專利名稱：炎癥狀態(tài)下在血腦屏障中差異表達(dá)的核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的核酸及其編碼的多肽，其表達(dá)在血腦屏障功能經(jīng)歷早期動態(tài)炎癥誘導(dǎo)的改變的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中被調(diào)節(jié)。這些多肽在本文被稱作“脂多糖敏感性(lipopolysaccharide-sensitive)”多肽(LPSS多肽)。本發(fā)明還涉及用于在需要這種生物學(xué)作用的哺乳動物中控制血腦屏障性質(zhì)的方法。這包括診斷和治療血腦/視網(wǎng)膜屏障失調(diào)、腦(包括眼)疾病以及外周血管疾病。另外，本發(fā)明進(jìn)一步涉及抗LPSS多肽抗體或配體作為診斷探針、作為血腦屏障靶向劑或者作為治療劑的應(yīng)用，以及LPSS多肽的表達(dá)、激活或生物活性配體或調(diào)節(jié)劑作為診斷探針、治療劑或藥物輸送增強(qiáng)劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
為了正確發(fā)揮功能，神經(jīng)元需要緊密調(diào)節(jié)的胞外環(huán)境。這種基本的、適當(dāng)?shù)奈h(huán)境是由稱為星形膠質(zhì)細(xì)胞(或星形膠質(zhì))的滋養(yǎng)腦細(xì)胞局部維持的。為應(yīng)付血液和腦的胞外區(qū)室的成分之間顯著及可變的不同，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)還通過許多血液-CNS屏障而與一般的血液循環(huán)隔離開，所述屏障即血腦屏障、血液腦脊液(CSF)屏障、軟膜管(pial vessle)-CSF屏障、室管膜和神經(jīng)膠質(zhì)界限，以及血液-視網(wǎng)膜屏障、血液-神經(jīng)屏障、血液-脊髓屏障。血腦屏障(BBB)被認(rèn)為是最重要的血液-CNS屏障，因?yàn)榕c其它血液-CNS屏障相比其覆蓋表面積大1000倍。BBB特征在于覆蓋在CNS中毛細(xì)血管的獨(dú)特的緊密的內(nèi)皮細(xì)胞層。再者，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過在毛細(xì)管上伸出“神經(jīng)膠質(zhì)足(glialfoot)”而在這些內(nèi)皮細(xì)胞中是BBB性質(zhì)的主要誘導(dǎo)物。
特別地，BBB調(diào)節(jié)離子(Na+、K+、Ca2+)、水、營養(yǎng)素、代謝物、神經(jīng)遞質(zhì)(谷氨酸、色氨酸)、血漿蛋白(白蛋白、血纖蛋白原、免疫球蛋白)、免疫系統(tǒng)的細(xì)胞及異生素(藥物)進(jìn)和出腦的運(yùn)輸。腦中的毛細(xì)管內(nèi)皮與外周毛細(xì)管相比具有特殊的性質(zhì)。其具有狹窄的緊密連接、沒有透明斑、低胞飲活性及連續(xù)的基底膜。這種狹窄的緊密連接導(dǎo)致1500-2000Ohm.cm2高電阻。另外，內(nèi)皮細(xì)胞具有負(fù)表面電荷，排斥負(fù)電荷的化合物。它們具有許多線粒體和酶以分解化合物及具有多種選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以將營養(yǎng)素及其它化合物主動轉(zhuǎn)運(yùn)至腦內(nèi)和腦外。在健康狀況下，BBB不僅調(diào)節(jié)藥物或內(nèi)源化合物進(jìn)入腦，而且與外周器官相比細(xì)胞滲入也較低。正常的內(nèi)皮細(xì)胞層提供了血栓抗性表面，防止血小板和白細(xì)胞粘附及任何凝固系統(tǒng)的激活。高度特化的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞形成緊密的屏障，其將腦與免疫監(jiān)視隔離并僅使少量單核的細(xì)胞(如激活的T細(xì)胞)遷移至CNS。主要組織相容性復(fù)合體抗原的低表達(dá)、健康CNS中抗原呈遞細(xì)胞的低數(shù)目及CNS不是由充分發(fā)育的淋巴管系統(tǒng)適當(dāng)引流的事實(shí)使得腦是“免疫隔離(immunosecluded)”部位。
目前關(guān)于BBB的解剖基礎(chǔ)的理解是其作為被動態(tài)調(diào)節(jié)的器官起作用，受外周(例如皮質(zhì)醇、腎上腺素)和局部激素(例如細(xì)胞因子、趨化因子)的影響。除了星形膠質(zhì)細(xì)胞之外，一些其它細(xì)胞如周細(xì)胞、神經(jīng)元和免疫系統(tǒng)的細(xì)胞影響其性質(zhì)。接下來，內(nèi)皮參與其它過程如凝固、血管緊張(vasotonus)的控制、抗原呈遞及由例如通過生長因子對基底膜的控制。特別地，在病理狀況如腦和大腦炎癥、腦腫瘤中血管發(fā)生的情況下，激活的內(nèi)皮起重要作用。
一般地，可認(rèn)為BBB是保護(hù)腦穩(wěn)態(tài)的器官。非令人驚奇地，BBB的功能異常在大量的腦病變中起關(guān)鍵作用。一些實(shí)例是
i.腦血管性水腫(cerebral vasogenic edema)是由于疾病(炎癥)導(dǎo)致的來自血液的血漿蛋白和水滲入腦組織所致。這是在病變?nèi)缧菘?、腦部感染、頭部外傷、腦腫瘤和多發(fā)性硬化中導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因。水腫導(dǎo)致腦在顱骨的堅(jiān)硬環(huán)境內(nèi)膨脹。所引起的顱內(nèi)壓增高隨后可導(dǎo)致腦疝及隨后的腦的基本功能如呼吸功能喪失，如果不加治療，則導(dǎo)致嚴(yán)重的殘疾、昏迷甚至死亡。
ii.在多發(fā)性硬化中，激活的自身反應(yīng)性T細(xì)胞穿過激活的BBB。在CNS中，這些T細(xì)胞誘導(dǎo)針對髓鞘質(zhì)的炎癥應(yīng)答，其也導(dǎo)致BBB的破壞。自身抗體和補(bǔ)體因子穿過破壞的BBB，導(dǎo)致脫髓鞘。髓鞘質(zhì)片段還通過破壞的BBB回滲入外周，在此其激活更多的自身反應(yīng)性T細(xì)胞并增加更多的自身抗體產(chǎn)生。
iii.不能保證細(xì)胞外液中精密的離子和神經(jīng)遞質(zhì)的平衡將導(dǎo)致神經(jīng)元信號傳遞損害并因此損害認(rèn)知功能、神經(jīng)精神疾病或癲癇發(fā)作。
iv.毒性蛋白質(zhì)穿過BBB進(jìn)入血流的清除受損與神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病和朊病毒病如克雅氏(Creutzfeldt-Jakob)病和BSE的發(fā)病機(jī)理相關(guān)。這種蛋白質(zhì)的病理性積聚導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡及隨后損害了認(rèn)知功能。
因此治愈的功能異常的BBB展現(xiàn)了治療腦病癥的新方法。腦失調(diào)在西方世界是導(dǎo)致發(fā)病和殘疾的主要因素。新LPSS多肽的鑒定和定性將被證明是符合這些需要的，所述新LPSS多肽的基因表達(dá)在血腦屏障功能性經(jīng)歷早期動態(tài)炎癥誘導(dǎo)的改變的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中被調(diào)節(jié)。
除了具有治愈BBB能力以治療腦失調(diào)的所需藥物之外，正確發(fā)揮功能的BBB也是阻斷或降低介導(dǎo)免疫應(yīng)答的淋巴細(xì)胞進(jìn)入腦所必需的。同樣也是轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞進(jìn)入腦所必需的。新LPSS多肽的鑒定和定性將被證明是符合這些需要的，所述新LPSS多肽的基因表達(dá)在血腦屏障功能性經(jīng)歷早期動態(tài)炎癥誘導(dǎo)的改變的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中被調(diào)節(jié)。
然而，BBB也限制異生素(如藥物和診斷劑)輸送至腦，這使得腦失調(diào)的傳統(tǒng)藥物治療(即靶向神經(jīng)元)變得復(fù)雜。因此還需要通過可逆性開放BBB而操縱BBB的通透性以將血液運(yùn)載的膜不通透的藥物輸送至腦，或者通過內(nèi)源性BBB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)選擇性將藥物靶向于腦。對經(jīng)過血液-睪丸屏障和血液-胎盤屏障的藥物輸送也同樣。新LPSS多肽的鑒定和定性將被證明是符合這些需要的，所述新LPSS多肽的基因表達(dá)在血腦屏障功能性經(jīng)歷早期動態(tài)炎癥誘導(dǎo)的改變的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中被調(diào)節(jié)。
也需要在除了血管失調(diào)中受影響的腦或眼之外的其它器官的微血管中操縱BBB的性質(zhì)。在外周微血管中導(dǎo)入BBB性質(zhì)對如下病癥是有益的(微)血管病、病理性血管發(fā)生、血液-睪丸屏障或血液-胎盤屏障失調(diào)及如肺水腫、細(xì)菌內(nèi)毒素導(dǎo)致的休克、過度纖維蛋白溶解(hyperfibrinolysis)及過敏性休克等病癥。新LPSS動態(tài)的鑒定和定性將被證明是符合這些需要的，所述新LPSS多肽的基因表達(dá)在血腦屏障功能性經(jīng)歷早期動態(tài)炎癥誘導(dǎo)的改變的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中被調(diào)節(jié)。
長期以來已知腦星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞(BCEC)中通過伸出血管周足(perivascular end feet)而誘導(dǎo)BBB性質(zhì)(Arthur et al.，1987，Brain Res.433155-159；Janzer and Raff，1987，Nature 325253-257)。長期以來也已知這種誘導(dǎo)是由可溶的因子帶來的，因?yàn)樾切文z質(zhì)細(xì)胞條件化的培養(yǎng)基(ACM)可再現(xiàn)一些這樣的誘導(dǎo)作用(Tio etal.，1990，Eur.J.Morphol.28(2-4)289-300)。已經(jīng)鑒別了一些候選分子，其能模擬在BCEC中ACM介導(dǎo)的屏障誘導(dǎo)現(xiàn)象，這些分子包括TGFβ、GDNF、bFGF、IL-6和類固醇。一些人員發(fā)現(xiàn)這種因子不是蛋白質(zhì)或肽，其含有一種鐵-氧化氮加成物(Federici et al.，1995，J.Neurochem.64(3)1008-1015；Regina et al.，2001，Biochim.Biophys.Acta 1540(3)233-242)。因此人們可推斷盡管存在一些研究成果，但仍未鑒別可靠的星形膠質(zhì)細(xì)胞衍生因子。
在先前的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)暴露于ACM的最初分離的BCEC在培養(yǎng)中保持許多基本的BBB性質(zhì)(Gaillard et al.，2001，Eur J Pharm Sci.12(3)215-222)。通過在細(xì)胞培養(yǎng)孔的底部導(dǎo)入最初培養(yǎng)的腦星形膠質(zhì)細(xì)胞，則經(jīng)過在濾膜插入物上培養(yǎng)的BCEC單層細(xì)胞的跨內(nèi)皮電阻(transendothelial electrical resistance，TEER)比在只有ACM中培養(yǎng)的BCEC單層細(xì)胞增加至大約150％。另外，當(dāng)將星形膠質(zhì)細(xì)胞在濾膜插入物的底部培養(yǎng)時(shí)，因此與BCEC非常接近，TEER倍增3-8倍。另外，熒光素鈉(FLU，分子量376Da)和FITC標(biāo)記的葡聚糖(FD4，分子量4kDa)的細(xì)胞旁(paracellular)轉(zhuǎn)運(yùn)降低至在只有ACM中培養(yǎng)的BCEC的大約50％?？傊?，BCEC的星形膠質(zhì)細(xì)胞的接近性確定作用的程度，盡管它們不與BCEC物理性接觸(Gaillard et al.，2001，如前)。
TEER是量化小離子通過BCEC之間緊密連接的通透性的一種靈敏的量度標(biāo)準(zhǔn)。TEER因此代表了緊密連接的功能性，其被認(rèn)為是BBB的主要特點(diǎn)。TEER的絕對值主要依賴于細(xì)胞之間緊密連接的數(shù)量和復(fù)雜性。另外，其還是大的和親水性化合物的旁細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的限制因素。
在另外的研究中，我們發(fā)現(xiàn)在濾膜插入物的底部培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞1)在第一次傳代后在BCEC上保持(或(再)誘導(dǎo))P-糖蛋白(Pgp，參與多種藥物抗性的藥物流出泵)的表達(dá)(Gaillard et al.，2000，Pharm.Res.17(10)1198-1205)；2)降低長春花堿誘導(dǎo)的BBB破壞的敏感性(Pgp功能性分析)(Gaillard et al.，2000，如前)；3)盡管PgP在BCEC單層細(xì)胞中表達(dá)，星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)PgP底物從濾膜的基底外側(cè)(CNS)主動轉(zhuǎn)運(yùn)至頂端(血液)，但這在BCEC單層細(xì)胞中觀測不到(Gaillard etal.，2000，如前)；4)介導(dǎo)對LPS誘導(dǎo)的BCEC破壞的保護(hù)性應(yīng)答(Gaillard，2000a，Ph.D.Thesis Leiden University，p 81-97)。這些作用無一是僅由ACM誘導(dǎo)的。顯然，濾膜插入物的底部星形膠質(zhì)細(xì)胞的物理性和最接近的存在當(dāng)與只有ACM的情況對比時(shí)，在BCEC中誘導(dǎo)BBB性質(zhì)方面是出眾的。
因此需要另外的產(chǎn)物、方法和分析以提供控制BBB性質(zhì)或者鑒定和調(diào)節(jié)對BBB功能性的早期動態(tài)炎癥誘導(dǎo)的改變的細(xì)胞應(yīng)答及對這種改變的組織應(yīng)答的手段。這種產(chǎn)物、方法和分析在如上述那些眾多的醫(yī)學(xué)病癥和程序中提供益處。
發(fā)明描述
定義
“多肽活性或穩(wěn)態(tài)水平的改變”在本文是指與在健康個(gè)體中正?；钚曰蚍€(wěn)態(tài)相比，多肽的生物學(xué)活性或蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)水平的任何可檢測的變化。
“激動劑”在本文是指模擬生物學(xué)活性、優(yōu)選一種多肽、受體或其配體的生物學(xué)活性的任何分子。拮抗劑是部分或完全阻斷、抑制或中和這種生物學(xué)活性的任何分子。
術(shù)語血管病失調(diào)的“治療”是指降低或減輕個(gè)體的一或多種癥狀，預(yù)防一或多種癥狀惡化或進(jìn)展，促進(jìn)康復(fù)或改善預(yù)后，和/或預(yù)防未患病個(gè)體患上疾病以及減慢或降低現(xiàn)有疾病的進(jìn)展。對于給定的個(gè)體，癥狀的改善、其惡化、衰退或進(jìn)展可以通過客觀或主觀量度標(biāo)準(zhǔn)而確定。治療效力可以根據(jù)發(fā)病率或死亡率的改善而測定(例如對于選定的群體存活曲線的延長)。
內(nèi)皮細(xì)胞/血管屏障的通透性增加使其更加滲漏(leaky)(即緊密性更低，通透性更高)。內(nèi)皮細(xì)胞/血管屏障的通透性降低使其更加緊密(即滲漏性更低、通透性更低)。治療血管失調(diào)因此意味著降低血管通透性，然而增加藥物輸送因此需要增加血管通透性。在BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物的BCEC中被上調(diào)的本發(fā)明LPSS多肽參與增加血管通透性。在BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物的BCEC中被下調(diào)的本發(fā)明LPSS多肽參與增加血管通透性。在BCEC單層細(xì)胞和BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物之間被差異上或下調(diào)的本發(fā)明的LPSS多肽參與從炎癥刺激中恢復(fù)的能力(圖2)。
內(nèi)皮細(xì)胞通透性的調(diào)節(jié)
本發(fā)明的第一方面涉及一種調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的方法。所述方法包括改變內(nèi)皮細(xì)胞中LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平，LPSS多肽具有與SEQ ID NO1-25所示氨基酸序列至少90％相同性的氨基酸序列。
序列相同性或相似性在下文描述。
所述內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)選是血管內(nèi)皮細(xì)胞，更優(yōu)選是微血管內(nèi)皮細(xì)胞。最優(yōu)選的內(nèi)皮細(xì)胞是組成或者是血液-中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)屏障的一部分的微血管內(nèi)皮細(xì)胞，最優(yōu)選的是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，所述屏障如血腦屏障、血液-視網(wǎng)膜屏障、血液-神經(jīng)屏障、血液-脊髓屏障。
這種內(nèi)皮屏障細(xì)胞可以在原位、離位(ex situ)(即在分離的毛細(xì)管中)或在體外通過例如特異性內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記、特異性屏障標(biāo)記鑒定，但也可以通過屏障功能分析而鑒定。更特別地，內(nèi)皮細(xì)胞可以通過其原位形態(tài)學(xué)而鑒定，即直徑為大約10-20微米的由單一的(或者不超過三個(gè))連續(xù)連接的內(nèi)皮細(xì)胞形成的管狀結(jié)構(gòu)，由連續(xù)的基板圍繞，其中外周血管周細(xì)胞位于此并且星形膠質(zhì)細(xì)胞終足在其上伸出。通過例如電子顯微鏡可觀測到在原位和離位以及在體外，屏障樣內(nèi)皮細(xì)胞的厚度均在1-5微米之間，具有許多線粒體，通過緊密連接而連接，無細(xì)胞間縫隙，無穿孔及很少的胞飲泡。在體外，毛細(xì)管結(jié)構(gòu)可以通過其在培養(yǎng)中的形態(tài)學(xué)而鑒定，即直徑為大約10-20微米、長度在50-200微米之間的管狀結(jié)構(gòu)。通過例如相差顯微鏡可觀測到在體外，內(nèi)皮細(xì)胞可以通過其在培養(yǎng)中的形態(tài)學(xué)而鑒定，即鵝卵石形(當(dāng)例如從毛細(xì)管中以簇生長時(shí))和紡錘形(當(dāng)鋪滿時(shí))，居中有橢圓形核。它們也可以通過使用一組普通的內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記和功能而鑒定，例如分化(CD)抗原的內(nèi)皮細(xì)胞特異性簇的表達(dá)(VCAM(CD106)、CD31、EN-4、ICAMs、E-選擇蛋白(E-Selectin)、PECAM、RBA)、鈣粘著蛋白、整聯(lián)蛋白、肌動蛋白、波形蛋白、因子VIII相關(guān)抗原(vWF)、膠原蛋白I和IV、纖連蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶、金屬蛋白酶的組織抑制劑；非凝血酶原性(non-thrombogenicity)；低白細(xì)胞粘附；血管活性化合物的釋放(氧化氮、內(nèi)皮縮血管肽-1和前列環(huán)素)；DiI-標(biāo)記的-乙?；兔芏戎鞍?DiI-Ac-LDL)的吸收；凝集素結(jié)合；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、堿性磷酸酶、單胺氧化酶和陰離子位點(diǎn)的存在。另外，可以使用典型的屏障標(biāo)記和功能，如緊密連接或緊密連接相關(guān)蛋白(ZO-1)的觀測及參考化合物(例如Evans藍(lán)(結(jié)合白蛋白)、甘露醇、蔗糖、熒光素、葡聚糖、白蛋白、AIB)的限制旁細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)；沒有囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)；沒有非屏障標(biāo)記如PAL-E；γ-谷氨酰-轉(zhuǎn)肽酶(γ-GTP)的表達(dá)；P-糖蛋白(Pgp)的表達(dá)和功能性、多重藥物抗性蛋白1-7、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、大的和中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；運(yùn)鐵蛋白受體、胰島素-生長因子受體、清除劑受體；許多線粒體的邊緣F-肌動蛋白定位及表達(dá)，盡管這些無一特異于內(nèi)皮細(xì)胞。這些標(biāo)記的(功能性)表達(dá)可以通過例如分子生物學(xué)、生物化學(xué)、(免疫)-組織(細(xì)胞)化學(xué)技術(shù)以及使用已知底物、配體和/或抑制劑進(jìn)行功能分析而確定。這些標(biāo)記已經(jīng)在國際學(xué)術(shù)雜志上進(jìn)行了描述和評述(de Boer etal.，1999，Eur J Pharm Sci.8(1)1-4；Hofman et al.，2001，InvestOphthalmol Vis Sci.42(5)895-901；Schlingemann et al.，1997，Ophthalmic Res.29(3)130-8；Schlingemann et al.，1999，Diabetologia.42(5)596-602；Vorbrodt et al.，1986，Brain Res.394(1)69-79；Dai etal.，2002，Brain Res.954(2)311-316)。
內(nèi)皮細(xì)胞的通透性在本文中是指化合物(可以是離子(例如Na+、K+、Ca2+)、水、營養(yǎng)物質(zhì)(例如葡萄糖、氨基酸)、代謝物、神經(jīng)遞質(zhì)(例如谷氨酸、色氨酸)、激素、肽、血漿蛋白(例如白蛋白、纖維蛋白原、免疫球蛋白、細(xì)胞因子、生長因子)、細(xì)胞和異生素(例如藥物、診斷標(biāo)記))可以從腔至近腔室方向擴(kuò)散或者(主動)轉(zhuǎn)運(yùn)或者穿過內(nèi)皮細(xì)胞層(反之亦然)的能力的測量標(biāo)準(zhǔn)。內(nèi)皮細(xì)胞通透性的改變也可以是給定化合物(可以是營養(yǎng)物質(zhì)(例如葡萄糖、氨基酸)、代謝物、神經(jīng)遞質(zhì)(例如谷氨酸、色氨酸)、激素、肽、血漿蛋白(例如白蛋白、纖維蛋白原、免疫球蛋白、細(xì)胞因子、生長因子)、細(xì)胞和異生素(例如藥物、診斷標(biāo)記))的內(nèi)皮細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的結(jié)果。通透性的調(diào)節(jié)包括增加或降低通透性。通透性可以如實(shí)施例所述常規(guī)地在體外通過確定跨內(nèi)皮電阻(TEER)而確定。TEER是量化離子通過細(xì)胞之間緊密連接的通透性的一種靈敏的測量標(biāo)準(zhǔn)。在本發(fā)明的方法中，內(nèi)皮細(xì)胞通透性的調(diào)節(jié)優(yōu)選導(dǎo)致TEER變化為至少20％、50％、100％、300％或1000％(Gaillard et al.，2000b，Eur J Pharm Sci.12(2)95-102)的調(diào)節(jié)。確定通透性的其它方法包括例如論證參與通透性控制的上述內(nèi)皮細(xì)胞/屏障標(biāo)記的(功能性)表達(dá)改變，通過例如分子生物學(xué)、生物化學(xué)、(免疫)-組織(細(xì)胞)化學(xué)技術(shù)或者通過使用轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的已知底物、配體和/或抑制劑的功能分析而進(jìn)行。更特異地，通透性的改變可以通過緊密連接表達(dá)的喪失、細(xì)胞間縫隙的出現(xiàn)、穿孔和/或胞飲泡的數(shù)目和定位而確定，這可以通過例如電子顯微鏡觀測(Hofman et al.，2001，如前)。參與內(nèi)皮細(xì)胞通透性的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)水平改變均是內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變的標(biāo)示，所述內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記如ZO-1、PAL-E、RBA、F-肌動蛋白、因子VIII相關(guān)抗原(vWF)、γ-GTP、Pgp、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、PECAM、整聯(lián)蛋白、鈣粘著蛋白-5、運(yùn)鐵蛋白受體、凝集素結(jié)合位點(diǎn)或堿性磷酸酶(Gaillard et al.，2001，如前；de Boer et al.，1999，如前；Schlingemann et al.，1997，如前；Schlingemann et al.，1999，如前；Tio et al.，1990，如前；Vorbrodt et al.，1986，如前；Dai et al.，2002，如前)。對于參考化合物(例如甘露醇、蔗糖、熒光素、葡聚糖、白蛋白)的限制旁細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、Pgp-底物(羅丹明123、長春花堿等)或運(yùn)鐵蛋白穿過內(nèi)皮細(xì)胞層的極性和主動及可抑制的(用例如異搏定、PSC-833、溫度)轉(zhuǎn)運(yùn)的功能分析是內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變的標(biāo)示(Gaillard et al.，2000，如前；Gaillard et al.，2001，如前)。
體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞的通透性可以如上述在體外情況中通過論證參與通透性控制的內(nèi)皮細(xì)胞/屏障標(biāo)記的(功能性)表達(dá)的改變而確定(通過例如分子生物學(xué)、生物化學(xué)、(免疫)-組織(細(xì)胞)化學(xué)技術(shù)或者通過使用轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的已知底物、配體和/或抑制劑進(jìn)行功能性分析)。另外，內(nèi)源(例如纖維蛋白原、IgG)或者(熒光或放射標(biāo)記的)外源(例如Evans藍(lán)(與白蛋白結(jié)合)、甘露醇、蔗糖、熒光素、葡聚糖、白蛋白、AIB)參考化合物的外滲可以通過(免疫)-組織(細(xì)胞)化學(xué)技術(shù)或通過一些體內(nèi)取樣方法確定，如腦吸收指數(shù)(BUI，Oldendorf，1970 BrainRes.24(2)372-376)、腦外向通量指數(shù)(brain efflux index，BEI，Kakeeet al.，1996 J Pharmacol Exp Therap.277(3)1550-1559)、原位灌流(Takasato et al.，1984 Am J Physiol.247(3 Pt 2)H484-493)、單一或多重途徑腦灌流(Brodie et al.，1960 J Pharmacol Exp Ther.130519-528)、CSF取樣(單位脈沖應(yīng)答，van Bree et al.，1989.J.Pharmacokin.Biopharm.17(4)441-462)、正電子發(fā)射X線斷層攝影術(shù)(PET，Hendrikse et al.，1998 Br J Pharmacol.124(7)1413-1418)、磁共振技術(shù)(MRI，MRS，Jenkins et al.，1999 Ann N Y Acad Sci.893214-242)、定量放射自顯影術(shù)(QAR，Smith，1989 In Implications of the blood-brainbarrier and its manipulation，vol.1Basic science aspects.New YorkPlenum Publ.Corp.，ed.EA Neuwelt，85-118)及腦內(nèi)微量透析(de Langeet al.，2000 Adv Drug Deliv Rev.45(2-3)125-148)。
在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平可以在多肽自身的水平改變，例如通過將外源的LPSS多肽提供給內(nèi)皮細(xì)胞，或者通過向內(nèi)皮細(xì)胞加入LPSS多肽的拮抗劑或抑制劑如LPSS多肽的抗體而進(jìn)行。為提供外源的LPSS多肽，LPSS多肽可以如下述常規(guī)地通過編碼LPSS多肽的核酸在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)而產(chǎn)生。LPSS多肽的抗體可以如下述獲得。
或者，LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平可以通過調(diào)節(jié)編碼該多肽的核苷酸序列的表達(dá)水平而改變。優(yōu)選地，核苷酸序列的表達(dá)水平在內(nèi)皮細(xì)胞中被調(diào)節(jié)。LPSS多肽的表達(dá)水平可以通過將一種表達(dá)載體導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞中而被上調(diào)，其中所述表達(dá)載體包含編碼LPSS多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列在能驅(qū)動該核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。LPSS多肽的表達(dá)水平也可以通過將一種表達(dá)載體導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞中而被上調(diào)，其中所述表達(dá)載體包含編碼能反式激活編碼LPSS多肽的內(nèi)源核苷酸序列的因子的核苷酸序列。
