專利名稱：丙型肝炎病毒ns5b聚合酶抑制劑結(jié)合袋的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及丙型肝炎病毒NS5B聚合酶(HCV NS5B)，尤其是，新型HCVNS5B抑制劑結(jié)合袋(binding pocket)。提供的HCV NS5B的晶體結(jié)構(gòu)包括定義該新型抑制劑結(jié)合袋的坐標和用于抑制劑篩選的三維模型。同時，提供了利用該晶體結(jié)構(gòu)和抑制劑結(jié)合信息設(shè)計和篩選NS5B抑制劑的方法。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)是輸血后和群體獲得性的全球性非甲非乙肝炎的主要致病因子。已證實全球超過2億人感染有這種病毒。很高比例的攜帶者成為慢性感染者并且大多數(shù)發(fā)展為慢性肝病，即所謂的慢性丙型肝炎。這些群體隨后有患嚴重肝病的危險，例如肝硬化、肝細胞癌和晚期肝病而導致死亡。
HCV形成病毒持久性和導致慢性肝病高發(fā)病率的機制還沒有完全得到闡明。還不知道HCV是如何與宿主免疫系統(tǒng)相互作用并逃避該系統(tǒng)的。另外，細胞免疫應答和體液免疫應答在防止HCV感染和疾病中的作用也還沒有得以確立。
HCV是黃病毒科的有包膜、正鏈RNA病毒。單鏈HCV RNA基因組是正極性的，包含一個約9600個核苷酸長的開放讀框(ORF)，編碼約3010個氨基酸的線性多蛋白。在被感染的細胞中，該多蛋白被細胞蛋白酶和病毒蛋白酶在多個位點切割，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白(C、E1、E2和E2-p7)包括構(gòu)成病毒顆粒的多肽。非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)編碼催化和調(diào)節(jié)HCV RNA基因組復制的酶或輔助因子。宿主細胞蛋白酶催化結(jié)構(gòu)蛋白的加工。成熟非結(jié)構(gòu)蛋白是由兩種被病毒編碼的蛋白酶催化產(chǎn)生的。第一種是NS2/3鋅依賴性金屬蛋白酶，該酶自動催化NS3蛋白從多蛋白中釋放。釋放的NS3蛋白包括N-末端絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，并催化從多蛋白中的剩余裂解。釋放的NS4A蛋白至少具有兩種作用。第一個作用是與NS3蛋白形成穩(wěn)定的復合物，并輔助NS3/NS4復合物在膜中定位；第二個作用是作為NS3蛋白酶的輔因子。這種膜結(jié)合的復合物隨后催化多蛋白上剩余位點的切割，從而影響NS4B、NS5A和NS5B的釋放。NS3蛋白的C-末端片段也具有核苷三磷酸酶和RNA解旋酶活性。蛋白NS4B的功能還不清楚。NS5A是高度磷酸化蛋白，很可能負責各種HCV基因表型干擾素抗性。NS5B是一種參與HCV復制的RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)。
HCV RNA基因組開放閱讀框5’端側(cè)翼是約340個核苷酸的非翻譯區(qū)(NTR)，它的作用是作為內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(IRES)，3’端側(cè)翼是約230個核苷酸的NTR。5’和3’NTR對于RNA基因組復制均非常重要。基因組中甚至存在不均衡的基因組序列變異，5’NTR和部分3’NTR都是最高度保守的部分。
對經(jīng)過克隆并鑒定的HCV基因組部分和完整序列進行分析，確定預期抗病毒治療的適宜靶標。下面這4種病毒酶活性提供了可能的靶標(1)NS2/3蛋白酶；(2)NS3/4A蛋白酶復合物，(3)NS3解旋酶和(4)NS5B RNA-依賴性RNA聚合酶(NS5B RdRp)。另外還將NS5B RNA依賴性RNA聚合酶結(jié)晶，以揭示具有所附活性位點的其它核酸聚合酶的結(jié)構(gòu)(Ago等1999；Bressanelli等1999；Lesburg等1999)。
復制所必需的病毒特異性功能是藥物開發(fā)中最具吸引力的靶。哺乳動物中不存在RNA依賴性RNA聚合酶，以及該酶是病毒復制所必需的事實，暗示HCV NS5B聚合酶是抗HCV療法的理想靶標。最近還證實破壞NS5B活性的突變可以消除黑猩猩(chimp)模型中的HCV RNA感染性(Kolykhalov，A.A.等，2000)。病毒RNA復制的起始步驟是NS5B(RdRp)識別RNA模板3’端，它可以直接或者間接在細胞蛋白的幫助下來實現(xiàn)(Lai，1998；Strauss等，1999)。然后，HCV聚合酶繼續(xù)延伸該模板，形成互補的RNA產(chǎn)物。
許多小組已經(jīng)描述了HCV NS5B聚合酶的晶體結(jié)構(gòu)(Ago等1999見上；Bressanelli等1999見上；Lesburg等1999見上)。它像一個扁平球，維數(shù)約為70_×60_×40_。多肽鏈圍繞活性位點在分子中心形成空穴，使其外形與其它U形聚合酶有很大不同。由于NS5B被細分為手指(finger)、手掌(palm)和拇指(thumb)域，其中手掌域(第188位至第225位和第287位至第370位殘基)是保守的，所以NS5B域的排列與其它聚合酶是相一致的。相比于其它聚合酶，拇指和手指域的廣泛接觸形成了球形HCV聚合酶。這些接觸部分地借助手指延伸到手掌域的環(huán)作為媒介。NS5B晶體結(jié)構(gòu)知識在以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計中是有用的，事實上，最近已經(jīng)對NS5B聚合酶/抑制劑復合物的結(jié)構(gòu)進行了報道(Wang等2003；Love等，2003；EP 1 256 628)。已發(fā)現(xiàn)，非核苷類似物抑制劑以楔形方式與位于聚合酶拇指域C末端區(qū)域附近的疏水結(jié)合袋結(jié)合。這項研究中，該酶在酶/抑制劑復合物中只能發(fā)生微小的構(gòu)象變化。在NS5B上至少具有兩個NTP結(jié)合位點，一個在活性位點手掌內(nèi)，第二個是拇指上的潛在變構(gòu)位點(O′Farrell等2003；Bressanelli等2002)。
有意思地是，Labonté等2002年報道NS5B N-末端手指環(huán)(finger loop)內(nèi)的Leu30突變會影響NS5B聚合酶活性，據(jù)推測是Leu30突變體結(jié)構(gòu)的局部改變導致該活性降低。但是，作者并未對結(jié)合袋的存在發(fā)表任何看法，該結(jié)合袋在其自然狀態(tài)下被手指環(huán)掩蓋，由于Leu30殘基突變或取代使該結(jié)合袋暴露。發(fā)現(xiàn)這種奇特的結(jié)合袋是本發(fā)明的一個主題。
因此，深入認識酶結(jié)構(gòu)對HCV復制的重要性，尤其是NS5B聚合酶，能促進開發(fā)有效治療HCV感染的方法。深入認識酶結(jié)構(gòu)，特別是當它與特異性抑制劑復合時的結(jié)構(gòu)，將會產(chǎn)生一種鑒定該酶中結(jié)合位點的方法，并獲得酶/抑制劑復合物以及該酶中敏感殘基的構(gòu)象，這些知識對藥物設(shè)計和優(yōu)化方法來講都是至關(guān)重要的。
發(fā)明概述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，HCV聚合酶，當與某些抑制劑復合時，會采用取代手指環(huán)區(qū)而暴露結(jié)合袋的構(gòu)象，其中所述手指環(huán)區(qū)由氨基酸殘基18至35定義，結(jié)合袋通常由氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義。這與現(xiàn)有技術(shù)發(fā)現(xiàn)的NS5B晶體結(jié)構(gòu)相反，現(xiàn)有技術(shù)認為在自然狀態(tài)下，由氨基酸殘基18至35定義的手指環(huán)會遮蓋此結(jié)合袋。這種新的“暴露型”結(jié)合袋為尋找能結(jié)合HCV NS5B，并調(diào)節(jié)或優(yōu)選抑制HCV NS5B聚合酶活性的其它化學實體定義了一種新的靶標。
因此，在一個方面，本發(fā)明提供了一種分離和純化的多肽，它包含由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義的，或者由其功能等同類似物定義的HCV NS5B抑制劑結(jié)合袋，其中所述結(jié)合袋由于由至少氨基酸殘基18至35定義的手指環(huán)被取代而暴被露出來，并且該所述結(jié)合袋保持其天然功能構(gòu)型。
在本發(fā)明的第二個方面，提供了一種分離和純化的HCV NS5B多肽類似物，它包含由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義的，或者由其功能等同類似物定義的HCV NS5B結(jié)合袋，其中所述結(jié)合袋保持其天然功能構(gòu)型，并且所述結(jié)合袋是可暴露的。
在進一步的方面，提供了一種分離和純化的HCV NS5B多肽，其由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義的，或者由其功能等同類似物定義的HCV NS5B結(jié)合袋組成，其中所述結(jié)合袋保持其天然功能構(gòu)型。
在另一方面，提供了一種HCV NS5B多肽變體，其在由HCV NS5B的氨基酸殘基18至35定義的手指環(huán)內(nèi)包含至少一個氨基酸突變，其中所述突變引起所述手指環(huán)發(fā)生取代，而使基本由天然HCV NS5B的氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義的，或者由其功能等同類似物定義的結(jié)合袋暴露，其中所述結(jié)合袋保持其天然功能構(gòu)型。
本發(fā)明的另一個方面提供了一種HCV NS5B多肽，或其功能等同類似物，其特征是取代了氨基酸殘基18至35。
本發(fā)明的另一個方面提供了一種HCV NS5B多肽，或其功能等同類似物，其中刪除了至少氨基酸殘基18至35。
在發(fā)明的另一個方面，提供了HCV NS5B晶體結(jié)構(gòu)，包含由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503的結(jié)構(gòu)坐標(structural coordinate)定義的，或由其功能等同類似物的結(jié)構(gòu)坐標定義的結(jié)合袋，其中取代了由至少氨基酸18至35的結(jié)構(gòu)坐標定義的天然手指環(huán)鏈，使所述結(jié)合袋暴露。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種復合物，包含如上定義的HCVNS5B多肽、多肽變體或多肽類似物以及一種化合物，其中該化合物與NS5B多肽、多肽變體或多肽類似物內(nèi)的結(jié)合袋結(jié)合，所述結(jié)合袋由天然HCVNS5B的氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義，或由其功能等同類似物定義。
在本發(fā)明的進一方面，提供了一種制備結(jié)晶的HCV NS5B復合物的方法，所述復合物包含如上定義的NS5B多肽、多肽變體或多肽類似物和與所述多肽、多肽變體或多肽類似物結(jié)合的化合物，其中所述化合物與由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義的，或由其功能等同類似物定義的NS5B結(jié)合袋結(jié)合。該方法包含下述步驟a)在結(jié)晶緩沖液中保溫純化的HCV NS5B多肽，獲得結(jié)晶的NS5B多肽；b)將所述化合物溶解；和c)在浸泡緩沖液中，將結(jié)晶的NS5B多肽與溶解的化合物一起浸泡適當?shù)慕輹r間，獲得HCV NS5B復合物。
在制備如上定義的結(jié)晶HCV NS5B復合物的可選方法中，是將化合物加到含有結(jié)晶的HCV NS5B的結(jié)晶緩沖液中。
在制備如上定義的結(jié)晶HCV NS5B復合物的另一個可選方法中，包含下述步驟a)將純化的HCV NS5B與溶解的化合物混合，形成NS5B復合物；b)在結(jié)晶緩沖液中讓復合物結(jié)晶。
在本發(fā)明的另一方面，提供了復合物的X-射線晶體結(jié)構(gòu)坐標，所述復合物包含如上定義的HCV NS5B多肽、多肽變體或多肽類似物和化合物，其中所述化合物與NS5B多肽、多肽變體或多肽類似物內(nèi)的結(jié)合袋結(jié)合，所述結(jié)合袋由天然HCV NS5B的氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義，或由其功能等同類似物定義。
