負(fù)責(zé)親和力以及選擇性和特異性。此時(shí)，特別是VH的CDR3區(qū)域和VL的CDR3區(qū)域起作用，然后是VH的CDR2和VL的CDR1，而大多數(shù)情況下VH的CDR1和VL的CDR2起次要作用。因此，為最佳化抗體的親和力以及選擇性和特異性，特別提示了CDR區(qū)域(也參見例如Schieret al.，J.Mol.Biol.(1996)263，551)。此時(shí)，例如一或多個(gè)CDR區(qū)域可以被特異性地交換為例如其它已經(jīng)示出本發(fā)明特性的其它抗體的CDR區(qū)域或者被相應(yīng)的CDR序列的文庫交換(為此見實(shí)施例1的優(yōu)化)，所述文庫產(chǎn)生了完全隨機(jī)的變化或含有或多或少對(duì)特異氨基酸或其組合的強(qiáng)偏愛(趨勢(shì)(Tendenz))。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員也能夠?qū)⑼暾目勺冩溡韵嗤绞浇粨Q為其它明確的抗體的相應(yīng)鏈或這種鏈的多樣性文庫。另外，通過誘變特異性交換CDR中的一或多個(gè)氨基酸基的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這種改變氨基酸殘基的鑒定在此例如是基于對(duì)比不同抗體的序列和鑒定保守的或至少在相應(yīng)位置高度同源的殘基來進(jìn)行的。在改變CDR時(shí)，此時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知所謂的“規(guī)范結(jié)構(gòu)(kanonischen Strukturen)”(Al-Lazikani et al.，J.Mol.Biol.(2000)295，979)；Knappik et al.J.Mol.Biol.(2000)296，57)，其影響CDR區(qū)域的三維排列，因此可以考慮設(shè)計(jì)的最佳策略。
而且，改變抗體或抗體片段的骨架區(qū)以獲得更穩(wěn)定或更可表達(dá)的分子的技術(shù)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(WO 92/01787；Nieba et al.(1997)Protein Eng.10，435；Ewert et al.(2003)Biochemistry 42，1517)。
除了用于修飾抗體或抗體片段的已經(jīng)描述的策略，根據(jù)本發(fā)明抗體的知識(shí)和本申請(qǐng)描述的測量方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員也能夠?qū)Π被嵝蛄谢蛩隹贵w的組合物進(jìn)行額外的改變并且通過使用所述分析和測量方法確定是否產(chǎn)生了其特性符合本發(fā)明抗體的特性的修飾抗體。
本發(fā)明的另一方面涉及編碼本發(fā)明的抗體或抗體片段之一的核酸分子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，此時(shí)這些是編碼可變鏈VL之一或可變鏈VH的核酸分子，所述可變鏈VL之一包含在序列SEQ-IDNo.2、6、10、14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和39中，所述可變鏈VH包含在序列SEQ-ID No.1、5、9和13中。此時(shí)特別優(yōu)選的是SEQ-ID No.3、4、7、8、11、12、15、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40的序列。
本發(fā)明的發(fā)射體結(jié)合肽最理想展示小于50nm及優(yōu)選小于10nm的結(jié)合親和力。
另一個(gè)方面是本發(fā)明的發(fā)射體結(jié)合肽，其中所述發(fā)射體包含一種在700-1000nm的光譜范圍內(nèi)具有至少一個(gè)吸收最大值和/或熒光最大值、優(yōu)選在750-900nm的光譜范圍內(nèi)具有至少一個(gè)吸收最大值和熒光最大值的染料。選擇染料的紅移，以便在與檢測發(fā)射體的試劑相互作用后所述吸收最大值和/或熒光最大值移向較高的波長，移動(dòng)值大于15nm，優(yōu)選大于25nm及最優(yōu)選大約30nm。此時(shí)，移動(dòng)是染料的特性，沒有必要以這種方式對(duì)移動(dòng)加以考慮。通常，移動(dòng)被測量為染料發(fā)射值的改變，即在某個(gè)單波長。為此，提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于測量的適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)試劑。這也應(yīng)用于測量偏振面的改變、熒光強(qiáng)度的改變、磷光強(qiáng)度的改變、熒光使用壽命的改變和吸收最大值和/或熒光最大值的紅移。
對(duì)于本發(fā)明的發(fā)射體結(jié)合肽，優(yōu)選使用的發(fā)射體包含選自聚次甲基染料，如二羰菁、三羰菁、靛三羰菁、部花青、苯乙烯基、squarilium和氧雜菁染料及羅丹明染料、吩噁嗪或吩噻嗪染料的一種染料。通常，本發(fā)明的物質(zhì)-發(fā)射體-綴合物的發(fā)射體可以包含通式(I)的一種花青染料 其中D表示基團(tuán)(II)或(III)
其中標(biāo)有星號(hào)的位置表示與基團(tuán)B連接的位點(diǎn)以及可以表示基團(tuán)(IV)、(V)、(VI)、(VII)或(VIII) 其中R1和R2，分別獨(dú)立地代表C1-C4-磺烷基鏈，飽和或不飽和的、支鏈或直鏈C1-C50-烷基鏈，其任選被0至15個(gè)氧原子和/或被0至3個(gè)羰基間隔和/或被0至5個(gè)羥基取代；R3和R4，分別獨(dú)立地代表基團(tuán)-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1或-E1，其中E1和E2分別獨(dú)立地代表氫原子，C1-C4-磺烷基鏈，飽和或不飽和的、支鏈或直鏈C1-C50-烷基鏈，其任選被0至15個(gè)氧原子和/或被0至3個(gè)羰基間隔和/或被0至5個(gè)羥基取代，R5代表氫原子、甲基、乙基或丙基或氟、氯、溴或碘原子，b表示數(shù)字2或3，及X和Y獨(dú)立地表示O、S、＝C(CH3)2或-(CH＝CH)-，以及這些化合物的鹽和溶劑合物。
可能令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在抗體與在近紅外光譜范圍內(nèi)(＞750nm)具有吸收和熒光的花青染料高度親和性結(jié)合后，吸收最大值和熒光最大值向較高波長移動(dòng)了大約30nm(紅移)。因此應(yīng)用這個(gè)原理，可能例如在一個(gè)大的濃度范圍內(nèi)直接檢測并且從全血樣品中光譜分離信號(hào)，其中關(guān)于要被測定的物質(zhì)的濃度的信號(hào)是線性的。
發(fā)射體可以和物質(zhì)形成綴合物。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，具有通式S-E的是物質(zhì)-發(fā)射體綴合物，其中S代表要被檢測的物質(zhì)及E代表發(fā)射體，其包含一個(gè)與檢測發(fā)射體的試劑相互作用時(shí)出現(xiàn)發(fā)射特性改變的部分。作為本發(fā)明的綴合物的組分，i.a.，在600-1200nm的光譜范圍內(nèi)具有至少一個(gè)吸收最大值和熒光最大值的染料是適當(dāng)?shù)?。此時(shí)，優(yōu)選在700-1000nm的光譜范圍內(nèi)具有至少一個(gè)吸收最大值和熒光最大值的染料。符合這些條件的染料例如是如下的那些聚次甲基染料，如二羰菁、三羰菁、部花青和氧雜菁染料、羅丹明染料、吩噁嗪或吩噻嗪染料、四吡咯染料(tetrapyrrolfarbstoffe)，尤其是苯卟啉、氯、細(xì)菌氯(bacteriochlorine)、脫鎂葉綠甲酯一酸、細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯一酸(bacteriopheophorbides)、紅紫素(purpurines)和酞菁。
優(yōu)選的染料是在750和900nm之間具有吸收最大值的花青染料，且靛三羰菁具有特別的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明綴合物的結(jié)構(gòu)組分也是通過本發(fā)明的方法確定濃度的物質(zhì)。
這些選自例如抗原，如蛋白質(zhì)、肽、核酸、寡核苷酸、血液組分、血清組分、脂質(zhì)、藥物制劑和低分子量的化合物，特別是糖、染料或其它分子量低于500道爾頓的化合物。
優(yōu)選的染料是在750和900nm之間具有吸收最大值的花青染料，且靛三羰菁具有特別的優(yōu)勢(shì)。
染料含有結(jié)構(gòu)元件，通過其與物質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)。這些是例如具有羧基、氨基和羥基的接頭。
在光學(xué)測量時(shí)，這可以以不同方式進(jìn)行，且取決于發(fā)射體(例如熒光團(tuán))光譜特性的特征性改變的類型。通常優(yōu)選的是檢測吸收波長和發(fā)射波長的移動(dòng)或在大部分檢測與抗體結(jié)合的熒光團(tuán)的部分的波長下測量吸收和/或熒光強(qiáng)度。根據(jù)抗體結(jié)合熒光團(tuán)的光譜特性的改變，其它特性，如例如光子使用壽命、偏振和漂白特性也可以用于光學(xué)測量。
熒光團(tuán)在近紅外光的光譜范圍內(nèi)的特別益處在于由血液組分產(chǎn)生的少的重疊(geringen berdeckung)。由此，可以進(jìn)行深穿透(Tiefeneindringung ermglicht)，而不會(huì)使待檢測的信號(hào)太強(qiáng)烈的改變。