或者，LPSS多肽的表達(dá)水平可以通過為細(xì)胞提供一種反義分子而被下調(diào)，所述反義分子能抑制編碼LPSS多肽的核苷酸序列的表達(dá)。所述反義分子可如此提供或者其可以通過將一種表達(dá)載體導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞中而提供，其中所述表達(dá)載體包含能抑制編碼LPSS多肽的核苷酸序列表達(dá)的一種反義核苷酸序列，而且所述反義核苷酸序列在能驅(qū)動該反義核苷酸在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。LPSS多肽的表達(dá)水平也可以通過將一種表達(dá)載體導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞中而被下調(diào)，其中所述表達(dá)載體包含編碼能反式抑制編碼LPSS多肽的內(nèi)源核苷酸序列的因子的核苷酸序列。
一般地，LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平可因此如下修飾
1.增加基因表達(dá)，例如通過提供
(a)一種表達(dá)或基因治療載體，其中編碼LPSS多肽的核苷酸序列可操縱地與啟動子連接；
(b)一種表達(dá)或基因治療載體，其中編碼LPSS多肽受體的核苷酸序列與啟動子可操縱地連接；
(c)一種表達(dá)或基因治療載體，其中編碼LPSS多肽受體的激動劑的核苷酸序列與啟動子LPSS可操縱地連接；
(d)一種表達(dá)或基因治療載體，其中編碼LPSS多肽受體的拮抗劑的核苷酸序列與啟動子LPSS可操縱地連接。
2.通過提供任何功能性RNA分子而降低基因表達(dá)，例如最近Famulok et al.(2002，Trends Biotechnol.，20(11)462-466)所述，所述RNA分子包括例如
(a)針對編碼LPSS多肽的核苷酸序列的反義核酸分子；
(b)針對編碼LPSS多肽受體的核苷酸序列的反義核酸分子；
(c)針對編碼LPSS多肽受體激動劑的核苷酸序列的反義核酸分子；
(d)針對編碼LPSS多肽受體拮抗劑的核苷酸序列的反義核酸分子；
(e)一種表達(dá)或基因治療載體，其中針對編碼LPSS多肽的核苷酸序列的反義核酸序列與啟動子可操縱地連接；
(f)一種表達(dá)或基因治療載體，其中針對編碼LPSS多肽受體的核苷酸序列的反義核酸序列與啟動子可操縱地連接；
(g)一種表達(dá)或基因治療載體，其中針對編碼LPSS多肽受體激動劑的核苷酸序列的反義核酸序列與啟動子可操縱地連接；
(h)一種表達(dá)或基因治療載體，其中針對編碼LPSS多肽受體拮抗劑的核苷酸序列的反義核酸序列與啟動子可操縱地連接。
3.激動劑，包括例如
(a)LPSS多肽的全部或部分激動劑，如
(i)天然配體；
(ii)LPSS多肽或其片段；
(iii)肽模擬物；
(iv)激動性抗體或抗體片段；
(v)小分子，或另一種藥物；
(b)LPSS多肽受體的全部或部分激動劑，例如
(i)天然配體；
(ii)LPSS多肽或其片段；
(iii)肽模擬物；
(iv)激動性抗體或抗體片段；
(v)小分子，或另一種藥物。
2.拮抗劑，包括例如
(a)LPSS多肽的全部或部分拮抗劑，如
(i)天然拮抗劑；
(ii)LPSS多肽片段；
(iii)肽模擬物；
(iv)拮抗或中和抗體或抗體片段；
(v)小分子，或另一種藥物；
(b)LPSS多肽受體的部分或反向激動劑，例如
(i)天然配體；
(ii)LPSS多肽片段；
(iii)肽模擬物；
(iv)抗體或抗體片段；
(v)小分子，或另一種藥物；
(c)LPSS多肽受體的全部或部分拮抗劑，
(i)天然的LPSS多肽受體拮抗劑；
(ii)LPSS多肽片段；
(iii)肽模擬物；
(iv)拮抗或中和抗體或抗體片段；
(v)小分子，或另一種藥物。
因此，在本發(fā)明的方法中，內(nèi)皮細(xì)胞的通透性優(yōu)選通過增加LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平而降低，LPSS多肽具有與選自由SEQ ID NO2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示的氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。更優(yōu)選地，通透性通過增加LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平而降低，LPSS多肽選自下調(diào)的分泌因子(SEQ ID NO2、3、4和23)、下調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO6、7、8、9、10和11)、差異上調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO19)、下調(diào)的受體和粘著分子(SEQ ID NO20)及差異上調(diào)的代謝酶(SEQ ID NO23-25)。LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平可以通過上述任何方式增加，例如通過將一種表達(dá)載體導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞中，其中所述表達(dá)載體包含編碼LPSS多肽的核苷酸序列，且所述核苷酸序列在能驅(qū)動該核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
或者，在本發(fā)明的方法中，內(nèi)皮細(xì)胞的通透性可以通過降低LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平而降低，LPSS多肽具有與選自由SEQ ID NO1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。更優(yōu)選地，通透性通過降低LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平而降低，LPSS多肽選自上調(diào)的分泌因子(SEQ ID NO1、13、14和22)、上調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQID NO5、12、15、16和17)、差異下調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO18)及上調(diào)的受體和粘著分子(SEQ ID NO21和22)。LPSS多肽的活性和穩(wěn)態(tài)水平可以通過上述任何方式降低，例如LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平可以通過將一種表達(dá)載體導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞而降低，所述表達(dá)載體包含能抑制編碼LPSS多肽的核苷酸序列表達(dá)的反義核苷酸序列，且所述反義核苷酸序列在能驅(qū)動該反義核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
在本發(fā)明的方法中，內(nèi)皮細(xì)胞的通透性可以通過增加LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平而增加，LPSS多肽具有與選自由SEQ ID NO1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。更優(yōu)選地，通透性通過降低LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平而降低，LPSS多肽選自上調(diào)的分泌因子(SEQ ID NO1、13、14和22)、上調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQID NO5、12、15、16和17)、差異下調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO18)及上調(diào)的受體和粘著分子(SEQ ID NO21和22)。LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平可以通過上述任何方式增加，例如通過將一種表達(dá)載體導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞中，所述表達(dá)載體包含編碼LPSS多肽的核苷酸序列，且所述核苷酸序列在能驅(qū)動該核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
或者，在本發(fā)明的方法中，內(nèi)皮細(xì)胞的通透性可以通過降低LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平而增加，LPSS多肽具有與選自由SEQ ID NO2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示的氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。更優(yōu)選地，通透性通過增加LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平而降低，LPSS多肽選自下調(diào)的分泌因子(SEQ ID NO2、3、4和23)、下調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO6、7、8、9、10和11)、差異上調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO19)、下調(diào)的受體和粘著分子(SEQ ID NO20)及差異上調(diào)的代謝酶(SEQ ID NO23-25)。LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平可以通過上述任何方式降低，例如LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平可以通過將一種表達(dá)載體導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞中而降低，所述表達(dá)載體包含能抑制編碼LPSS多肽的核苷酸序列表達(dá)的反義核苷酸序列，且所述反義核苷酸序列在能驅(qū)動該反義核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
微血管通透性修飾失調(diào)(microvascular permeability modifyingdisorders)的治療或預(yù)防
另一方面，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防患者微血管通透性修飾失調(diào)的方法。所述方法包括經(jīng)藥理學(xué)改變患者微血管內(nèi)皮細(xì)胞中LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平，LPSS多肽具有與SEQ ID NO1-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述改變足以降低微血管通透性修飾失調(diào)的癥狀。所述方法優(yōu)選包括給予患者治療有效量的一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如上述具有與SEQ ID NO1-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的LPSS多肽，或者包含編碼LPSS多肽的核苷酸序列的核酸分子，或者有效修飾LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平的另一實(shí)體。優(yōu)選地，在本發(fā)明方法中，LPSS多肽是具有與SEQ ID NO2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列的一種多肽。更優(yōu)選地，通透性通過增加LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平而降低，LPSS多肽選自下調(diào)的分泌因子(SEQ ID NO2、3、4和23)、下調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO6、7、8、9、10和11)、差異上調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO19)、下調(diào)的受體和粘著分子(SEQ ID NO20)及差異上調(diào)的代謝酶(SEQIDNO23-25)。核酸分子優(yōu)選是一種基因治療載體，其中核苷酸序列在能驅(qū)動該核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)選在微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
或者，所述治療方法是包括給予患者一種治療有效量的藥物組合物的一種方法，所述藥物組合物包含LPSS多肽的拮抗劑，LPSS多肽具有與SEQ ID NO1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，其中優(yōu)選所述拮抗劑是LPSS多肽的抗體。更優(yōu)選地，所述氨基酸序列選自上調(diào)的分泌因子(SEQ ID NO1、13、14和22)、上調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO5、12、15、16和17)、差異下調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO18)、及上調(diào)的受體和粘著分子(SEQ ID NO21和22)。相同的作用可以在包括給予患者治療有效量的包含一種基因治療載體的藥物組合物的方法中達(dá)到。基因治療載體優(yōu)選包含能抑制編碼LPSS多肽的核苷酸序列表達(dá)的反義核苷酸序列，LPSS多肽具有與選自由SEQ ID NO1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，其中所述反義核苷酸序列在能驅(qū)動該反義核昔酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)選微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。更優(yōu)選地，所述氨基酸序列選自上調(diào)的分泌因子(SEQ ID NO1、13、14和22)、上調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO5、12、15、16和17)、差異下調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO18)及上調(diào)的受體和粘著分子(SEQ IDNO21和22)。
在本發(fā)明的治療方法中，微血管通透性失調(diào)優(yōu)選選自神經(jīng)退行性疾病，如腦血管意外(CVA)、阿爾茨海默病(AD)、血管相關(guān)性癡呆、克雅氏病(Creutzfeldt-Jacob disease，CJD)、牛海綿狀腦病(BSE)、帕金森病(PD)、腦外傷、多發(fā)性硬化(MS)、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(ALS)、杭廷頓氏舞蹈癥(Huntington′s chorea)；具有CNS成分的外周失調(diào)，如敗血癥休克、肝性腦病、(糖尿病性)高血壓、糖尿病微血管病變(diabetic microangiopathy)、昏睡病、惠普耳病(Whipple disease)、杜興氏肌營養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)、天冬氨酰葡糖胺尿癥(aspartylglucosaminuria)、膽固醇酯貯積病、沃耳曼病(Wolman disease)、胱氨酸過多癥、Danon病、法布萊氏病(Fabrydisease)、法伯脂肪性肉芽腫病(Farber lipogranulomatosis)、法伯病(Farber disease)、巖藻糖代謝病、半乳糖唾液酸沉積癥(galactosialidosis)I/II型、Gaucher病I/II/III型、Gaucher病、球樣細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、克臘比病(Krabbe disease)、糖原貯積病II、龐帕氏病(Pompe disease)、GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥I/II/III型、GM2-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥I型、泰薩二氏病(Tay Sachs disease)、GM2-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥II型、山霍夫氏病(Sandhoff disease)、GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥、α-甘露糖苷過多癥I/II型、甘露糖苷過多癥、異染色性腦白質(zhì)障礙癥、粘脂糖癥I型、唾液酸沉積癥1/11型粘脂糖癥11/III型1-細(xì)胞(1-cell)病、粘脂糖癥IIIC型假赫爾勒多種營養(yǎng)不良(pseudo-Hurlerpolydystrophy)、粘多糖代謝病I型、粘多糖代謝病II型、亨特氏綜合征(Hunter syndrome)、粘多糖代謝病IIIA型、山菲立普綜合征(Sanfilippo syndrome)、粘多糖代謝病IIIB型、粘多糖代謝病IIIC型、粘多糖代謝病IIID型、粘多糖代謝病IVA型、莫爾基奧綜合征(Morquiosyndrome)、粘多糖代謝病IVB型莫爾基奧綜合征、粘多糖代謝病VI型、粘多糖代謝病VII型、斯利綜合征(Sly syndrome)、粘多糖代謝病IX型、多種硫酸酯酶缺陷(multiple sulphatase deficiency)、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥、CLN1巴騰病(Batten disease)、尼皮二氏病(Niemann-Pick disease)A/B型、尼皮二氏病、尼皮二氏病C1型、尼皮二氏病C2型、致密性成骨不全癥、欣德勒病(Schindler disease)VII型、欣德勒病及唾液酸貯積癥病、(先兆)子癇；神經(jīng)精神失調(diào)，如抑郁癥、孤獨(dú)癥、焦慮性注意缺陷多動障礙(anxiety attention deficithyperactivity disorder，ADHD)、神經(jīng)精神性系統(tǒng)性紅斑狼瘡、雙相性精神障礙(bipolar disorder)、精神分裂癥及其它精神??；其它CNS失調(diào)，如腦瘤、癲癇、偏頭痛、發(fā)作性睡病、失眠癥、慢性疲勞綜合征、高山病、腦炎、腦膜炎、AIDS相關(guān)性癡呆；及血管發(fā)生相關(guān)失調(diào)，如血管腫瘤、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病(proliferative vitreoretinopathy)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病(Crohn′s disease)、動脈粥樣硬化、卵巢過度刺激(ovarian hyperstimulation)、牛皮癬、新血管化相關(guān)子宮內(nèi)膜異位癥、球囊血管成形術(shù)后再狹窄、疤痕組織過度增生、外周血管病、高血壓、炎癥性血管炎、雷諾氏病(Reynaud’s disease)、雷諾氏現(xiàn)象(Reynaud’s phenomenon)、動脈瘤、動脈再狹窄、血栓性靜脈炎、淋巴管炎、淋巴水腫(lymphedema)、創(chuàng)傷愈合及組織修復(fù)、缺血性再灌注損傷、心絞痛、心肌梗塞、慢性心臟病、心力衰竭如充血性心力衰竭、年齡相關(guān)性黃斑變性及骨質(zhì)疏松癥。
另一方面，本發(fā)明涉及一種可逆性增加患者微血管通透性的方法。所述方法包括給予患者有效量的增加微血管通透性的一種藥物組合物，該藥物組合物包含具有與SEQ ID NO1-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的LPSS多肽，或者包含編碼LPSS多肽的核苷酸序列的核酸分子，或者有效修飾LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平的另一實(shí)體。優(yōu)選地，LPSS多肽是具有與選自SEQ ID NO1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的一種多肽。更優(yōu)選地，所述氨基酸序列選自上調(diào)的分泌因子(SEQ ID NO1、13、14和22)、上調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO5、12、15、16和17)、差異下調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO18)及上調(diào)的受體和粘著分子(SEQ ID NO21和22)。優(yōu)選地，所述核酸分子是一種基因治療載體，其中核苷酸序列在能驅(qū)動該核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)選微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。在這種方法中，微血管通透性增加的可逆性增加優(yōu)選通過使用一種僅能瞬時(shí)表達(dá)該核苷酸序列的基因治療載體實(shí)現(xiàn)(見下文)，和/或使用能驅(qū)動該核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選該啟動子是一種誘導(dǎo)型啟動子。更優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)型啟動子是通過給予小的有機(jī)或無機(jī)化合物而被誘導(dǎo)的啟動子(見下文)。
或者，可逆性增加患者微血管通透性的方法也可以是包括給予患者治療有效量的一種包含LPSS多肽的拮抗劑的藥物組合物的方法，LPSS多肽具有與選自SEQ ID NO2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，所述拮抗劑優(yōu)選是LPSS多肽的抗。更優(yōu)選地，所述氨基酸序列選自下調(diào)的分泌因子(SEQ ID NO2、3、4和23)、下調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO6、7、8、9、10和11)、差異上調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO19)、下調(diào)的受體和粘著分子(SEQ ID NO20)及差異上調(diào)的代謝酶(SEQ ID NO23-25)。相似地，所述方法還包括給予患者治療有效量的一種包含基因治療載體的藥物組合物，所述基因治療載體包含能抑制編碼LPSS多肽的核苷酸序列表達(dá)的反義核苷酸序列，LPSS多肽具有與選自SEQ ID NO2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，且所述反義核苷酸序列在能驅(qū)動反義核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)選微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。更優(yōu)選地，所述氨基酸序列選自下調(diào)的分泌因子(SEQ ID NO2、3、4和23)、下調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ IDNO6、7、8、9、10和11)、差異上調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO19)、下調(diào)的受體和粘著分子(SEQ ID NO20)及差異上調(diào)的代謝酶(SEQ ID NO23-25)。
當(dāng)想要輸送血液運(yùn)載的、膜不通透藥物至腦時(shí)，可有利地應(yīng)用可逆性增加患者微血管通透性的方法。該藥物可以是在制藥、獸醫(yī)或診斷方面有益的任何化合物或者化合物的組合物，其通常不能透過或者至少不完全透過血腦屏障或其它生理學(xué)屏障。該藥物的藥理學(xué)性質(zhì)是不重要的。本發(fā)明因此用于輸送廣泛的藥物穿過生理學(xué)屏障如血腦屏障。然而，預(yù)期根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面所輸送的初步候選物是抗腫瘤化合物，如氨甲蝶呤、阿霉素、順鉑，及下文所述的其它抗腫瘤制劑或胞毒性藥物(見例如本文第24-28頁)；生長因子，如NGF、RDNF和CNTF，其用于治療神經(jīng)退行性疾病；顯影劑，尤其是基于抗體的那些制劑；及透不過血腦屏障的神經(jīng)遞質(zhì)拮抗劑或激動劑(如某些NMDA受體阻斷劑)。
對于除了美國之外的大多數(shù)國家而言，本發(fā)明的另一方面涉及了本發(fā)明的化合物在生產(chǎn)治療或預(yù)防微血管通透性修飾失調(diào)的藥物中的多種應(yīng)用。例如在一個(gè)這樣的方面中，本發(fā)明涉及LPSS多肽或者包含編碼LPSS多肽的核苷酸序列的核酸分子或者有效修飾LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平的另一實(shí)體在生產(chǎn)治療或預(yù)防微血管通透性修飾失調(diào)的組合物中的應(yīng)用，所述LPSS多肽具有與SEQ ID NO1-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。優(yōu)選地，LPSS多肽是具有與選自SEQ ID NO2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。更優(yōu)選地，所述氨基酸序列選自下調(diào)的分泌因子(SEQ ID NO2、3、4和23)、下調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO6、7、8、9、10和11)、差異上調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO19)、下調(diào)的受體和粘著分子(SEQ ID NO20)及差異上調(diào)的代謝酶(SEQ IDNO23-25)。所述核酸分子優(yōu)選是包含所述核苷酸序列的一種基因治療載體，所述核苷酸序列在能驅(qū)動該核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。具有與選自SEQ ID NO1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的LPSS多肽的拮抗劑也可用于生產(chǎn)治療或預(yù)防微血管通透性修飾失調(diào)的組合物，所述拮抗劑優(yōu)選是LPSS多肽的抗體。更優(yōu)選地，所述氨基酸選自上調(diào)的分泌因子(SEQ ID NO1、13、14和22)、上調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO5、12、15、16和17)、差異下調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO18)及上調(diào)的受體和粘著分子(SEQ ID NO21和22)。
或者，一種包含反義核苷酸序列的基因治療載體可用于生產(chǎn)治療或預(yù)防微血管通透性修飾失調(diào)的組合物，所述反義核苷酸序列能抑制編碼LPSS多肽的核苷酸序列的表達(dá)，LPSS多肽具有與選自SEQ IDNO1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，所述反義核苷酸序列在能驅(qū)動反義核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)選在微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。更優(yōu)選地，所述氨基酸序列選自上調(diào)的分泌因子(SEQ ID NO1、13、14和22)、上調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQID NO5、12、15、16和17)、差異下調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO18)及上調(diào)的受體和粘著分子(SEQ ID NO21和22)。
在本發(fā)明的化合物在生產(chǎn)治療微血管通透性修飾失調(diào)的藥物中的上述應(yīng)用中，所述失調(diào)優(yōu)選是如上述的微血管通透性修飾失調(diào)。
相似地，對于除了美國之外的大多數(shù)國家而言，本發(fā)明另一方面涉及本發(fā)明的化合物在生產(chǎn)可逆性增加患者微血管通透性的藥物或組合物中的多種應(yīng)用。優(yōu)選地，所述化合物是具有與SEQ ID NO.1-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的LPSS多肽，或者包含編碼LPSS多肽的核苷酸序列的核酸分子，或者如本文所列舉的有效修飾LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平的另一實(shí)體。優(yōu)選地，LPSS多肽是具有與選自SEQ ID NO1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的一種多肽。更優(yōu)選地，所述氨基酸序列選自上調(diào)的分泌因子(SEQ ID NO1、13、14和22)、上調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQID NO5、12、15、16和17)、差異下調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO18)及上調(diào)的受體和粘著分子(SEQ ID NO21和22)。所述核酸分子優(yōu)選是一種基因治療載體，其中編碼LPSS多肽的核苷酸序列在能驅(qū)動該核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)選微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