在本發(fā)明的另一方面，提供了計算機可讀性存儲介質(zhì)，在該介質(zhì)上存儲有復合物的晶體結(jié)構(gòu)模型，所述復合物包含如上定義的HCV NS5B多肽、多肽變體或多肽類似物和化合物，其中所述化合物與由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503的結(jié)構(gòu)坐標定義的，或由其功能等同類似物的結(jié)構(gòu)坐標定義的結(jié)合袋結(jié)合。
在本發(fā)明的進一方面，提供了一種鑒定結(jié)合HCV NS5B的化合物的方法，包括下述步驟a)將三維分子模型算法應用于由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503的結(jié)構(gòu)坐標定義的，或由其功能等同類似物的結(jié)構(gòu)坐標定義的HCV NS5B結(jié)合袋的結(jié)構(gòu)坐標，確定HCV NS5B結(jié)合袋的空間坐標；和b)在HCV NS5B結(jié)合袋空間坐標的背景下對存儲的化合物的空間坐標進行電子篩選，測定該化合物是否結(jié)合在HCV NS5B結(jié)合袋內(nèi)。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種鑒定潛在HCV抑制劑的虛擬篩選方法，包括下述步驟a)構(gòu)建HCV NS5B結(jié)合袋的計算機模型，其中所述HCV NS5B結(jié)合袋由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503的結(jié)構(gòu)坐標定義，或由其功能等同類似物的結(jié)構(gòu)坐標定義；b)利用計算機工具，在待評化合物和NS5B結(jié)合袋的計算機模型之間進行吻合度(fitting)程序操作，從而提供結(jié)合袋中化合物的能量最小化構(gòu)型；和c)對該吻合度操作的結(jié)果進行評價，量化化合物和結(jié)合袋間的結(jié)合，其中與結(jié)合袋結(jié)合并獲得低能量、穩(wěn)定復合物的化合物就是潛在的NS5B抑制劑。
還在本發(fā)明的另一方面，提供了一種篩選候選HCV NS5B抑制劑化合物的方法，包括下述步驟a)在適宜結(jié)合的條件下，保溫如上定義的HCV NS5B多肽、多肽變體或多肽類似物和候選抑制劑化合物；和b)測定候選抑制劑化合物是否與多肽結(jié)合，其中與多肽結(jié)合的化合物是潛在的HCV NS5B抑制劑。
在發(fā)明的另一方面，提供了一種設(shè)計能結(jié)合如上定義的NS5B多肽、多肽變體或多肽類似物的化合物的方法，包括下述步驟評估互補性，即化合物和NS5B多肽中結(jié)合袋間的“吻合度”，其中所述結(jié)合袋由天然HCVNS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義，或由其功能等同類似物定義。
在發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生抑制HCV NS5B的RNA復制活性的藥物的方法，包括鑒定或設(shè)計與NS5B結(jié)合袋吻合的化合物，所述NS5B結(jié)合袋由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義，或由其功能等同類似物定義，其中由于取代了由至少氨基酸殘基18至35定義的手指環(huán)鏈而使所述結(jié)合袋暴露。
下面，將會參考所附圖片對本發(fā)明的方面和實施例進行更詳細的描述，其中


圖1A描述沒有化合物時的NS5B apo酶結(jié)構(gòu)；圖1B描述與NS5B結(jié)合的化合物A，其中取代了氨基酸18至35，因此該結(jié)構(gòu)中看不到它們；圖1C描述結(jié)合到代表本發(fā)明結(jié)合袋的溶劑可及表面內(nèi)的化合物A；圖2描述結(jié)合到代表本發(fā)明結(jié)合袋的溶劑可及表面內(nèi)的化合物B；圖3描述結(jié)合到代表本發(fā)明結(jié)合袋的溶劑可及表面內(nèi)的化合物C的NMR衍生的結(jié)合構(gòu)象對接模型(docked model)；圖4顯示與化合物A復合的SEQ ID No.1的HCV NS5B的原子結(jié)構(gòu)坐標；圖5顯示與化合物B復合的SEQ ID No.1的HCV NS5B的原子結(jié)構(gòu)坐標圖6顯示與化合物C復合的SEQ ID No.1的HCV NS5B的原子結(jié)構(gòu)坐標發(fā)明詳述定義除非另外定義，本文所用的科學和技術(shù)術(shù)語以及名稱具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)理解相同的意思。通常，細胞培養(yǎng)、感染步驟、分子生物學方法等都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些常規(guī)技術(shù)可參閱參考手冊，如Sambrook等(1989)和Ausubel等(1994)。
術(shù)語“HCV NS5B”指參與HCV復制的丙型肝炎病毒(HCV)RNA-依賴性RNA聚合酶(RdRp)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，術(shù)語HCV包含含有許多不同菌株、分離體和亞型的病毒家族。另外，雖然此家族各成員的NS5B聚合酶功能等同且結(jié)構(gòu)高度同源，它們在氨基酸序列上還是會有些區(qū)別。HCVNS5B聚合酶(來自HCV 1b基因型的NS5B)的氨基酸序列示于SEQ ID No.1中。其它分離的HCV NS5B聚合酶序列可獲自現(xiàn)有的公共序列數(shù)據(jù)庫。
本文所用術(shù)語“結(jié)合袋”指分子或分子復合物的區(qū)域，由于其構(gòu)型所致，其有利于與相同分子或分子復合物實體或部分，或者不同分子、分子復合物、化學化合物或其它化合物實體或部分結(jié)合；或者被相同分子或分子復合物實體或部分，或者不同分子、分子復合物、化學化合物或其它化合物實體或部分占據(jù)。根據(jù)本發(fā)明，本文所定義的NS5B結(jié)合袋會由于取代了殘基18至35的手指環(huán)域而暴露出來，從而使能影響NS5B活性，如抑制NS5B活性的化合物結(jié)合NS5B結(jié)合袋。通常，結(jié)合袋或其至少一部分包含一空穴，此空穴是可與相同或不同分子實體相互作用的部位。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，結(jié)合袋內(nèi)的空穴特性會由于分子和分子的不同而有不同。
用于本發(fā)明多肽的術(shù)語“分離和純化的”是指基本與其它成分分離的多肽。
用于本發(fā)明結(jié)合袋的氨基酸序列的術(shù)語“天然HCV NS5B”是指給定HCV NS5B中的結(jié)合袋的天然氨基酸序列。
用于本發(fā)明結(jié)合袋的術(shù)語“天然功能構(gòu)型”是指氨基酸天然重排，包括空間重排，形成可與某些化合物/實體結(jié)合或被某些化合物/實體占據(jù)的結(jié)合袋。
本文所用術(shù)語“復合物”是指兩個或多個實體相混合，至少其中一個實體是蛋白或酶。具體地，本發(fā)明復合物是NS5B蛋白和另一化合物形成的復合物，其中NS5B蛋白包括可含氨基酸取代、截斷或插入的NS5B蛋白類似物。化合物或化學實體與蛋白混合或“復合”是指化合物或化學實體和蛋白結(jié)合(association/binding)的特性。復合物組分間的結(jié)合是各組分之間的接近狀態(tài)，這種結(jié)合可以是天然非共價鍵的，其中該接近能量上受氫鍵或范德華力或靜電相互作用支持，或者可以是共價鍵結(jié)合。
用于分子化合物的術(shù)語“類似物”表示自天然或自然氨基酸序列修飾過的氨基酸序列，并且該氨基酸序列保持著天然或自然氨基酸序列的生物活性(功能或結(jié)構(gòu)的生物活性)。這種類似物可以獲自相同或不同種類，并且可以是天然類似物，或者是合成制備的。所述類似物包括取代、刪除或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列，只要其保持了蛋白的生物活性。術(shù)語“保守性類似物”表示含有保持生物活性的氨基酸修飾的類似物。含氨基酸取代的類似物包括具有強或弱相似性的取代(參見，如Dayhoff，M.O.，(1978)，蛋白序列和結(jié)構(gòu)圖譜，5，suppl.3，National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.)，根據(jù)下述“氨基酸相似性表”所定義
用于本發(fā)明結(jié)合袋多肽的術(shù)語“功能等同類似物”是指取代、刪除或插入了一個或多個氨基酸的結(jié)合袋。取代可以是根據(jù)如上所述進行的，例如用合適的保守性氨基酸或保守性合成氨基酸類似物來進行取代。本質(zhì)上，術(shù)語“類似物”與前述定義相一致。短語“功能等同”說明類似物保持著天然分子的生物活性。
用于氨基酸或氨基酸殘基的術(shù)語“側(cè)鏈”意思是α-氨基酸的α碳原子上所附的基團。例如，例如，R-基側(cè)鏈對于甘氨酸是氫，對于丙氨酸是甲基，對于纈氨酸是異丙基。關(guān)于α-氨基酸的特定的R-基團或側(cè)鏈參考A.L.Lehninger’s text on Biochemistry(參見第四章)。
術(shù)語“截短”是指任何弄短或縮短的分子片段，且其為了本發(fā)明的目的保持其生物活性。截短可以指縮短天然蛋白分子或其類似物。
術(shù)語“均方根差(root mean square deviateon)”或“rms偏差”或“rmsd”是指平均值方差的算術(shù)平均值的平方根。在原子目標的上下文中，數(shù)字單位為埃(_)。它表示與趨勢(trend)或目標(object)的差異。
本文使用下述縮寫DLB差示譜線增寬(differential line broadening)；DMSO二甲亞砜；DTT二硫蘇糖醇；EDTA乙二胺四乙酸；FID自由感應衰變(free induction decay)；IPTG異丙基-β-D-硫代半乳糖苷；HEPES4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸；MES2-(N-嗎啉)乙磺酸；MPD2-甲基-2，4戊二醇)；NMR核磁共振；NOESY核Overhauser效應譜；PEG聚乙二醇；PEG5k mme單甲醚聚乙二醇5000；Tris三(羥甲基)氨基甲烷；TSP3-三甲代甲硅烷基四氘丙酸鈉。
優(yōu)選實施方式HCV NS5B聚合酶第一方面，本發(fā)明提供了包括功能HCV NS5B結(jié)合袋的分離和純化的多肽，所述結(jié)合袋由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選氨基酸殘基37和496中的一個或多個)定義，其中由于取代了由至少氨基酸殘基18至35定義的手指環(huán)鏈，而使所述結(jié)合袋暴露，并且所述結(jié)合袋保持其天然功能構(gòu)型。
在本發(fā)明的此方面，還提供了由暴露的HCV NS5B結(jié)合袋組成的分離和純化的HCV NS5B多肽，所述結(jié)合袋由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選氨基酸殘基37和496中的一個或多個)定義，并且所述結(jié)合袋保持其天然功能構(gòu)型。
在本發(fā)明的此方面，對本發(fā)明的多肽來說，引入呈現(xiàn)其天然構(gòu)型(即在天然HCV NS5B聚合酶中所呈現(xiàn)的天然構(gòu)型)的結(jié)合袋是很重要的，從而可以正確地模擬結(jié)合袋，成為有用的HCV NS5B抑制劑篩選工具。
另外，為了使多肽能有效地起到HCV NS5B抑制劑篩選工具的作用，使抑制劑結(jié)合袋暴露或者抑制劑結(jié)合袋至少是可暴露的也是很重要的，這樣才能讓抑制劑接近結(jié)合袋。在HCV NS5B中，發(fā)明人確定當NS5B手指環(huán)鏈的至少氨基酸殘基18至35被取代時，本文所定義的結(jié)合袋就會暴露。因此，在此方面，提供了包含有暴露構(gòu)型的結(jié)合袋的多肽。
在本文中，由于一種HCV基因型或菌株與另一種HCV基因型或菌株的預期序列相似性，本發(fā)明的結(jié)合袋參考HCV NS5B蛋白中的氨基酸位置進行定義。取代的或可取代的手指環(huán)區(qū)也參考氨基酸位置進行定義，即氨基酸18至35。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解因為氨基酸插入或刪除，所有HCV NS5B中的氨基酸編號可能會與本文所示的HCV NS5B氨基酸編號略有不同。本文所示的氨基酸編號是以示于SEQ ID NO1的天然HCV 1bNS5B聚合酶序列為基礎(chǔ)的。而且，其它HCV NS5B中的相應氨基酸可以通過目測氨基酸序列或利用可商購的同源性軟件程序如Vector NTI來進行鑒定(由InfoMax Inc.提供)。從這方面來講，為了鑒定NS5B蛋白，應注意HCVNS5B序列的前4個氨基酸通常是-SMSY-(SEQ ID NO2)，這4個氨基酸在各變體之間是保守的。