而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知在結(jié)合熒光團(tuán)后能夠改變其UV范圍內(nèi)光譜特性的針對(duì)熒光團(tuán)的抗體。通過將熒光團(tuán)結(jié)合在抗體的抗原結(jié)合口袋中，可以主要改變熒光強(qiáng)度、吸收最大值、發(fā)射最大值和光子使用壽命[Simeonov，A.，et al.，Science(2000)307-313]。這些已知的抗體針對(duì)發(fā)射體(熒光團(tuán))，然而其在光的可見光和UV范圍內(nèi)具有吸收和熒光發(fā)射。
本發(fā)明的另一方面涉及將本發(fā)明的發(fā)射體結(jié)合肽用于體外診斷的應(yīng)用。
為此，本發(fā)明的發(fā)射體結(jié)合肽也可以存在于一個(gè)診斷試劑盒中，任選和其它佐劑一起。另外，所有本發(fā)明的這些試劑盒都可以含有特別的指導(dǎo)和文件(例如標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量指導(dǎo)等)。
本發(fā)明現(xiàn)在基于實(shí)施例和所附附圖和序列更詳細(xì)地被描述，但是本發(fā)明不限與此。這里

圖1CysDisplay-Screening載體pMORPH23(載體圖和序列)，圖2表達(dá)載體pMORPHX9MS(載體圖和序列)，及圖3實(shí)施例2的染料在PBS中在存在和不存在抗體MOR02965時(shí)的吸收光譜(左)和熒光光譜。
實(shí)施例
實(shí)施例1選擇、生產(chǎn)和定性發(fā)射體結(jié)合抗體選擇針對(duì)花青染料Fuji 6-4(ZK203468)[三鈉-3，3-二甲基-2-{4-甲基-7-[3，3-二甲基-5-磺?；?1-(2-磺酰乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]七-2，4，6-三烯-1-基亞基}-1-(2-磺酰乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸鹽，內(nèi)鹽]([Trisodium-3，3-dimethyl-2-{4-methyl-7-[3，3-dimethyl-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoethyl)-3H-indolium-2-yl]hepta-2，4，6-trien-1-ylidene}-1-(2-sulfonatoethyl)-2，3-dihydro-1H-indole-5-sulfonate，Inner Salt])的HuCAL GOLD Fab抗體片段HuCAL GOLD抗體文庫抗體文庫HuCAL GOLDHuCAL GOLD是完全合成的、Fab抗體片段形式的模塊化人抗體文庫。HuCAL GOLD基于HuCAL-scFv1文庫描述的HuCAL-共有序列-抗體基因(WO 97/08320；Knappik，(2000)，J.Mol.Biol.296，57-86；Krebs et al.J Immunol Methods.2001 Aug 1；254(1-2)67-84).在HuCAL GOLD中，所有相應(yīng)于人抗體中這些區(qū)域組成的6個(gè)CDR區(qū)域通過使用所謂的三核苷酸誘變(trinukleotidmutagenese)被多樣化(Virneks et al.(1994)NucleicAcids Res.1994Dec 25；22(25)5600-7)，而在較早的HuCAL文庫中(HuCAL-scFv1和HuCAL-Fab1)，只有VH和VL中相應(yīng)于天然組成的CDR3-區(qū)域被多樣化(見Knappik et al.，2000)。而且，稱為CysDisplay一種修飾的篩選方法(WO 01/05950)也發(fā)現(xiàn)于HuCALGOLD中。用于篩選方法的載體pMORPH23見于圖1。
Vλ的1位and 2位.原始的HuCAL主基因用其可信的(authentischen)N-末端構(gòu)建VLλ1QS(CAGAGC)，VLλ2QS(CAGAGC)和VLλ3SY(AGCTAT).這些序列見于WO 97/08320。生產(chǎn)HuCAL-scFv1-文庫時(shí)，這兩個(gè)氨基酸殘基被改變?yōu)椤錎I″以促進(jìn)克隆(EcoRI位點(diǎn))。這些殘基在生產(chǎn)HuCAL-Fab1和HuCAL GOLD時(shí)被保留了。因此，所有HuCAL文庫都含有在5’-端具有EcoRV切割位點(diǎn)GATATC(DI)的VLλ基因。所有HuCAL kappa基因(主基因和文庫中的所有基因)在任何情況下在5’-端都含有DI，因?yàn)檫@些代表了可信的N-末端(WO 97/08320)。
VH的1位.原始的HuCAL-主基因用其可信的N-末端生產(chǎn)VH1A、VH1B、VH2、VH4和VH6具有Q(＝CAG)作為第一個(gè)氨基酸基，VH3以及VH5具有E(＝GAA)。相應(yīng)的序列見于WO 97/08320。在克隆HuCAL-Fab1以及HuCAL GOLD文庫時(shí)，氨基酸Q(CAG)被摻入所有VH基因的這個(gè)1位中。
噬菌粒的生產(chǎn)大量的噬菌粒通過輔助噬菌體感染來自HuCAL GOLD抗體文庫或來自成熟文庫的大腸桿菌(E.coli)TOP10F′細(xì)胞生產(chǎn)和濃縮。最后，HuCAL GOLD或成熟文庫(TOP10F′細(xì)胞中)在具有34μg/ml的氯霉素/10μg/ml的四環(huán)素/1％葡萄糖的2×YT培養(yǎng)基中在37℃培養(yǎng)至OD600為0.5。然后，用VCSM13輔助噬菌體在37℃進(jìn)行感染。沉淀感染的細(xì)胞并重懸于2×YT/34μg/ml氯霉素/10μg/ml四環(huán)素/50μg/ml卡那霉素/0.25mmol IPTG中并且22℃培養(yǎng)過夜。用PEG從上清中沉淀噬菌體2x并通過離心收集(Ausubel(1998)Current Protocols inMolecular Biology.John Wiley Sons，Inc.，New York，USA)。將噬菌體重懸于PBS/20％甘油并儲(chǔ)存于-80℃。
每個(gè)選擇循環(huán)中噬菌粒的擴(kuò)增如下進(jìn)行對(duì)數(shù)期大腸桿菌TG1細(xì)胞用選擇的噬菌體感染并鋪板于具有1％葡萄糖/34μg/ml的氯霉素的LB-瓊脂平板上。溫育過夜后，刮下細(xì)菌菌落，重新培養(yǎng)并用VCSM13輔助噬菌體感染。
初步選擇針對(duì)染料Fuji 6-4(ZK203468)的抗體HuCAL GOLD抗體文庫純化濃縮的噬菌粒用于標(biāo)準(zhǔn)選擇方法。作為抗原，BSA-或運(yùn)鐵蛋白-偶聯(lián)的ZK203468交替使用。將抗原加入PBS中并以50μg/ml的濃度加入MaxisorpTM微量滴定板F96(Nunc)中。Maxisorp平板在4℃溫育過夜(″包被″)。在Maxisorp平板用含有5％奶粉的PBS封閉后，將大約2E+13個(gè)HuCAL GOLD噬菌體加入到抗原荷載的(antigen-beladenen)、封閉的孔中并且在室溫溫育過夜或2小時(shí)。幾個(gè)洗滌步驟之后(洗滌步驟隨著漸進(jìn)的選擇循環(huán)而變得更嚴(yán)格)，結(jié)合的噬菌體用20mmol DTT或100μmol未綴合的ZK203468洗脫?？傊M(jìn)行三次連續(xù)的選擇循環(huán)，其中在選擇循環(huán)之間進(jìn)行噬菌體擴(kuò)增，如上述。
亞克隆選擇的Fab片段用于表達(dá)包含3個(gè)循環(huán)的抗體選擇之后，分離的HuCAL克隆的Fab-編碼插入物亞克隆至表達(dá)載體pMORPHX9_MS(見圖2)以促進(jìn)Fab片段隨后的表達(dá)。最后，選擇的HuCAL Fab克隆的純化的質(zhì)粒-DNA用限制性酶XbaI和EcoRI消化。純化Fab-編碼插入物并連接到相應(yīng)消化的載體pMORPHX9_MS中。這個(gè)克隆步驟產(chǎn)生了Fab-表達(dá)載體pMORPHX9_Fab_MS。這個(gè)載體表達(dá)的Fab片段攜帶2個(gè)C-末端標(biāo)記(Myc標(biāo)記和Strep標(biāo)記II)用于純化和檢測。
篩選和定性ZK203468-結(jié)合Fab片段選擇后分離了幾千個(gè)克隆并亞克隆及通過ELISA在384孔板中對(duì)于淘選中使用的抗原ZK203468-BSA和-運(yùn)鐵蛋白的特異性檢測進(jìn)行了測試。在此鑒定的克隆在抑制性-ELISA(inhibitions-ELISA)中研究了其對(duì)未綴合染料的有效結(jié)合。
這產(chǎn)生了腸胃外Fab片段MOR02628(蛋白質(zhì)序列SEQ-ID NO1(VH-CH)和SEQ-ID NO2(VL-CL)；DNA序列SEQ-ID NO3(VH-CH)和SEQ-ID NO4(VL-CL))、MOR02965(蛋白質(zhì)序列SEQ-ID NO5(VH-CH)和SEQ-ID NO6(VL-CL)；DNA序列SEQ-ID NO7(VH-CH)和SEQ-ID NO8(VL-CL))和MOR02977(蛋白質(zhì)序列SEQ-IDNO9(VH-CH)和SEQ-ID NO10(VL-CL)；DNA序列SEQ-ID NO11(VH-CH)和SEQ-ID NO12(VL-CL))和MOR02969(蛋白質(zhì)序列SEQ-ID NO13(VH-CH)和SEQ-ID NO14(VL-CL)；DNA序列SEQ-ID NO15(VH-CH)和SEQ-ID NO16(VL-CL))，其有效地結(jié)合未綴合的染料ZK203468。