或者，LPSS多肽的拮抗劑可以用于生產(chǎn)可逆性增加患者微血管通透性的組合物，LPSS多肽具有與選自SEQ ID NO2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，優(yōu)選所述拮抗劑是LPSS多肽的抗體。更優(yōu)選地，所述氨基酸序列選自下調(diào)的分泌因子(SEQ ID NO2、3、4和23)、下調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO6、7、8、9、10和11)、差異上調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO19)、下調(diào)的受體和粘著分子(SEQ ID NO20)及差異上調(diào)的代謝酶(SEQ IDNO23-25)?；蛘甙环N反以核苷酸序列的基因治療載體可用于生產(chǎn)可逆增加患者微血管通透性的組合物，所述反義核苷酸序列能抑制編碼LPSS多肽的核苷酸序列的表達(dá)，LPSS多肽具有與選自SEQ IDNO2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，且所述反義核苷酸序列在能驅(qū)動反義核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)選在微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。更優(yōu)選地，所述氨基酸序列選自下調(diào)的分泌因子(SEQ ID NO2、3、4和23)、下調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO6、7、8、9、10和11)、差異上調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO19)、下調(diào)的受體和粘著分子(SEQ ID NO20)及差異上調(diào)的代謝酶(SEQ ID NO23-25)。優(yōu)選地，所述基因治療載體是瞬時(shí)表達(dá)的載體(見下文)和/或啟動子優(yōu)選是誘導(dǎo)型啟動子。更優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)型啟動子是可以通過給予小的有機(jī)或無機(jī)化合物而誘導(dǎo)的啟動子(見下文)。
靶向微血管內(nèi)皮屏障
另一方面，本發(fā)明涉及通過給予患有或處于發(fā)展CNS或微血管失調(diào)的危險(xiǎn)中的患者一種治療劑或診斷劑以治療或診斷CNS或微血管失調(diào)的方法，所述治療劑或診斷劑例如是一種神經(jīng)活性劑(neuroactiveagent)，通過將該制劑或其藥物可接受的載體靶向于具有與SEQ IDNO1-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的LPSS多肽。優(yōu)選地，所述神經(jīng)激活劑或其載體靶向于具有與SEQ ID NO1、5、12、13、14、15、16、17、18、19、21-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的上調(diào)的LPSS多肽。更優(yōu)選地，所述氨基酸序列選自上調(diào)的分泌因子(SEQ ID NO1、13、14和22)、上調(diào)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(SEQ ID NO5、12、15、16、17和19)、上調(diào)的受體和粘著分子(SEQ ID NO21和22)及上調(diào)的代謝酶(SEQ ID NO23-25)。更優(yōu)選上調(diào)的LPSS多肽具有與SEQ ID NO21或22所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。
靶向劑可以是LPSS多肽的抗體、蛋白質(zhì)、肽、LPSS多肽激動劑、LPSS多肽拮抗劑、肽模擬物、小分子、或者與LPSS多肽特異性結(jié)合的另一種化合物。如本文所用術(shù)語“特異性結(jié)合”是指與非特異性相互作用有可測定的不同的結(jié)合。特異性結(jié)合可以例如通過確定與對照分子的結(jié)合相比的分子的結(jié)合而測定，對照分子通常是不具有結(jié)合活性的相似結(jié)構(gòu)的分子，例如相似大小但沒有特異性結(jié)合序列的肽。如果分子與對照分子相比與LPSS多肽具有可測定的較高的親和性，則存在特異性結(jié)合。結(jié)合的特異性可以通過例如與已知結(jié)合靶位的對照分子競爭而測定。本文所用術(shù)語“特異性結(jié)合”包括低和高親和性特異性結(jié)合。特異性結(jié)合可以例如通過Kd為至少大約10-4M的低親和性靶向劑而表現(xiàn)。例如如果LPSS多肽具有一個(gè)以上的靶向劑結(jié)合位點(diǎn)，則低親和性的靶向劑可用于靶向微血管內(nèi)皮。特異性結(jié)合可以通過Kd為至少大約10-7M、至少大約10-8M、至少大約10-9M、至少大約10-10M或者Kd為至少大約10-11M或10-12M或更高的高親和性靶向劑表現(xiàn)。低和高親和性靶向劑均用于靶向微血管內(nèi)皮。
靶向劑優(yōu)選與治療劑或其藥物可接受的載體綴合?！熬Y合”在本文是指由共價(jià)偶聯(lián)在一起的兩個(gè)實(shí)體組成。在本發(fā)明中，第一個(gè)實(shí)體通常是如上述的靶向劑，而第二個(gè)實(shí)體可以是治療或診斷部分，如用于治療或診斷CNS或微血管失調(diào)的分子或結(jié)構(gòu)。這種治療或診斷部分可以例如是抗腫瘤化合物，如抗腫瘤劑或胞毒性藥物，如烷化劑，例如鹽酸氮芥(Mechlorethamine hydrochloride)(Nitrogen Mustard，Mustargen，HN2)、環(huán)磷酰胺(Cytovan，Endoxana)、異環(huán)磷酰胺(Ifosfamide)(IFEX)、苯丁酸氮芥(Leukeran)、苯丙氨酸氮芥(Phenylalanine Mustard，L-sarcolysin，Alkeran，L-PAM)、白消安(Myleran)、硫化三磷(Triethylenethiophosphoramide)、亞硝基脲氮芥(BiCNU，BCNU)、Lomustine(CeeNU，CCNU)、Streptozocin(Zanosar)等；植物生物堿，例如長春新堿(Oncovin)、長春花堿(Velban，Velbe)、紫杉醇(Taxol)等；抗代謝物，例如氨甲蝶呤(MTX)、6-巰基嘌呤(Purinethol，6-MP)、6-硫代鳥嘌呤(6-TG)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Cytosar-U，Ara-C)、Azacitidine(Mylosar，5-AZA)等；抗生素，例如放線菌素D(Actinomycin D，Cosmegen)、阿霉素(adriamycin)、道諾紅菌素(daunomycin，Cerubidine)、Idarubicin(Idamycin)、博來霉素(Blenoxane)、光神霉素(Mithramycin，Mithracin)、絲裂霉素(Mutamycin)等；及其它抗細(xì)胞增殖劑，例如羥基脲(Hydrea)、普魯芐肼(Mutalane)、Dacarbazine(DTIC-Dome)、順鉑(Platinol)、Carboplatin(Paraplain)、天冬酰胺酶(Elspar)、鬼臼亞乙苷(VePesid，VP-16-213)、Amsarcrine(AMSA，m-AMSA)、Mitotane(Lysodren)、Mitoxantrone(Novatrone)等；gefitinib(ZD 1839或IressaTM)及imatinib mesylate(Gleevec或Glivec)；抗癌生物藥品包括抗體(Rituxan或rituximab；Herceptin或trastuzumab；Zevalin或ibritumomab tiuxetan(放射標(biāo)記的)；Erbitux或cetuximab；AvastinTM或bevacizumab或rhuMAb-VEGF)及細(xì)胞因子(Intron或α-干擾素；ProleukinIL-2或aldesleukin)以治療原發(fā)腦瘤或機(jī)體腫瘤的腦轉(zhuǎn)移；抗炎癥藥物包括抗體(Enbrel或etanercept；Remicade或infliximab；Simulect或basiliximab；Zenapax或daclizumab；Kineret或anakinra；Xolair或omalizumab；Humira或adalimumab；Antegren或natalizumab；RhuFabTM或ranibizumab；RaptivaTM或efalizumab)及細(xì)胞因子如干擾素-α、干擾素-β(Avonex或干擾素-β-1a；Betaseron/Betaferon或干擾素-β-lb；Rebif或干擾素-β-la)、干擾素-γ、白細(xì)胞介素1(IL-1)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素3(IL-3)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素5(IL-5)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、TNF、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSFLeukine或sargramostim)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSFNeupogen或filgrastim)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、血小板衍生生長因子(PDGF)，以治療例如神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的神經(jīng)炎癥；神經(jīng)營養(yǎng)因子(例如NGF或神經(jīng)生長因子；BDNF或腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子；NT3或神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3；NT4或神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4；NT5或神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-5；RDGF或視網(wǎng)膜衍生生長因子；CNTF或睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子；活化素；bFGF或堿性成纖維細(xì)胞生長因子；aFGF或酸性成纖維細(xì)胞生長因子；GDNF或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子或neublastin或artemin或enovin，presephin，neurturin；CTGF或結(jié)締組織生長因子；EGF或上皮生長因子)；紅細(xì)胞生成素(EPO)(Procrit/Eprex或紅細(xì)胞生成素α；Epogen或紅細(xì)胞生成素；NeoRecormon或紅細(xì)胞生成素β；Aranesp或darbepoietin alfa)；生長激素或促生長素(Humatrope；Protropin/Nutropin；Serostim；Saizen)；抗-NogoA Mab(IN-1)；Nogo66抑制劑的NogoA拮抗劑(NEP1-40)，以治療例如神經(jīng)退行性疾??；酶(例如Cerezyme或葡糖腦苷脂酶；AldurazymeTM或laronidase；AryplaseTM或芳基硫酸酯酶B；I2S或艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶；α-L-iduronidase；N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶；phenylase；天冬氨酰氨基葡糖苷酶(aspartylglucosaminidase)；酸脂肪酶；半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；Lamp-2；α半乳糖苷酶A；酸神經(jīng)酰胺酶(acid ceramidase)；α-L-巖藻糖苷酶；ss-氨基己糖苷酶A；GM2-激活劑缺乏；α-D-甘露糖苷酶；ss-D-甘露糖苷酶；芳基硫酸酯酶A；saposin B；神經(jīng)氨酸酶；α-N-乙酰氨基葡糖苷酶磷酸轉(zhuǎn)移酶；磷酸轉(zhuǎn)移酶7-亞基；類肝素-N-硫酸酯酶；α-N-乙酰氨基葡糖苷酶；乙酰CoAN-乙酰轉(zhuǎn)移酶；N-乙酰葡萄胺6-硫酸酯酶；半乳糖6-硫酸酯酶；O-半乳糖苷酶；透明質(zhì)酸氨基葡糖苷酶(hyaluronoglucosaminidase)；多硫酸酯酶(multiplesulphatases)；棕櫚酰蛋白硫酯酶；三肽基肽酶I；酸性鞘磷脂酶；膽固醇運(yùn)輸(cholesterol trafficking)；組織蛋白酶K；α-半乳糖苷酶B；唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；SOD或Cu/Zn超氧化物岐化酶)以治療例如溶酶體貯積病(相關(guān)的神經(jīng)學(xué)癥狀)或其它神經(jīng)退行性疾?。荒X作用激素及神經(jīng)遞質(zhì)如促生長素抑制素、催產(chǎn)素、血管升壓素、咖啡因、VIP、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、縮膽囊素(CCK)、P物質(zhì)、鈴蟾肽、促胃動素、胰高血糖素樣肽、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽(GLP-1)；及神經(jīng)肽及其衍生物如肽YY(PYY)、神經(jīng)肽Y(NPY)、胰多肽(PP)、神經(jīng)激肽A、神經(jīng)激肽B、內(nèi)啡肽、腦啡肽、神經(jīng)降壓肽、神經(jīng)調(diào)節(jié)肽K、神經(jīng)調(diào)節(jié)肽L、降鈣素相關(guān)肽(CGRP)、內(nèi)皮縮血管肽、ANP(″心房利尿鈉肽″)、BNP(″腦尿鈉肽″)、CNP(C-型尿鈉肽″)及PACAP(″垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽″)；顯影劑，尤其是基于抗體的那些；不透過血腦屏障的神經(jīng)遞質(zhì)拮抗劑或激動劑(如某些NMDA受體阻斷劑)；抗生素，如氨基糖苷類，例如氨羥丁卡那霉素A、阿泊拉霉素、阿貝卡星(arbekacin)、黃霉素(bambermycins)、丁苷菌毒、地貝卡星(dibekacin)、二氫鏈霉素、健霉素、慶大霉素、異帕米星(isepamicin)、卡那霉素、小諾霉素(micronomcin)、新霉素、奈替米星(netilmicin)、paromycin、核糖霉素、紫蘇霉素、壯觀霉素、鏈霉素、妥布拉霉素、托奇霉素；氯霉素(amphenicols)，例如疊氮氯霉素(azidamfenicol)、氯霉素、氟苯尼考(florfenicol)及theimaphenicol；安莎霉素類(ansamycins)，例如rifamide、利福平、利福霉素、rifapentine、利福昔明(rifaximin)；β-內(nèi)酰胺，例如carbacephems、碳青霉烯、頭孢菌素、頭孢霉素(cehpamycins)、單環(huán)內(nèi)酰胺、oxaphems、青霉素；lincosamides，例如clinamycin、潔霉素；大環(huán)內(nèi)酯類，例如克拉霉素(clarithromycin)、地紅霉素(dirthromycin)、紅霉素等等；多肽，例如雙霉素、桿菌肽、卷曲霉素等等；四環(huán)素類，例如阿哌環(huán)素(apicycline)、氯四環(huán)素、羥甲金霉素等等；合成的抗菌制劑，如2，4-二氨基嘧啶、硝基呋喃、喹諾酮類(quinolones)及其類似物、磺胺、砜；抗真菌制劑，如多烯，例如兩性霉素B、殺念珠菌素、制皮菌素、菲律賓菌素、制霉菌色素、曲古霉素、哈霉素、明霉素、甲三菌素、游霉素、制霉菌素、培西洛星(pecilocin)、表霉素；合成的抗真菌劑，如丙烯胺(allylamines)，例如布替萘芬(butenafine)、萘替芬(naftifine)、terbinafine；咪唑，例如聯(lián)苯芐唑(bifonazole)、布康唑(butoconazole)、氯登妥因(chlordantoin)、氯米達(dá)唑(chlormidazole)等等，硫代氨基甲酸，例如托西拉酯(tolciclate)，三唑，例如氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、特康唑(terconazole)；驅(qū)腸蟲藥，如檳榔堿、綿馬毒素、綿馬酚、二氯苯(dichlorophene)、酸藤子素、苦辛(kosin)、萘(napthalene)、niclosamide、石榴堿、奎納克林、土木香內(nèi)脂、amocarzine、amoscanate、驅(qū)蛔素、bephenium、bitoscanate、四氯化碳、香芹酚、cyclobendazole、diethylcarbamazine等等；抗瘧劑，如acedapsone、氨酚喹(amodiaquin)、arteether、artemether、青蒿素、artesunate、atovaquone、比比林(bebeerine)、黃連素、chirata、氯胍(chlorguanide)、氯奎、chlorprogaunil、金雞納樹皮、金雞尼丁、金雞寧、cycloguanil、龍膽苦苷、halofantrine、羥氯奎、mefloquine hydrochloride、3-methylarsacetin、撲瘧喹(pamaquine)、plasmocid、伯氨喹、乙嘧啶(pyrimethamine)、奎納克林、奎寧、quinocide、奎寧、二元砷酸鈉(dibasic sodium arsenate)；抗原生動物制劑，如acranil、tinidazole、ipronidazole、ethylstibamine、pentamidine、乙酰胺胂(acetarsone)、aminitrozole、茴香霉素、nifuratel、磺甲硝咪唑、benzidazole、蘇拉明等等；編碼多肽(優(yōu)選編碼Neprilysin及上述蛋白質(zhì)、肽、酶、細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素、激素及生長因子)或多肽的反義DNA的基因(包括表達(dá)載體和/或啟動子，優(yōu)選GFAP-和/或γ-GTP啟動子)；及反義探針(核酸或肽核酸)。除了治療或診斷部分與靶向劑之間的直接綴合之外，這種治療或診斷部分可以被包囊化在微容器(nanocontainer)內(nèi)，如微顆粒(nanoparticle)、脂質(zhì)體或微凝膠(nanogel)，所述靶向劑優(yōu)選與這種微容器共價(jià)偶聯(lián)。與微容器的這種綴合可以直接綴合或者通過任何熟知的聚合物綴合劑綴合，如鞘磷脂、聚乙二醇(PEG)或其它有機(jī)聚合物，及與單一的靶向劑或者與抗血腦屏障和腦細(xì)胞膜上的胰島素、運(yùn)鐵蛋白、IGF、leptin、LRP(1B)或LDL受體的任何熟知的血腦屏障靶向部分組合。生產(chǎn)包含靶向的(PEG)脂質(zhì)體的這種藥物組合物的詳細(xì)描述見美國專利No.6,372,250。
本領(lǐng)域已知靶向劑與治療或診斷部分綴合的多種方法。這種方法是例如Hermanson于U.S.6,180,084和U.S.6,264,914中所述方法(1996，Bioconjugate Techniques，Academic Press)，包括例如應(yīng)用免疫學(xué)中常規(guī)應(yīng)用的將半抗原與載體蛋白連接的方法(見Harlow和Lane，1988，″AntibodiesA laboratory manual″，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY)。技術(shù)人員意識到在一些情況中，靶向劑或治療部分或診斷部分根據(jù)例如綴合程序或所用的化學(xué)基團(tuán)而可能喪失效力或功能性。然而，在給定的多種綴合方法中，技術(shù)人員能發(fā)現(xiàn)不影響或最小影響綴合的實(shí)體的效力或功能性的綴合方法。
靶向劑與治療或診斷部分綴合的合適方法包括例如碳二亞胺綴合方法(Bauminger and Wilchek，1980，Meth.Enzymol.70151-159)?；蛘?，一個(gè)部分可以與靶向劑偶聯(lián)，如Nagy et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 937269-7273(1996)及Nagy et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 951794-1799(1998)所述，所述文獻(xiàn)在此均并入?yún)⒖肌Ａ硪环N合適的綴合方法是例如高碘酸鈉氧化，隨后經(jīng)適當(dāng)反應(yīng)物的還原烷化及戊二醛交聯(lián)。
當(dāng)靶向劑與治療部分是(多)肽時(shí)，可以應(yīng)用特別有用的綴合方法。在這種情況中，這兩種實(shí)體可以合成為包含靶向劑和治療肽的氨基酸序列的單(多)肽鏈。當(dāng)靶向劑和治療肽的氨基酸序列總和不超過50、80或100個(gè)氨基酸時(shí)，綴合物可以通過上述固相肽合成方法合成?；蛘撸?dāng)氨基酸序列總和較大時(shí)，包含靶向劑和治療肽的單(多)肽鏈可以通過下述重組表達(dá)技術(shù)產(chǎn)生。在這種情況中，例如編碼靶向劑的核酸序列和編碼治療肽的核酸序列可以以符合讀框地可操縱地連接以形成一個(gè)單一的開放讀框。含有單一開放讀框的核酸序列然后可以插入合適的表達(dá)載體中以在合適的宿主中表達(dá)，然后如下述從中回收綴合物并任選進(jìn)一步純化。在這些方法中，靶向肽可以置于治療肽的一端或兩端，或者可以插入治療肽的氨基酸序列內(nèi)的一或多個(gè)位置，而不破壞各自肽的功能或效力。使用常規(guī)的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定靶向肽相對于治療肽的最佳位置。
微血管通透性的診斷
本發(fā)明另一方面涉及診斷患者微血管通透性的方法。這種方法優(yōu)選包括如下步驟(a)確定患者微血管內(nèi)皮中編碼LPSS多肽的核酸序列的表達(dá)水平，LPSS多肽具有與SEQ ID NO1-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列；(b)將該核酸序列的表達(dá)水平與核酸序列表達(dá)水平的參考值進(jìn)行對比，參考值優(yōu)選是在健康個(gè)體的微血管內(nèi)皮中表達(dá)水平的平均值。核酸序列的表達(dá)水平可以間接通過確定該核酸序列編碼的LPSS多肽的量而確定。在一個(gè)優(yōu)選的方法中，對比一種以上核酸序列的表達(dá)水平。當(dāng)分析一種以上的核酸序列時(shí)，這可以使用如下述及實(shí)施例中所述的包含互補(bǔ)核酸的微陣列而常規(guī)進(jìn)行。表達(dá)水平可以在得自患者的樣品中回體(ex vivo)確定。所述方法優(yōu)選是診斷微血管通透性失調(diào)或診斷對微血管通透性失調(diào)的易感性的方法，所述微血管通透性可以是如上所述。所述方法也可以用于評估恢復(fù)微血管通透性的治療效力。
篩選能調(diào)節(jié)內(nèi)皮通透性的物質(zhì)
本發(fā)明的另一方面涉及鑒別能調(diào)節(jié)微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的物質(zhì)的方法。所述方法優(yōu)選包括如下步驟(a)提供能表達(dá)編碼LPSS多肽的一或多個(gè)核酸序列的測試細(xì)胞群，LPSS多肽具有與SEQ ID NO1-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列；(b)將測試細(xì)胞群與包含測試物質(zhì)的組合物接觸；(c)確定與所述物質(zhì)接觸的測試細(xì)胞群中編碼LPSS多肽的核酸序列的表達(dá)水平，LPSS多肽具有與SEQ ID NO1-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列；(d)將該核酸序列的表達(dá)水平與未與所述物質(zhì)接觸的測試細(xì)胞群中核酸序列的表達(dá)水平進(jìn)行對比；及(e)鑒別在與所述物質(zhì)接觸的測試細(xì)胞群與未與所述物質(zhì)接觸的測試細(xì)胞群之間產(chǎn)生所述核酸序列表達(dá)水平不同的物質(zhì)。在這個(gè)方法中，核酸序列的表達(dá)水平可以通過間接確定由該核酸序列編碼的LPSS多肽的量而確定?？梢詫Ρ纫环N以上的核酸序列的表達(dá)水平。在一個(gè)優(yōu)選的方法中，測試細(xì)胞群包含內(nèi)皮細(xì)胞，優(yōu)選血管內(nèi)皮細(xì)胞，更優(yōu)選微血管內(nèi)皮細(xì)胞，最優(yōu)選腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。測試細(xì)胞群中的細(xì)胞優(yōu)選是哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選人細(xì)胞。優(yōu)選在所述方法中，與所述物質(zhì)接觸的測試細(xì)胞群和未與所述物質(zhì)接觸的測試細(xì)胞群衍生自一種細(xì)胞群，優(yōu)選衍生自一種細(xì)胞系，更優(yōu)選衍生自一個(gè)細(xì)胞。在進(jìn)一步優(yōu)選的方法中，測試細(xì)胞群與輔助細(xì)胞群共培養(yǎng)，測試細(xì)胞群在濾膜的一側(cè)培養(yǎng)，輔助細(xì)胞群在濾膜的另一側(cè)培養(yǎng)，且所述輔助細(xì)胞群優(yōu)選包含星形膠質(zhì)細(xì)胞。
用于本發(fā)明方法中的優(yōu)選的LPSS多肽
我們在此揭示了特異性差異表達(dá)的多肽，其參與血管通透性的降低。我們因此稱這些多肽為“脂多糖敏感性”多肽或LPSS多肽。LPSS多肽參與一些不同類型的參與控制血腦屏障功能性的機(jī)制。這些包括分泌因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、受體和粘著分子及代謝酶。LPSS多肽及這些機(jī)制在下文更詳細(xì)地描述。如果已知或可利用，給出了每個(gè)LPSS多肽的如下信息
■LPSS多肽的編碼氨基酸序列(序列表)；
■受體、受體激動劑、受體拮抗劑；
■激動劑LPSS多肽或片段；
■全部或部分LPSS多肽受體激動劑；
■激動性肽模擬物；
■激動性抗體或抗體片段；
■激動性小分子或其它藥物；
■拮抗性LPSS多肽片段；
■拮抗性肽模擬物；
■拮抗性小分子或其它藥物；
■拮抗性或中和抗體或抗體片段；
■部分或反向LPSS多肽受體激動劑；
■全部或部分LPSS多肽受體拮抗劑。
技術(shù)人員將意識到這些實(shí)體的每一種均可用于在此所述的本發(fā)明方法中。
分泌的多肽
胞外分泌的或操作的LPSS多肽(如激素、酶、生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、結(jié)合蛋白等等)在本發(fā)明的實(shí)施方案中優(yōu)選用于特異性調(diào)節(jié)或監(jiān)測血腦屏障通透性。我們已經(jīng)鑒別一些這種新的特異性差異表達(dá)的多肽，包括前B細(xì)胞集落增強(qiáng)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4、潛伏轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白2、腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白6、肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子(白喉毒素受體)及磷脂酶A2，VII組。除了白喉毒素受體(SEQ ID NO22)和磷脂酶A2，VII組(SEQ ID NO23)在不同的部分論述之外(分別在受體和粘著分子及代謝酶部分論述)，這些物質(zhì)在下文更詳盡地論述。
編碼前B細(xì)胞集落增強(qiáng)因子(pre-B-cell colony-enhancing factor)的PBEF基因(SEQ ID NO1；LPSS01)在BCEC單層和BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物中暴露于LPS 2小時(shí)后在BCEC中是上調(diào)的(表1和表2)。上調(diào)的LPSS多肽參與血管通透性的增加。前B細(xì)胞集落增強(qiáng)因子是作用于早期B細(xì)胞系前體細(xì)胞的一種細(xì)胞因子。其增加干細(xì)胞因子(MGF)和白細(xì)胞介素7(IL7)的前B細(xì)胞集落形成活性。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)PBEF基因或前B細(xì)胞集落增強(qiáng)因子在組成血腦屏障的細(xì)胞中被LPS修飾，先前對此未加報(bào)道，提供了修飾或監(jiān)測血腦屏障功能性的新機(jī)會。因此，改變PBEF基因產(chǎn)物(前B細(xì)胞集落增強(qiáng)因子)的生物學(xué)活性的任何制劑在本發(fā)明的實(shí)施方案中均用于特異性調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性。前B細(xì)胞集落增強(qiáng)因子活性可以通過PBEF基因的反義抑制而便利地降低，而前B細(xì)胞集落增強(qiáng)因子活性可以通過將PBEF基因?qū)爰?xì)胞中或者通過將內(nèi)皮細(xì)胞暴露于外源前B細(xì)胞集落增強(qiáng)因子而便利地增加。另外，Ognjanovic等(2001，J Mol Endocrinol.26(2)107-117)揭示了前B細(xì)胞集落增強(qiáng)因子的抗體，其可用于診斷或治療目的。這個(gè)基因表達(dá)的改變在本發(fā)明的實(shí)施方案中可用于血管通透性狀態(tài)的診斷目的。為此，與PBEF基因互補(bǔ)的核酸以及PBEF蛋白的抗體均可以應(yīng)用。