在本發(fā)明的一個實施方式中，將結(jié)合袋定義為下述氨基酸序列(37)*392-393 395-396 399 424-425 428-429 492-495(496)*500 503
*(括號表示任意的氨基酸殘基)或，可選地(V37)，L392，A393，A395，A396，T399，I424，L425，H428，F(xiàn)429，L492，G493，V494，P495，(P496)，W500和R503。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，多肽的功能等同類似物也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明多肽的一個或多個氨基酸殘基，不管它在結(jié)合袋內(nèi)還是在結(jié)合袋域外，都可以用功能等同的氨基酸，通常是上述“氨基酸相似性表”中所列的保守性氨基酸替代，其合成氨基酸類似物或其它HCV基因型中發(fā)現(xiàn)的天然存在的氨基酸取代，并且它們?nèi)匀槐３纸Y(jié)合袋的功能形態(tài)或構(gòu)型。也可以對多肽進行氨基酸刪除和/或插入。所述氨基酸取代、插入或刪除可以使多肽更利于在篩選試驗中使用，或使多肽更容易制備。不同HCV基因型中的結(jié)合袋內(nèi)天然存在的氨基酸取代的粗略例子包括但不限于含有T499V取代的HCV基因型1b NS5B；含有M36L，I424V和T499A取代的HCV基因型1a NS5B；含有M36L，I424V，L425M和V494C取代的HCV基因型3a NS5B；含有M36K，L392I，A393S，I424V，L425I和V494A取代的HCV基因型2b NS5B；含有V494A取代的HCV基因型2a，2k，6b；含有V494I取代的HCV基因型3b；含有P495L取代的HCV基因型6a；和含有A396V取代的HCV基因型4a。
應該知道結(jié)合袋通常是由多肽的所有氨基酸原子來定義的，例如當抑制劑與多肽復合時，NS5B就在抑制劑所有原子5_內(nèi)?？衫酶鞣N計算機分析來測定含有本文所定義結(jié)合袋的多肽是否與上述HCV NS5B結(jié)合袋充分相似，甚至于功能?？梢栽谑熘膽密浖羞M行分析，如MolecularSimilarity applications of QUANTA[Molecular Simulations Inc，San Diego，Calif.]，Sybyl[Tripos Associates，St.Louis，Mo.]，InsightII[Accelrys]和MOE[Chemical Computing Group Inc.，Montreal，Quebec，Canada]。
從本發(fā)明的這個方面衍生出了許多實施方式。例如，除了用上述氨基酸定義本發(fā)明的結(jié)合袋之外，結(jié)合袋可以額外包括一個或多個HCV NS5B的氨基酸殘基36，426，498或499。優(yōu)選這些位置分別被M36，M426，R498和T/V499占據(jù)。
在此方面的另一個實施方式中，多肽可以包括以天然構(gòu)型存在的HCVNS5B的氨基酸殘基決定簇36和37。優(yōu)選位置36和37被下述氨基酸占據(jù)M36和V37，或者具有氨基酸序列M-V。
在另一個實施方式中，多肽可以包括以天然構(gòu)型存在的HCV NS5B的氨基酸殘基決定簇392-399。優(yōu)選位置392-399被下述氨基酸占據(jù)L392，A393，R394，A395，A396，W397，E398和T399，或者具有氨基酸序列L-A-R-A-A-W-E-T(SEQ ID NO4)。
在另一個實施方式中，多肽可以包括以天然構(gòu)型存在的HCV NS5B的氨基酸殘基決定簇424-429。優(yōu)選位置424-429被下述氨基酸占據(jù)I424，L425，M426，T427，H428和F429，或者具有氨基酸序列I-L-M-T-H-F(SEQID NO5)。
在另一個實施方式中，多肽可以包括以天然NS5B構(gòu)型存在的HCVNS5B的氨基酸殘基決定簇492-503。在此，優(yōu)選位置492-503被下述氨基酸占據(jù)L492，G493，V494，P495，P496，L497，R498，T499，W500，R501，H502和R503，或者具有氨基酸序列L-G-V-P-P-L-R-T-W-R-H-R(SEQID NO6)。
HCV NS5B多肽類似物第二方面，本發(fā)明提供了分離和純化的HCV NS5B多肽類似物，包括由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選氨基酸殘基37和496中的一個)定義的，或由其功能等同類似物定義的HCV NS5B結(jié)合袋，其中所述結(jié)合袋保持其天然功能構(gòu)型，且所述結(jié)合袋是可暴露的。
保持本文所公開的天然結(jié)合袋功能構(gòu)型的上述NS5B多肽類似物，極方便地提供了天然NS5B多肽的模擬物，可將它設(shè)計成在抑制劑篩選試驗中使用時勝過天然NS5B多肽。例如，可將多肽類似物設(shè)計成更易制備和使用的，或者更加穩(wěn)定的。還可以對它進行設(shè)計，從而能提供更易獲得的結(jié)合袋。
通過上面更詳細描述的定義中的，尤其是術(shù)語“類似物”定義中的氨基酸取代、刪除或插入來改變NS5B多肽，獲得NS5B多肽類似物。在此，優(yōu)選對由氨基酸殘基18至35定義的手指環(huán)鏈進行修飾，提供更易被取代而使本發(fā)明結(jié)合袋暴露的手指環(huán)鏈，或者提供取代或刪除的手指環(huán)鏈而暴露結(jié)合袋。
如上所述，取代NS5B手指環(huán)鏈的至少氨基酸殘基18至35時，就會使本發(fā)明的HCV NS5B結(jié)合袋暴露?，F(xiàn)在已經(jīng)確定某些化合物能夠取代手指環(huán)，而接近結(jié)合袋。因此，提供的多肽類似物中的結(jié)合袋是可暴露的，即天然NS5B構(gòu)型被部分NS5B蛋白，如由氨基酸18至35定義的手指環(huán)掩蓋，通過用有結(jié)合袋傾向的化合物取代而使結(jié)合袋暴露。
從本發(fā)明的這個方面衍生出了許多實施方式。例如，除了用上述氨基酸定義本發(fā)明的結(jié)合袋之外，結(jié)合袋可以額外包括HCV NS5B的氨基酸殘基36，426或498或499中的一個或多個。優(yōu)選，結(jié)合袋包括所有這些氨基酸殘基。同時，優(yōu)選這些位置各自被M36，M426，R498和T/V499占據(jù)。
在此方面的另一個實施方式中，多肽的結(jié)合袋可以包括以天然構(gòu)型存在的HCV NS5B的氨基酸殘基36和37。優(yōu)選位置36和37被下述氨基酸占據(jù)M36和V37，或者具有氨基酸序列M-V。
在此方面的另一個實施方式中，多肽的結(jié)合袋可以包括以天然構(gòu)型存在的HCV NS5B的氨基酸殘基392至399。優(yōu)選位置392至399被下述氨基酸占據(jù)L392，A393，R394，A395，A396，W397，E398和T399，或者具有氨基酸序列L-A-R-A-A-W-E-T(SEQ ID NO4)。
在另一個實施方式中，多肽的結(jié)合袋可以包括以天然構(gòu)型存在的HCVNS5B的氨基酸殘基424至429。優(yōu)選位置424至429被下述氨基酸占據(jù)I424，L425，M426，T427，H428和F429，或者具有氨基酸序列I-L-M-T-H-F(SEQ ID NO5)。
在另一個實施方式中，多肽的結(jié)合袋可以包括以天然NS5B構(gòu)型存在的HCV NS5B的氨基酸殘基492至503。在此，優(yōu)選位置492至503被下述氨基酸占據(jù)L492，G493，V494，P495，P496，L497，R498，T499，W500，R501，H502和R503，或者具有氨基酸序列L-G-V-P-P-L-R-T-W-R-H-R(SEQID NO6)。
在進一步的實施方式中，結(jié)合袋殘基的優(yōu)選序列是與SEQ ID NO1所列序列一致的序列。
如上所述，由于HCV基因型之間存在高水平的序列同源性，在本文中，結(jié)合袋和可取代的/取代的手指環(huán)區(qū)是參考以SEQ ID NO1所列的HCV 1b基因型NS5B序列為基礎(chǔ)的氨基酸位置來進行定義的。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應該理解，結(jié)合袋或手指環(huán)的一個或多個氨基酸殘基位置上的微小變化，例如結(jié)合袋中一個氨基酸位置由1變?yōu)?(其可能由于插入或刪除一個或多個N-末端氨基酸而自然發(fā)生)，或者將單個氨基酸轉(zhuǎn)移到NS5B蛋白其它位置(如，不影響結(jié)合袋構(gòu)型的區(qū)域)，仍然可以獲得與本發(fā)明相一致的結(jié)合袋和具有暴露結(jié)合袋功能的手指環(huán)。因此，這種位置差異在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
HCV NS5B多肽變體在另一方面，本發(fā)明提供了HCV NS5B多肽變體，其在由氨基酸殘基18至35定義的手指環(huán)內(nèi)包括至少一個氨基酸突變，其中所述突變能導致該手指環(huán)被取代，而使基本由天然HCV NS5B的氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選氨基酸殘基37和496中的一個)定義的，或由其功能等同類似物定義的結(jié)合袋暴露，其中所述結(jié)合袋保持其天然功能構(gòu)型。
本發(fā)明此方面所述的NS5B變體可以包括任何能引起由氨基酸18至35定義的手指環(huán)發(fā)生取代的突變。例如，對與本文所述結(jié)合袋內(nèi)的一個或多個殘基形成結(jié)合的氨基酸進行突變，可以阻止這種結(jié)合，從而引發(fā)取代或“打開”手指環(huán)而暴露結(jié)合袋。
在本發(fā)明的一個實施方式中，對HCV NS5B第30和31位氨基酸殘基中的至少一個進行突變，會使手指環(huán)發(fā)生取代。在優(yōu)選的實施方式中，將氨基酸殘基30突變?yōu)槌涟彼嶂獾陌被釟埢?。更?yōu)選，氨基酸殘基30選自P，F(xiàn)，W，M，G，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R和H。
如上所述的關(guān)于結(jié)合袋、包含結(jié)合袋的附加氨基酸殘基，以及結(jié)合袋殘基具體序列的實施方式是關(guān)于NS5B多肽和類似物的。
本發(fā)明的另一個方面提供了HCV NS5B多肽，或其功能等同類似物，其特征是取代了氨基酸殘基18至35。
本發(fā)明的另一個方面提供了HCV NS5B多肽，或其功能等同類似物，其中刪除了至少氨基酸殘基18至35。
如前所述，取代或刪除氨基酸殘基18至35會暴露本文所定義的新型結(jié)合袋，該結(jié)合袋在開發(fā)HCV治療劑中具有重要作用。
HCV NS5B晶體結(jié)構(gòu)在發(fā)明的進一方面中，提供了HCV NS5B晶體結(jié)構(gòu)，包括由天然HCVNS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選氨基酸殘基37和496中的一個)的結(jié)構(gòu)坐標定義的，或由其功能等同類似物的結(jié)構(gòu)坐標定義的結(jié)合袋，其中取代了由至少氨基酸18至35的結(jié)構(gòu)坐標定義的天然手指環(huán)鏈而使所述結(jié)合袋暴露。優(yōu)選地，結(jié)構(gòu)坐標如圖4，5或6中任一所示。
暴露抑制劑結(jié)合袋的結(jié)構(gòu)對于設(shè)計和開發(fā)候選NS5B抑制劑是很有價值的工具，因為該結(jié)構(gòu)提供了更清楚理解結(jié)合袋構(gòu)型和總體性質(zhì)的手段和指導開發(fā)治療性NS5B抑制劑的重要知識。
在優(yōu)選的實施方式中，提供的HCV NS5B晶體結(jié)構(gòu)中的結(jié)合袋還額外由氨基酸殘基36，426，498和499來定義。在另一優(yōu)選的實施方式中，提供的HCV NS5B晶體結(jié)構(gòu)中的結(jié)合袋由氨基酸殘基36-37，392-399，424-429和492-503決定簇定義。