實(shí)施例2通過交換LCDR3區(qū)域最佳化腸胃外抗體片段克隆LCDR3文庫4個(gè)腸胃外(parenteralen)克隆MOR02628、MOR02965、MOR02969和MOR02977的質(zhì)粒-DNA用限制性酶EcoRI和XbaI消化，并將產(chǎn)生的來自表達(dá)載體pMORPHX9_MS的完整的Fab-插入物亞克隆至相應(yīng)酶切的展示載體(display vektor)pMORPH23中。這個(gè)步驟對(duì)于制備用于在噬菌體表面呈遞Fab片段的基因III(GenIII)是必需的。在另一步驟中，4個(gè)胃腸外克隆(現(xiàn)pMORPH23中)用BpiI和SphI消化。在此，LCDR3區(qū)和Clambda恒定區(qū)從載體骨架中去除。分離純化相應(yīng)的載體-DNA片段。同時(shí)，從HuCAL-Fab 2文庫分離互補(bǔ)BpiI/SphI片段，其含有多樣化的LCDR3區(qū)域(具有大約3E+8的可變性)和Clambda恒定區(qū)(＝插入物-DNA)。幾μg的載體-DNA和相容的插入物-DNA以1∶2的摩爾比用T4-DNA-連接酶連接并在純化后轉(zhuǎn)化進(jìn)電感受態(tài)(elektrokompetente)TOP10F′細(xì)胞中。此時(shí)，每個(gè)胃腸外抗體獲得了5E+8至大約1E+9個(gè)克隆大小的文庫。
組合克隆MOR02628、MOR02969和MOR02977基于的文庫(″Pool″)。個(gè)別處理MOR02965文庫(″Lead″)。如所述，通過這些TOP10F′-成熟文庫用VCSM13輔助噬菌體感染生產(chǎn)相應(yīng)的噬菌粒。
MaxisorpTM微量滴定板的抗體選擇“l(fā)ead”和“pool”文庫的純化和濃縮的噬菌粒用于在嚴(yán)格條件下的成熟選擇方法(長洗滌時(shí)間、被純化的、胃腸外的Fab蛋白置換)。作為抗原，BSA-或運(yùn)鐵蛋白-偶聯(lián)的ZK203468交替使用。這些抗原加入PBS中并以100-250ng/ml的低濃度加入MaxisorpTM微量滴定板F96(Nunc)中。Maxisorp平板在4℃溫育過夜(″包被″)。在Maxisorp平板用含有5％奶粉的PBS封閉后，將大約2E+13個(gè)HuCAL GOLD噬菌體加入到抗原荷載的、封閉的孔中并且在室溫溫育過夜或2小時(shí)。為提高嚴(yán)格性，在溫育過程中加入額外的100nm或500nm的、胃腸外克隆的純化Fab片段。幾次充分(ausgedehnten)洗滌步驟之后，結(jié)合的噬菌體用20mmol的DTT洗脫?？傊?，進(jìn)行兩個(gè)連續(xù)的選擇循環(huán)，其中在選擇循環(huán)之間進(jìn)行噬菌體擴(kuò)增，如上述。
在Neutavidin Strip上的抗體選擇“l(fā)ead”和“pool”文庫的純化的和濃縮的噬菌粒另外用于嚴(yán)格條件下的第二種成熟選擇方法(長洗滌時(shí)間，被純化的、胃腸外的Fab蛋白或游離染料置換)。作為抗原，使用生物素綴合的ZK203468(或者具有烷基或醚接頭)。這些抗原加入PBS中并以60或12ng/ml的低濃度和大約2E+11個(gè)噬菌體混合?？乖?噬菌體溶液在室溫溫育過夜或2小時(shí)。為提高嚴(yán)格性，在溫育過程中加入額外的0.5μg/ml胃腸外克隆的純化Fab片段或40nm/ml的ZK203468。然后將含有抗原-結(jié)合噬菌體的溶液加入封閉的neutravidin strip上并溫育30分鐘以使得通過抗原的生物素基結(jié)合可能固相。幾次洗滌步驟后，結(jié)合的噬菌體用20mmol的DTT洗脫?？傊M(jìn)行兩個(gè)連續(xù)的選擇循環(huán)，其中在選擇循環(huán)之間進(jìn)行噬菌體擴(kuò)增，如上述。
亞克隆選擇的Fab片段用于表達(dá)選擇(“成熟”)之后，分離的HuCAL克隆的Fab-編碼插入物亞克隆進(jìn)表達(dá)載體pMORPHX9_MS以促進(jìn)隨后的表達(dá)。最后，選擇的HuCAL Fab克隆的純化治療-DNA用限制性酶XbaI和EcoRI消化。純化Fab-編碼插入物并連接入被相應(yīng)消化的載體pMORPHX9_MS中。這個(gè)克隆步驟產(chǎn)生了Fab-表達(dá)載體pMORPHX9_Fab_MS。這個(gè)載體表達(dá)的Fab片段攜帶2個(gè)C-末端標(biāo)記(Myc標(biāo)記和Strep標(biāo)記II)用于純化和檢測。
鑒定最佳化的抗體片段為鑒定對(duì)染料Fuji 6-4具有改良的親和力的抗體，從選擇中分離克隆并在384-孔板中通過ELISA篩選。最后，將ZK203468-BSA加入ELISA-微量滴定板中。要被檢測的Fab片段作為未純化的細(xì)菌裂解物加入。為研究除了與抗原綴合物的結(jié)合之外的與游離染料的結(jié)合，將具有細(xì)菌裂解物和額外的游離染料的相同的篩選平板以兩種不同濃度進(jìn)行混合。由于未綴合的染料導(dǎo)致的Fab結(jié)合固相的抑制表明抗體不特異性檢測染料綴合物，而是游離染料。在此，在溶液抑制測試和ELISA形式以及Luminex裝置中精確定性了分離的克隆，而且測定了其對(duì)Fuji 6-4的親和力。
如下克隆相比于胃腸外抗體示出了改良的親和力
總之，胃腸外MOR02977的親和力相比于MOR03267可能提高了140倍。所有其它鑒定的克隆相比于分別的胃腸外Fab示出了提高2-70倍。
實(shí)施例3光物理學(xué)定性染料-抗體復(fù)合物和測定光譜移動(dòng)/熒光量子產(chǎn)額檢測了基于與靛三羰菁染料三鈉-3，3-二甲基-2-{4-甲基-7-[3，3-二甲基-5-磺?；?1-(2-磺酰乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]七-2，4，6-三烯-1-基亞基}-1-(2-磺酰乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸鹽，內(nèi)鹽結(jié)合的抗體的染料-抗體復(fù)合物(見實(shí)施例1和2)。制備于PBS中濃度為1μmol/l的上述染料和2.4μmol/l的各自抗體的溶液并在室溫溫育2小時(shí)。用分光測光儀(Perkin-Elmer，Lambda2)測定吸收最大值。用SPEX fluorolog(通過燈和探測器對(duì)依賴波長的靈敏性進(jìn)行校準(zhǔn)，wellenlngenabhngigeEmpfindlichkeit von Lampe und Detektor kalibriert)測定相對(duì)于靛青綠(DMSO中Q＝0.13，J Chem Eng Data 1977，22，379，Bioconjugate Chem2001，12，44)的熒光最大值和熒光量子產(chǎn)額。根據(jù)吸收和熒光最大值，計(jì)算在沒有于PBS中的抗體(1μmol/l)時(shí)相對(duì)于上述染料溶液的光譜移動(dòng)(吸收最大值754nm，熒光最大值783nm，熒光量子產(chǎn)額10％)。
結(jié)果總結(jié)在下表中
實(shí)施例4構(gòu)建用于表達(dá)HuCAL免疫球蛋白的表達(dá)載體克隆重鏈去除載體pCDNA3.1+(Invitrogen)的″多克隆位點(diǎn)″(NheI/ApaI)，并且與HuCAL設(shè)計(jì)的限制性切割位點(diǎn)相容的platzhalter用于連接前導(dǎo)序列(NheI/EcoRI)、Fab片段的VH結(jié)構(gòu)域(MunI/)和免疫球蛋白恒定區(qū)(BlpI/ApaI)。前導(dǎo)序列(EMBL 83133)具有一個(gè)Kozak序列(Kozak，1987)。人IgG(PIR J00228)、IgG4(EMBL K01316)和血清-IgA1(EMBL J00220)的恒定區(qū)被分為具有長度為例如70個(gè)堿基的重疊寡核苷酸。將″沉默突變″導(dǎo)入以去除與HuCAL設(shè)計(jì)不相容的限制性切割位點(diǎn)。寡核苷酸通過″重疊延伸-PCR″連接。
在亞克隆Fab片段到IgG分子的過程中，F(xiàn)ab片段的重鏈通過MfeI/BlpI切割并連接到用EcoRI/BlpI開口的載體中。EcoRI(g/aattc)和MfeI(c/aattg)具有兩個(gè)相容的粘性末端(aatt)，而且Fab片段中的原始MfeI切割位點(diǎn)的序列在連接到IgG表達(dá)載體中時(shí)從c/aattg改變?yōu)間/aattg，由此，一方面MfeI切割位點(diǎn)和EcoRI切割位點(diǎn)都被破壞，而另一方面，發(fā)生了氨基酸從Q(密碼子caa)到E(密碼子gaa)的改變。
克隆輕鏈.通過兩個(gè)不同的platzhalter取代pCDNA3.1/Zeo+(Invitrogen)的″多克隆位點(diǎn)″。k-platzhalter含有用于摻入k-前導(dǎo)序列(NheI/EcoRV)、HuCAL Fab Vk結(jié)構(gòu)域(EcoRV/BsiWI)和k-鏈的恒定區(qū)(BsiWI/ApaI)的限制性切割位點(diǎn)。1-platzhalter中相應(yīng)的切割位點(diǎn)是NheI/EcoRV(1-前導(dǎo)序列)、EcoRV/HpaI(V1-結(jié)構(gòu)域)和HpaI/ApaI(恒定區(qū)1-鏈)。k-前導(dǎo)序列(EMBL Z00022)以及1-前導(dǎo)序列(EMBL J00241)都由Kozak序列提供。人k-(EMBL L00241)和1-鏈(EMBL M18645)的恒定區(qū)都通過″重疊延伸(overlap extension)-PCR″組裝，如上述。