編碼骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenic protein 4)的BMP4基因(SEQ ID NO2、3和4；LPSS02)在BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物中暴露于LPS 2小時(shí)后是下調(diào)的(表1和表2)。下調(diào)的LPSS多肽參與血管通透性的增加。骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(或者骨形態(tài)發(fā)生蛋白2B(BMP2B或BMP2B1)或ZYME)是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族的一個(gè)成員，是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的一部分。所述超家族包括生長因子和分化因子的大家族。骨形態(tài)發(fā)生蛋白最初通過去礦質(zhì)的骨提取物在體內(nèi)在骨外(extraskeletal)部位誘導(dǎo)軟骨骨發(fā)生的能力而鑒別。這個(gè)特殊家族成員在人的軟骨內(nèi)骨形成的發(fā)生中起重要作用，其表達(dá)的降低與許多骨病相關(guān)，包括可遺傳的失調(diào)進(jìn)行性骨化性纖維發(fā)育不良(Fibrodysplasia Ossificans Progressiva)。對這個(gè)基因的5’非翻譯區(qū)中的可變剪接已經(jīng)加以了描述，并描述了三個(gè)均編碼同一蛋白質(zhì)的變體。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)BMP4基因或骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的表達(dá)在組成血腦屏障的細(xì)胞中由LPS修飾，這個(gè)發(fā)現(xiàn)在先前未加以報(bào)道，提供了修飾或監(jiān)測血腦屏障功能性的新機(jī)會。因此，改變BMP4基因產(chǎn)物(骨形態(tài)發(fā)生蛋白4)的生物學(xué)活性的任何制劑在本發(fā)明的實(shí)施方案中均用于特異性調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性。骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的活性可以通過反義抑制BMP4基因或者通過將內(nèi)皮細(xì)胞暴露于骨形態(tài)發(fā)生蛋白4抑制劑noggin或chordin而便利地降低，而骨形態(tài)發(fā)生蛋白4活性可以通過將BMP4基因?qū)爰?xì)胞中或者通過將內(nèi)皮細(xì)胞暴露于外源骨形態(tài)發(fā)生蛋白4而便利地增加。另外，R&D Systems Europe Ltd.，UK提供了骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的有用的抗體，其可用于診斷或治療目的。這個(gè)基因表達(dá)的改變在本發(fā)明的實(shí)施方案中可用于血管通透性狀態(tài)的診斷目的。為此，與BMP4基因互補(bǔ)的核酸以及BMP4蛋白的抗體均可以有用。
編碼潛伏轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白2(latent transforming growthfactor beta binding protein 2)的LTBP2基因(SEQ ID NO13；LPSS06)在BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物中暴露于LPS 2小時(shí)后是上調(diào)的(表1和表2)。上調(diào)的LPSS多肽參與增加血管通透性。潛伏轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白2(先前稱為LTBP3)參與胞外基質(zhì)中tgf-β的結(jié)合。其作為調(diào)節(jié)tgf-β功能的一個(gè)重要機(jī)制。LTBP2中的突變已經(jīng)在兩個(gè)非典型的馬方綜合征(Marfan syndrome)情況中鑒別。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)LTBP2基因或者潛伏轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白2在組成血腦屏障的細(xì)胞中被LPS修飾，這個(gè)發(fā)現(xiàn)先前未加以報(bào)道，提供了修飾或監(jiān)測血腦屏障功能性的一個(gè)新機(jī)會。因此，改變LTBP2基因產(chǎn)物(潛伏轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白2)的生物學(xué)活性的任何制劑在本發(fā)明的實(shí)施方案中均用于特異性調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性。潛伏轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白2的活性可以通過反義抑制LTBP2基因而便利地降低，同時(shí)潛伏轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白2的活性可以通過將LTBP2基因?qū)爰?xì)胞中或者將內(nèi)皮細(xì)胞暴露于外源潛伏轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白2而便利地增加。另外，ElastinProducts Company，Inc.(Missouri，USA)提供了潛伏轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白2的抗體，其用于診斷或治療目的。這個(gè)基因表達(dá)的改變在本發(fā)明的實(shí)施方案中可用于血管通透狀態(tài)的診斷目的。為此，可應(yīng)用與LTBP2基因互補(bǔ)的核酸以及LTBP2蛋白的抗體。
編碼腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白6(tumor necrosis factoralpha-induced protein 6)的TNFAIP6基因(SEQ ID NO14；LPSS07)在BCEC單層和BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物中暴露于LPS 2小時(shí)后是上調(diào)的(表1和表2)。上調(diào)的LPSS多肽參與血管通透性的增加。腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白6(或者腫瘤壞死因子刺激基因6蛋白或TSG6，或者透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白，或者腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白6，或者腫瘤壞死因子α可誘導(dǎo)蛋白6)是一種分泌蛋白，其含有一個(gè)透明質(zhì)酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并因此是透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白家族的一個(gè)成員。已知透明質(zhì)酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域參與胞外基質(zhì)穩(wěn)定性和細(xì)胞遷移。這個(gè)蛋白質(zhì)已經(jīng)示出與間-α-抑制劑(inter-alpha-inhibitor，IαI)形成一種穩(wěn)定的復(fù)合物，并因此增強(qiáng)IαI的絲氨酸蛋白酶抑制活性，其在與炎癥相關(guān)的蛋白酶網(wǎng)絡(luò)中是重要的。這個(gè)基因在正常成纖維細(xì)胞、外周血單核的細(xì)胞、滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中的表達(dá)可以通過腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素-1和LPS誘導(dǎo)。表達(dá)也可以通過血管平滑肌細(xì)胞中的機(jī)械刺激而誘導(dǎo)，并發(fā)現(xiàn)與蛋白聚糖合成及聚集相關(guān)。TNFAIP6與粘附受體CD44相似。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)TNFAIP6基因或者腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白6在組成血腦屏障的細(xì)胞中由LPS修飾，這個(gè)發(fā)現(xiàn)先前未加以報(bào)道，提供了修飾或監(jiān)測血腦屏障功能性的新機(jī)會。因此，改變TNFAIP6基因產(chǎn)物(腫瘤壞死因子α-誘導(dǎo)蛋白6)的生物學(xué)活性的任何制劑在本發(fā)明的實(shí)施方案中均用于特異性調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性。腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白6活性可以通過反義抑制TNFAIP6基因或者通過使用TNFAIP6蛋白的抗體而便利地降低，同時(shí)腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白6的活性可以通過將TNFAIP6基因?qū)爰?xì)胞中或者通過將內(nèi)皮細(xì)胞暴露于外源腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白6而便利地增加。這個(gè)基因表達(dá)的改變在本發(fā)明的實(shí)施方案中可用于血管通透性狀態(tài)的診斷目的。為此，可應(yīng)用與TNFAIP6基因互補(bǔ)的核酸以及TNFAIP6蛋白的抗體。
信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
參與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的多肽在本發(fā)明的實(shí)施方案中優(yōu)選用于特異性調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性。我們已經(jīng)鑒別了一些新的這種特異性差異表達(dá)多肽，包括成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白6、鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaM激酶)IIγ、巨噬細(xì)胞豆蔻?；槐彼酑激酶底物、GTP結(jié)合蛋白RH06、phosducin同種型phosducin樣蛋白質(zhì)/orphanl、鈣網(wǎng)蛋白前體及G蛋白偶聯(lián)受體誘導(dǎo)蛋白。這些蛋白質(zhì)在下文更詳細(xì)地描述。
編碼成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白6的RBBP6基因(SEQ ID NO5；LPSS03)在BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物中暴露于LPS 2小時(shí)后在BCEC中是上調(diào)的(表1和表2)。上調(diào)的LPSS多肽參與血管通透性的增加。成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白6(或RBQ-1或DKFZp761B2423)是一種遍在表達(dá)的核蛋白。發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)直接結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白。其與低磷酸化的成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白優(yōu)先相互作用。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)RBBP6基因或成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白6的表達(dá)在組成血腦屏障的細(xì)胞中由LPS修飾，這個(gè)發(fā)現(xiàn)先前未加以報(bào)道，提供了修飾或監(jiān)測血腦屏障功能性的新機(jī)會。因此，改變RBBP6基因產(chǎn)物(成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白6)的生物學(xué)活性的任何制劑在本發(fā)明的實(shí)施方案中用于特異性調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性。成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白6的活性可以通過反義抑制RBBP6基因或者通過使用RBBP6蛋白的抗體而便利地降低，同時(shí)成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白6的活性可以通過將RBBP6基因?qū)爰?xì)胞中或者將內(nèi)皮細(xì)胞暴露于外源成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白6而便利地增加。這個(gè)基因表達(dá)的改變在本發(fā)明的實(shí)施方案中可用于血管通透性狀態(tài)的診斷目的。為此，可應(yīng)用與RBBP6基因互補(bǔ)的核酸以及RBBP6蛋白的抗體。
編碼鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaM激酶)IIγ的CAMK2G基因(SEQ ID NO6、7、8、9、10和11；LPSS04)在BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物中暴露于LPS 2小時(shí)后在BCEC中是下調(diào)的(表1和表2)。下調(diào)的LPSS多肽參與血管通透性的增加。鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaM激酶)IIγ(或CAMK、CAMKG、CAMK-II、MGC26678)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，及屬于Ca(2+)/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶亞家族(subfamily)。鈣信號在谷氨酸能(glutamatergic)突觸對可塑性的一些方面是至關(guān)緊要的。在哺乳動物細(xì)胞中，這個(gè)酶由四個(gè)不同的鏈組成α、β、γ及δ。這個(gè)基因的產(chǎn)物是γ鏈。迄今為止已經(jīng)鑒定了編碼6個(gè)不同的同種型的6個(gè)可變剪接變體。已經(jīng)描述了編碼不同同種型的另外的可變剪接變體，但其全長性質(zhì)還未確定。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)CAMK2G基因或鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaM激酶)II γ的表達(dá)在組成血腦屏障的細(xì)胞中由LPS修飾，這個(gè)發(fā)現(xiàn)先前未加以報(bào)道，提供了修飾或監(jiān)測血腦屏障功能性的新機(jī)會。因此，改變CAMK2G基因產(chǎn)物(鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaM激酶)IIγ)的生物學(xué)活性的任何制劑在本發(fā)明的實(shí)施方案中均用于特異性調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性。鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaM激酶)IIγ的活性可以通過反義抑制CAMK2G基因或者通過使用CAMK2G蛋白的抗體而便利地降低，同時(shí)鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaM激酶)IIγ的活性可以通過將CAMK2G基因?qū)爰?xì)胞中或者將內(nèi)皮細(xì)胞暴露于外源鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaM激酶)IIγ而便利地增加。這個(gè)基因表達(dá)的改變在本發(fā)明的實(shí)施方案中可用于血管通透性狀態(tài)的診斷目的。為此，可以使用與CAMK2G基因互補(bǔ)的核酸以及CAMK2G蛋白的抗體。另外，Bui等(2000，Cell 100(4)457-67)產(chǎn)生了表達(dá)CaMKIIγB*(T287D)的轉(zhuǎn)基因小鼠，CaMKIIγB*是CaMKIIγB的部分鈣非依賴性突變體，其在本發(fā)明的實(shí)施方案中可用于特異性研究血腦屏障。
編碼巨噬細(xì)胞豆蔻酰化富丙氨酸C激酶底物(macrophagemyristoylated alanine-rich C kinase substrate)的MACMARCKS基因(SEQ ID NO12；LPSS05)在BCEC單層和BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物中在暴露于LPS 2小時(shí)后在BCEC中均是上調(diào)的(表1和表2)。上調(diào)的LPSS多肽參與血管通透性的增加。巨噬細(xì)胞豆蔻?；槐彼酑激酶底物(也稱為F52或MARCKS樣蛋白或MLP或MLP1或者M(jìn)ARCKS相關(guān)蛋白MRP)在鈣調(diào)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白激酶C系統(tǒng)的偶聯(lián)中起作用。其參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)MACMARCKS基因或者巨噬細(xì)胞豆蔻?；槐彼酑激酶底物在組成血腦屏障的細(xì)胞中被LPS修飾，這個(gè)發(fā)現(xiàn)先前未加以報(bào)道，提供了修飾或監(jiān)測血腦屏障功能性的新機(jī)會。因此，改變MACMARCKS基因產(chǎn)物(巨噬細(xì)胞豆蔻?；槐彼酑激酶底物)的生物學(xué)活性的任何制劑在本發(fā)明的實(shí)施方案中均用于特異性調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性。巨噬細(xì)胞豆蔻酰化富丙氨酸C激酶底物的活性可以通過反義抑制MACMARCKS基因或者通過MACMARCKS蛋白的抗體而便利地降低，同時(shí)巨噬細(xì)胞豆蔻?；槐彼酑激酶底物的活性可以通過將MACMARCKS基因?qū)爰?xì)胞中或者通過將內(nèi)皮細(xì)胞暴露于外源巨噬細(xì)胞豆蔻?；槐彼酑激酶底物而便利地增加。這個(gè)基因表達(dá)的改變在本發(fā)明的實(shí)施方案中可用于血管通透性狀態(tài)的診斷目的。為此，可以使用與MACMARCKS基因互補(bǔ)的核酸以及MACMARCKS蛋白的抗體。另外，Wu等(1996，Proc Natl Acad Sci USA，93(5)2110-2115)產(chǎn)生了F52缺陷小鼠，其在本發(fā)明的實(shí)施方案中可用于特異性研究血腦屏障。
編碼GTP結(jié)合蛋白RHO6的RHO6基因(SEQ ID NO15；LPSS08)在BCEC單層和BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物中暴露于LPS 2小時(shí)后在BCEC中均是上調(diào)的(表1和表2)。上調(diào)的LPSS多肽參與血管通透性的增加。GTP結(jié)合蛋白RHO6(或roundl、RND1)參與肌動蛋白細(xì)胞骨架和細(xì)胞附著的調(diào)節(jié)。RHO6與ARHE(或RND3或Rho8或RhoE)高度相似。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)RHO6基因或者GTP結(jié)合蛋白RHO6在組成血腦屏障的細(xì)胞中由LPS修飾，這個(gè)發(fā)現(xiàn)先前未加以報(bào)道，提供了修飾或監(jiān)測血腦屏障功能性的新機(jī)會。因此，改變RHO6基因產(chǎn)物(GTP結(jié)合蛋白RHO6)的生物學(xué)活性的任何制劑在本發(fā)明的實(shí)施方案中均用于特異性調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性。GTP結(jié)合蛋白RHO6的活性可以通過反義抑制RHO6基因或者通過RHO6蛋白的抗體而便利地降低，同時(shí)GTP結(jié)合蛋白RHO6的活性可以通過將RHO6基因?qū)爰?xì)胞中或者通過將內(nèi)皮細(xì)胞暴露于外源GTP結(jié)合蛋白RHO6而便利地增加。這個(gè)基因表達(dá)的改變在本發(fā)明的實(shí)施方案中可用于血管通透性狀態(tài)的診斷目的。為此，可以使用與RHO6基因互補(bǔ)的核酸以及RHO6蛋白的抗體。
編碼phosducin同種型phosducin樣蛋白/orphan 1的PDC基因(SEQID NO16和17；LPSS09)在BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物中暴露于LPS 2小時(shí)后在BCEC中是上調(diào)的(表1和表2)。上調(diào)的LPSS多肽參與血管通透性的增加。Phosducin(也稱為phosducin樣蛋白或PhLP1或者phosducin、松果體或者G βγ結(jié)合蛋白或者33kDA光轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(phototransducing protein)或者PHD或者M(jìn)EKA)位于視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞的外部和內(nèi)部節(jié)段(segment)中。Phosducin可參與視覺光轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)或者參與光受體代謝的整合。Phosducin通過與視網(wǎng)膜G-蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)素的β和γ亞基相互作用而調(diào)節(jié)光轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)。已經(jīng)描述了兩個(gè)可變剪接的轉(zhuǎn)錄變體。該變體編碼的同種型之一，phosducin樣orphan蛋白不結(jié)合G蛋白。Phosducin蛋白及其同種型也存在于其它組織中，在此其參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。編碼這個(gè)蛋白質(zhì)的基因是色素性視網(wǎng)膜炎和烏斯赫爾綜合征(Usher syndrome)II型的一種潛在的候選基因。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)PDC基因或者phosducin同種型phosducin-樣蛋白/orphan 1的表達(dá)在組成血腦屏障的細(xì)胞中由LPS修飾，這個(gè)發(fā)現(xiàn)先前未加以報(bào)道，提供了修飾或監(jiān)測血腦屏障功能性的新機(jī)會。因此，改變PDC基因產(chǎn)物(phosducin同種型phosducin樣蛋白/orphan 1)的生物學(xué)活性的任何制劑在本發(fā)明的實(shí)施方案中均用于特異性調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性。Phosducin同種型phosducin樣蛋白/orphan 1的活性可以通過反義抑制PDC基因或者通過使用PDC蛋白的抗體而便利地降低，同時(shí)phosducin同種型phosducin樣蛋白/orphan 1的活性可以通過將PDC基因?qū)爰?xì)胞中或者將內(nèi)皮細(xì)胞暴露于外源phosducin同種型phosducin-樣蛋白/orphan 1而便利地增加。這個(gè)基因表達(dá)的改變在本發(fā)明的實(shí)施方案中可用于血管通透性狀態(tài)的診斷目的。為此，可以應(yīng)用與PDC基因互補(bǔ)的核酸以及PDC蛋白的抗體。
編碼鈣網(wǎng)蛋白前體的CALR基因(SEQ ID NO18；LPSS10)在BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物中暴露于LPS 2小時(shí)后在BCEC中是差異下調(diào)的(表1和表2)。BCEC單層與BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物之間差異下調(diào)的LPSS多肽參與從LPS刺激中恢復(fù)的能力(圖2)。鈣網(wǎng)蛋白(或者自身抗原Ro或干燥綜合征抗原A或SSA或cClqR)是一種多功能蛋白質(zhì)，其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中作為主要的Ca2+結(jié)合(貯存)蛋白。其在核中也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，提示其在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中也許有作用。鈣網(wǎng)蛋白結(jié)合合成的肽KLGFFKR，其與核受體超家族的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的氨基酸序列幾乎相同。鈣網(wǎng)蛋白結(jié)合系統(tǒng)性狼瘡和斯耶格倫(sjogren)患者的某些血清中的抗體，其含有抗Ro/SSA抗體，其在物種中是高度保守的，且其位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌質(zhì)網(wǎng)中，在此其可以與鈣結(jié)合。鈣網(wǎng)蛋白的氨基末端與糖皮質(zhì)激素受體的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用并防止該受體與其特異性糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件結(jié)合。鈣網(wǎng)蛋白可抑制雄激素受體與其激素應(yīng)答性DNA元件結(jié)合，并可以抑制雄激素受體和視黃酸受體的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性以及視黃酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元分化。因此，鈣網(wǎng)蛋白通過核激素受體而可作為基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)重要調(diào)節(jié)子。系統(tǒng)性紅斑狼瘡與鈣網(wǎng)蛋白的自身抗體效價(jià)增加相關(guān)，但鈣網(wǎng)蛋白不是Ro/SS-A抗原。先前的論文稱鈣網(wǎng)蛋白是Ro/SS-A抗原，但這點(diǎn)隨后未被證實(shí)。人鈣網(wǎng)蛋白自身抗體效價(jià)的增加在IgG和IgM類別的完全先天性心傳導(dǎo)阻滯的嬰兒中發(fā)現(xiàn)。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)CALR基因或鈣網(wǎng)蛋白前體的表達(dá)在組成血腦屏障的細(xì)胞中由LPS修飾，這個(gè)發(fā)現(xiàn)先前未加以報(bào)道，提供了修飾或監(jiān)測血腦屏障功能性的新機(jī)會。因此，改變CALR基因產(chǎn)物(鈣網(wǎng)蛋白前體)的生物學(xué)活性的任何制劑在本發(fā)明的實(shí)施方案中均用于特異性調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性。鈣網(wǎng)蛋白前體的活性可以通過反義抑制CALR基因或通過使用CALR蛋白的抗體而便利地降低，同時(shí)鈣網(wǎng)蛋白前體的活性可以通過將CALR基因?qū)爰?xì)胞中或者將內(nèi)皮細(xì)胞暴露于外源鈣網(wǎng)蛋白前體而便利地增加。這個(gè)基因表達(dá)的改變在本發(fā)明的實(shí)施方案中可用于血管通透性狀態(tài)的診斷目的。為此，可以使用與CALR基因互補(bǔ)的核酸以及CALR蛋白的抗體。
編碼G-蛋白偶聯(lián)受體誘導(dǎo)蛋白(G-protein-coupled receptorinduced protein)的C8FW基因(SEQ ID NO19；LPSS11)在BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物中暴露于LPS 2小時(shí)后在BCEC中是差異上調(diào)的(表1和表2)。BCEC單層和BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物之間差異上調(diào)的LPSS多肽參與從LPS刺激中恢復(fù)的能力(圖2)。C8FW(或GIG2)是一種中間基因符號(interim gene symbol)，并以這種磷蛋白質(zhì)而命名，其由促有絲分裂途徑調(diào)節(jié)。這種G-蛋白偶聯(lián)受體誘導(dǎo)蛋白與蛋白激酶相似。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)C8FW基因或者G-蛋白偶聯(lián)受體誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)在組成血腦屏障的細(xì)胞中由LPS修飾，這個(gè)發(fā)現(xiàn)先前未加以報(bào)道，提供了修飾或監(jiān)測血腦屏障功能性的新機(jī)會。因此，改變C8FW基因產(chǎn)物(G-蛋白偶聯(lián)受體誘導(dǎo)蛋白)的生物學(xué)活性的任何制劑在本發(fā)明的實(shí)施方案中均用于特異性調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性。G-蛋白偶聯(lián)受體誘導(dǎo)蛋白的活性可通過反義抑制C8FW基因或者通過使用C8FW蛋白的抗體而便利地降低，同時(shí)G-蛋白偶聯(lián)受體誘導(dǎo)蛋白的活性可以通過將C8FW基因?qū)爰?xì)胞中或者通過將內(nèi)皮細(xì)胞暴露于G-蛋白偶聯(lián)受體誘導(dǎo)蛋白而便利地增加。這個(gè)基因表達(dá)的改變在本發(fā)明的實(shí)施方案中可用于血管通透性狀態(tài)的診斷目的。為此，可以使用與C8FW基因互補(bǔ)的核酸以及C8FW蛋白的抗體。