HCV NS5B復合物在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供了包括HCV NS5B多肽和化合物的復合物，其中所述化合物與NS5B多肽內(nèi)的結(jié)合袋結(jié)合，所述結(jié)合袋由天然HCV NS5B的氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選氨基酸殘基37和496中的一個)來定義，或由其功能等同類似物來定義。
本發(fā)明的NS5B抑制劑-結(jié)合袋在由氨基酸殘基18至35定義的手指環(huán)區(qū)發(fā)生取代時而暴露。結(jié)合袋本身由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選氨基酸殘基37和496中的一個)定義。而且，它還可以進一步由附加的氨基酸殘基36，426，498和499中的一個或多個來定義，或甚至另外由下述氨基酸殘基決定簇36-37，392-399，424-429和492-503定義。
根據(jù)本發(fā)明的此方面，HCV NS5B多肽可以是天然NS5B多肽，或者是選自下組的HCV NS5B多肽、變體或類似物i)分離和純化的多肽，包括由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選氨基酸殘基37和496中的一個)定義的，或由其功能等同類似物定義的功能HCV NS5B結(jié)合袋，其中所述結(jié)合袋由于取代了由至少氨基酸殘基18至35定義的手指環(huán)鏈而暴露出來，其中所述結(jié)合袋保持其天然功能構(gòu)型；ii)分離和純化的HCV NS5B多肽，其由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選氨基酸殘基37和496中的一個)定義的，或由其功能等同類似物定義的HCV NS5B結(jié)合袋組成，其中所述結(jié)合袋保持其天然功能構(gòu)型；iii)分離和純化的HCV NS5B多肽類似物，包括由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選氨基酸殘基37和496中的一個)定義的，或由其功能等同類似物定義的HCV NS5B結(jié)合袋，其中所述結(jié)合袋保持其天然功能構(gòu)型且所述結(jié)合袋是可暴露的；iv)HCV NS5B多肽變體，其在由氨基酸殘基18至35定義的手指環(huán)內(nèi)包括至少一個氨基酸突變，其中所述突變能導致該手指環(huán)被取代，而使基本由天然HCV NS5B的氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選氨基酸殘基37和496中的一個)定義的，或由其功能等同類似物定義的結(jié)合袋暴露，其中所述結(jié)合袋保持其天然功能構(gòu)型；v)HCV NS5B多肽或其功能等同類似物，其特征是取代了氨基酸18至35；和vi)HCV NS5B多肽或其功能等同類似物，其中刪除了至少氨基酸殘基18至35。
在此方面的優(yōu)選實施方式中，復合物包含與選自下述專利文獻WO01/047883，WO 02/004425，WO 03/000254，WO 03/007945，WO 03/010140，WO 03/010141和WO 03/026587中的化合物家族的化合物結(jié)合的如上定義的HCV NS5B，類似物或變體。在此方面可選的優(yōu)選實施方式中，復合物包含與選自描述于美國共同未決申請10/755,256，10/755,544和60/546,213(在此引入以供參考)中的化合物家族的化合物結(jié)合的上述HCVNS5B多肽、類似物或變體。以前，未顯示這些化合物會與本申請所要求保護的NS5B結(jié)合袋結(jié)合，形成本發(fā)明所述NS5B復合物。
在更優(yōu)選的實施方式中，HCV NS5B復合物包含與下述化合物A，B或C中之一種化合物結(jié)合的NS5B多肽、類似物和變體化合物A 化合物B 化合物C 圖4，5和6顯示分別與化合物A，B和C結(jié)合的SEQ ID No1 HCV NS5B的結(jié)構(gòu)坐標。獲得這些結(jié)構(gòu)坐標的方法，對坐標進行解釋，并解釋該坐標在理解蛋白結(jié)構(gòu)，尤其是本文所述結(jié)合袋的效用都是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的。也可以參考常規(guī)教科書，如《晶體結(jié)構(gòu)分析》(Crystal StructureAnalysis)，Jenny Pickworth Glusker和Kenneth N.Trueblood，第二版，OxfordUniversity Press，1985，New York；和《蛋白結(jié)構(gòu)原理》(Principles of ProteinStructure)，G.E.Schulz和R.H.Schirmer，Springer-Verlag，1985，New York，書中進行了深入的指導。
另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應懂得酶復合物的一組結(jié)構(gòu)坐標，如圖4，5和6所示，是三維空間上確定形狀的相對的一組點。因此，很有可能完全不同的一組坐標可以定義出相似或相同的形狀，即天然NS5B結(jié)合袋的功能等同類似物，從而落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。另外，各個坐標中的微小差別對整體形狀沒什么影響。對結(jié)合袋來說，期望這些變化不會明顯改變可與這些結(jié)合袋結(jié)合的化合物的性質(zhì)。
還應引起注意的是由于突變、添加、取代和/或刪除氨基酸而對晶體結(jié)構(gòu)進行修飾，或者構(gòu)成晶體的任何組分的其它改變都會引起結(jié)構(gòu)坐標改變。如果這種改變在誤差可接受標準內(nèi)，如與原始坐標相比，對于包含結(jié)合袋的α-碳來說rmsd＜1.0_，那么就認為所得三維形狀相同。因此，例如，與本文所述NS5B結(jié)合袋活性位點結(jié)合的化合物也可以與其限定形狀的結(jié)構(gòu)坐標在可接受的誤差范圍內(nèi)的其它結(jié)合袋結(jié)合。
結(jié)晶方法在本發(fā)明的另一個方面，提供了制備包括HCV NS5B多肽和化合物的結(jié)晶的HCV NS5B復合物的方法，其中所述化合物結(jié)合到NS5B結(jié)合袋內(nèi)，所述結(jié)合袋是由HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選氨基酸殘基37和496中的一個)的結(jié)構(gòu)坐標定義，或由其功能等同類似物定義。
優(yōu)選的結(jié)晶方法包括下述步驟a)在結(jié)晶緩沖液中保溫純化的HCV NS5B多肽，獲得結(jié)晶的NS5B多肽；b)將化合物溶解；和c)將晶體多肽與溶解的化合物一起在浸泡緩沖液(soaking buffer)中浸泡合適的時間，獲得結(jié)晶的Ns5B復合物。
在制備上述結(jié)晶的HCV NS5B復合物的可選方法中，直接將化合物加到含結(jié)晶的HCV NS5B的結(jié)晶緩沖液中。
在另一個可選方法中，通過使NS5B蛋白與化合物一起共結(jié)晶來制備上述的結(jié)晶的HCV NS5B復合物。該方法包括下述步驟
a)將純化的HCV NS5B多肽與溶解的化合物混合，形成NS5B復合物；和b)復合物在結(jié)晶緩沖液中結(jié)晶。
在此方面的優(yōu)選實施方式中，將NS5B與選自上述化合物家族的化合物復合。更優(yōu)選，化合物是選自上述化合物A、B或C中的一個，或其相關(guān)化合物。如上所述，結(jié)晶方法可以包括直接將化合物加到含有結(jié)晶的HCVNS5B的結(jié)晶緩沖液中，或者以溶解形式將純化的HCV NS5B多肽與化合物混合。當使用溶解形式的化合物時，優(yōu)選將化合物溶解在濃度約25mM的100％DMSO中。
將濃度約5mg/mL-約15mg/mL的NS5B與純化緩沖液混合。優(yōu)選，純化緩沖液中所用的NS5B濃度是約7-10mg/mL。純化緩沖液的性質(zhì)通常在本領(lǐng)域中是已知的，其包括用于穩(wěn)定HCV NS5B的鹽和/或甘油，使用的純化緩沖液pH在約6和約9之間。純化緩沖液的優(yōu)選pH是約7.5。緩沖液如但不限制到Tris-，HEPES或bis-Tris，使用的濃度是約0mM-約50mM。優(yōu)選緩沖液是濃度約20mM的Tris-。
為了穩(wěn)定HCV NS5B，可將濃度約200mM-約800mM的鹽如，或加到緩沖液中。優(yōu)選鹽是濃度約300mM的。
為了進一步穩(wěn)定HCV NS5B，可加入濃度約0％-約30％的甘油。優(yōu)選甘油濃度是約10％。
更優(yōu)選，純化緩沖液約pH7.5，包括濃度約20mM的Tris-，濃度約10％的甘油，濃度約5mM的DTT，和濃度約300mM的。
可利用本領(lǐng)域已知的任何一種技術(shù)來讓NS5B多肽結(jié)晶，包括如油下分批結(jié)晶(batch crystallization under oil)、懸滴式蒸汽擴散(hanging drop vapordiffusion)和直滴式蒸汽擴散(sitting drop vapor diffusion)技術(shù)。實現(xiàn)本發(fā)明目的的優(yōu)選結(jié)晶方法是如McPherson等(Preparation and Analysis of ProteinCrystals，Krieger Pub.1989)中所述的懸滴式蒸汽擴散技術(shù)。簡單的講，該結(jié)晶方法包括將含純化的NS5B的液滴置在儲存溶液(reserveoir solution)上方的結(jié)晶緩沖液中。液滴的蒸汽擴散使蛋白濃度增加，從而促進結(jié)晶。
使用的結(jié)晶緩沖液選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任一種適合本目的的緩沖液，包括但不限于濃度約50mM-約0.2M的MES，磷酸鈉，磷酸鉀，乙酸鈉或琥珀酸鈉。優(yōu)選結(jié)晶緩沖液是濃度約0.1M的MES。
結(jié)晶緩沖液的pH通常在約4.5-約6.5之間，優(yōu)選使用的結(jié)晶緩沖液pH是約5.4。
結(jié)晶緩沖液可以額外包括至少一種促NS5B結(jié)晶的沉淀劑。合適的沉淀劑的例子包括但不限于PEG，PEG5K mme(單甲醚聚乙二醇5000)，硫酸銨，MPD，異丙醇，乙醇或叔丁醇。使用的沉淀劑濃度通常為約30％-約40％。在優(yōu)選的實施方式中，沉淀劑是濃度約21％的PEG5K mme和濃度約0.4mM的硫酸銨。
在常規(guī)的結(jié)晶條件下誘導NS5B結(jié)晶。例如，在約0℃-約22℃的溫度下進行結(jié)晶。誘導結(jié)晶的優(yōu)選溫度在約4℃-約11℃之間。
在優(yōu)選的結(jié)晶方法中，在存在浸泡緩沖液的條件下，將溶劑的化合物浸入結(jié)晶的NS5B多肽中。浸泡緩沖液可包含任意一種常規(guī)緩沖液，包括但不限于濃度約50mM到約0.2M的MES，Tris，磷酸鈉，乙酸鈉和琥珀酸鈉。優(yōu)選使用的浸泡緩沖液濃度是約0.1M。浸泡緩沖液的pH通常是約5-約8，優(yōu)選使用的浸泡緩沖液pH是約7.0。
通過添加任何合適的蛋白，包括但不限于溶菌酶，BSA或甚至額外的NS5B，可將浸泡緩沖液的蛋白含量補充到濃度高至約10mg/mL。
浸泡緩沖液可以包括起NS5B穩(wěn)定劑作用的補充劑。可將一種或多種濃度約100mM-約500mM的鹽，如，或加到緩沖液中去。優(yōu)選加入的鹽濃度在約150mM到約300nM之間。更優(yōu)選，加入濃度分別約210mM和約280mM的和。
為了進一步穩(wěn)定HCV NS5B，可將濃度約10-20％的甘油加到浸泡緩沖液中去。優(yōu)選加入的甘油濃度是約14％。
結(jié)晶緩沖液可以額外包括至少一種促結(jié)晶的沉淀劑。合適的沉淀劑的例子包括但不限于PEG，PEG5K mme(單甲醚聚乙二醇5000)，硫酸銨，MPD，異丙醇，乙醇或叔丁醇。使用的沉淀劑濃度通常為約10％-約18％。在優(yōu)選的實施方式中，沉淀劑是濃度約14％的PEG5K mme和濃度約0.4mM的硫酸銨。
將結(jié)晶的NS5B和溶解的化合物浸泡在浸泡緩沖液中約1到約12小時，優(yōu)選約3到約8小時，更優(yōu)選約5到約6小時的適宜浸泡時間。浸泡時的溫度是約5-約15℃，優(yōu)選溫度是約11℃。
在可選的結(jié)晶方法中，將化合物加到含結(jié)晶的NS5B的結(jié)晶緩沖液中。在該方法中，將化合物簡單地噴灑到緩沖液上，隨后保溫合適的時間讓其溶解和結(jié)晶。