產(chǎn)生IgG-表達(dá)CHO細(xì)胞.CHO-K1細(xì)胞用重和輕IgG鏈表達(dá)載體的等摩爾混合物共轉(zhuǎn)染。用600mg/ml的G418和300mg/ml的Zeocin(Invitrogen)選擇雙重抗性轉(zhuǎn)染子。通過“捕獲ELISA(capture-ELISA)”檢測各個(gè)克隆上清中的IgG表達(dá)。陽性克隆在具有10％″ultra-low IgG-FCS″(Life Technologies)的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在上清的pH為8.0之后及無菌過濾之后，對(duì)溶液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的A蛋白-柱層析(Standard-Protein A-Sulenchromatographie)(Poros 20A，PEBiosystems)。
序列表<110>舍林股份公司莫弗西斯股份公司<120>使發(fā)射體的光譜發(fā)射特性產(chǎn)生改變的發(fā)射體結(jié)合肽<130>
<150>DE 103 31 054.1<151>2003-07-09<150>US 60/487,234<151>2003-07-16<160>40<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>252<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Fab fragment MOR02628 VH-CH<400>1Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn20 25 30Ser Ala Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu35 40 45Trp Leu Gly Arg Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala50 55 60Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn65 70 75 80Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val85 90 95Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Ser Phe Tyr Gln Lys Leu Phe Phe Ile Ala100 105 110Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr130 135 140Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro145 150 155 160Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val165 170 175His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser180 185 190Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile195 200 205Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val210 215 220Glu Pro Lys Ser Glu Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu225 230 235 240Asn Gly Ala Pro Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys245 250<210>2<211>216<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Fab fragment MOR02628 VL-CL<400>2Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser pro Gly Gln1 5 10 15Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Gly Gly Ala Tyr20 25 30His Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu35 40 45Met Ile Tyr Gly Val Ile Tyr Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Phe Arg85 90 95Lys Arg Leu Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu115 120 125Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe130 135 140Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val145 150 155 160Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys165 170 175Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser180 185 190His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu195 200 205Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Ala210 215<210>3<211>762<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>DNA coding for Fab fragment MOR02628 VH-CH<400>3caggtgcaat tgcaacagtc tggtccgggc ctggtgaaac cgagccaaac cctgagcctg 60acctgtgcga tttccggaga tagcgtgagc tctaattctg ctgcttggtc ttggattcgc120cagtctcctg ggcgtggcct cgagtggctg ggccgtatct attatcgtag caagtggtat180aacgattatg cggtgagcgt gaaaagccgg attaccatca acccggatac ttcgaaaaac240cagtttagcc tgcaactgaa cagcgtgacc ccggaagata cggccgtgta ttattgcgcg300cgtacttctt tttatcagaa gctttttttt attgcttttg atcattgggg ccaaggcacc360
ctggtgacgg ttagctcagc gtcgaccaaa ggtccaagcg tgtttccgct ggctccgagc420agcaaaagca ccagcggcgg cacggctgcc ctgggctgcc tggttaaaga ttatttcccg480gaaccagtca ccgtgagctg gaacagcggg gcgctgacca gcggcgtgca tacctttccg540gcggtgctgc aaagcagcgg cctgtatagc ctgagcagcg ttgtgaccgt gccgagcagc600agcttaggca ctcagaccta tatttgcaac gtgaaccata aaccgagcaa caccaaagtg660gataaaaaag tggaaccgaa aagcgaattc gagcagaagc tgatctctga ggaggatctg720aacggcgcgc cgtggagcca cccgcagttt gaaaaatgat aa 762<210>4<211>654<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>DNA coding for Fab fragment MOR02628 VL-CL<400>4gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60tcgtgtacgg gtactagcag cgatggtggt gcttatcatt atgtgtcttg gtaccagcag120catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatggtgtta tttatcgtcc ctcaggcgtg180agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg240caagcggaag acgaagcgga ttattattgc gctgcttggg attttcgtaa gcgtcttaat300gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccagc cgaaagccgc accgagtgtg360acgctgtttc cgccgagcag cgaagaattg caggcgaaca aagcgaccct ggtgtgcctg420attagcgact tttatccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc480aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc540agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc600acgcatgagg ggagcaccgt ggaaaaaacc gttgcgccga ctgaggcctg ataa 654<210>5<211>245<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Fab fragment MOR02965 VH-CH<400>5Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15