受體和粘著分子
作為膜(信號化或內(nèi)在化)受體或(信號化)粘著分子的多肽在本發(fā)明的實(shí)施方案中優(yōu)選用于特異性調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性。我們已經(jīng)鑒別了一些新的這種特異性差異表達(dá)的多肽，包括趨化因子(C-X-C基序)受體4、生長激素受體和白喉毒素受體(肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子)。這些在下文更詳細(xì)地論述。
編碼趨化因子(C-X-C基序)受體4的CXCR4基因(SEQ ID NO20；LPSS12)在BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物中暴露于LPS 2小時(shí)后在BCEC中是下調(diào)的(表1和表2)。下調(diào)的LPSS多肽參與增加血管通透性。趨化因子受體4是一種G蛋白偶聯(lián)受體，其結(jié)合CXC細(xì)胞因子。其介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣的流出。趨化因子受體4參與激活MAPK、編程性細(xì)胞死亡、趨化性、組織發(fā)生和器官發(fā)生、免疫應(yīng)答、炎癥應(yīng)答、侵潤生長、神經(jīng)發(fā)生、對病毒和毒力的應(yīng)答(其是HIV-1進(jìn)入細(xì)胞的一種共同受體)。根據(jù)所研究的性質(zhì)，這種蛋白質(zhì)稱為神經(jīng)肽Y受體Y3(NPY3R)；融合素(fusin)；白細(xì)胞衍生的7-跨膜結(jié)構(gòu)域受體(LESTR)；7-跨膜-節(jié)段受體(seven-transmembrane-segment receptor)、脾；脂多糖(LPS)相關(guān)蛋白3(LAP3)，具有多種名稱(如HM89、NPYR、HSY3RR、NPYY3R、D2S201E)。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)CXCR4基因或者趨化因子受體4的表達(dá)在組成血腦屏障的細(xì)胞中由LPS修飾，這個(gè)發(fā)現(xiàn)先前未加以報(bào)道，提供了修飾或監(jiān)測血腦屏障功能性的新機(jī)會。因此，改變CXCR4基因產(chǎn)物(趨化因子受體4)的生物學(xué)活性的任何制劑在本發(fā)明的實(shí)施方案中均用于特異性調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性。趨化因子受體4活性可以通過反義抑制CXCR4基因或者通過趨化因子受體4拮抗劑包括CXCR4蛋白的抗體而便利地降低，同時(shí)趨化因子受體4的活性可以通過將CXCR4基因?qū)爰?xì)胞中或者將內(nèi)皮細(xì)胞暴露于外源趨化因子受體4激動劑而便利地增加。迄今為止，已經(jīng)描述了如下CXCR4拮抗劑肽化合物(T22、T134、T140、ALX40-4C、CGP64222)、bicyclam衍生物(AMD3100)、中和抗體(12G5、44717-111)及天然拮抗劑(HIV-1tat蛋白)(Sachpatzidis et al.，2003，J Biol Chem 278(2)896-907；DeClercq et al.，2001，Antivir Chem Chemother 12 Suppl 119-31；Tamamura et al.，1998，Biochem Biophys Res Commun 253(3)877-882)。迄今為止，已經(jīng)描述了如下CXCR4激動劑肽化合物(RSVM、ASLW)及天然激動劑(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α和β(CXCL12)(Sachpatzidis et al.，2003，supra)。另外，R&D Systems Europe Ltd.，UK提供了重組人和小鼠CXCL12及趨化因子受體4的有用的抗體及其配體CXCL12，其可用于診斷或治療目的。這個(gè)基因表達(dá)的改變在本發(fā)明的實(shí)施方案中可用于血管通透性狀態(tài)的診斷目的。為此，可以使用與CXCR4基因互補(bǔ)的核酸以及CXCR4蛋白的抗體。
編碼生長激素受體的GHR基因(SEQ ID NO.21；LPSS13)在BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物中暴露于LPS 2小時(shí)后在BCEC中是上調(diào)的(表1和表2)。上調(diào)的LPSS多肽參與血管通透性的增加。生物學(xué)活性的生長激素結(jié)合其跨膜受體(GHR)，使其二聚體化以激活胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起胰島素樣生長因子I(IGF1)的合成與分泌。在血漿中，IGF1結(jié)合可溶的IGF1受體(IGF1R)。對于靶細(xì)胞，這個(gè)復(fù)合物激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致引起生長的促有絲分裂及合成代謝應(yīng)答。GHR也已知是生長激素結(jié)合蛋白(GHBP)，其衍生自GHR的胞外激素結(jié)合區(qū)域，GHBP保持結(jié)合循環(huán)中的生長激素，并穩(wěn)定循環(huán)中的生長激素。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)GHR基因或生長激素受體的表達(dá)在組成血腦屏障的細(xì)胞中由LPS修飾，這個(gè)發(fā)現(xiàn)先前未加以報(bào)道，提供了修飾或監(jiān)測血腦屏障功能性的新機(jī)會。因此，改變GHR基因產(chǎn)物(生長激素受體)的生物學(xué)活性的任何制劑在本發(fā)明的實(shí)施方案中用于特異性調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性。生長激素受體活性可以通過反義抑制GHR基因、通過生長激素受體拮抗劑(包括高濃度的生長激素，其然后成為拮抗性的)或者通過GHR蛋白的抗體而便利地降低，同時(shí)生長激素受體活性可以通過將GHR基因?qū)爰?xì)胞中或通過將內(nèi)皮細(xì)胞暴露于外源生長激素受體激動劑(如生長激素)而便利地增加。這個(gè)基因表達(dá)的改變在本發(fā)明的實(shí)施方案中可用于血管通透性狀態(tài)的診斷目的。為此，可以應(yīng)用與GHR基因互補(bǔ)的核酸以及GHR蛋白的抗體。
編碼白喉毒素受體(或者肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子)的DTR(或HEGFL)基因(SEQ ID NO22；LPSS14)在BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物中暴露于LPS 2小時(shí)后在BCEC中是上調(diào)的(表1和表2)。上調(diào)的LPSS多肽參與血管通透性的增加。
白喉毒素受體(或稱為HB-EGF或肝素結(jié)合EGF樣生長因子前體或者白喉毒素敏感性DTS)是白喉毒素(DT)的受體，是白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae)的溶原化菌株產(chǎn)生的強(qiáng)力外毒素。DT，是一種58kDa的多功能蛋白質(zhì)，其殺死易感的哺乳動物細(xì)胞。其由兩個(gè)二硫鍵連接的蛋白質(zhì)片段組成，這兩個(gè)片段均是中毒過程所需的。A片段催化真核延伸因子2(eukaryotic elongation factor 2)的ADP核糖基化，從而抑制蛋白質(zhì)合成。B片段負(fù)責(zé)毒素與細(xì)胞結(jié)合并且是促進(jìn)A片段進(jìn)入細(xì)胞溶膠所必需的。特異性細(xì)胞表面DT受體的存在于1973年首次論證，現(xiàn)在已知DT通過受體介導(dǎo)的胞吞進(jìn)入易感哺乳動物細(xì)胞。最初的步驟包括DT與DTR的結(jié)合，隨后是毒素受體復(fù)合物的內(nèi)在化進(jìn)入包被的窩(pit)中及A片段易位至細(xì)胞溶膠中。事實(shí)上，在DT毒素結(jié)合其細(xì)胞受體之后，其被胞吞，同時(shí)在這個(gè)胞吞泡中其暴露于酸性pH環(huán)境。酸性pH誘導(dǎo)毒素分子中的結(jié)構(gòu)變化，提供了膜插入和易位至細(xì)胞溶膠的驅(qū)動力。不是所有的哺乳動物細(xì)胞均對DT等同地敏感。例如，猴腎細(xì)胞如Vero細(xì)胞是高度敏感的，而例如人、兔、豚鼠和倉鼠細(xì)胞是中等程度敏感的，小鼠和大鼠細(xì)胞是抗性的。雞細(xì)胞對DT也是敏感的。如在實(shí)施例2中所示出，在頂端和基底外側(cè)暴露之后，DT在(亞)納摩爾范圍以濃度和時(shí)間依賴性方式對牛BCEC是毒性的。
HB-EGF最初在1990年鑒別為巨噬細(xì)胞分泌的肝素結(jié)合生長因子。如同EGF家族的其它成員，HB-EGF通過結(jié)合EGF受體(EGF-R)分子的erb類別而發(fā)揮其生物學(xué)作用。HB-EGF激活兩種EGF受體亞型，HER1和HER4并結(jié)合細(xì)胞表面HSPG。然而，與EGF家族的大多數(shù)成員包括EGF不同，HB-EGF與肝素高親和性結(jié)合。肝素表現(xiàn)為加強(qiáng)HB-EGF與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)EGF-R的結(jié)合，并還可以調(diào)節(jié)生長因子對靶細(xì)胞的生物學(xué)作用，包括細(xì)胞遷移和增殖。HB-EGF對成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞是促有絲分裂的，但對內(nèi)皮細(xì)胞不是。另外，HB-EGF是由上皮細(xì)胞產(chǎn)生的并作為這些細(xì)胞的自分泌生長因子。其是熱抗性的陽離子蛋白，分子量為大約22kDa，用1.0M NaCl從肝素親和層析柱洗脫。HB-EGF基因表達(dá)在應(yīng)答例如氧化、缺血、滲透壓(高葡萄糖或高滲)、電子和機(jī)械(剪切)刺激時(shí)及暴露于細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、TGF-α)、LPS、生長因子(EGF、HB-EGF、雙調(diào)蛋白、bFGF、PDGF)、溶血磷脂酰膽堿、氯化汞、佛波酯、Ca-離子載體、血清、凝血酶、內(nèi)皮縮血管肽-1、血管緊張素II、脂蛋白、血小板活化因子(PAF)、α-腎上腺素能激動劑及轉(zhuǎn)錄因子如MyoD、Raf、v-Ha-ras之后是高度上調(diào)的?？扇艿某墒霩B-EGF是從較大的膜錨定前體中由基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP′s，特別是MMP-3)和ADAM′s(一個(gè)解離素(disintegrin)和金屬蛋白酶家族，包括ADAM9、ADAM10/Kuzbanian、ADAM 12/meltrin-α及ADAM 17/TACE(TNF-α轉(zhuǎn)換酶))而蛋白酶解的。這個(gè)過程稱為胞外域脫落(ectodomain shedding)，通過如下方式誘導(dǎo)或上調(diào)UV光、IL-1β、茴香霉素、山梨糖醇、LPS、過氧化氫、脫羥腎上腺素、內(nèi)皮縮血管肽-1、血管緊張素II、胰島素樣生長因子-1、12-O-十四酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)，通過蛋白激酶C δ的激活及隨后與ADAM9/MDC9/meltrin-γ的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，或者通過溶血磷脂酸(LPA)，經(jīng)Ras-Raf-MEK和小GTPase Rac信號化途徑，或者通過應(yīng)激和炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)的p38 MAPK介導(dǎo)的途徑(Takenobu et al.，2003，J.Biol.Chem.，27817255-17262；Umata et al.，2001，J.Biol.Chem.，27630475-30482；Asakura et al.，2002，Nature Medicine，835-40)。Pro-HB-EGF脫落由MMP抑制劑如基于氧肟酸的KB-R8301、一般的MMP抑制劑(包括TIMP′s)及BB-94(batimastat)和ADAM12抑制劑KB-R7785及ADAM10抑制劑XL784和XL081或者其類似物而抑制。TPA誘導(dǎo)的脫落是由PKC抑制劑Ro-31-8220抑制的，LPA誘導(dǎo)的脫落是由MEK拮抗劑PD98059抑制的，p38 MAPK-介導(dǎo)的脫落是由SB203580抑制的(Takenobu et al.，2003，如前)。在從膜的蛋白酶解過程之后，相當(dāng)數(shù)量的HB-EGF前體在細(xì)胞表面保持未切割(Nakamura etal.，1995，J.Cell Biol.1291691-1705)。
HB-EGF參與許多正常的生理學(xué)過程，如胚泡植入和傷口愈合，并參與病理學(xué)過程如腫瘤生長、SMC增生和動脈粥樣硬化。HB-EGF基因表達(dá)已經(jīng)在許多組織中論證，包括血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞、炎癥細(xì)胞(主要是NK細(xì)胞)、骨骼肌和心肌、腎系膜細(xì)胞(kidney mesangialcells)、角質(zhì)細(xì)胞、小腸、腦(神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)、整個(gè)關(guān)節(jié)、滋養(yǎng)層、胚泡、卵巢和子宮、胎盤、皮膚、淋巴結(jié)、膀胱和腫瘤細(xì)胞(包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤)。
近來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HB-EGF前體發(fā)揮白喉毒素受體的功能(Naglich etal.，1992，Cell，691051-1061)。盡管HB-EGF前體在包括具有相似組織分布的人、猴、大鼠和小鼠等物種中表達(dá)，但由于在人和猴中由DT特異性識別的序列中的氨基酸取代(HB-EGF上DT的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域)導(dǎo)致大鼠和小鼠對DT有抗性，這降低了DT與嚙齒動物HB-EGF的結(jié)合(Mitamura et al.，1995，J.Biol.Chem.，2701015-1019)。近來已經(jīng)示出AA141(Glu141)是DT結(jié)合及毒素敏感性的關(guān)鍵殘基(Hooper andEidels，1996，Biochem.Biophys.Res.Commun.，220675-680)。稍后Mitamura等(1997，J.Biol.Chem.，27227084-27090)揭示了DT結(jié)合及毒素敏感性的兩個(gè)另外的關(guān)鍵殘基(AA115(Phe115)和AA127(Leu127))。表3示出不同的DT-不敏感的(小鼠、大鼠)及DT敏感的(中國倉鼠、兔、豬、猴、人和雞)物種的HB-EGF的DT受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(AA106-147)的序列。
表3DT不敏感的(小鼠(Ms)、大鼠(Rt))和DT敏感的(中國倉鼠(CH)、兔(Rb)、豬(P)、猴(Mk)、人(H)和雞(C))物種中HB-EGF的DT受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(AA106-147)的序列。與人不同的殘基用斜體字表示，粗體表示的殘基是DT結(jié)合和毒素敏感性關(guān)鍵的殘基(AA115(Phe115)、AA127(Leu127)和AA141(Glu141))。
肝素、硫酸乙酰肝素和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)及其它相關(guān)蛋白質(zhì)如CD9/DRAP27和α3-β1-整聯(lián)蛋白通過增加DTR與其配體的親和性(以及HB-EGF與其受體的結(jié)合(Shishido et al.，1995，J.Biol.Chem.4929578-29585))而調(diào)節(jié)DTR功能?？笴D9/DRAP27單克隆抗體(IgG1ALB-6和TP82，和IgG2aBU16和007，及MAB1206)抑制DT與人細(xì)胞的結(jié)合和毒性(Nakamura et al.，1995，如前；Mitamuraet al.，1992，J.Cell Biol.1181389-1399；Iwamoto et al.，1991，J.Biol.Chem.26620463-20469)。
發(fā)現(xiàn)DTR基因(或者白喉毒素受體(或者肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子)在組成血腦屏障的細(xì)胞上表達(dá)(如實(shí)施例1和2所示出)，并且DTR的生物學(xué)活性由如下因素修飾疾病刺激(如實(shí)施例1和3中針對LPS所示出)、肝素結(jié)合(如實(shí)施例3中暴露于外源肝素所示出)、拮抗劑(如實(shí)施例2中針對CRM197(DT的競爭性拮抗劑)及實(shí)施例2和4中針對可溶的HB-EGF(DT的非競爭性拮抗劑)所示出、胞外域脫落的抑制劑(如實(shí)施例3中暴露于基質(zhì)金屬蛋白酶BB-94(或batimastat)所示出)或其組合(如實(shí)施例3所示出)，這個(gè)發(fā)現(xiàn)提供了將藥物特異性靶向并穿過血腦屏障和/或胞內(nèi)區(qū)室，特別是溶酶體的新機(jī)會。改變DTR基因產(chǎn)物(即肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子)的生物學(xué)活性的任何制劑在本發(fā)明的實(shí)施方案中均用于特異性調(diào)節(jié)靶向血腦屏障的能力。特異性結(jié)合DTR的(受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域)(如(部分)DT、(部分)DT的B片段、(部分)CRM197(如實(shí)施例4所示出)或者任何其它配體)的任何配體在本發(fā)明的實(shí)施方案中均用于將藥物靶向于血腦屏障。
蛋白質(zhì)毒素(或者其非毒性衍生物)作為例如肽和蛋白質(zhì)的載體穿過膜并進(jìn)入細(xì)胞溶膠中的應(yīng)用的一般概念未加以更新(參見關(guān)于此論題的最新綜述Sandvig and van Deurs(2002，Annu.Rev.CellDev.Biol.，181-24)。DT在與其受體HB-EG結(jié)合后，通過稱為受體介導(dǎo)的胞吞的過程而內(nèi)在化。受體介導(dǎo)的胞吞/胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)是一種熟知的安全而有效的將藥物選擇性靶向于腦的貨物運(yùn)載轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制(Pardridge，2002，Nat.Rev.Drug Discov.，1131-139)。然而，先前從未意識到通過涉及受體介導(dǎo)的胞吞/胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制(針對例如運(yùn)鐵蛋白受體所描述的)，DTR的特異性配體攜帶藥物直接穿過血腦屏障進(jìn)入CNS的應(yīng)用。事實(shí)上，只開發(fā)了破傷風(fēng)毒素蛋白的非毒性C片段(TTC或Tet451)及破傷風(fēng)毒素蛋白的非毒性衍生物(Glu234由Ala取代)攜帶藥物進(jìn)入CNS，然而通過明顯不同的作用機(jī)制(與在血腦屏障處受體介導(dǎo)的胞吞/胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)相比)，包括吸收進(jìn)外周神經(jīng)末梢隨后通過逆行軸突運(yùn)輸至其細(xì)胞體并跨突觸轉(zhuǎn)移至中樞神經(jīng)元(見U.S.5,780,024描述，在此并入?yún)⒖?，及Li et al.，2001 J.Biol.Chem.27631394-31401所述)。即使先前已經(jīng)描述了HB-EGF在大鼠腦的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血管中組成型及疾病誘導(dǎo)型表達(dá)(Mishima等(1996，Neurosci.Lett.，213153-156)，Nakagawa等(1998，Dev.BrainRes.，108263-272)，Hayase等(1998，Brain Res.，784163-178)及Tanaka等(1999，Brain Res.，827130-138))，但這些作者無一意識到將與DTR的配體偶聯(lián)的藥物靶向輸送于腦中這些細(xì)胞(胞內(nèi)區(qū)室)的機(jī)會。這種疏忽通過這樣的事實(shí)得以最佳地解釋嚙齒動物HB-EGF不是DT的受體。事實(shí)上，在嚙齒動物中，DT穿過腦腫瘤的微血管的通透性與其它大蛋白質(zhì)的通透性相等或略低(Wrobel et al.，1990，J.Neurosurg.72(6)946-950)，即使其在被動擴(kuò)散后可以有效地殺死腦內(nèi)的腫瘤細(xì)胞(Arguello et al.，1996.Blood.87(10)4325-4332)。因此這些研究僅針對HB-EGF的自分泌和鄰分泌(auto-and juxtacrine)生長和粘著因子性質(zhì)而進(jìn)行。更令人驚奇地，即使在受體介導(dǎo)的胞吞/胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)方面著名的CNS藥物輸送專家(包括關(guān)于此論題出版了許多學(xué)術(shù)和綜述類文章/書籍、專利和專利申請的Pardridge和Rapoport)及Yatvin等的最近公布的、其中提供了將藥物輸送至腦的可用技術(shù)的全面綜述的題目為“Covalent conjugates of biologically-active compounds with aminoacids and amino acid derivatives for targeting tophysiologically-protected sites”的美國專利申請(US20030087803，在此并入?yún)⒖?的作者均未意識到將與DTR的配體偶聯(lián)的藥物靶向輸送于腦內(nèi)細(xì)胞(胞內(nèi)區(qū)室)的機(jī)會。
DT對易感的哺乳動物細(xì)胞是非常毒性的事實(shí)使得藥物靶向于具有其天然配體DT的DTR不是優(yōu)選的。然而，非毒性DT部分包括(部分)DT的B片段或者(部分)CRM197(DT的非毒性突變蛋白)的鑒別開啟了通過DTR安全而有效地將藥物靶向于腦的大門。CRM197是最優(yōu)選的，因?yàn)榕cCRM197綴合的多糖在接種疫苗程序中已經(jīng)安全地用于數(shù)百萬人(嬰兒、學(xué)步兒童、青少年和成人)(例如流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)b型寡糖CRM197綴合疫苗(Hib TiterTM)；肺炎球菌7價(jià)綴合疫苗(PrevnarTM)；腦膜炎球菌C寡糖綴合疫苗(MenjugateTM和MeningtecTM))。從這些研究中已知CRM197蛋白是一種安全而有效的糖類T細(xì)胞依賴性載體。同樣，CRM66(交叉反應(yīng)性66kDa蛋白質(zhì))是銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A的一種失活突變形式，其特異性結(jié)合低密度脂蛋白(LDL)受體相關(guān)蛋白(LRP)和LRP 1B，并可以與Demeule等針對p97(黑素運(yùn)鐵蛋白(melanotransferrin))所述相似的方式用于輸送藥物穿過血腦屏障(2002，J.Neurochem.83(4)924-933)，其結(jié)合相同的受體(WO03009815)。
CRM197是由產(chǎn)生毒素的棒狀桿菌噬菌體(corynephage)(β)的亞硝基胍誘變而產(chǎn)生的非產(chǎn)生毒素的噬菌體(β197tox-)感染的白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)產(chǎn)生的(Uchida，et al.1971，NatureNew Biology，2338-11)。CRM197蛋白與白喉毒素具有相同的分子量，但在結(jié)構(gòu)基因中有一個(gè)堿基改變而不同(鳥嘌呤改變?yōu)橄汆堰?。這個(gè)單一的堿基改變導(dǎo)致成熟蛋白質(zhì)中氨基酸取代(AA52谷氨酸取代為甘氨酸)并消除了白喉毒素的毒性。
疫苗中的載體蛋白基于如下觀點(diǎn)而揭示。用完整的(但失活的)病毒或細(xì)菌接種是有效的，但具有許多缺點(diǎn)和副作用。為此，揭示了僅具有病毒和細(xì)菌的免疫原性部分(或模擬物)的接種方案(例如(多)糖或莢膜蛋白)。然而，這種疫苗在處于感染危險(xiǎn)的群體中至少是有效的無B細(xì)胞免疫應(yīng)答的個(gè)體，依賴于T細(xì)胞應(yīng)答以起到免疫保護(hù)的老年人和2歲以下的嬰幼兒。由于這種疫苗幾乎不是T細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)劑，因此病毒和細(xì)菌的免疫原性部分轉(zhuǎn)變?yōu)槟苷T導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的免疫原是在靶向群體中產(chǎn)生足夠的保護(hù)作用的關(guān)鍵因素。已經(jīng)揭示了將病毒和細(xì)菌的免疫原性部分與合適的蛋白質(zhì)載體如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、破傷風(fēng)類毒素(TT)、白喉類毒素(形式化DT)、牛血清白蛋白(BSA)或者人血清白蛋白(HSA)連接，通過非特異性作用機(jī)制產(chǎn)生這種免疫原。事實(shí)上，白喉類毒素綴合物的作用機(jī)制在此與DTR結(jié)合介導(dǎo)的對淋巴細(xì)胞的作用不相關(guān)。為避免白喉類毒素綴合物的任何殘余毒性，隨后將白喉類毒素用非毒性的DT突變體CRM197代替。載體蛋白基于非特異性作用機(jī)制而應(yīng)用的觀點(diǎn)由這樣的事實(shí)而認(rèn)可，即CRM197綴合疫苗的效力在DT非敏感性小鼠中常規(guī)測試。Gupta等(1997，Vaccine 151341-1343)示出CRM197綴合疫苗的免疫原性中的巨大不同可以在DT不敏感的小鼠和DT敏感的豚鼠之間論證，表明CRM197-綴合疫苗在DT敏感的物種中確實(shí)利用特異性DTR介導(dǎo)的細(xì)胞吸收。
DT(的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的中和抗體可以存在于接納體的血清中(因?yàn)橄惹氨┞队诨蚪臃N了白喉棒桿菌、(部分)DT(B-片段)或(部分)CRM197(或任何其它(部分)非毒性DT)，這可以預(yù)防DTR上與CRM197(或與DT結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的任何其它化合物)綴合的藥物的特異性結(jié)合，從而降低藥物輸送系統(tǒng)的整體效力。這種中和抗體優(yōu)選在應(yīng)用藥物輸送系統(tǒng)之前通過將接納體暴露于有效的最小量游離CRM197或者與中和抗體上DT結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的任何其它化合物(如(部分)DT(B-片段)或者(部分)CRM197的CRM197片段、小分子、肽、模擬物、抗獨(dú)特型抗體等等)而失活的。
另外，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)DTR基因或白喉毒素受體(或者肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子)的表達(dá)在組成血腦屏障的細(xì)胞中由LPS修飾，這個(gè)發(fā)現(xiàn)提供了修飾或監(jiān)測血腦屏障功能性的新機(jī)會。另外，改變DTR基因產(chǎn)物(即肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子)的生物學(xué)活性的任何制劑在本發(fā)明的實(shí)施方案中均用于特異性調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性。白喉毒素受體(肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子)活性可以通過反義抑制DTR基因或者通過肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子拮抗劑或者通過DTR蛋白的抗體而便利地降低，同時(shí)白喉毒素受體(肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子)活性可以通過將DTR基因?qū)爰?xì)胞中或者通過將內(nèi)皮細(xì)胞暴露于外源肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子而便利地增加。另外，R&D Systems Europe Ltd.，UK提供了重組人HB-EGF及HB-EGF的有效抗體，其可用于診斷或治療目的。這個(gè)基因表達(dá)的改變在本發(fā)明的實(shí)施方案中可用于血管通透性狀態(tài)的診斷目的。為此，可以應(yīng)用與HB-EGF基因互補(bǔ)的核酸以及HB-EGF蛋白的抗體。