在另一個可選的結(jié)晶方法中，讓NS5B和化合物在如上所述僅用于NS5B的結(jié)晶緩沖液中共結(jié)晶。在該方法中，將NS5B和溶解的化合物在結(jié)晶緩沖液中混和，在如上所述的結(jié)晶條件下結(jié)晶。
按照本發(fā)明，結(jié)晶的NS5B復合物能按照X-射線晶體學進行處理是很重要的。利用X-射線晶體學分析，獲得的NS5B復合物晶體空間群(spacegroup)屬P2(1)2(1)2(1)，單位晶胞大小為a＝105.1，b＝106.6，c＝133.5，每個不對稱單位有兩個分子。利用配有R-axis IV++影像平板監(jiān)視器(image platearea detector)的MicroMax007 home source X射線發(fā)生器(Rigaku，Japan)收集衍射數(shù)據(jù)。優(yōu)選，對單個復合物晶體收集分辨率為2.8_的數(shù)據(jù)。
X-射線坐標另一個方面，提供了上述NS5B復合物的X-射線晶體結(jié)構(gòu)坐標。甚至更優(yōu)選，NS5B復合物的結(jié)構(gòu)坐標由圖4，圖5和圖6中之一來限定。
本發(fā)明的NS5B復合物的三維結(jié)構(gòu)由圖4，圖5和圖6中任一所示的一組結(jié)構(gòu)坐標來限定。術(shù)語“結(jié)構(gòu)坐標(structure coordinate)”是由數(shù)學操作獲得的Cartesian坐標，所述操作與對晶體復合物的原子(散射中心)進行X-射線單色光束衍射所獲得的圖形相關(guān)。用衍射數(shù)據(jù)計算晶體重復單元的電子密度圖。然后用電子密度圖確定已知結(jié)構(gòu)坐標的結(jié)合袋的各個原子的位置。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應懂得一組蛋白或蛋白抑制劑復合物或其部分的結(jié)構(gòu)坐標是在三維空間上確定形狀的的相對的一組點。因此，很有可能完全不同的一組坐標能定義出相似或相同的形狀。
通過對結(jié)構(gòu)坐標進行數(shù)學操作可以使坐標改變。例如，通過對圖4，5或6所示的結(jié)構(gòu)坐標進行結(jié)構(gòu)坐標晶體學排列、分級或?qū)λ龆嘟M結(jié)構(gòu)坐標或其組合進行矩陣操作，即可對結(jié)構(gòu)坐標進行操作。
必需測定分子或分子復合物或其部分是否與本文所述的全部或部分HCV NS5B蛋白或NS5B復合物足夠類似以致于可以認為兩者是等效的。利用目前所用的應用軟件，如QUANTA的分子相似性應用軟件[MolecularSimulations Inc，San Diego，Calif.]，Sybyl[Tripos Associates，St.Louis，Mo.]，InsightII[Accelrys]和MOE[Chemical Computing Group Inc.，Montreal，Quebec，Canada]即可進行這種分析。
分子相似性應用能比較不同的結(jié)構(gòu)，相同結(jié)構(gòu)的不同構(gòu)象以及相同結(jié)構(gòu)的不同部分。在比較結(jié)構(gòu)的分子相似性中使用的方法分為下述四步1)輸入待比較的結(jié)構(gòu)；2)限定這些結(jié)構(gòu)中的等效原子，3)進行吻合度(重疊)操作；和4)分析結(jié)果。
計算機-可讀性存儲介質(zhì)另外，在本發(fā)明的另一方面，提供了一種計算機可讀性存儲介質(zhì)，其上存儲有HCV NS5B復合物的晶體結(jié)構(gòu)模型，所述HCV NS5B復合物包括HCV NS5B多肽和化合物，其中所述化合物與由圖4、5和6所示的天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選氨基酸殘基37和496中的一個)的結(jié)構(gòu)坐標定義的，或由其功能等同類似物的結(jié)構(gòu)坐標定義的NS5B結(jié)合袋結(jié)合。
計算機可讀性數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，包括如硬盤、CD-ROM、磁盤(軟盤)和DVD。
根據(jù)本發(fā)明的此方面，可將NS5B復合物和其部分的結(jié)構(gòu)坐標存儲在機器可讀性存儲介質(zhì)中。該數(shù)據(jù)可用于各種目的，如藥物開發(fā)和蛋白晶體的X-衍射晶體學分析。
在此方面的優(yōu)選實施方式中，HCV NS5B復合物包括與上述確定的化合物家族中的化合物復合的NS5B。更優(yōu)選，NS5B復合物包括與化合物A、B或C中的一種化合物結(jié)合的NS5B。
如前所述，結(jié)合袋可以額外由選自氨基酸殘基36，426，498和499中的一個或多個附加氨基酸殘基來定義，或甚至另外由氨基酸簇36-37，392-399，424-429和492-503定義。
NS5B復合物的坐標數(shù)據(jù)，如圖4、5和6所示，當與計算機聯(lián)合使用時，其中所述計算機裝有將這些坐標翻譯成三維結(jié)構(gòu)的軟件程序，就可用于各種目的，尤其是有關(guān)藥物開發(fā)的目的。產(chǎn)生上述三維圖解圖像的軟件是已知且可以商購的。例子包括Quanta和WebLite Viewer。現(xiàn)用的坐標數(shù)據(jù)需要以計算機可讀格式存儲。因此，按照本發(fā)明，將能以三維結(jié)構(gòu)顯示的數(shù)據(jù)存儲在計算機可讀介質(zhì)上，當在裝有指示利用該數(shù)據(jù)程序的機器上使用時，該介質(zhì)能顯示本文所述HCV NS5B復合物或HCV NS5B結(jié)合袋的圖解三維圖像。
HCV NS5B X-射線坐標數(shù)據(jù)對篩選潛在NS5B抑制活性的化合物是有用的。例如，可以利用計算機對由數(shù)據(jù)編碼的多肽NS5B結(jié)合袋結(jié)構(gòu)結(jié)合指定化合物的能力來進行評價。同時，通過某種類型的結(jié)合而確定“適合”本文所述結(jié)合袋的化合物可能會阻止HCV NS5B聚合酶的生物活性，這樣，該化合物就代表一種潛在的藥物候選物。另外，可以在計算機屏幕上顯示數(shù)據(jù)的圖解三維圖像，從而可以目測HCV NS5B結(jié)合袋和化合物在NS5B復合物中的結(jié)合袋內(nèi)的結(jié)合。
鑒定HCV NS5B結(jié)合化合物的虛擬方法在進一步的方面，本發(fā)明提供了一種評價化合物復合HCV NS5B潛力的虛擬方法。該方法描述為第一輪篩選搜索與本發(fā)明結(jié)合袋結(jié)合的化合物，并最終搜索到由于結(jié)合結(jié)合袋導致HCV抑制而具備治療效力的化合物。
因此，在本發(fā)明的進一步方面，提供了一種鑒定潛在HCV抑制劑的虛擬篩選方法，其包括下述步驟a)構(gòu)建HCV NS5B結(jié)合袋的計算機模型，所述HCV NS5B結(jié)合袋由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選氨基酸殘基37和496中的一個)的結(jié)構(gòu)坐標定義，或由其功能等同類似物定義；b)用計算工具對待測化合物和NS5B結(jié)合袋的計算機模型進行吻合度程序操作，從而提供所述化合物在該結(jié)合袋內(nèi)的能量最小化構(gòu)型；和c)對吻合度操作的結(jié)果進行評價，量化化合物和結(jié)合袋間的結(jié)合，其中與結(jié)合袋結(jié)合、產(chǎn)生低能量、穩(wěn)定復合物的化合物是潛在的NS5B抑制劑。
另外，本發(fā)明提供了一種鑒定結(jié)合HCV NS5B的化合物的方法，包括步驟a)將三維分子模型算法應用于HCV NS5B結(jié)合袋的結(jié)構(gòu)坐標，確定HCV NS5B結(jié)合袋的空間坐標，其中所述HCV NS5B結(jié)合袋由天然HCVNS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選氨基酸殘基37和496中的一個)來定義；和
b)在HCV NS5B結(jié)合袋空間坐標的背景下對存儲的候選化合物的空間坐標進行電子篩選，鑒定能結(jié)合到HCV NS5B結(jié)合袋內(nèi)的化合物。
在本發(fā)明此方面的優(yōu)選實施方式中，結(jié)合袋可以額外由氨基酸殘基36，426，498和499中的一個或多個來定義，或者由氨基酸殘基36-37，392-399，424-429和492-503定義的一個或多個氨基酸簇來定義。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式中，結(jié)合袋的結(jié)構(gòu)坐標是如圖4，5和6所示的結(jié)構(gòu)坐標，或者是本領(lǐng)域技術(shù)人員能理解的功能等同的結(jié)構(gòu)坐標。
根據(jù)本發(fā)明的此方面，任何給定化合物都可以在計算機上評價其與本文所述HCV NS5B結(jié)合袋的結(jié)合能力，以及其作為確定的NS5B抑制劑的潛力。如上暗示，利用已知軟件，如QUANTA[Molecular Simulations Inc，SanDiego，Calif.]，Sybyl[Tripos Associates，St.Louis，Mo.]，InsightII[Accelrys]，MOE[Chemical Computing Group Inc.，Montreal，Quebec，Canada]可構(gòu)建出由本文所述HCV NS5B結(jié)合袋構(gòu)成的多肽的計算機模型。然后將要評價的待選化合物置于結(jié)合袋內(nèi)的多個定位內(nèi)，或者停靠在結(jié)合袋內(nèi)。可利用軟件如GRID，DOCK，AUTODOCK，F(xiàn)lexX和GOLD實現(xiàn)?？?。當化合物?？吭诮Y(jié)合袋內(nèi)產(chǎn)生NS5B復合物“虛擬”圖像時，可進一步使用計算工具，利用軟件如QUANTA，Sybyl，InsightII和MOE獲得復合物的定量和定性圖，包括如，藥效團圖，表面性質(zhì)圖(繪制Conolly，Gaussian and van der Waalssurfaces)和隨機受體潛力圖。
可通過計算機評估來檢測和優(yōu)化所選化合物與本發(fā)明HCV NS5B結(jié)合袋結(jié)合的效力。例如通過目測定性確定的或者利用評分函數(shù)如LUDI，PLP，PMF，SCORE，GOLD和FlexX定性確定的形狀、大小和靜電互補來對給定化合物在NS5B結(jié)合袋內(nèi)的配合等級進行評價。可單獨或組合，例如以一致評分法使用這些定性和定量評價法。
另外，可以在化合物與HCV NS5B結(jié)合形成復合物的相互作用能量基礎(chǔ)上對結(jié)合效力進行評價。例如，以本文所述方式與NS5B形成“低能量穩(wěn)定復合物”的確定化合物，保證會進一步分析作為潛在的NS5B抑制劑。本文所用術(shù)語“低能量穩(wěn)定復合物”解釋為NS5B復合物中的范德華(van derWaals)相互作用能量值，即化合物和NS5B相互作用的范德華能量小于約8000kcal/mol的NS5B復合物?？衫密浖﨧OE，并在MMFF94力場基礎(chǔ)上確定范德華相互作用能量值。因此，確定形成范德華相互作用能量值小于約8000kcal/mol的復合物的化合物是潛在的NS5B抑制劑。優(yōu)選，本發(fā)明的低能量穩(wěn)定復合物的范德華相互作用能量值小于約6000kcal/mol，更優(yōu)選小于約4000kcal/mol。
利用本發(fā)明NS5B多肽變體/類似物的方法一旦利用虛擬方法，如上面描述的虛擬方法對許多化合物進行了篩選，就可以對已確定是潛在HCV抑制劑的化合物進行進一步的評價，來確定其與本發(fā)明結(jié)合袋相互作用和抑制HCV的實際傾向。