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<223>Fab fragment MOR03201 VL-CL<400>21Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln1 5 10 15Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Asn20 25 30Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu35 40 45Met Ile Tyr Gly Gly Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Thr Ser Tyr85 90 95
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<223>DNA coding for Fab fragment MOR03201 VL-CL<400>22gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt tctaataatt atgtgtcttg gtaccagcag120catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatggtggtt ctaatcgtcc ctcaggcgtg180agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg240caagcggaag acgaagcgga ttattattgc tcttcttgga cttcttattt tcatattcgt300gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccagc cgaaagccgc accgagtgtg360acgctgtttc cgccgagcag cgaagaattg caggcgaaca aagcgaccct ggtgtgcctg420attagcgact tttatccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc480aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc540
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<223>Fab fragment MOR03267 VL-CL<400>23Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln1 5 10 15Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Asn20 25 30Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu35 40 45Met Ile Tyr Gly Gly Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Asn85 90 95Phe Lys Asn Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu115 120 125Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe130 135 140Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val145 150 155 160Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys165 170 175Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
180 185 190His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu195 200 205Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Ala210 215<210>24<211>654<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>DNA coding for Fab fragment MOR03267 VL-CL<400>24gatatcgcac tgacccagec agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt tctaataatt atgtgtcttg gtaccagcag120catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatggtggtt ctaatcgtcc ctcaggcgtg180agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg240caagcggaag acgaagcgga ttattattgc caggcttggg attctaattt taagaatcgt300gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccagc cgaaagccgc accgagtgtg360acgctgtttc cgccgagcag cgaagaattg caggcgaaca aagcgaccct ggtgtgcctg420attagcgact tttatccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc480aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc540agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc600acgcatgagg ggagcaccgt ggaaaaaacc gttgcgccga ctgaggcctg ataa 654<210>25<211>216<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Fab fragment MOR03268 VL-CL<400>25Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln1 5 10 15Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Asn20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu35 40 45Met Ile Tyr Gly Gly Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Arg Ser Trp Asp Ser Asn85 90 95Leu Ser Tyr Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu115 120 125Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp phe130 135 140Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val145 150 155 160Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys165 170 175Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser180 185 190His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu195 200 205Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Ala210 215<210>26<211>654<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>DNA coding for Fab fragment MOR03268 VL-CL<400>26gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60
tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt tctaataatt atgtgtcttg gtaccagcag120catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatggtggtt ctaatcgtcc ctcaggcgtg180agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg240caagcggaag acgaagcgga ttattattgc cgttcttggg attctaatct ttcttattct300gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccagc cgaaagccgc accgagtgtg360acgctgtttc cgccgagcag cgaagaattg caggcgaaca aagcgaccct ggtgtgcctg420attagcgact tttatccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc480aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc540agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc600acgcatgagg ggagcaccgt ggaaaaaacc gttgcgccga ctgaggcctg ataa 654<210>27<211>216<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Fab fragment MOR03292 VL-CL<400>27Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln1 5 10 15Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Asn20 25 30Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu35 40 45Met Ile Tyr Gly Gly Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Ala Pro Leu85 90 95Phe Lys Met Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