為了顯著增強(qiáng)相關(guān)的動物疾病模型的實(shí)驗(yàn)和有效性以在本發(fā)明的實(shí)施方案中特異性研究血腦屏障的通透性，優(yōu)選產(chǎn)生人樣HB-EGF轉(zhuǎn)基因或敲入(knock-in，KI)小鼠。人樣HB-EGF轉(zhuǎn)基因小鼠可以通過導(dǎo)入在組成型激活的(例如腫瘤)啟動子或組織特異性啟動子優(yōu)選GFAP和/或γ-GTP啟動子控制下的人DTR基因(編碼HB-EGF)而遺傳工程化，以獲得該基因在腦和/或腦血管中表達(dá)。然而，最優(yōu)選在ES細(xì)胞中通過同源重組導(dǎo)入遺傳工程化的Hegf1基因(編碼在其內(nèi)源啟動子控制下的小鼠HB-EGF基因)，由此外顯子2和3將含有人白喉毒素受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列，優(yōu)選含有陽性和陰性選擇標(biāo)記序列。白喉毒素受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的編碼序列定位于外顯子2的末端和外顯子3的起始處。最后，小鼠基因組DNA克隆衍生自PAC文庫，優(yōu)選pPAC4文庫(129/SvevTACfBr菌株)。在靶向載體中，最初的第二個(gè)和第三個(gè)外顯子通過遺傳工程由人白喉毒素受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特異性序列置換，產(chǎn)生白喉毒素敏感性受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在內(nèi)含子2內(nèi)或外顯子3的下游，存在PGK驅(qū)動的LoxP位點(diǎn)位于兩側(cè)的neo盒。將胚胎干細(xì)胞(E14)電穿孔并使用外部探針通過Southern印跡分析選擇進(jìn)行同源重組的克隆。人白喉毒素受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列通過PCR使用人特異性引物測試，另外優(yōu)選隨后用限制酶消化以及對外顯子2和3進(jìn)行測序分析。將靶向的ES細(xì)胞注入胚泡以產(chǎn)生嵌合動物。確定F1刺豚鼠(agouti)子代基因型，探查突變的等位基因的傳遞(transmission)，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因品系的人樣HB-EGF+NEO。將雜合的人樣HB-EGF+NEO小鼠與EIIA-Cre品系的小鼠繁殖(Lakso et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93(12)5860-5865)以除去neo盒。通過這些方式，獲得種系傳遞并建立轉(zhuǎn)基因品系人樣HB-EGF KI。將小鼠與C57B1/6J進(jìn)一步繁殖5代。使用純合的人樣HB-EGF KI和wt同窩出生仔鼠進(jìn)行進(jìn)一步分析(～97％C57B16J背景)。然后，為在人樣HB-EGF KI小鼠中使異種腫瘤植入物生長，在本發(fā)明中可利用許多免疫缺陷小鼠。這些小鼠包括但非限于裸鼠、scid鼠和rag-1和rag-2基因缺陷小鼠。具有由于某些遺傳基因座突變而導(dǎo)致的不同類型的免疫缺陷的其它動物可見于網(wǎng)址immunology.tch.harvard.edu。將這些小鼠與前述人樣HB-EGF KI小鼠雜交以產(chǎn)生免疫功能缺陷但表達(dá)人樣HB-EGF的子代。另外，在這些小鼠中期望無針對外源載體蛋白如CRM197的免疫遺傳學(xué)應(yīng)答(產(chǎn)生例如中和抗體)。另外，將前述人樣HB-EGF KI(原始的和/或免疫缺陷的)小鼠與現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域作為疾病模型所述的任何剔除的轉(zhuǎn)基因/KI小鼠雜交以產(chǎn)生既具有疾病表型又對外源載體蛋白如CRM197敏感的子代。同樣，轉(zhuǎn)基因大鼠和豬也可以由此產(chǎn)生。
序列相同性
“序列相同性”在本文是指通過序列對比確定的兩或多個(gè)氨基酸(多肽或蛋白質(zhì))序列或者兩或多個(gè)核酸(多核苷酸)序列之間的關(guān)系。在本技術(shù)領(lǐng)域中，“相同性”還指氨基酸或核酸序列之間的序列相關(guān)程度，這可以通過這種序列鏈之間的匹配而確定。兩個(gè)氨基酸序列之間的“相似性”通過對比一種多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代與另一種多肽的序列而確定。“相同性”和“相似性”可以通過已知方法容易地計(jì)算，所述方法包括但非限于如下所述Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford UniversityPress，New York，1988；BiocomputingInformatics and GenomeProjects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；ComputerAnalysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in MolecularBiology，von Heine，G，Academic Press，1987；及Sequence AnalysisPrimer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，NewYork，1991；及Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)。
確定相同性的優(yōu)選方法設(shè)計(jì)為給出測試序列之間的最大匹配。確定相同性和相似性的方法可在公眾可利用的計(jì)算機(jī)程序中程序化。確定兩個(gè)序列之間的相同性和相似性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序方法包括例如GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research 12(1)387(1984))，BestFit、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.et al.，J.Mol.Biol.215403-410(1990)。BLAST X程序可公開得自NCBI及其它來源(BLAST Manual，Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.，et al.，J.Mol.Biol.215403-410(1990)。也可以使用熟知的Smith Waterman算法確定相同性。
多肽序列對比的優(yōu)選參數(shù)包括如下算法Needleman andWunsch，J.Mol.Biol.48443-453(1970)；對比矩陣(comparisonmatrix)BLOSSUM62，來自Hentikoff and Hentikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.8910915-10919(1992)；缺口罰值(Gap Penalty)12；缺口長度罰值4。具有這些參數(shù)的程序可公開得自位于Madison，WI的Genetics Computer Group的Ogap程序。前述參數(shù)(連同末端缺口的nopenalty一起)是氨基酸對比的默認(rèn)參數(shù)。
核酸對比的優(yōu)選參數(shù)包括如下算法Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48443-453(1970)；對比矩陣匹配＝+10，錯(cuò)配＝0；缺口罰值50；缺口長度罰值3。得自位于Madison，Wis.的GeneticsComputer Group的Gap程序。上述給出了核酸對比的默認(rèn)參數(shù)。
任選地，在確定氨基酸相似性程度中，技術(shù)人員也可考慮所謂的“保守”氨基酸取代，這為技術(shù)人員所已知。保守氨基酸取代是指具有相似側(cè)鏈的殘基的可交換性。例如，具有脂肪族側(cè)鏈的一組氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族一羥基側(cè)鏈的一組氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含有酰胺側(cè)鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族側(cè)鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的一組氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側(cè)鏈的一組氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸，及天冬酰胺-谷氨酰胺。本文揭示的氨基酸序列的取代變體是其中所揭示的序列中已經(jīng)除去了至少一個(gè)殘基并在此位置插入一個(gè)不同的殘基。優(yōu)選地。氨基酸變化是保守的。對于每個(gè)天然發(fā)生的氨基酸的優(yōu)選的保守取代如下Ala取代為ser；Arg取代為lys；Asn取代為gln或his；Asp取代為glu；Cys取代為ser或ala；Gln取代為asn；Glu取代為asp；Gly取代為pro；His取代為asn或gln；Ile取代為leu或val；Leu取代為ile或val；Lys取代為arg、gln或glu；Met取代為leu或ile；Phe取代為met，leu取代為tyr；Ser取代為thr；Thr取代為ser；Trp取代為tyr；Tyr取代為trp或phe；Val取代為ile或leu。
重組產(chǎn)生多肽的重組技術(shù)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明中使用的多肽可以使用重組技術(shù)制備，其中編碼感興趣的多肽的核苷酸序列在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明因此還涉及包含上述核酸分子或核苷酸序列的載體的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述載體是一種復(fù)制載體，其包含一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)(或者自主復(fù)制序列)，這保證了所述載體在適于載體的宿主中增殖。或者該載體能整合入宿主細(xì)胞的基因組中，例如通過同源重組或別的方式進(jìn)行。特別優(yōu)選的載體是一種表達(dá)載體，其中編碼上述多肽的核苷酸序列任選地與能指導(dǎo)編碼序列在載體的宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動子可操縱地連接。
如本文所用，術(shù)語“啟動子”是指一個(gè)核酸片段，其位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄方向的上游，發(fā)揮控制一或多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的作用，并且在結(jié)構(gòu)上以存在DNA依賴性RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和任何其它DNA序列而鑒別，所述序列包括但非限于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、阻抑物和激活物蛋白結(jié)合位點(diǎn)及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它核苷酸序列以發(fā)揮直接或間接調(diào)節(jié)啟動子轉(zhuǎn)錄的量的作用。“組成型”啟動子是在大多數(shù)生理和發(fā)育條件下是活性的啟動子。“誘導(dǎo)型”啟動子是依賴于生理或發(fā)育條件而被調(diào)節(jié)的啟動子?！敖M織特異性”啟動子僅在特殊類型的分化的細(xì)胞/組織中有活性。
表達(dá)載體使得上述LPSS多肽可以使用重組技術(shù)制備，其中編碼感興趣的LPSS多肽的核苷酸序列在合適的細(xì)胞中表達(dá)，例如在培養(yǎng)的細(xì)胞或多細(xì)胞生物體的細(xì)胞中表達(dá)，所述方法如Ausubel et al.，″Current Protocols in Molecular Biology″，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York(1987)及Sambrook and Russell(2001，如前)所述；這兩篇文獻(xiàn)在此均以其全文并入?yún)⒖?。也見于Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82488(描述定點(diǎn)誘變)和Roberts et al.(1987)Nature 328731-734或Wells，J.A.，et al.(1985)Gene 34315(描述盒式誘變)所述。
典型地，在表達(dá)載體中使用編碼希望的多肽的核酸。術(shù)語“表達(dá)載體”一般是指能影響基因在與這種序列相容的宿主中表達(dá)的核苷酸序列。這些表達(dá)載體典型地包括至少合適的啟動子序列及任選轉(zhuǎn)錄終止信號。如本文所述也可以使用影響表達(dá)必需的或有益的額外因素。將編碼多肽的DNA摻入能導(dǎo)入并在體外細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)的DNA構(gòu)建體中。特別地，DNA構(gòu)建體適于在原核宿主如細(xì)菌，例如大腸桿菌(E.coli)中復(fù)制，或者可以導(dǎo)入培養(yǎng)的哺乳動物、植物、昆蟲，例如Sf9、酵母、真菌或其它真核細(xì)胞系中。
制備用于導(dǎo)入特殊宿主的DNA構(gòu)建體典型地包括由宿主識別的一個(gè)復(fù)制系統(tǒng)、編碼希望的多肽的指定的DNA節(jié)段及與多肽編碼節(jié)段可操縱地連接的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止調(diào)節(jié)序列。當(dāng)DNA節(jié)段與另一個(gè)DNA節(jié)段以功能關(guān)系放置時(shí)，則是“可操縱地連接的”。例如，如果一個(gè)啟動子或增強(qiáng)子刺激編碼序列轉(zhuǎn)錄時(shí)則與該序列是可操縱地連接。信號序列的DNA如果表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白(preprotein)，則其與編碼該多肽的DNA是可操縱地連接。一般地，可操縱地連接的DNA序列是鄰近的，并且在信號序列的情況中是鄰近及解讀相(reading phase)的。然而，增強(qiáng)子不需要與其控制轉(zhuǎn)錄的編碼序列鄰近。連接通過在便利的限制位點(diǎn)或在插入的連接物(adapter)或接頭(linker)處連接而完成。
適當(dāng)?shù)膯幼有蛄械倪x擇通常依賴于針對DNA節(jié)段表達(dá)所選擇的宿主細(xì)胞。合適的啟動子序列的例子包括本領(lǐng)域熟知的原核及真核啟動子(見例如Sambrook and Russell，2001，如前)。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列典型地包括由宿主識別的異源增強(qiáng)子或啟動子。合適的啟動子的選擇根據(jù)宿主而定，但啟動子如trp、lac和噬菌體啟動子、tRNA啟動子和糖酵解酶啟動子是已知及可利用的(見例如Sambrook and Russell，2001，supra)。表達(dá)載體包括復(fù)制系統(tǒng)和轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列，并且可以應(yīng)用多肽編碼節(jié)段的插入位點(diǎn)。細(xì)胞系和表達(dá)載體的可使用組合的例子如Sambrook和Russell(2001，如前)及Metzger et al.(1988)Nature33431-36所述。例如，合適的表達(dá)載體可以在酵母，例如釀酒酵母(S.cerevisiae)、昆蟲細(xì)胞，例如Sf9細(xì)胞，哺乳動物細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞及細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌中表達(dá)。宿主細(xì)胞因此可以是原核或真核宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是適于在液體培養(yǎng)基中或固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞在生產(chǎn)上述LPSS多肽的方法中使用。所述方法包括在有益于多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞的步驟。任選地，所述方法可包含回收該多肽。所述多肽可例如通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)從培養(yǎng)基中回收，所述蛋白質(zhì)純化技術(shù)包括本領(lǐng)域已知的多種層析方法。
或者，宿主細(xì)胞是多細(xì)胞生物體的一部分，如轉(zhuǎn)基因植物或動物、優(yōu)選非人動物的一部分。轉(zhuǎn)基因植物在其至少一部分細(xì)胞中包含上述載體。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法例如U.S.6,359,196及在本文引用的參考文獻(xiàn)所述。這種轉(zhuǎn)基因植物可用于生產(chǎn)上述LPSS多肽的方法中，所述方法包括回收在其細(xì)胞中包含所述載體的一部分轉(zhuǎn)基因植物或者回收一部分這種轉(zhuǎn)基因植物的子代，由此所述植物含有所述多肽，及任選地從該植物部分中回收該多肽。這種方法也見于U.S.6,359,196及在本文引用的參考文獻(xiàn)所述。相似地，轉(zhuǎn)基因動物在其體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中包含上述載體。轉(zhuǎn)基因動物優(yōu)選是一種非人動物。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的方法例如WO01/57079及在本文引用的參考文獻(xiàn)中所述。這種轉(zhuǎn)基因動物可以用于生產(chǎn)上述LPSS多肽的方法中，所述方法包括從包含該載體的轉(zhuǎn)基因動物或其雌性子代中回收體液的步驟，其中所述體液含有該多肽，并任選地從該體液中回收該多肽。這種方法也見于WO01/57079及在本文引用的參考文獻(xiàn)中所述。含有所述多肽的體液優(yōu)選是血液，更優(yōu)選是乳汁。
制備多肽的另一種方法是應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)。將編碼多肽的DNA克隆進(jìn)如前述的表達(dá)載體中。然后將該表達(dá)載體在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯。翻譯產(chǎn)物可直接使用或首先純化。得自體外翻譯的多肽典型地不含有在體內(nèi)合成的多肽上翻譯后修飾，盡管由于固有存在微粒體而可能發(fā)生一些翻譯后修飾。通過體外翻譯而合成多肽的方法見例如Berger & Kimmel，Methods in Enzymology，Volume 152，Guide toMolecular Cloning Techniques，Academic Press，Inc.，San Diego，CA，1987所述。
基因治療
本發(fā)明的一些方面涉及包含上述核苷酸序列的表達(dá)載體的應(yīng)用，其中所述載體是適于基因治療的載體。適于基因治療的載體見于Anderson 1998，Nature 39225-30；Walther and Stein，2000，Drugs 60249-71；Kay et al.，2001，Nat.Med.733-40；Russell，2000，J.Gen.Virol.812573-604；Amado and Chen，1999，Science 285674-6；Federico，1999，Curr.Opin.Biotechnol.10448-53；Vigna and Naldini，2000，J.Gene Med.2308-16；Marin et al.，1997，Mol.Med.Today 3396-403；Peng and Russell，1999，Curr.Opin.Biotechnol.10454-7；Sommerfelt，1999，J.Gen.Virol.803049-64；Reiser，2000，Gene Ther.7910-3；及本文應(yīng)用的參考文獻(xiàn)所述。
特別合適的基因治療載體包括腺病毒和腺伴隨病毒(AAV)載體。這些載體感染眾多類型的分裂和非分裂細(xì)胞。另外，腺病毒載體能高水平表達(dá)轉(zhuǎn)基因。然而，由于腺病毒和AAV載體在進(jìn)入細(xì)胞后的附加型性質(zhì)，因此這些病毒載體最適于僅需要轉(zhuǎn)基因瞬時(shí)表達(dá)的治療應(yīng)用(Russell，2000，J.Gen.Virol.812573-2604)。優(yōu)選的腺病毒載體被修飾以降低宿主應(yīng)答，如Russell(2000，如前)所述。
通常地，基因治療載體是如上述的有義表達(dá)載體，其包含編碼被表達(dá)的LPSS多肽的核苷酸序列，由此該核苷酸序列可操縱地與如上述合適的調(diào)節(jié)序列連接。這種調(diào)節(jié)序列至少包含一個(gè)啟動子序列。表達(dá)基因治療載體編碼的多肽的核苷酸序列的合適啟動子包括例如巨細(xì)胞病毒(CMV)中間早期啟動子、病毒長末端重復(fù)啟動子(LTRs)，如來自鼠莫洛尼氏白血病病毒(MMLV)勞氏肉瘤病毒或HTLV-1的那些啟動子，猿猴病毒40(SV40)早期啟動子及單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子。
已經(jīng)描述了一些誘導(dǎo)型啟動子系統(tǒng)，其可以通過給予小的有機(jī)或無機(jī)化合物而誘導(dǎo)。這種誘導(dǎo)型啟動子包括由以下物質(zhì)控制的那些啟動子，重金屬如金屬硫蛋白(metallothionine)啟動子(Brinster et al.1982 Nature 29639-42；Mayo et al.1982 Cell 2999-108)、RU-486(一種孕酮拮抗劑)(Wang et al.1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 918180-8184)、類固醇(Mader and White，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA905603-5607)、四環(huán)素(Gossen and Bujard 1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895547-5551；U.S.Pat.No.5，464，758；Furth et al.1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 919302-9306；Howe et al.1995 J.Biol.Chem.27014168-14174；Resnitzky et al.1994 Mol.Cell.Biol.141669-1679；Shockett et al.1995 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 926522-6526)及tTAER系統(tǒng)，其基于多嵌合(multi-chimeric)反式激活蛋白，其由作為VP16的激活結(jié)構(gòu)域的tetR多肽及雌激素受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成(Yeeet al.，2002，US 6,432,705)。
基因治療載體可任選地包含編碼第二個(gè)或另外的蛋白質(zhì)的第二個(gè)或者一或多個(gè)另外的核苷酸序列。所述第二個(gè)或另外的蛋白質(zhì)可以是(可選擇的)標(biāo)記蛋白，其使得可以鑒別、選擇和/或篩選含有表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)胞。為此目的，合適的標(biāo)記蛋白是例如熒光蛋白GFP及可選擇的標(biāo)記基因HSV胸苷激酶(在HAT培養(yǎng)基上選擇)、細(xì)菌潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(在潮霉素B上選擇)、Tn5氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(在G418上選擇)及二氫葉酸還原酶(DHFR)(在氨甲蝶呤上選擇)、CD20、低親和性神經(jīng)生長因子基因。獲得這些標(biāo)記基因的來源及其使用方法由Sambrook和Russel(2001)“Molecular CloningA Laboratory Manual(3rd edition)”，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York提供。
或者，所述第二個(gè)或另外的核苷酸序列可編碼一種蛋白質(zhì)(如果確實(shí)需要)，該蛋白質(zhì)提供了可以治療轉(zhuǎn)基因細(xì)胞患者的故障安全機(jī)制。這種核苷酸序列通常稱為自殺基因，其編碼能將前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)槟軞⑺榔渲斜磉_(dá)所述蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的毒性物質(zhì)的蛋白質(zhì)。這種自殺基因的合適實(shí)例包括例如大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶基因或者單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒和水痘—帶狀皰疹病毒的胸苷激酶基因之一，在這種情況中可以使用9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤作為前體藥物以殺死患者體內(nèi)的IL-10轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(見例如Clair et al.，1987，Antimicrob.Agents Chemother.31844-849)。
基因治療載體優(yōu)選在包含下述合適的藥物載體的藥物組合物中配制。
抗體
本發(fā)明的一些方面涉及特異性結(jié)合上述本發(fā)明的LPSS多肽的抗體或抗體片段。產(chǎn)生特異性結(jié)合給定多肽的抗體或抗體片段的方法見例如Harlow and Lane(1988，AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)和WO91/19818；WO 91/18989；WO 92/01047；WO 92/06204；WO 92/18619；及US 6,420,113和本文引用的參考文獻(xiàn)所述。本文所用術(shù)語“特異性結(jié)合”包括低和高親和性特異性結(jié)合。特異性結(jié)合可以例如通過Kd為至少大約10-4M的低親和性抗體或抗體片段展示。特異性結(jié)合也可以通過高親和性抗體或抗體片段而展示，例如Kd為至少大約10-7M、至少大約10-8M、至少大約10-9M、至少大約10-10M或者Kd為至少大約10-11M或10-12M或更高的抗體或抗體片段。
肽模擬物
特異性結(jié)合LPSS多肽或LPSS多肽受體的并可用于本發(fā)明的任何方法的肽樣分子(稱作肽模擬物)或非肽分子可以使用本領(lǐng)域已知的方法鑒別，例如在本文并入?yún)⒖嫉腢S 6,180,084所詳述。這種方法包括例如篩選肽模擬物、肽的文庫、DNA或cDNA表達(dá)文庫、組合化學(xué)及特別有用的噬菌體展示文庫。這些文庫可以篩選LPSS多肽或其受體的激動劑和拮抗劑，通過將該文庫與基本純化的LPSS多肽、LPSS多肽受體、其片段或結(jié)構(gòu)類似物相接觸而進(jìn)行。
藥物組合物
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含上述活性成分LPSS多肽、抗體或基因治療載體的藥物制品。所述組合物優(yōu)選除了活性成分之外至少包含一種藥物可接受的載體。
在一些方法中，從哺乳動物、昆蟲或微生物細(xì)胞培養(yǎng)物中、從轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳汁中或者其它來源中純化的本發(fā)明的多肽或抗體以純化形式與藥物學(xué)載體一起作為藥物組合物而給予。生產(chǎn)包含多肽的藥物組合物的方法見美國專利No5,789,543和6,207,718所述。優(yōu)選的形式根據(jù)指定的給予模式和治療應(yīng)用而定。
藥物載體可以是適于將多肽、抗體或基因治療載體輸送給患者的任何相容的非毒性物質(zhì)。無菌水、醇、脂肪、蠟及惰性固體都可用作載體。藥物可接受的佐劑、緩沖劑、分散劑等也可摻入藥物組合物中。
藥物組合物中本發(fā)明的LPSS多肽或抗體的濃度可以廣泛變化，即從低于大約0.1％重量、通常為至少大約1％重量至多如20％重量或更多。
對于口服給予，所述活性成分可以固體劑型給予，如膠囊、片劑和粉末，或者以液體劑型給予，如酏劑、糖漿和懸浮液。活性成分可以連同非活性成分和粉末狀載體如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纖維素或纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸、糖精鈉、滑石、碳酸鎂等一起裝入膠囊內(nèi)。可以加入的以提供希望的顏色、味道、穩(wěn)定性、緩沖能力、分散或其它已知希望的特征的額外的非活性成分的實(shí)例是紅色氧化鐵、硅膠、十二烷基硫酸鈉、二氧化鈦、可食用的白色墨水等。可以使用相似的稀釋劑以產(chǎn)生壓制片劑。片劑和膠囊均可以制備為持續(xù)釋放產(chǎn)物而在幾個(gè)小時(shí)的時(shí)期內(nèi)提供持續(xù)釋放藥物。壓制片劑可以是糖衣的或者用薄膜包被的以掩蓋任何討厭的味道并保護(hù)該片劑免于被空氣破壞，或者是腸衣片以在胃腸道內(nèi)選擇性分解?？诜o予的液體劑型可以含有色素和香味劑以增加患者的接受度。