這樣，本發(fā)明的另一個方面，提供了一種篩選候選HCV NS5B抑制劑化合物的方法，包括下述步驟a)在適合與多肽結(jié)合的條件下，保溫候選抑制劑化合物，其中所述多肽選自下組i)分離和純化的多肽，包括由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選氨基酸殘基37和496中的一個)定義的，或由其功能等同類似物定義的功能HCV NS5B結(jié)合袋，其中所述結(jié)合袋由于取代了由至少氨基酸殘基18至35定義的手指環(huán)鏈而暴露出來，其中所述結(jié)合袋保持其天然功能構(gòu)型；ii)分離和純化的HCV NS5B多肽，其由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選氨基酸殘基37和496中的一個)定義的，或由其功能等同類似物定義的HCV NS5B結(jié)合袋組成，其中所述結(jié)合袋保持其天然功能構(gòu)型；iii)分離和純化的HCV NS5B多肽類似物，包括由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任選氨基酸殘基37和496中的一個)定義的，或由其功能等同類似物定義的HCV NS5B結(jié)合袋，其中所述結(jié)合袋保持其天然功能構(gòu)型且所述結(jié)合袋是可暴露的；iv)HCV NS5B多肽變體，其在由氨基酸殘基18至35定義的手指環(huán)內(nèi)包括至少一個氨基酸突變，其中所述突變能導致該手指環(huán)被取代，而使基本由天然HCV NS5B的氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選氨基酸殘基37和496中的一個)定義的，或由其功能等同類似物定義的結(jié)合袋暴露，其中所述結(jié)合袋保持其天然功能構(gòu)型；v)HCV NS5B多肽或其功能等同類似物，其特征是取代了氨基酸18至35；和vi)HCV NS5B多肽或其功能等同類似物，其中刪除了至少氨基酸殘基18至35；和b)測定候選抑制劑化合物是否與多肽結(jié)合，其中與多肽結(jié)合的化合物是潛在的HCV NS5B抑制劑。
可以利用本領(lǐng)域的固定方法對候選化合物在定義的HCV NS5B結(jié)合袋內(nèi)的結(jié)合進行測定。例如，可以使用結(jié)合試驗，該試驗在適合發(fā)生結(jié)合的條件下，將候選化合物與含有本發(fā)明NS5B結(jié)合袋的多肽接觸。然后，例如利用NMR或其它已知的檢測技術(shù)對結(jié)合進行評估。
設(shè)計HCV NS5B抑制劑的方法在本發(fā)明的進一步方面，提供了設(shè)計與本文所述NS5B結(jié)合袋結(jié)合的化合物的方法。因此，本發(fā)明提供了以NS5B中的新結(jié)合袋結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，利用分子設(shè)計技術(shù)鑒定、選擇或設(shè)計潛在HCV NS5B抑制劑的機會。該預測模型對于高成本的制備和測定可能或不可能結(jié)合HCV NS5B蛋白的多種不同化合物來講是有價值的。
根據(jù)本發(fā)明，可以在實際合成和檢測前，對潛在NS5B抑制劑與本文所述NS5B結(jié)合袋的結(jié)合能力進行評價。如果推測擬用化合物不足以與結(jié)合袋相互作用或結(jié)合，那就排除制備和檢測該化合物。但如果計算機模型顯示相互作用很強，那就可以制備該化合物并完全測定其結(jié)合能力?？衫帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員范圍內(nèi)的常規(guī)試驗來進行測定，從而確定結(jié)合。
在此，所提供的設(shè)計能與上述NS5B多肽結(jié)合的化合物的方法包括下述步驟評價化合物和NS5B多肽內(nèi)結(jié)合袋的互補性，即“符合度”，其中所述結(jié)合袋由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選氨基酸殘基37和496中的一個)定義，或由其功能等同類似物定義。
類似地，提供的制備抑制HCV NS5B的RNA復制活性的藥物的方法包括鑒定或設(shè)計正好符合NS5B結(jié)合袋的化合物，所述NS5B結(jié)合袋由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選氨基酸殘基37和496中的一個)定義，或由其功能等同類似物定義，其中所述結(jié)合袋由于取代了由至少氨基酸殘基18至35定義的手指環(huán)鏈而暴露出來。
作為第一次，本發(fā)明允許使用基于結(jié)構(gòu)或合理的藥物設(shè)計技術(shù)來設(shè)計、選擇和合成化學個體，包括能放進和/或結(jié)合本文所定義的新型NS5B結(jié)合袋的抑制性化合物。
本發(fā)明可用的一具體有用的藥物設(shè)計技術(shù)是迭代藥物設(shè)計。迭代藥物設(shè)計是一種通過測定和評估蛋白質(zhì)/化合物復合物的連續(xù)套三維結(jié)構(gòu)，優(yōu)化蛋白質(zhì)和化合物之間結(jié)合的方法。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到天然配體或底物與其對應的受體或酶的結(jié)合袋的結(jié)合是多種生物作用機制的基礎(chǔ)。類似地，許多藥物通過與受體和酶的結(jié)合空穴結(jié)合發(fā)揮其生物效應。這種結(jié)合可發(fā)生在所有或任何部分的結(jié)合袋。理解這種結(jié)合有助于設(shè)計更易于與其靶受體或酶結(jié)合的性質(zhì)的藥物，從而提高了生物效應。因此，該信息在設(shè)計本發(fā)明潛在受體或酶的配體或抑制劑，如HCV NS5B類多肽，尤其是HCV NS5B的抑制劑中非常有用。
在迭代藥物設(shè)計時，先獲得一系列蛋白質(zhì)/化合物復合物的晶體。然后將各復合物的三維結(jié)構(gòu)解析。這一途徑提供各復合物蛋白質(zhì)和化合物之間的結(jié)合的深入了解。如下達到該目的選擇具有抑制活性的化合物、獲得該新蛋白質(zhì)/化合物復合物的晶體、解析該復合物的三維結(jié)構(gòu)以及比較新蛋白質(zhì)/化合物復合物之間的結(jié)合和先前解析的蛋白質(zhì)/化合物復合物之間的結(jié)合。通過觀察化合物變化如何影響蛋白質(zhì)/化合物結(jié)合，可以優(yōu)化結(jié)合。
下面將通過具體實施例對本發(fā)明的具體實施方式
進行描述，而不應將其理解為限制本發(fā)明。
實施例實施例1-表達和純化HCV NS5B通過將缺失了通常在成熟NS5B中發(fā)現(xiàn)的C末端21個氨基酸的變體表達，來制備溶解的重組HCV1b基因型(J4株)NS5B聚合酶(其氨基酸序列示于SEQ ID NO1中)。為了本發(fā)明的目的，表達的NS5BΔ21C末端具備6-His序列。在24℃，用0.4mM IPTG處理3小時，誘導大腸桿菌菌株JM109(DE3)中的pET載體表達NS5B。收獲細胞(在25mM Tris pH7.5，10％甘油，1mMEDTA，500mM ，2mM 2-巰基乙醇和蛋白酶抑制劑混合物(購自RocheBiochemicals Inc.的標準混合物)，并在微流化器(microfluidizer)中裂解。將裂解物離心(30,000X)后，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的下述連續(xù)層析步驟來純化(i)利用Ni-NTA樹脂(Qiagen)進行金屬親和層析，用含遞增濃度(從10mM-500mM)的咪唑的緩沖液洗脫；(ii)DEAE-Sepharose層析，其中NS5B溶于含300mM 的緩沖液中過柱；(iii)肝素Sepharose層析，其中NS5B在含200mM 的緩沖液中，然后用含梯度高至1M 的緩沖液洗脫所結(jié)合的NS5B。在Resource S柱上濃縮富含NS5B蛋白的洗脫組分，然后用20mM Tris- pH7.5，10％甘油，5mM DTT，300mM 過Superdex200柱。將含高純度His-標記NS5B的峰值組分-80℃保存，直至使用。
實施例2-HCV NS5B的結(jié)晶用單甲醚聚乙二醇5000(PEG5Kmme)作沉淀劑，將如實施例1詳述獲得的HCV聚合酶NS5B株1b/J4(SEQ.ID NO1)結(jié)晶為其apo形式。利用懸滴式蒸氣擴散技術(shù)(McPherson，見上)獲得大的單晶體。具體地，將1μL NS5B(7.66mg/mL在含20mM Tris，pH7.3，300mM ，10％甘油的純化緩沖液中)加到由21％PEG5Kmme，0.1M MES，pH5.4，10％甘油和0.4M硫酸銨組成的1μL溶液中。將獲得的2μL液滴懸在由21％PEG5Kmme，0.1MMES，pH5.4，20％甘油和0.4M硫酸銨組成的1mL儲液之上。所得NS5B復合物晶體屬空間群P2(1)2(1)2(1)，單位晶胞大小為a＝105.1，b＝106.6，c＝133.5，每個不對稱單位包括兩個分子。利用由常規(guī)旋轉(zhuǎn)正極源(regularrotating anode source)發(fā)出的X射線，顯示晶體衍射(diffract)分辨率高至2_。
實施例3-制備抑制劑化合物A，B和C根據(jù)2004年1月12日提交的共同未決申請US 10/755,256制備抑制劑化合物A。
根據(jù)2004年1月12日提交的共同未決申請US 10/755,256制備抑制劑化合物B。
根據(jù)2003年1月22日公開的WO 03/007945制備抑制劑化合物C。
實施例4 NS5B-抑制劑復合物的形成抑制劑浸泡將晶體移至由14％PEG5Kmme，14mM Tris，pH7.5，70mM MES，pH7.0，14％甘油，210mM ，10mg/mL溶菌酶和280mM硫酸銨組成的5μL浸泡液液滴中。抑制劑分子用DMSO溶解，濃縮至25mM。將抑制劑溶液(0.2μL)加到5μL NS5B晶體液滴中，11℃保溫5-6小時。保溫后，用cryoloop(Hampton Research，California，USA)將NS5B-抑制劑復合物晶體從溶液中移出，在液氮內(nèi)低溫冷藏(cryo-cooled)。利用化合物A和B制備NS5B復合物。
數(shù)據(jù)收集在配有Raxis-IV++影像信號板監(jiān)視器(Rigaku/MSC，Texas，USA)的MicroMax-007旋轉(zhuǎn)正極x-射線發(fā)生器上收集衍射數(shù)據(jù)。在用化合物A和化合物B制備的NS5B復合物于-180℃低溫冷藏的單晶體上采集分辨率2.8_的數(shù)據(jù)。
定相(phasing)，構(gòu)建模型和精加工利用HCV NS5B的公眾可得結(jié)構(gòu)(pdb code1C2J)通過分子替換(MR)對衍射數(shù)據(jù)進行定相。利用程序CNX(Accelrys)進行旋轉(zhuǎn)和平移檢索(translation search)。用軟件O(Alwyn Jones，Upsala University，Sweden)進行模型構(gòu)建，用CNX軟件(Accelrys)進行模型精加工。通過多輪模型構(gòu)建和精加工來改善模型，直到獲得所需結(jié)果。所有情況下的最終模型包括兩分子NS5B，鑒定為NS5B A和NS5B B，(即殘基A1至A149，A154至A563，B1至B17，B36至B148和B153至B563)和一分子與NS5B分子B結(jié)合的化合物A或B?；衔顰和化合物B NS5B復合物的最終原子結(jié)構(gòu)坐標分別示于圖4和圖5中。NS5B-化合物A復合物的最終結(jié)晶(crystallographic)R因子是21.9％，R游離因子是28.0％，分辨率2.8_。NS5B-化合物B復合物的最終結(jié)晶R因子是21.9％，R游離因子是25.7％，分辨率2.7_。
實施例5 基于NMR結(jié)合構(gòu)象的NS5B-化合物C復合物模型按照本文詳細描述的幾個步驟來確定化合物C在HCV聚合酶上的結(jié)合位點。開始，用NMR光譜法(轉(zhuǎn)移的NOESY)確定化合物C與HCV聚合酶結(jié)合時的結(jié)構(gòu)。另一種NMR技術(shù)，差示譜線增寬(DLB)幫助辨認化合物C中與聚合酶結(jié)合的片段以及在結(jié)合狀態(tài)下暴露于溶劑的片段。然后將該結(jié)合結(jié)構(gòu)對接(dock)在NS5B-化合物A復合物的X-射線衍生結(jié)構(gòu)上。通過將化合物A和化合物C的吲哚和苯并咪唑所共有的5/6芳香環(huán)重疊，開始對接過程。然后，計算所有差示譜線增寬數(shù)據(jù)，利用MOE使復合物能量最小化。
按照下述方法獲得轉(zhuǎn)移的NOESY和DLB數(shù)據(jù)。將15μL的DMSO-d6濃縮液(含0.31mg化合物C)加入由20mM Tris-d11，2mM DTT-d10，1mMEDTA-d12，300mM 和摻有TSP-2，2，3，3-d4的10％(v/v)D2O組成的含水緩沖液中，制得含化合物C的樣品管(5mm)。將緩沖液終體積加到600μL，pH調(diào)為6.0。記錄游離化合物C的光譜。往NMR管中加兩次HCV聚合酶濃縮貯存液，測定光譜。在緩沖液中，濃縮貯存物包含21.7mg/mL HCV聚合酶(NS5BΔ21C-His6)，其中緩沖液組成為20mM Tris-d11，2mM DTT-d10，1mM EDTA-d12，300mM 和10％(v/v)甘油-d8。