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<223>DNA coding for Fab fragment MOR03292 VL-CL<400>28gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt tctaataatt atgtgtcttg gtaccagcag120catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatggtggtt ctaatcgtcc ctcaggcgtg180agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg240caagcggaag acgaagcgga ttattattgc cagtcttggg ctcctctttt taagatgcgt300gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccagc cgaaagccgc accgagtgtg360acgctgtttc cgccgagcag cgaagaattg caggcgaaca aagcgaccct ggtgtgcctg420attagcgact tttatccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc480aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc540agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc600acgcatgagg ggagcaccgt ggaaaaaacc gttgcgccga ctgaggcctg ataa 654<210>29
<211>216<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Fab fragment MOR03294 VL-CL<400>29Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln1 5 10 15Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Asn20 25 30Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu35 40 45Met Ile Tyr Gly Gly Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Thr Ser Ser85 90 95Phe Ser Ser Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu115 120 125Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe130 135 140Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val145 150 155 160Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys165 170 175Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser180 185 190His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu195 200 205
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<223>DNA coding for Fab fragment MOR03294 VL-CL<400>30gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt tctaataatt atgtgtcttg gtaccagcag120catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatggtggtt ctaatcgtcc ctcaggcgtg180agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg240caagcggaag acgaagcgga ttattattgc cagacttgga cttcttcttt ttcttctcgt300gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccagc cgaaagccgc accgagtgtg360acgctgtttc cgccgagcag cgaagaattg caggcgaaca aagcgaccct ggtgtgcctg420attagcgact tttatccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc480aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc540agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc600acgcatgagg ggagcaccgt ggaaaaaacc gttgcgccga ctgaggcctg ataa 654<210>31<211>216<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Fab fragment MOR03295 VL-CL<400>31Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln1 5 10 15Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Asn20 25 30Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu35 40 45Met Ile Tyr Gly Gly Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
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<223>DNA coding for Fab fragment MOR03295 VL-CL<400>32gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt tctaataatt atgtgtcttg gtaccagcag120catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatggtggtt ctaatcgtcc ctcaggcgtg180agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg240
caagcggaag acgaagcgga ttattattgc cagtcttggg attctgctct ttctaatcgt300gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccagc cgaaagccgc accgagtgtg360acgctgtttc cgccgagcag cgaagaattg caggcgaaca aagcgaccct ggtgtgcctg420attagcgact tttatccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc480aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc540agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc600acgcatgagg ggagcaccgt ggaaaaaacc gttgcgccga ctgaggcctg ataa 654<210>33<211>216<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Fab fragment MOR03309 VL-CL<400>33Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln1 5 10 15Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Asn20 25 30Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu35 40 45Met Ile Tyr Gly