LPSS多肽、抗體或基因治療載體優(yōu)選胃腸外給予。胃腸外給予的多肽、抗體或載體必須是無菌的。無菌狀態(tài)可以通過滅菌濾膜過濾而達(dá)到，之后凍干和重建(reconstitution)。LPSS多肽、抗體或載體的胃腸外給予途徑是根據(jù)已知方法而定，例如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、病灶內(nèi)、顱內(nèi)、鞘內(nèi)、經(jīng)皮、鼻、口腔、直腸或陰道途徑注射或灌注。所述肽、抗體或載體通過灌注或大丸藥注射而持續(xù)給予。靜脈內(nèi)灌注的典型組合物可以制成為含有10-50ml無菌的0.9％NaCl或5％葡萄糖溶液，任選補(bǔ)加20％白蛋白溶液和1-50μg LPSS多肽、抗體或載體。肌內(nèi)注射的典型藥物組合物制成為含有例如1-10ml無菌緩沖水和1-100μg本發(fā)明的LPSS多肽、抗體或載體。制備胃腸外給予的組合物的方法是本領(lǐng)域熟知的并在不同資料中詳加描述，包括例如Remington′s Pharmaceutical Science(15th ed.，Mack Publishing，Easton，PA，1980)(在本文以其全文并入?yún)⒖?。
對于治療應(yīng)用，藥物組合物以足以降低癥狀的嚴(yán)重程度和/或預(yù)防或阻滯癥狀進(jìn)一步發(fā)展的量給予患有微血管通透性失調(diào)的患者。足夠達(dá)到這個(gè)目的的量為“治療”或“預(yù)防有效劑量”。這種有效劑量根據(jù)病癥的嚴(yán)重程度及根據(jù)患者的一般健康狀況而定。通常地，治療或預(yù)防有效劑量優(yōu)選是這樣的劑量，其使得微血管通透性恢復(fù)至正常未受影響的健康個(gè)體的平均水平。
在本發(fā)明的方法中，LPSS多肽或抗體通常以大約1μg/kg患者體重/周或更高的劑量給予患者。通常的劑量高于10μg/kg/周。劑量方案可以在從10μg/kg/周至至少1mg/kg/周的范圍內(nèi)。典型的劑量方案是10μg/kg/周、20μg/kg/周、30μg/kg/周、40μg/kg/周、60μg/kg/周、80μg/kg/周和120μg/kg/周。在優(yōu)選的方案中，每周給予一次、兩次或三次10μg/kg、20μg/kg或40μg/kg。治療優(yōu)選通過胃腸外途徑給予。
微陣列
本發(fā)明另一方面涉及包含上述核酸、多肽或抗體的微陣列(或者其它高通量篩選設(shè)備)。一種微陣列是含有一或多種固定的核酸或多肽片段的固體支持物或載體，以分析核酸或氨基酸序列或其混合物(見例如WO 97/27317、WO 97/22720、WO 97/43450、EP 0 799 897、EP 0 785 280、WO 97/31256、WO 97/27317、WO 98/08083及Zhu andSnyder，2001，Curr.Opin.Chem.Biol.540-45所述)。包含所述核酸的微陣列可用于例如上述分析基因型或表達(dá)模式的方法中。包含多肽的微陣列可用于檢測與所述多肽相互作用的底物、配體或其它分子的合適候選物。包含抗體的微陣列可用于分析上述多肽表達(dá)模式的方法中。
附圖描述


圖1是具有BCEC-ACM單層(a組)和BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物(b組)的濾膜插入物的詳細(xì)示意圖。
圖2是在體外暴露于脂多糖(LPS)之后在BBB發(fā)生的事件的詳細(xì)示意圖。將BCEC在50％ACM中培養(yǎng)為單層或者與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)。星形膠質(zhì)細(xì)胞增加體外BBB性能(1相)。由LPS誘導(dǎo)的疾病破壞BCEC單層(2相)，而BCEC+星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物能恢復(fù)(3相)。這個(gè)恢復(fù)過程涉及蛋白質(zhì)重新合成，因?yàn)榄h(huán)己酰亞胺(CHX)能完全抑制恢復(fù)相。
圖3示出暴露于LPS中2小時(shí)后對TEER穿過BCEC-ACM單層的作用，以O(shè)hm.cm2(平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差，a組)及與對照的％表示(對照即未處理的BCEC-ACM單層，平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差，b組)。
圖4示出在暴露于LPS 2小時(shí)后對TEER穿過BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物的作用，以O(shè)hm.cm2(平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差，a組)及與對照的％表示(對照即未處理的BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物，平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差，b組)。
圖5示出在濾膜頂面(血液)側(cè)暴露于不同濃度(1ng/ml直至10μg/ml)的DT后對TEER穿過BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物的作用(以與對照的平均％表示)。
圖6示出在濾膜基底外側(cè)(腦)側(cè)暴露于不同濃度(25ng/ml直至1μg/ml)的DT后對TEER穿過BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物的作用(以與對照的平均％表示)。
圖7示出在暴露于100ng/ml DT后對TEER穿過BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物的作用(以與對照的平均％表示)，DT預(yù)先與不同濃度的可溶的HB-EGF(0.1-10μg/ml)溫育(在室溫溫育1小時(shí))，通過結(jié)合DT的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域而作為DTR的非競爭性拮抗劑，之后暴露于濾膜的頂面。
圖8示出TEER穿過用5μg/ml的CRM197預(yù)處理1小時(shí)的BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物的作用(以與對照的平均％表示)，通過結(jié)合DT的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域而作為DTR的競爭性拮抗劑，之后BCEC暴露于100ng/ml DT。
圖9示出TEER穿過用肝素(125μg/ml)預(yù)處理1小時(shí)的BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物的作用(以與對照的平均％表示)，通過在DT的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中導(dǎo)入構(gòu)象變化而在DTR作為DT結(jié)合的增強(qiáng)劑，之后BCEC暴露于100ng/ml DT。
圖10示出TEER穿過用頂面暴露于1μg/ml LPS(血清型055B5)2小時(shí)的BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物的作用(以與對照的平均％表示)，從而增加DTR的表達(dá)水平，或者暴露于10μmol BB94(batimastat)1小時(shí)，作為參與胞外域脫落過程的MMP’s的抑制劑，從而增加細(xì)胞膜上DTR利用度，或者暴露于LPS和BB94的組合，從而增加表達(dá)水平和細(xì)胞膜上DTR的利用度，之后BCEC暴露于100ng/ml DT。
圖11示出在暴露于相應(yīng)于5μg/ml未綴合的HRP的HRP綴合蛋白(CRM197、BSA和全運(yùn)鐵蛋白)后，BCEC裂解物中HRP活性。
圖12示出在暴露于相應(yīng)于5μg/ml未綴合的HRP、HRP綴合的CRM197、HRP綴合的BSA后，BCEC裂解物中HRP活性，HRP綴合的CRM197與10μg/ml可溶的HB-EGF預(yù)溫育，通過結(jié)合CRM197的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域而作為DTR介導(dǎo)的吸收的非競爭性拮抗劑。
圖13示出HRP綴合的CRM197在體外穿過血腦屏障的活性及選擇性胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用(即在37℃(實(shí)心線)和4℃(虛線)以相應(yīng)于5μg/ml未綴合的HRP的濃度，頂面暴露于HRP綴合的CRM197(環(huán)形線)和HRP綴合的BSA(方形線)之后HRP在基底外側(cè)區(qū)室中的活性。
圖14示出在37℃和4℃暴露于相應(yīng)于5μg/ml游離HRP濃度的HRP-荷載CRM197包被的PEG脂質(zhì)體之后，HRP在BCEC裂解物中的活性(以抑制主動吸收)，表明HRP荷載CRM197包被的PEG脂質(zhì)體由BCEC主動吸收。
圖15示出暴露于相應(yīng)于5μg/ml游離HRP濃度的HRP荷載CRM197包被的PEG脂質(zhì)體或HRP荷載BSA包被的PEG脂質(zhì)體之后，HRP在BCEC裂解物中的活性(以確定載體特異性)，表明HRP荷載CRM197包被的PEG脂質(zhì)體由BCEC特異性吸收。
圖16示出暴露于相應(yīng)于5μg/ml游離HRP濃度的HRP荷載CRM197包被的PEG脂質(zhì)體之后，HRP在BCEC裂解物中的活性，并與在用50μg/ml的游離CRM197預(yù)處理1小時(shí)的BCEC中的吸收相對比(以確定DTR的特異性關(guān)聯(lián))，表明HRP荷載CRM197包被的PEG脂質(zhì)體確實(shí)通過DTP由BCEC特異性吸收。
圖17示出HRP通過CRM197包被的脂質(zhì)體穿過體外血腦屏障的選擇性胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用(即以相應(yīng)于5μg/ml游離HRP的濃度，在頂面暴露于HRP荷載CRM197包被的PEG脂質(zhì)體(環(huán)形線)及HRP荷載BSA包被的PEG脂質(zhì)體(方形線，以確定載體特異性)之后，HRP在基底外側(cè)區(qū)室中的活性)。
圖18示出HRP在CRM197-HRP綴合物注射的動物的三個(gè)大腦皮質(zhì)勻漿樣品(即全部勻漿(稱為勻漿)、腦實(shí)質(zhì)(稱為實(shí)質(zhì))及腦血管(稱為毛細(xì)管))中的活性。在來自TrF-HRP綴合物注射的動物以及游離HRP注射的動物的所有樣品中，HRP活性水平均低于HRP分析的檢測極限，表明只有與40kDa物質(zhì)(即HRP)綴合的CRM197在大腦皮質(zhì)中特異性吸收，其中游離HRP及與TrF綴合的HRP則否。
圖19示出了代表性照片
(A組)通過TMB針對內(nèi)源過氧化物酶活性而直接染色的非灌注對照腦(注意遍布于整個(gè)切片的血管的獨(dú)特及強(qiáng)染色模式特征)；
(B組)通過TMB針對內(nèi)源過氧化物酶活性而直接染色的充分灌注的對照腦(注意用鹽水通過心臟動脈的灌注程序能完全除去在A組中見到的內(nèi)源過氧化物酶活性)；
(C和D組)兩個(gè)游離HRP注射的動物的充分灌注的腦的TMB染色的冷凍切片(cryo-section)(注意與在充分灌注的對照腦中一樣，無可明顯的染色可觀測到)；
(E和F組)CRM197-HRP綴合物注射的動物的充分灌注的腦的兩個(gè)TMB染色的冷凍切片(注意小血管相關(guān)的染色模式特征，以及穿過血管外滲(即轉(zhuǎn)運(yùn))HRP的獨(dú)特染色區(qū)域特征)；
(G和H組)CRM197-HRP綴合物注射的動物的兩個(gè)更好灌注的腦的TMB染色的冷凍切片(再一次注意穿過血管外滲(即轉(zhuǎn)運(yùn))HRP的獨(dú)特染色區(qū)域特征)；
(I和J組)TrF-HRP綴合物注射的動物的充分灌注的腦的兩個(gè)TMB染色的冷凍切片(注意與小血管相關(guān)的少量(如果有的話)非常微弱的染色模式)；
(K和L組)TrF-HRP綴合物注射的動物的另外充分灌注的腦的兩個(gè)TMB染色的冷凍切片(再一次注意與小血管相關(guān)的少量(如果有的話)非常微弱的染色模式)。
總之，這些結(jié)果表明與40kDa物質(zhì)(即HRP)綴合的CRM197在大腦皮質(zhì)被特異性吸收，而在此游離的HRP及與TrF綴合的HRP則否。大腦皮質(zhì)冷凍切片的所有放大倍率均為40倍。
圖20示出代表性照片
(A和D組)用小鼠抗白喉毒素通過對白喉毒素的免疫組織化學(xué)針對CRM197染色的CRM197-HRP綴合物注射的動物的冷凍切片(注意遍布整個(gè)切片的微弱的均勻分布的染色模式，A組放大倍率20倍及D組放大倍率100倍)；
(B和E組)用小鼠抗白喉毒素通過對白喉毒素的免疫組織化學(xué)針對CRM197染色的游離HRP注射的動物的冷凍切片(注意沒有染色模式存在，B組放大倍率20倍及E組放大倍率100倍)；
(C和F組)用小鼠抗白喉毒素通過對白喉毒素的免疫組織化學(xué)針對CRM197染色的TrF-HRP綴合物注射的動物的冷凍切片(再一次注意無染色模式存在，C組放大倍率20倍及F組放大倍率100倍)。
總之，這些結(jié)果表明CRM197(裂解的或仍與HRP綴合的)在腦中被吸收。
實(shí)施例
方法和材料
1.1 細(xì)胞培養(yǎng)
1.1.1 牛腦毛細(xì)血管的分離
腦毛細(xì)血管分離自牛(小牛)腦，在屠宰場從剛殺死的動物中獲得。將腦在冰凍的磷酸鹽緩沖鹽水(LPSS，1.1mM KH2PO4，5.6mMNa2HPO4及150mM NaCl，pH 7.4)中運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。除去腦膜和白質(zhì)并將灰質(zhì)收集在補(bǔ)加了10％(v/v)熱失活的(56℃，30分鐘)胎牛血清的Dulbecco′s Modified Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)中(DMEM+S)。DMEM是用高D-葡萄糖(4.5g/l)、NaHCO3(3.7g/l)和HEPES(25mM)配制的，含有額外的MEM非必需氨基酸，L-谷氨酰胺(2mM)，硫酸鏈霉素(0.1g/l)和青霉素G鈉(100000U/l)。血管片段通過使用Wheaton勻漿儀人工勻漿，隨后在150μm尼龍網(wǎng)上過濾而制備。將血管在37℃在于DMEM+S中在膠原酶CLS3(210U/ml)、胰蛋白酶TRL(91U/ml)和DNAse I(170U/ml，終濃度)中消化1小時(shí)，隨后通過200μm尼龍網(wǎng)過濾。將腦毛細(xì)血管級分重懸于冷凍混合物(胎牛血清(FCS)與10％(v/v)DMSO)中并在-80℃貯存
1.1.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離
星形膠質(zhì)細(xì)胞分離自新生的Wistar大鼠仔(Harlan B.V，Zeist，TheNetherlands)。將分離的皮質(zhì)片段化并在37℃與于DMEM(HEPES充分緩沖的(50mM)，無NaHCO3)中用0.016％(w/v)胰蛋白酶-EDTA(終濃度)在搖動的水浴中溫育(80rpm，30分鐘)。將懸浮液分別通過120和45μm尼龍網(wǎng)過濾。將細(xì)胞懸浮液在增濕孵箱(Napco ScientificCompany，Tualatin，OR，USA)中的250ml塑料組織培養(yǎng)瓶(GreinerB.V，Alphen a/d Rijn，The Netherlands)中在37℃在空氣與10％CO2的混和氣體中在DMEM+S中培養(yǎng)3天。之后，將培養(yǎng)基每隔一天更換一次。在培養(yǎng)7天后，在搖動水浴(80rpm)中在室溫?fù)u動培養(yǎng)物過夜以除去除了星形膠質(zhì)細(xì)胞之外的其它細(xì)胞。2天后，將培養(yǎng)物與0.05％(w/v)胰蛋白酶-EDTA以1∶3的分離比率在聚-D-賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中傳代(10μg/ml聚-D-賴氨酸溶液攪動過夜，在空氣中干燥并用LPSS洗滌(3次))。當(dāng)鋪滿時(shí)，每隔一天收集一次星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(astrocyte conditioned medium)，共2-4周，滅菌過濾并在-20℃貯存。為了共培養(yǎng)，將2周的培養(yǎng)物傳代并在液氮中以冷凍混合物貯存。
1.1.3 腦毛細(xì)血管和BCEC培養(yǎng)物的差異接種(seeding)
將腦毛細(xì)血管接種在膠原(人胎盤IV型，于0.1％(v/v)乙酸中10μg/ml溶液中2小時(shí)并用LPSS洗滌3次)和人血漿纖連蛋白(于LPSS中10μg/ml溶液，30分鐘)包被的250ml塑料組織培養(yǎng)瓶中并在孵箱中粘附4小時(shí)。之后，將培養(yǎng)基更換為生長培養(yǎng)基(具有50％(v/v)星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的DMEM+S，補(bǔ)加了125μg/ml肝素)并將過度生長的細(xì)胞、占優(yōu)勢的BCEC和一些周細(xì)胞在37℃在10％CO2中培養(yǎng)。
1.1.4 BBB在濾膜上的體外制備
體外BBB模型在膠原包被的(如上述)Transwell聚碳酸酯濾膜上制備(表面積0.33cm2，孔大小0.4μm，Coming Costar，Cambridge，MA，USA)。在大約70％鋪滿時(shí)(腦毛細(xì)血管接種后第4或5天)，將BCEC對內(nèi)皮細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA傳代(500 BAEE單位豬胰蛋白酶和180μg EDTA/ml)大約1分鐘，剩下仍與基質(zhì)粘附的大部分周細(xì)胞。BCEC和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物是用接種在濾膜底部的星形膠質(zhì)細(xì)胞制備的，密度為45000個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞/濾膜。使星形膠質(zhì)細(xì)胞粘附于濾膜底部8分鐘、2或3天，之后傳代BCEC。BCEC以30000BCEC/濾膜的密度接種。將BCEC+星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物在前兩天在補(bǔ)加了125μg/ml肝素的DMEM+S中及在最后兩天在DMEM+S中共培養(yǎng)成為緊密的單層。由此培養(yǎng)BCEC單層，但向培養(yǎng)基中加入50％(v/v)星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基。
1.2 Affymetrix GeneChip基因表達(dá)分析
1.2.1 總RNA的分離
在BCEC+星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物的情況中，先除去星形膠質(zhì)細(xì)胞，然后通過刮Transwell濾膜的基底外側(cè)而分離BCEC RNA?？俁NA分離自BCEC(含有＜5％周細(xì)胞(Gaillard et al.，2001，如前))，使用RNeasy迷你試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)進(jìn)行。為此，除去細(xì)胞-培養(yǎng)基并更換為40μl/Transwell濾膜的裂解緩沖液。隨后，將裂解物重懸并從多個(gè)(12-18)Transwell濾膜中收集，隨后根據(jù)廠商推薦的程序從動物細(xì)胞中分離總RNA。使用QIA粉碎機(jī)勻漿細(xì)胞裂解物。當(dāng)需要時(shí)，將總RNA用乙酸鈉和乙醇濃縮。
1.2.2 標(biāo)記RNA的制備
隨后根據(jù)廠商推薦方案進(jìn)行從總RNA中制備生物素?；腸RNA以進(jìn)行Affymetrix GeneChip基因表達(dá)分析，如AffymetrixGeneChip Expression Analysis Manual(Affymetrix，Santa Clara，CA，USA)所述。簡而言之，將6-16μg/樣品的總RNA用于雙鏈cDNA合成，使用Gibco BRL Superscript Choice System(Life Technologies，Rockville，MD，USA)進(jìn)行。使用T7-dT24引物和Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies，Rockville，MD，USA)進(jìn)行第一條鏈合成。第二條鏈合成涉及大腸桿菌DNA聚合酶I(Life Technologies，Rockville，MD，USA)。然后將雙鏈cDNA使用酚/氯仿提取(利用鎖相凝膠(phaselock gel)(Eppendorf AG，Hamburg，Germany))隨后通過乙酸銨和乙醇沉淀而純化。生物素酰化的cRNA通過從cDNA體外轉(zhuǎn)錄而合成，使用BioArray HighYield RNA轉(zhuǎn)錄標(biāo)記試劑盒(Enzo Diagnostics，F(xiàn)armingdale，NY，USA)在37℃溫育5小時(shí)而進(jìn)行。然后將標(biāo)記的cRNA使用RNeasy迷你試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)的RNA cleanup方案進(jìn)行純化。隨后，將15-20μg標(biāo)記的cRNA通過在94℃在片段化緩沖液(40mM Tris-乙酸(pH 8.1)、125mM KOAc、30mM MgOAc)中加熱35分鐘而片段化。
1.2.3 GeneChip雜交
將標(biāo)記的和片段化的cRNA與HG-U95Av2和HG-U133A陣列(Affymetrix，Santa Clara，CA，USA)在廠商推薦的條件下雜交。將cRNA首先與Test2Chip(Affymetrix)雜交，以保證制品的質(zhì)量。簡而言之，將cRNA在雜交混合物(1×MES雜交緩沖液，100μg/ml鯡精(herringsperm)、50μg/ml乙?；腂SA、對照寡核苷酸B2和真核雜交對照物)中稀釋，變性，然后在45℃以60rpm雜交16小時(shí)。雜交后，洗滌陣列并用鏈霉抗生物素-藻紅蛋白染色，使用Affymetrix Genechip FluidicsStation 400進(jìn)行。陣列上的熒光信號使用Hewlett-Packard AffymetrixGeneArray掃描儀測定。
實(shí)施例1
“脂多糖敏感基因”的鑒別、在BCEC-ACM單層和BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物中及之間的差異表達(dá)
在早期的實(shí)驗(yàn)中(如Gaillard(2000a，如前)所詳述，在此并入?yún)⒖?，我們發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞和炎癥過程(通過脂多糖LPS模擬)在BBB的動態(tài)共培養(yǎng)模型中顯示相反的作用。簡而言之，星形膠質(zhì)細(xì)胞增加屏障的功能性，而LPS降低屏障的功能性。另外，星形膠質(zhì)細(xì)胞致使從LPS中發(fā)生恢復(fù)過程，這在無星形膠質(zhì)細(xì)胞物理存在時(shí)(即在BCEC-ACM單層中)觀測不到。最后，這個(gè)恢復(fù)過程依賴于蛋白質(zhì)合成，這表明涉及特異性基因轉(zhuǎn)錄。在圖2中，這個(gè)實(shí)驗(yàn)方法以圖示詳細(xì)描述。
為進(jìn)行涉及的LPSS基因及其參與恢復(fù)過程的鑒別，針對從牛腦種原代分離的腦毛細(xì)血管中培養(yǎng)的BCEC，使用四種不同的細(xì)胞培養(yǎng)條件(如Gaillard et al.，2001，如前所詳述，在此并入?yún)⒖疾⒃凇?.1細(xì)胞培養(yǎng)”中簡要加以了描述)1)將濾膜上BCEC單層插入50％ACM中(圖1aBCEC-ACM)；2)將濾膜上BCEC單層插入50％ACM中，頂面暴露于1μg/ml LPS(血清型055B5)2小時(shí)；3)將濾膜上BCEC單層與在濾膜插入物底部培養(yǎng)的原代分離的新生大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞一起插入(圖1bBCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞)；4)將濾膜上BCEC單層與在濾膜插入物的底部培養(yǎng)的原代分離的新生大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞一起插入，頂面暴露于1μg/ml LPS(血清型055B5)2小時(shí)。將LPS處理的BCEC(條件2和4)與在未處理的BCEC(條件1和3)中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相對比。
在暴露于LPS中2小時(shí)后，BBB功能性通過TEER穿過濾膜而確定，使用具有電流經(jīng)過的和電壓測定電極的電阻系統(tǒng)(ERS)(Millicell-ERS，Millipore Corporation，Bedford，MA，USA)進(jìn)行。TEER(Ohm.cm2)從輸出裝置屏幕上顯示的電阻中減去無細(xì)胞的膠原包被的濾膜的電阻而計(jì)算，并根據(jù)濾膜的表面積校準(zhǔn)。穿過在底部僅有星形膠質(zhì)細(xì)胞的膠原包被的濾膜的TEER接近為0(Gaillard et al.，2001，如前)。
穿過BCEC-ACM單層的平均TEER為29.3+/-2.1Ohm.cm2(平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差，n＝12)，之后暴露于LPS并在暴露于LPS中2小時(shí)后降低為21.2+/-4.2Ohm.cm2(平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差，n＝18)。見圖3a的結(jié)果圖示。根據(jù)不成對的t-試驗(yàn)(p＞0.05)，不能認(rèn)為TEER中的這種降低是顯著的。相應(yīng)地，當(dāng)與未處理的BCEC-ACM單層對比時(shí)，TEER降低為72.4+/-14.3％(平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差，n＝18)(見圖3b的示意圖)。
穿過BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物的平均TEER為149.8+/-5.4Ohm.cm2(平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差，n＝18)，之后暴露于LPS并在暴露于LPS中2小時(shí)后降低為65.5+/-2.1Ohm.cm2(平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差，n＝18)。見圖4a的結(jié)果圖示。TEER中的這種降低根據(jù)未成對的t-試驗(yàn)(p＜0.0001)可以可認(rèn)為是非常顯著的。相應(yīng)地，當(dāng)與未處理的BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物對比時(shí)，TEER降低為43.7+/-1.4％(平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差，n＝18)(見圖4b的圖示)。
對于所有試驗(yàn)條件(BCEC-ACM單層+/-LPS及BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物+/-LPS)，RNA分離、cRNA的標(biāo)記及雜交方案均以一式三份進(jìn)行，所有樣品均在HG-U95Av2和HG-U133A陣列上分析。使用Affymetrix Microarray Suite 5.0和Affymetrix Data Mining Tool 2.0初步分析已獲得的強(qiáng)度數(shù)據(jù)。使用Microsoft Excel(Microsoft，USA)進(jìn)一步分析。進(jìn)行其中每個(gè)芯片的數(shù)據(jù)被比例化(scaled)為使用者限定的靶強(qiáng)度的整體比例(global scaling)，以使得試驗(yàn)可對比。在所有樣品中通過Affymetrix Microarray Suite 5.0認(rèn)為“不存在(absent)”的基因在進(jìn)一步的分析中被排除。當(dāng)可應(yīng)用時(shí)，只對在所有三個(gè)“一式三份”樣品中“存在(present)”或“邊緣性存在(marginally present)”的基因進(jìn)行進(jìn)一步分析。進(jìn)行Mann-Whitney試驗(yàn)以鑒別統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性地差異表達(dá)的基因(在對照BCEC-ACM單層與LPS-處理的BCEC-ACM單層之間；在對照BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物與LPS處理的BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物之間；在LPS處理的BCEC-ACM單層與LPS處理的BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物之間)。當(dāng)p值＜0.05時(shí)認(rèn)為差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。另外，對于BCEC-ACM單層與BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物之間LPS的作用，基于平均強(qiáng)度值計(jì)算倍數(shù)改變(只有2倍或更高倍數(shù)的改變認(rèn)為是生物學(xué)相關(guān)的)。
鑒別的基因在此稱為“脂多糖敏感性(LPSS)”基因，因此加以編碼(LPSS01-LPSS25)并示于表1。本發(fā)明還包括LPSS基因的SEQ IDNO號、LPS作用(上調(diào)、下調(diào)、差異表達(dá)(dif+或dif-))、在公眾易獲得的數(shù)據(jù)庫的參考登記號(RefSeq)、基因符號及描述(名稱或基因名稱)。對于每個(gè)鑒別的LPSS基因，特異的結(jié)果示于表2。
實(shí)施例2
BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物中LPSS14(DTR)的定性