于22和27℃，在Bruker AVANCE 600和800MHz NMR光譜儀上獲得NMR譜。溶劑信號的抑制是通過利用預飽和或通過在獲得數(shù)據(jù)前插入3-9-19WATERGATE模塊獲得的。采集兩個樣品管的一維光譜，用于DLB對比，采集各光譜的128輪掃描。不含聚合酶的樣品管的NOESY試驗結(jié)果沒有觀察到預期的明顯交叉峰。另外，含聚合酶的樣品管的NOESY光譜觀察到許多交叉峰，其包括抑制劑C與HCV聚合酶結(jié)合時有價值的內(nèi)氫距離信息。記錄的一系列NOESY混合時間包括75，100，150，200和300秒(600和800MHz場)。通常獲得的二維數(shù)據(jù)組t2中是2048個點，t1中是512個點。取128輪掃描的均值用于NOESY FIDs。利用Bruker’s XWinNMR和WinNMR軟件(Bruker Canada，555 Steeles Ave.East，Milton，Ontario)加工和分析數(shù)據(jù)。在利用相移位sinebell窗口功能轉(zhuǎn)化后，對數(shù)據(jù)組進行零填充，產(chǎn)生2048×2048個真實數(shù)據(jù)點。
通過定制的模擬退火方法計算出化合物C結(jié)構(gòu)，該方法在MOE分子建模程序(CCG，Montreal，Qc，Canada)中實現(xiàn)。利用mmff94力場在MOE的2202.03版本中實現(xiàn)全部計算。從系列NOESY數(shù)據(jù)獲得NMR-衍生的平底限制(flat-bottomed restraint)。將NOESY交叉峰的相對強度分為3級，然后作為限制，強(1.8-2.7_)，中(1.8-3.5_)或弱(1.8-5.0_)。冷卻階段，NMR-衍生的平底限制中的力常數(shù)逐漸增高。在1000K進行單獨的高溫無限制動力學測試(run)，以10psec間隔收集100個結(jié)構(gòu)，獲得起始組構(gòu)象。各結(jié)構(gòu)利用下述模擬退火方法進行冷卻和最小化。在模擬過程中，溫度和限制權(quán)重(weight)分別是從1000K變到50K和從1/1000000變到20。使最終結(jié)構(gòu)發(fā)生能量最小化，計算總能量，計算限制能，確定限制背離(restraint violation)。分離出NMR-一致結(jié)構(gòu)，對兩個家族的結(jié)構(gòu)進行鑒定。
然后，將NMR-衍生結(jié)構(gòu)各家族的一個代表物對接在NS5B-化合物A復合物的X-射線衍生結(jié)構(gòu)上。通過將化合物A和化合物C的吲哚和苯并咪唑所共有5/6芳香環(huán)重疊開始對接過程?；衔顲只有一種結(jié)構(gòu)同時與DLB數(shù)據(jù)和結(jié)合袋形狀匹配。在該復合物中，化合物C的右手側(cè)位于Pro 495和Pro 496上或與Pro 495和Pro 496鄰近。利用MOE分子建模程序，可以對第503，498和499位氨基酸的側(cè)鏈取向進行略微重調(diào)，從而提高抑制劑-聚合酶吻合度。將His 428和502質(zhì)子化。利用最陡降幅、共軛梯度和刪簡的Newton算法的組合使復合物能量最小化，從而使該結(jié)構(gòu)只發(fā)生較小變化。建立一種方法，從而可以讓抑制劑與位于抑制劑6_內(nèi)的聚合酶殘基在最小化過程中移動，而其它所有殘基均固定，使用的遠程力閾值是9.5-10_。將在MOE分子建模程序2002.03版中運行的mmff94s力場用于計算，包括溶劑化。使用MOE分子建模程序進行復合物可視化。
NS5B-化合物C復合物的結(jié)構(gòu)坐標獲自最終的最小化，并示于圖6中。
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Thr Glu Arg Leu Tyr Ile Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly Gln            260                 265                 270Asn Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser        275                 280                 285Cys Gly Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Thr Ala Ala Cys Arg    290                 295                 300Ala Ala Lys Leu Gln Asp Cys Thr Met Leu Val Asn Gly Asp Asp Leu305                 310                 315                 320Val Val Ile Cys Glu Ser Ala Gly Thr Gln Glu Asp Ala Ala Ala Leu                325                 330                 335Arg Ala Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp            340                 345                 350Pro Pro Gln Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser        355                 360                 365Asn Val Ser Val Ala His Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu    370                 375                 380Thr Arg Asp Pro Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Ala385                 390                 395                 400Arg His Thr Pro Ile Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Met Tyr Ala                405                 410                 415Pro Thr Leu Trp Ala Arg Met Ile Leu Met Thr His Phe Phe Ser Ile            420                 425                 430Leu Leu Ala Gln Glu Gln Leu Glu Lys Ala Leu Asp Cys Gln Ile Tyr        435                 440                 445Gly Ala Cys Tyr Ser Ile Glu Pro Leu Asp Leu Pro Gln Ile Ile Glu    450                 455                 460Arg Leu His Gly Leu Ser Ala Phe Thr Leu His Ser Tyr Ser Pro Gly465                 470                 475                 480Glu Ile Asn Arg Val Ala Ser Cys Leu Arg Lys Leu Gly Val Pro Pro                485                 490                 495Leu Arg Thr Trp Arg His Arg Ala Arg Ser Val Arg Ala Lys Leu Leu            500                 505                 510Ser Gln Gly Gly Arg Ala Ala Thr Cys Gly Arg Tyr Leu Phe Asn Trp        515                 520                 525Ala Val Arg Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro Ile Pro Ala Ala Ser Gln    530                 535                 540Leu Asp Leu Ser Gly Trp Phe Val Ala Gly Tyr Ser Gly Gly Asp Ile545                 550                 555                 560Tyr His Ser Leu Ser Arg Ala Arg Pro Arg His His His His His His                565                 570                 575<210>2<211>4<212>PRT<213>HCV<400>2Ser Met Ser Tyr 1<210>3<211>4<212>PRT<213>HCV<400>3
Leu Gly Val Pro 1<210>4<211>8<212>PRT<213>HCV<400>4Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr 1               5<210>5<211>6<212>PRT<213>HCV<400>5Ile Leu Met Thr His Phe 1               5<210>6<211>12<212>PRT<213>HCV<400>6Leu Gly Val Pro Pro Leu Arg Thr Trp Arg His Arg 1               5                  10
權(quán)利要求
1.選自下組的分離且純化的多肽i)多肽，包括由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義的，或由其功能等同類似物定義的HCV NS5B抑制劑結(jié)合袋，其中所述結(jié)合袋由于取代了由至少氨基酸殘基18至35定義的手指環(huán)鏈而暴露出來，且所述結(jié)合袋保持其天然功能構(gòu)型；ii)HCV NS5B多肽類似物，包括由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義的，或由其功能等同類似物定義的HCV NS5B結(jié)合袋，其中所述結(jié)合袋保持其天然功能構(gòu)型且所述結(jié)合袋是可暴露的；iii)HCV NS5B多肽，其由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義的，或由其功能等同類似物定義的HCV NS5B結(jié)合袋組成，其中所述結(jié)合袋保持其天然功能構(gòu)型；和iv)HCV NS5B多肽變體，其在由氨基酸殘基18至35定義的手指環(huán)內(nèi)包括至少一個氨基酸突變，其中所述突變能導致該手指環(huán)被取代，而使基本由天然HCV NS5B的氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義的，或由其功能等同類似物定義的結(jié)合袋暴露，其中所述結(jié)合袋保持其天然功能構(gòu)型。
2.權(quán)利要求1所述的多肽，其中結(jié)合袋由選自氨基酸殘基37和496的一個或多個附加氨基酸殘基來定義。
3.權(quán)利要求2所述的多肽，其中結(jié)合袋由選自氨基酸殘基36，426，498和499的一個或多個附加氨基酸殘基來定義
4.權(quán)利要求1所述的多肽，其中結(jié)合袋額外由選自36-37，392-399，424-429和492-503中的一個或多個氨基酸簇定義。
5.權(quán)利要求2所述的多肽，其中結(jié)合袋具有氨基酸序列V37，L392，A393，A395，A396，T399，I424，L425，H428，F(xiàn)429，L492，G493，V494，P495，P496，W500和R503。
6.權(quán)利要求3所述的多肽，其中所述附加的氨基酸具有氨基酸序列M36，M426，R498和T499。
7.權(quán)利要求4所述的多肽，其中氨基酸簇36-37具有氨基酸序列M-V，氨基酸簇392-399具有氨基酸序列L-A-R-A-A-W-E-T，氨基酸簇424-429具有氨基酸序列I-L-M-T-H-F，且氨基酸簇492-503具有氨基酸序列L-G-V-P-P-L-R-T-W-R-H-R。
8.權(quán)利要求1所述的多肽，其中HCV NS5B多肽變體的第30和31位中的至少一個氨基酸殘基是突變的。