Gly Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Asp His Gly85 90 95Phe Thr His Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu115 120 125Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe130 135 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val145 150 155 160Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys165 170 175Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser180 185 190His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu195 200 205Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Ala210 215<210>34<211>654<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>DNA coding for Fab fragment MOR03309 VL-CL<400>34gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt tctaataatt atgtgtcttg gtaccagcag120catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatggtggtt ctaatcgtcc ctcaggcgtg180agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg240caagcggaag acgaagcgga ttattattgc cagacttggg atcatggttt tactcatcgt300gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccagc cgaaagccgc accgagtgtg360acgctgtttc cgccgagcag cgaagaattg caggcgaaca aagcgaccct ggtgtgcctg420attagcgact tttatccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc480aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc540agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc600acgcatgagg ggagcaccgt ggaaaaaacc gttgcgccga ctgaggcctg ataa 654<210>35<211>213<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Fab fragment MOR03291 VL-CL
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<223>DNA coding for Fab fragment MOR03291 VL-CL<400>36gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60tcgtgtagcg gcgattctat tcgttctaag tatgttcatt ggtaccagca gaaacccggg120caggcgccag ttcttgtgat ttatcgtgat aataatcgtc cctcaggcat cccggaacgc180tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa240gacgaagcgg attattattg cgcttcttat gattataagt ctaagaatat tgtgtttggc300ggcggcacga agttaaccgt tcttggccag ccgaaagccg caccgagtgt gacgctgttt360ccgccgagca gcgaagaatt gcaggcgaac aaagcgaccc tggtgtgcct gattagcgac420ttttatccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga480gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctatctg540agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgag600gggagcaccg tggaaaaaac cgttgcgccg actgaggcct gataa645<210>37<211>214<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Fab fragment MOR03285 VL-CL<400>37Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln1 5 10 15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Tyr20 25 30Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu35 40 45Ile Tyr Gly Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln65 70 75 80
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<223>DNA coding for Fab fragment MOR03285 VL-CL<400>38gatatcgtgc tgacccagcc gccttcagtg agtggcgcac caggtcagcg tgtgaccatc 60tcgtgtagcg gcagcagcag caacattggt tcttattatg tgtattggta ccagcagttg120cccgggacgg cgccgaaact tctgatttat ggtaattctc agcgtccctc aggcgtgccg180gatcgtttta gcggatccaa aagcggcacc agcgcgagcc ttgcgattac gggcctgcaa240agcgaagacg aagcggatta ttattgccag gcttggactg gttcttatgc tactgtgttt300ggcggcggca cgaagttaac cgttcttggc cagccgaaag ccgcaccgag tgtgacgctg360tttccgccga gcagcgaaga attgcaggcg aacaaagcga ccctggtgtg cctgattagc420
gacttttatc cgggagccgt gacagtggcc tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg480ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctat540ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacagaagct acagctgcca ggtcacgcat600gaggggagca ccgtggaaaa aaccgttgcg ccgactgagg cctgataa 648<210>39<211>216<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Fab fragment MOR03293 VL-CL<400>39Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln1 5 10 15Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Asn20 25 30Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu35 40 45Met Ile Tyr Gly Gly Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Thr Thr Ile85 90 95Tyr Arg Asn Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu115 120 125Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe130 135 140Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val145 150 155 160Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