9.權(quán)利要求8所述的多肽，其中第30位的氨基酸殘基是突變的。
10.權(quán)利要求9所述的多肽，其中將第30位的氨基酸殘基突變?yōu)檫x自P，F(xiàn)，W，M，G，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R和H的氨基酸。
11.HCV NS5B多肽或其功能等同類似物，特征是取代了氨基酸殘基18至35。
12.HCV NS5B多肽或其功能等同類似物，其中刪除了至少氨基酸殘基18至35。
13.HCV NS5B晶體結(jié)構(gòu)，包含由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任選氨基酸殘基37或496的結(jié)構(gòu)坐標定義的，或由其功能等同類似物的結(jié)構(gòu)坐標定義的結(jié)合袋，其中取代了由至少氨基酸18至35的結(jié)構(gòu)坐標定義的天然手指環(huán)鏈，使所述結(jié)合袋暴露。
14.NS5B復合物，包含由權(quán)利要求1-12中任一項所述的多肽和化合物，其中化合物在NS5B多肽內(nèi)與結(jié)合袋結(jié)合，所述結(jié)合袋由天然HCV NS5B的氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任選氨基酸殘基37或496定義，或由其功能等同類似物定義。
15.權(quán)利要求14所述的復合物，其中所述化合物具有下述化學式(A)
16.權(quán)利要求14所述的復合物，其中所述化合物具有下述化學式(B)
17.權(quán)利要求14所述的復合物，其中所述化合物具有下述化學式(C)
18.一種制備結(jié)晶的HCV NS5B復合物的方法，所述復合物包含權(quán)利要求1-12中任一項所述的多肽和化合物，其中所述化合物與由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503并且任選氨基酸殘基37或496定義的，或由其功能等同類似物定義的NS5B結(jié)合袋結(jié)合，所述方法包含下述步驟a)在結(jié)晶緩沖液中保溫純化的HCV NS5B多肽，獲得結(jié)晶的NS5B多肽；b)將化合物溶解；和c)在浸泡緩沖液中，將所述結(jié)晶的NS5B多肽與溶解的化合物一起浸泡適當?shù)慕輹r間，獲得結(jié)晶的NS5B復合物。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中結(jié)晶緩沖液選自MES，磷酸鈉，磷酸鉀，乙酸鈉或琥珀酸鈉。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中使用的結(jié)晶緩沖液濃度在約50mM-0.2M之間。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中結(jié)晶緩沖液是濃度約0.1M的MES。
22.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述結(jié)晶緩沖液額外包括至少一種沉淀劑。
23.權(quán)利要求22所述的方法，其中沉淀劑是選自由PEG，PEG5K mme，硫酸銨，MPD，異丙醇，乙醇和叔丁醇組成的組中的沉淀劑。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中使用的沉淀劑濃度在約30％-約40％之間。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中沉淀劑是濃度約21％的PEG5K mme和濃度約0.4mM的硫酸銨。
26.權(quán)利要求18所述的方法，其中浸泡緩沖液是選自由MES，Tris，磷酸鈉，乙酸鈉和琥珀酸鈉組成的組中的浸泡緩沖液。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中使用的浸泡緩沖液濃度在約50mM-約0.2M之間。
28.權(quán)利要求18所述的方法，其中浸泡緩沖液包含最高約至10mg/mL的蛋白。
29.權(quán)利要求18所述的方法，其中浸泡緩沖液額外包括選自，和的一種或多種鹽。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中存在于浸泡緩沖液中的鹽濃度是約100mM-約500mM。
31.權(quán)利要求30所述的方法，其中浸泡緩沖液包含和。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中浸泡緩沖液包括濃度約210mM的和濃度約280mM的。
33.權(quán)利要求18所述的方法，其中浸泡緩沖液額外包括濃度約10-約20％的甘油。
34.權(quán)利要求18所述的方法，其中浸泡緩沖液額外包括至少一種沉淀劑。
35.權(quán)利要求34所述的方法，其中沉淀劑是選自由PEG，PEG5K mme，硫酸銨，MPD，異丙醇，乙醇和叔丁醇組成的組中的沉淀劑。
36.權(quán)利要求35所述的方法，其中沉淀劑的存在濃度是約10％-約18％。
37.權(quán)利要求36所述的方法，其中浸泡緩沖液包括濃度約14％的沉淀劑PEG5K mme(單甲醚聚乙二醇5000)和濃度約0.4mM的硫酸銨。
38.權(quán)利要求18所述的方法，其中浸泡時間是約3-約8小時。
39.權(quán)利要求38所述的方法，其中浸泡時間是約5-約6小時。
40.一種制備結(jié)晶的HCV NS5B復合物的方法，所述復合物包含權(quán)利要求1-12中任一項所述的多肽和化合物，其中所述化合物與由天然HCVNS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任選氨基酸殘基37或496定義的，或由其功能等同類似物定義的NS5B結(jié)合袋結(jié)合，其中該方法包含將所述化合物加到含結(jié)晶的HCV NS5B的結(jié)晶緩沖液中的步驟。
41.一種制備結(jié)晶的HCV NS5B復合物的方法，所述復合物包含權(quán)利要求1-12中任一項所述的多肽和化合物，其中所述化合物與由天然HCVNS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任選氨基酸殘基37或496定義的，或由其功能等同類似物定義的NS5B結(jié)合袋結(jié)合，所述方法包含下述步驟a)將純化的HCV NS5B與溶解的化合物混合，形成NS5B復合物；和b)在結(jié)晶緩沖液中讓復合物結(jié)晶。
42.權(quán)利要求14所述HCV NS5B復合物的一組X-射線晶體結(jié)構(gòu)坐標。
43.權(quán)利要求15所述HCV NS5B復合物的一組X-射線晶體結(jié)構(gòu)坐標。
44.權(quán)利要求43所述的坐標，如圖4所示。
45.權(quán)利要求16所述HCV NS5B復合物的一組X-射線晶體結(jié)構(gòu)坐標。
46.權(quán)利要求45所述的坐標，如圖5所示。
47.權(quán)利要求17所述HCV NS5B復合物的一組X-射線晶體結(jié)構(gòu)坐標。
48.權(quán)利要求47所述的坐標，如圖6所示。
49.一種計算機可讀性存儲介質(zhì)，其上存儲有權(quán)利要求14所述HCVNS5B復合物的晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)坐標。
50.一種計算機可讀性存儲介質(zhì)，其上存儲有權(quán)利要求15所述HCVNS5B復合物的晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)坐標。
51.權(quán)利要求50所述的存儲介質(zhì)，其上存儲有圖4所示的結(jié)構(gòu)坐標。
52.一種計算機可讀性存儲介質(zhì)，其上存儲有權(quán)利要求16所述HCVNS5B復合物的晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)坐標。
53.權(quán)利要求52所述的存儲介質(zhì)，其上存儲有圖5所示的結(jié)構(gòu)坐標。
54.一種計算機可讀性存儲介質(zhì)，其上存儲有權(quán)利要求17所述HCVNS5B復合物的晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)坐標。
55.權(quán)利要求54所述的存儲介質(zhì)，其上存儲有圖6所示的結(jié)構(gòu)坐標。
56.一種鑒定結(jié)合HCV NS5B的化合物的方法，包括下述步驟a)將三維分子模型算法應用于HCV NS5B結(jié)合袋的結(jié)構(gòu)坐標，確定HCV NS5B結(jié)合袋的空間坐標，其中所述結(jié)合袋的結(jié)構(gòu)坐標由天然HCVNS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任選氨基酸殘基37或496的結(jié)構(gòu)坐標定義的，或由其功能等同類似物的結(jié)構(gòu)坐標定義；和b)在HCV NS5B結(jié)合袋空間坐標的背景下對存儲所述化合物的空間坐標進行電子篩選，測定該化合物是否結(jié)合在HCV NS5B結(jié)合袋內(nèi)。
57.一種鑒定潛在HCV抑制劑的虛擬篩選方法，包括下述步驟a)構(gòu)建HCV NS5B結(jié)合袋的計算機模型，其中所述HCV NS5B結(jié)合袋由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任選氨基酸殘基37或496的結(jié)構(gòu)坐標定義，或由其功能等同類似物的結(jié)構(gòu)坐標定義；b)利用計算機工具，在待評化合物和NS5B結(jié)合袋的計算機模型之間進行吻合度程序操作，提供結(jié)合袋中化合物的能量最小化構(gòu)型；和c)對該吻合度操作的結(jié)果進行評價，量化化合物和結(jié)合袋間的結(jié)合，其中與結(jié)合袋結(jié)合并獲得低能量、穩(wěn)定復合物的化合物就是潛在的NS5B抑制劑。
58.權(quán)利要求57所述的方法，其中復合物的范德華相互作用能量值小于約8000kcal/mol。
59.權(quán)利要求58所述的方法，其中復合物的范德華相互作用能量值小于約6000kcal/mol。
60.權(quán)利要求59所述的方法，其中復合物的范德華相互作用能量值小于約4000kcal/mol。
61.一種篩選候選HCV NS5B抑制劑化合物的方法，包括下述步驟a)在適宜結(jié)合的條件下，保溫權(quán)利要求1-12中任一項所述多肽和候選抑制劑化合物；和b)測定候選抑制劑化合物是否與多肽結(jié)合，其中與多肽結(jié)合的化合物是潛在的HCV NS5B抑制劑。
62.一種設(shè)計與權(quán)利要求1-12中任一項所述多肽結(jié)合的化合物的方法，包括評估化合物和NS5B多肽中結(jié)合袋間的互補性，其中所述結(jié)合袋由天然HCV NS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任選氨基酸殘基37或496定義，或由其功能等同類似物定義。
63.一種產(chǎn)生抑制HCV NS5B的RNA復制活性的藥物的方法，包括鑒定或設(shè)計與NS5B結(jié)合袋吻合的化合物，所述NS5B結(jié)合袋由天然HCVNS5B的至少氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任選氨基酸殘基37或496定義，或由其功能等同類似物定義，其中所述結(jié)合袋由于由至少氨基酸殘基18至35定義的手指環(huán)鏈被取代而被暴露。
全文摘要
HCV聚合酶，當與某些抑制劑復合時，會采用取代手指環(huán)區(qū)而暴露結(jié)合袋的構(gòu)象，其中所述手指環(huán)區(qū)由氨基酸殘基18至35定義，結(jié)合袋通常由氨基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，496，500和503定義。這種新的暴露型結(jié)合袋為尋找能結(jié)合HCV NS5B，并調(diào)節(jié)或優(yōu)選抑制HCV NS5B聚合酶活性的其它化學實體定義了一種新的靶標。
文檔編號C12N5/08GK1820022SQ200480019473
公開日2006年8月16日 申請日期2004年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月9日
發(fā)明者勒內(nèi)·庫隆比, 皮埃爾·L·博利厄, 埃里克·約里庫爾, 喬治·庫科爾, 斯蒂文·萊普蘭特, 馬克-安德烈·波帕特 申請人:貝林格爾.英格海姆國際有限公司