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<223>DNA coding for Fab fragment MOR03293 VL-CL<400>40gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt tctaataatt atgtgtcttg gtaccagcag120catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatggtggtt ctaatcgtcc ctcaggcgtg180agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg240caagcggaag acgaagcgga ttattattgc tcttcttgga ctactattta tcgtaatcgt300gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccagc cgaaagccgc accgagtgtg360acgctgtttc cgccgagcag cgaagaattg caggcgaaca aagcgaccct ggtgtgcctg420attagcgact tttatccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc480aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc540agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc600acgcatgagg ggagcaccgt ggaaaaaacc gttgcgccga ctgaggcctg ataa 65權(quán)利要求
1.發(fā)射體結(jié)合肽，其特征在于所述肽在其抗原結(jié)合口袋和發(fā)射體相互作用時(shí)改變所述發(fā)射體的光譜發(fā)射特性。
2.權(quán)利要求1的發(fā)射體結(jié)合肽，其中所述發(fā)射體包含一種染料，該染料在700至1000nm的光譜范圍內(nèi)具有至少一個(gè)吸收最大值和/或熒光最大值，優(yōu)選在750至900nm的光譜范圍內(nèi)具有至少一個(gè)吸收最大值和/或熒光最大值。
3.權(quán)利要求1或2的發(fā)射體結(jié)合肽，其選自抗體或抗體片段，如Fab抗體、scFv片段、scTCR鏈、單鏈抗體或其混合物。
4.權(quán)利要求3的發(fā)射體結(jié)合肽，其包括一種VH/VL對(duì)，其包含在如下序列對(duì)之一之中SEQ ID No1+2、SEQ ID No5+6、SEQID No9+10、SEQ ID No13+14、SEQ ID No5+17、SEQ ID No5+19、SEQ ID No5+37、SEQ ID No9+21、SEQ ID No9+23、SEQ ID No9+25、SEQ ID No9+27、SEQ ID No9+29、SEQ IDNo9+31、SEQ ID No9+33、SEQ ID No9+39和SEQ ID No13+35。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的發(fā)射體結(jié)合肽，其對(duì)所述發(fā)射體的結(jié)合親和力小于50nm并優(yōu)選小于10nm。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的發(fā)射體結(jié)合肽，其中所述發(fā)射體的發(fā)射特性的改變選自偏振面改變、熒光強(qiáng)度改變、磷光改變，特別是磷光強(qiáng)度的改變、熒光使用壽命改變和吸收最大值和/或熒光最大值的紅移。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的發(fā)射體結(jié)合肽，其中在與檢測發(fā)射體的試劑相互作用之后吸收和/或熒光最大值向較高波長移動(dòng)值大于15nm，優(yōu)選大于25nm，及最優(yōu)選大約30nm。
8.權(quán)利要求2-7任一項(xiàng)的發(fā)射體結(jié)合肽，其中染料選自聚次甲基染料，如二羰菁、三羰菁、靛三羰菁、部花青、苯乙烯基、squarilium和氧雜菁染料及羅丹明染料、吩噁嗪或吩噻嗪染料。
9.權(quán)利要求2-8任一項(xiàng)的發(fā)射體結(jié)合肽，其中染料包括通式(I)的花青染料 其中D代表基團(tuán)(II)或(III) 其中星號(hào)標(biāo)明的位置是和基團(tuán)B連接的位點(diǎn)，其表示基團(tuán)(IV)、(V)、(VI)、(VII)或(VIII) 其中R1和R2，各自獨(dú)立地代表C1-C4磺烷基鏈，飽和或不飽和的、支鏈或直鏈C1-C50烷基鏈，其任選被0至15個(gè)氧原子和/或被0至3個(gè)羰基間隔和/或被0至5個(gè)羥基取代；R3和R4，各自獨(dú)立地代表基團(tuán)-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1或-E1，其中E1和E2分別獨(dú)立地代表氫原子，C1-C4磺烷基鏈，飽和或不飽和的、支鏈或直鏈C1-C50烷基鏈，其任選被0至15個(gè)氧原子和/或被0至3個(gè)羰基間隔和/或被0至5個(gè)羥基取代，R5代表氫原子或氟、氯、溴或碘原子、Me、Et或Prop，b表示數(shù)字2或3，及X和Y獨(dú)立地表示O、S、＝C(CH3)2或-(CH＝CH)-，以及這些化合物的鹽和溶劑合物。
10.多核苷酸，特別是DNA、RNA或PNA，其包括編碼權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的發(fā)射體結(jié)合肽或其功能性變體的序列。
11.DNA-或RNA-載體分子，其含有至少一種或多種權(quán)利要求10的多核苷酸且其可以在細(xì)胞中表達(dá)。
12.含有權(quán)利要求10的多核苷酸或權(quán)利要求11的載體分子的宿主細(xì)胞。
13.包含權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的至少一種發(fā)射體結(jié)合肽的抗體，特別是多克隆或單克隆抗體、人抗體或人源化抗體、合成或重組抗體。
14.生產(chǎn)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的發(fā)射體結(jié)合肽的方法，包括用一種發(fā)射體免疫適當(dāng)?shù)纳矬w，所述發(fā)射體包含一種染料，其選自聚次甲基染料，如二羰菁、三羰菁、靛三羰菁、部花青、苯乙烯基、squarilium和氧雜菁染料及羅丹明染料、吩噁嗪或吩噻嗪染料。
15.生產(chǎn)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的發(fā)射體結(jié)合肽的方法，包括所述肽的重組和/或合成生產(chǎn)。
16.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的發(fā)射體結(jié)合肽、權(quán)利要求10或11的核酸、權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞或權(quán)利要求13的抗體作為用于體外診斷的診斷試劑的應(yīng)用。
17.用于體外診斷的診斷試劑盒，包括選自權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的發(fā)射體結(jié)合肽、權(quán)利要求10或11的核酸、權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞或權(quán)利要求13的抗體的至少一種試劑，任選在共同的或另一個(gè)容器中還具有其它佐劑和/或指導(dǎo)。
18.體外定量測定在樣品中含有的一種物質(zhì)的方法，包括如下步驟a)將權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的發(fā)射體結(jié)合肽與一種發(fā)射體接觸，從而所述綴合物的發(fā)射體與發(fā)射體結(jié)合肽的相互作用在發(fā)射體的光譜發(fā)射特性中產(chǎn)生了一個(gè)改變，及b)測量發(fā)射體的光譜發(fā)射特性的改變。
19.權(quán)利要求18的直接體外定量測定樣品中含有的物質(zhì)或樣品中存在的抗原檢測試劑的方法，其還額外包括如下步驟，d)通過測量發(fā)射體的發(fā)射特性的改變定量樣品中含有的物質(zhì)。
20.權(quán)利要求18或19的方法，其中發(fā)射體部分的光譜發(fā)射特性的改變選自偏振面改變、磷光改變，特別是磷光強(qiáng)度的改變、熒光使用壽命改變和吸收最大值和/或熒光最大值的紅移。
21.權(quán)利要求18-20任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)射體結(jié)合肽、抗體片段，如Fab片段、scFv片段、scTCR鏈、單鏈抗體或其混合物與樣品接觸。
22.權(quán)利要求18-21任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)射體結(jié)合肽包含權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的序列。
23.權(quán)利要求19-22任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)射體結(jié)合肽對(duì)發(fā)射體具有小于50nm及優(yōu)選小于10nm的結(jié)合親和力。
全文摘要
本發(fā)明涉及發(fā)射體結(jié)合肽，在其抗原結(jié)合口袋與發(fā)射體相互作用時(shí)其能夠改變發(fā)射體的光譜發(fā)射特性。本發(fā)明的發(fā)射體結(jié)合肽特別是抗體和抗體片段的組分。
文檔編號(hào)C12N15/13GK1820027SQ200480019621
公開日2006年8月16日 申請(qǐng)日期2004年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月9日
發(fā)明者米夏爾多·席爾納, 凱·利哈, 安德烈亞斯·門拉德, 斯特凡尼·烏爾林格, 科尼莉亞·哈內(nèi)爾, 博多·布羅克斯 申請(qǐng)人:舍林股份公司, 莫弗西斯股份公司