對于血腦屏障上LPSS14(DTR)的定性，將從小牛腦部原代分離的腦毛細(xì)血管培養(yǎng)的BCEC在濾膜插入物上用作單層，該濾膜插入物的底部上具有培養(yǎng)的原代分離的新生大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞(圖1bBCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞，如Gaillard et al.，2001，如前所詳述，在此并入?yún)⒖疾⒃凇?.1細(xì)胞培養(yǎng)”中簡要描述)。我們使用1)在濾膜的頂面(血管側(cè))上暴露于不同濃度(1ng/ml直至10μg/ml)DT的BCEC(結(jié)果示于圖5)；2)與1相同，但隨后DT暴露于濾膜的基底外側(cè)部(腦側(cè))(結(jié)果示于圖6)；3)暴露于100ng/ml DT的與不同濃度可溶HB-EGF(0.1-10μg/ml)預(yù)溫育的BCEC，通過結(jié)合DT的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域而發(fā)揮DTR非競爭性拮抗劑的作用，之后暴露于濾膜的頂面(結(jié)果示于圖7)；4)BCEC與5μg/ml用CRM197預(yù)處理1小時(shí)，通過結(jié)合DT的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域而發(fā)揮DTR的競爭性拮抗劑作用，之后BCEC暴露于100ng/ml DT(結(jié)果示于圖8)。
在暴露于DT后，每個(gè)小時(shí)使用具有電流通過和電壓測定電極的電阻系統(tǒng)(ERS)(Millicell-ERS，Millipore Corporation，Bedford，MA，USA)通過穿過濾膜的TEER而評定BBB的功能性。TEER(Ohm.cm2)是從輸出裝置屏幕上展示的電阻中減去無細(xì)胞的膠原包被濾膜的電阻而計(jì)算并根據(jù)濾膜的表面積而校準(zhǔn)。穿過在底部僅有星形膠質(zhì)細(xì)胞的膠原包被濾膜的TEER接近為0(Gaillard et al.，2001，如前)。對TEER的作用針對對照處理的濾膜而標(biāo)準(zhǔn)化并如此表示。
在頂面暴露于1ng/ml直至10μg/ml的DT之后，穿過BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物的TEER以濃度和時(shí)間依賴性方式降低，而低如1ng/ml的濃度在過夜溫育之后是毒性的(圖5)。這些結(jié)果表明DT在頂面由BCEC有效地吸收，其中其可以發(fā)揮其毒性作用。
在基底外側(cè)暴露于25ng/ml直至1000ng/ml的DT之后，穿過BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物的TEER以濃度和時(shí)間依賴性方式降低，而當(dāng)與等摩爾的頂面濃度或數(shù)量的DT對比時(shí)，這些作用大約提前1小時(shí)發(fā)生(圖6)。這些結(jié)果表明當(dāng)與頂面暴露對比時(shí)，DT更有效地由BCEC從基底外側(cè)部位吸收。
在頂面暴露于與可溶HB-EGF預(yù)溫育的100ng/ml DT之后，DT對BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物的毒性作用以濃度依賴性方式降低(圖7)。事實(shí)上，100ng/ml DT與10μg/ml可溶HB-EGF的預(yù)溫育完全阻止了DT誘導(dǎo)的對BCEC的毒性作用，甚至在過夜后評價(jià)也如此。這些結(jié)果表明BCEC中DT吸收通過先前DT與其可溶受體的特異性結(jié)合而被有效地阻斷，使其在BCEC內(nèi)不能發(fā)揮其毒性作用。
在BCEC與CRM197預(yù)溫育之后，對BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物的毒性作用在頂面暴露于100ng/ml DT后降低(圖8)。這些結(jié)果表明BCEC中DT吸收通過先前CRM197與DTR的特異性結(jié)合而被有效地拮抗，使DT在BCEC內(nèi)部不太可能發(fā)揮其毒性作用。
實(shí)施例3
BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物中LPSS14(DTR)生物學(xué)活性的調(diào)節(jié)
為調(diào)節(jié)血腦屏障上LPSS14(DTR)的生物學(xué)活性，從牛腦中原代分離的腦毛細(xì)管培養(yǎng)的BCEC用作濾膜插入物上的單層，該濾膜插入物的底部具有原代分離的新生大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞(圖1bBCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞，如Gaillard et al.，2001，如前所詳述，在此并入?yún)⒖疾⒃凇?.1細(xì)胞培養(yǎng)”中簡要描述)。我們使用1)用肝素(125μg/ml)預(yù)處理1小時(shí)的BCEC，通過在DT的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中導(dǎo)入一個(gè)構(gòu)象改變而在DTR發(fā)揮DT結(jié)合增強(qiáng)子的作用，之后BCEC暴露于100ng/ml DT(結(jié)果示于圖9)；2)BCEC頂面暴露于1μg/ml LPS(血清型055B5)2小時(shí)，從而增加DTR的表達(dá)水平，之后BCEC暴露于100ng/ml DT(結(jié)果示于圖10)；3)BCEC頂面暴露于10μmol的BB94(batimastat)1小時(shí)，發(fā)揮參與胞外域脫落過程的MMP’s的抑制劑的作用，從而增加細(xì)胞膜上DTR有效性，之后BCEC暴露于100ng/ml DT(結(jié)果示于圖10)；4)LPS(2)與BB94(3)組合，從而增加細(xì)胞膜上DTR的表達(dá)水平和有效性，之后BCEC暴露于100ng/ml DT(結(jié)果示于圖10)。
在暴露于DT后，使用具有電流經(jīng)過和電壓測定電極的電阻系統(tǒng)(ERS)(Millicell-ERS，Millipore Corporation，Bedford，MA，USA)通過穿過濾膜的TEER每小時(shí)評定一次BBB功能性。TEER(Ohm.cm2)從輸出裝置屏幕上顯示的電阻減去無細(xì)胞的膠原包被濾膜的電阻而計(jì)算并針對濾膜表面積而校準(zhǔn)。穿過在底部僅有星形膠質(zhì)細(xì)胞的膠原包被濾膜的TEER接近為0(Gaillard et al.，2001，如前)。對TEER的作用針對對照處理的濾膜而標(biāo)準(zhǔn)化并如此表示。
在BCEC與肝素預(yù)溫育后，在頂部暴露于100ng/ml DT后對BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物的毒性作用以所述作用比未處理的對照組提前大約1小時(shí)發(fā)生的方式增加(圖9)，這與在使用10倍高的DT濃度后測定的毒性水平一致。這些結(jié)果表明BCEC中DT吸收通過肝素而有效地增加。
在BCEC與LPS或BB94預(yù)溫育后，在頂面暴露于100ng/ml DT之后對BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物的毒性作用以所述作用比未處理對照組更快速發(fā)生的方式中等程度地增加(圖10)。另外，當(dāng)BCEC與LPS和BB94一起預(yù)溫育時(shí)，在頂面暴露于100ng/ml DT之后對BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物的毒性作用以所述作用比未處理對照組及單獨(dú)處理的BCEC中更快速發(fā)生的方式增加(圖10)。這些結(jié)果表明BCEC中DT吸收通過LPS(可能由于增加的DTR表達(dá)所致)和BB94(可能由于通過抑制的胞外域脫落而增加的DTR有效性所致)而有效地增加，并且這些是加性效應(yīng)。
實(shí)施例4
通過LPSS14(DTR)靶向于血腦屏障的藥物體外吸收研究
為評定通過LPSS14(DTR)血腦屏障藥物靶向能力，從牛腦中原代分離的腦毛細(xì)血管培養(yǎng)的BCEC在96孔平板中用作單層(如Gaillard etal.，2001，如前所詳述，在此并入?yún)⒖疾⒃凇?.1細(xì)胞培養(yǎng)”中簡要描述)。我們使用1)與辣根過氧化物酶(HRP，40kDa的酶)以10∶1重量/重量比率綴合的蛋白質(zhì)(CRM197、BSA和全運(yùn)鐵蛋白(TrF))(圖11)；及2)與HRP以10∶1重量/重量比率綴合的CRM197及與10μg/ml可溶HB-EGF預(yù)溫育(室溫1小時(shí))的HRP以10∶1重量/重量比率綴合的CRM197，通過與CRM197的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合而發(fā)揮DTR介導(dǎo)的吸收的非競爭性拮抗劑作用(圖12)；及3)在37℃和4℃HRP荷載CRM197包被的PEG脂質(zhì)體以確定主動吸收(圖14)。為進(jìn)行4℃的實(shí)驗(yàn)，將BCEC在冰箱中冷卻1小時(shí)，之后開始吸收實(shí)驗(yàn)。在這個(gè)特異性實(shí)驗(yàn)中，BCEC在完全hepes緩沖的DMEM+S中生長最后2天；及4)HRP荷載CRM197包被的PEG脂質(zhì)體及HRP荷載BSA包被的PEG脂質(zhì)體，以確定特異性吸收(圖15)；5)HRP荷載CRM197包被的PEG脂質(zhì)體及BCEC上HRP荷載CRM197包被的PEG脂質(zhì)體，用50μg/ml游離的CRM197預(yù)處理1小時(shí)，通過與CRM197包被的PEG脂質(zhì)體的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合而發(fā)揮DTR的競爭性拮抗劑作用(圖16)。
根據(jù)廠商指導(dǎo)利用HRP綴合試劑盒將蛋白質(zhì)與HRP綴合(AlphaDiagnostic International，San Antonio，TX，USA)。另外，綴合的蛋白質(zhì)在充滿Sephacryl S-200 HR基質(zhì)的HiPrep 16/60柱上進(jìn)一步純化(Amersham Biosciences，UK)。
脂質(zhì)體(100nm)基本如Mastrobattista et al.(1999，Biochim.Biophys.Acta.1419353-363)所述制備并由2∶1比率的EPC-35和膽固醇組成，具有2.5％PEG2000-DSPE和2.5％PEG2000-馬來酰亞胺-PE，與大約3-60 CRM197蛋白質(zhì)/脂質(zhì)體綴合。簡而言之，在有機(jī)溶劑蒸發(fā)后，將脂質(zhì)膜重懸于含有0.3mg HRP/μmol PL的HBS pH 6.5中，脂質(zhì)體通過一系列濾膜(200-50nm)而擠壓(extrude)3-5次。使用SATA用硫醇基修飾CRM197，根據(jù)Bloemen等所述進(jìn)行(1995，F(xiàn)EBS Lett.357140-144)。將CRM197與SATA(1∶8摩爾比率)在持續(xù)搖動下室溫溫育1小時(shí)。游離的SATA通過30kDa截?cái)?cutoff)濾膜(Vivaspin)離心而除去。就在與PEG2000-馬來酰亞胺-PE偶聯(lián)之前，將硫醇基通過與0.1M羥胺(pH 7.4)在室溫溫育45分鐘而激活(去保護(hù))。硫醇基的量和穩(wěn)定性用Ellman′s試劑確定(Ellman，1959，Arch.Biochem.Biophys.8270-77)。HRP預(yù)荷載脂質(zhì)體用CRM197綴合的PEG2000包被，根據(jù)插入后方法進(jìn)行(Iden et al.，2001，Biochim Biophys Acta.1513(2)207-216)。簡而言之，將2.5％CRM197綴合的PEG2000-馬來酰亞胺-PE與2.5％PEG2000-DSPE的微團(tuán)(micelle)在40℃的2小時(shí)溫育期間移至預(yù)形成的HRP荷載脂質(zhì)體中，之后在Sephadex CL4B柱上分離，隨后使用超速離心法濃縮(60.000g，30分鐘，10℃)。為進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)(如每個(gè)實(shí)施例所示)，在上述方案中將CRM197用BSA代替作為對照脂質(zhì)體。在制備之后，磷脂含量根據(jù)Fiske和Subarrow所述確定，蛋白質(zhì)含量使用Biorad蛋白質(zhì)分析(對Bradford的修改方法)確定。CRM197包被的PEG脂質(zhì)體含有3.3蛋白質(zhì)/脂質(zhì)體，而BSA包被的PEG脂質(zhì)體含有26.9蛋白質(zhì)/脂質(zhì)體。另外，大小(對CRM197包被的PEG脂質(zhì)體而言是112nm，對BSA包被的PEG脂質(zhì)體而言是104nm)和多分散性(對CRM197包被的PEG脂質(zhì)體而言是0.21，對BSA包被的PEG脂質(zhì)體而言是0.08)使用Malvern 4700系統(tǒng)(Malvern Ltd.Malvern，UK)通過動態(tài)光散射確定。Zeta電勢(對CRM197包被的PEG脂質(zhì)體而言是-18.6+/-0.7，對BSA包被的PEG脂質(zhì)體而言是-25.2+/-11.2)使用Malvern3000 HSa zetasizer(Malvern Ltd.Malvern，UK)確定。
綴合的蛋白質(zhì)的HRP活性、脂質(zhì)體及細(xì)胞裂解物樣品中的HRP含量使用具有適當(dāng)?shù)男?zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)比色測定而檢測。細(xì)胞和脂質(zhì)體(在用冷卻的PBS徹底洗滌后)通過40μl的0.1％脫氧膽酸鈉水溶液裂解。
在BCEC與相應(yīng)于5μg/ml未綴合的HRP的HRP綴合蛋白質(zhì)溫育之后，CRM197-HRP綴合物當(dāng)與BSA-和運(yùn)鐵蛋白-HRP綴合物對比時(shí)優(yōu)選由BCEC吸收(圖11)。這些結(jié)果表明與40kDa物質(zhì)綴合的CRM197由BCEC特異性吸收。
在BCEC與用10μg/ml可溶HB-EGF預(yù)溫育的CRM197-HRP-綴合物(相應(yīng)于5μg/ml未綴合HRP)溫育后，CRM197-HRP綴合物的特異性吸收與BSA-HRP-綴合物的特異性吸收相對比被完全抑制(圖12)。這些結(jié)果表明與40kDa物質(zhì)綴合的CRM197通過DTR介導(dǎo)的吸收過程而由BCEC特異性吸收。
在BCEC與相應(yīng)于5μg/ml游離HRP濃度的HRP荷載CRM197包被的PEG脂質(zhì)體溫育后，當(dāng)與在4℃的吸收相對比時(shí)，在37℃HRP荷載CRM197包被的PEG脂質(zhì)體由BCEC主動吸收(圖14)，當(dāng)與HRP荷載BSA包被的PEG脂質(zhì)體的吸收對比時(shí)是特異性的(圖15)，及當(dāng)與用50μg/ml游離CRM197預(yù)處理1小時(shí)的BCEC吸收的HRP荷載CRM197包被的PEG脂質(zhì)體的吸收量對比時(shí)是由DTR特異性介導(dǎo)的(圖16)?？傊?，這些結(jié)果表明CRM197包被的PEG脂質(zhì)體在BCEC是由DTR主動及特異性吸收的。
實(shí)施例5
通過LPSS14(DTR)靶向穿過血腦屏障的藥物體外胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)研究
為評定經(jīng)LPSS14(DTR)通過胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)靶向血腦屏障的藥物的能力，從牛腦中原代分離的腦毛細(xì)血管培養(yǎng)的BCEC在濾膜插入物上用作單層，該濾膜底部有培養(yǎng)的原代分離的新生大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞(圖1bBCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞，如Gaillard et al.，2001，如前所詳述，在此并入?yún)⒖疾⒃凇?.1細(xì)胞培養(yǎng)”中簡要描述)。為進(jìn)行這個(gè)實(shí)施例中描述的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，在前2或3天，將細(xì)胞用312.5μM8-(4-chlorophenylthio(CPT))-cAMP，和17.5μM RO-20-1724在完全hepes緩沖的DMEM+S中處理以顯著增加BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物的緊密度(即降低細(xì)胞旁泄漏(paracellular leakiness))。我們使用1)作為靶向部分的CRM197及作為對照蛋白的BSA與辣根過氧化物酶(HRP，一種40kDa的酶)以2∶1重量/重量比率綴合，在37℃和4℃進(jìn)行，以確定主動和特異性胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用(圖13)。為進(jìn)行4℃實(shí)驗(yàn)，將濾膜在冰箱中冷卻1小時(shí)之后開始轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)；2)HRP荷載CRM197包被的PEG脂質(zhì)體和HRP荷載BSA包被的PEG脂質(zhì)體以確定特異性胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用(圖17)。
BBB功能性使用具有電流經(jīng)過和電壓測定電極的電阻系統(tǒng)(ERS)(Millicell-ERS，Millipore Corporation，Bedford，MA，USA)通過穿過濾膜的TEER評定。TEER(Ohm.cm2)是從輸出裝置屏幕上顯示的電阻減去無細(xì)胞的膠原包被濾膜的電阻而計(jì)算，并根據(jù)濾膜表面積而校準(zhǔn)。穿過僅在底部具有星形膠質(zhì)細(xì)胞的膠原包被濾膜的TEER接近為0(Gaillard et al.，2001，如前)。
利用HRP綴合試劑盒(Alpha Diagnostic International，San Antonio，TX，USA)根據(jù)廠商指導(dǎo)將蛋白質(zhì)與HRP綴合。另外，將綴合的蛋白質(zhì)在充滿Sephacryl S-200HR基質(zhì)(Amersham Biosciences，UK)的HiPrep 16/60柱上進(jìn)一步純化。
脂質(zhì)體(100nm)基本根據(jù)Mastrobattista等(1999，Biochim.Biophys.Acta.1419353-363)所述制備，由2∶1比率的EPC-35和膽固醇組成，具有2.5％PEG2000-DSPE和2.5％PEG2000-馬來酰亞胺-PE，與大約3-60 CRM197蛋白質(zhì)/脂質(zhì)體綴合。簡而言之，在有機(jī)溶劑蒸發(fā)后，將脂質(zhì)膜重懸于含有0.3mg HRP/μmol PL的HBS pH 6.5中，并將脂質(zhì)體通過一系列濾膜(200-50nm)擠壓3-5次。根據(jù)Bloemen等(1995，F(xiàn)EBS Lett.357140-144)所述將CRM197使用SATA用硫醇基修飾。將CRM197和SATA(1∶8摩爾比率)在持續(xù)搖動下在室溫溫育1小時(shí)。游離的SATA在30kDa截?cái)酁V膜(Vivaspin)上通過離心除去。就在與PEG2000-馬來酰亞胺-PE偶聯(lián)之前，將硫醇基通過與0.1M羥胺(pH 7.4)在室溫溫育45分鐘而激活(去保護(hù))。硫醇基的量和穩(wěn)定性用Ellman′s試劑(Ellman，1959，Arch.Biochem.Biophys.8270-77)確定。將HRP預(yù)荷載的脂質(zhì)體用CRM197綴合的PEG2000包被，根據(jù)插入后方法進(jìn)行(Iden et al.，2001，Biochim Biophys Acta.1513(2)207-216)。簡而言之，將2.5％CRM197-綴合的PEG2000-馬來酰亞胺-PE和2.5％PEG2000-DSPE微團(tuán)在40℃的2小時(shí)溫育期間移至預(yù)制的HRP荷載脂質(zhì)體中，之后在Sephadex CL4B柱上分離，隨后使用超速離心(60.000g，30分鐘，10℃)濃縮。對于特異性實(shí)驗(yàn)(如每個(gè)實(shí)施例所示)，在進(jìn)行上述方案時(shí)將CRM197以BSA代替作為對照脂質(zhì)體。在制備后，磷脂含量根據(jù)Fiske和Subarrow所述確定，蛋白質(zhì)含量用Biorad蛋白質(zhì)分析(Bradford的修改方法)測定。CRM197包被的PEG脂質(zhì)體含有3.3蛋白質(zhì)/脂質(zhì)體，BSA包被的PEG脂質(zhì)體含有26.9蛋白質(zhì)/脂質(zhì)體。另外，大小(對于CRM197包被的PEG脂質(zhì)體而言是112nm，對于BSA包被的PEG脂質(zhì)體而言是104nm)和多分散性(對于CRM197包被的PEG脂質(zhì)體而言是0.21，對于BSA包被的PEG脂質(zhì)體而言是0.08)使用Malvern 4700系統(tǒng)(Malvern Ltd.Malvern，UK)通過動態(tài)光散射而確定。Zeta電勢(對于CRM197包被的PEG脂質(zhì)體而言是-18.6+/-0.7，對于BSA包被的PEG脂質(zhì)體而言是-25.2+/-11.2)使用Malvern 3000 HSazetasizer(Malvern Ltd.Malvern，UK)確定。
將與CRM197或BSA綴合的HRP或者與CRM197或BSA綴合的HRP荷載PEG脂質(zhì)體加入濾膜插入物的頂面，并將濾膜直接移至含有溫的(對于HRP綴合的蛋白質(zhì)而言是冷卻的)250μl hepes緩沖的DMEM+S的新鮮孔中。每小時(shí)(共4小時(shí))將這個(gè)步驟重復(fù)一次以防止HRP綴合的蛋白質(zhì)或與CRM197或BSA綴合的HRP荷載PEG脂質(zhì)體在BCEC的近腔室側(cè)可能發(fā)生的再次胞吞。胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)的HRP進(jìn)入基底外側(cè)區(qū)室的累積HRP活性使用具有適當(dāng)?shù)男?zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)比色測定檢測。
穿過BCEC-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物的平均TEER在用8-4-CPT-cAMP和RO-20-1724處理后從149.8+/-5.4Ohm.cm2(平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差，n＝18)增加至834+/-77Ohm.cm2(平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差，n＝24)。DT敏感性在未處理的細(xì)胞和處理的單細(xì)胞之間觀測到無差異(數(shù)據(jù)未示出)。
在BCEC與相應(yīng)于5μg/ml未綴合HRP濃度的HRP綴合蛋白質(zhì)溫育后，CRM197-HRP綴合物當(dāng)與BSA-HRP綴合物相對比時(shí)優(yōu)先穿過BCEC而胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)(圖13)。在4℃，CRM197-HRP綴合物的轉(zhuǎn)運(yùn)水平與在37℃和4℃的BSA-HRP綴合物相同(圖13)。這些結(jié)果表明CRM197即使當(dāng)與40kDa蛋白質(zhì)物質(zhì)綴合時(shí)也特異性及主動胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)穿過血腦屏障。
在BCEC與相應(yīng)于5μg/ml游離HRP濃度的與CRM197或BSA綴合的HRP荷載PEG脂質(zhì)體溫育時(shí)，CRM197包被的PEG脂質(zhì)體當(dāng)與BSA包被的PEG脂質(zhì)體相對比時(shí)優(yōu)先胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)穿過BCEC(圖17)。這些結(jié)果表明CRM197即使當(dāng)與大約100nm的脂質(zhì)體綴合時(shí)也能特異性輸送其40kDa蛋白質(zhì)物質(zhì)穿過血腦屏障。
實(shí)施例6
經(jīng)LPSS14(DTR)靶向穿過血腦屏障的藥物
在豚鼠中進(jìn)行的體內(nèi)腦分布研究
在幼雄性豚鼠(Dunkin-Hartley HsdPocHD，250-300g)中與HRP綴合(2∶1重量/重量比率)的CRM197或全運(yùn)鐵蛋白(TrF)的腦部吸收在頸動脈內(nèi)大丸劑注射所述綴合物(相應(yīng)于0.5ml未綴合HRP的鹽水中500μg/ml濃度)之后1.5小時(shí)進(jìn)行確定，并與等濃度的游離HRP進(jìn)行對比。利用HRP綴合試劑盒(Alpha Diagnostic International，San Antonio，TX，USA)根據(jù)廠商指導(dǎo)將蛋白質(zhì)與HRP綴合。另外，綴合的蛋白質(zhì)在充滿Sephacryl S-200HR基質(zhì)(Amersham Biosciences，UK)的HiPrep16/60柱上進(jìn)一步純化。簡而言之，將動物在空氣/氧混合物(2∶1)中用異氟烷吸入麻醉(4％誘導(dǎo)，1-1.5％保持)。將一個(gè)插管置于頸動脈中以收集血樣和給藥。在注射蛋白質(zhì)之后1.5小時(shí)，將動物用4％異氟烷(1-2分鐘)深度麻醉，隨后通過頸動脈用鹽水灌注(＜5分鐘)整個(gè)動物(包括腦)，以清除血管中血液。之后將動物斷頭并從顱骨中取出腦以進(jìn)一步分析。只使用清除全部血液的腦(基于對腦進(jìn)行目測)進(jìn)行進(jìn)一步分析。
切下灌注的腦皮質(zhì)(及一個(gè)未灌注的對照腦)并稱重。之后，將皮質(zhì)片段勻漿并將一半體積的勻漿通過120μm尼龍網(wǎng)過濾。另外，除了全部的勻漿之外，過濾物(含有血管結(jié)構(gòu))和洗脫物(含有腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞)均用于分析胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)的HRP進(jìn)入三個(gè)腦皮質(zhì)樣品(即全部的勻漿(圖18中稱為“勻漿”)、腦實(shí)質(zhì)(圖18中稱為“實(shí)質(zhì)”)及腦血管(圖18中稱為“毛細(xì)血管”))的HRP活性。組織/細(xì)胞用0.1％脫氧膽酸鈉水溶液(終濃度)裂解，之后使用標(biāo)準(zhǔn)比色測定方法通過適當(dāng)?shù)男?zhǔn)曲線檢測旋轉(zhuǎn)后的勻漿的清澈上清中HRP活性，并根據(jù)上清的稀釋度和蛋白質(zhì)含量校準(zhǔn)。
切下灌注的腦(及一個(gè)未灌注的對照腦(即未注射HRP或HRP綴合物))的大約0.5cm中央橫切面(central cross-section)(耳至耳)，直接在異戊烷中速凍并在-80℃貯存直至使用。將組織切片在恒冷切片機(jī)上切成14μm的冷凍切片。將一些切片通風(fēng)固定，HRP(或者在未灌注的對照腦的情況中的內(nèi)源過氧化物酶)活性通過TMB(過氧化物酶底物試劑盒TMB，Vector Laboratories)直接染色30分鐘，在去離子水(demi water)中洗滌5分鐘，及在一系列乙醇和二甲苯中脫水(90％乙醇2×1分鐘；100％乙醇2×1分鐘；二甲苯2×1分鐘)最后包埋于Entellan(Merck)中。其它切片在4％多聚甲醛中固定(15分鐘)，腦中CRM197分布用小鼠抗白喉毒素1∶10(OBT0746，ImmunologicalsDirect.com)及二級HRP-山羊抗小鼠抗體1∶250(Jackson Immunoresearch)通過對白喉毒素的免疫組織化學(xué)染色。這個(gè)初級抗體在斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)中在純蛋白質(zhì)樣品及在CRM197-HRP綴合的勻漿樣品中均能選擇性染色CRM197以及CRM197-HRP綴合物(數(shù)據(jù)未示出)。內(nèi)源過氧化物酶被阻斷(在PBS中用0.3％H2O2及0.1％NaN3 20分鐘)，非特異性染色通過5％正常山羊血清而阻止。二級抗體的HRP活性通過TMB(過氧化物酶底物試劑盒TMB，Vector Laboratories)染色10分鐘，在demi水中洗滌5分鐘，并在系列乙醇和二甲苯脫水(90％乙醇2×1分鐘；100％乙醇2×1分鐘；二甲苯2×1分鐘)，最后包埋于Entellan(Merck)中。不進(jìn)行復(fù)染。
在豚鼠注射HRP綴合的CRM197和TrF(均相應(yīng)于500μg/ml未綴合的HRP濃度)以及等濃度的游離HRP之后1.5小時(shí)，僅在CRM197-HRP綴合物注射的動物的所有三個(gè)腦皮質(zhì)勻漿樣品(即全部的勻漿(圖18中稱為“勻漿”)、腦實(shí)質(zhì)(圖18中稱為“實(shí)質(zhì)”)及腦血管(圖18中稱為“毛細(xì)血管”))中觀測到HRP活性(圖18)。這個(gè)分析包括來自三個(gè)動物的數(shù)據(jù)，基于腦中血液的完全不存在(這在如下述冷凍切片中也被證實(shí))。TrF-HRP綴合物注射的動物以及游離HRP注射的動物的所有樣品中HRP活性水平低于檢測限度(這兩組n＝2，基于腦中血液完全不存在(這在如下述冷凍切片中也被證實(shí))而選擇)。這些結(jié)果表明與40kDa物質(zhì)(即HRP)綴合的CRM197在腦皮質(zhì)中被特異性吸收，游離的HRP及與TrF綴合的HRP則否。不幸地，注射的HRP綴合物和游離HRP的血漿動力學(xué)基于HRP的標(biāo)準(zhǔn)比色測定方法不能確定，這是由于血液中存在高水平的內(nèi)源性過氧化物酶所致，在對照組(即0.5μl鹽水)注射的動物中也隨著時(shí)間而改變(可能由于注射的鹽水體積所致輕度和短暫溶血所致，在所有動物中均觀測到)。因此，未能計(jì)算CRM197-HRP綴合物的腦皮質(zhì)分布體積。
在未灌注的對照腦的冷凍切片直接針對內(nèi)源過氧化物酶活性由TMB直接染色之后，在遍布整個(gè)切片觀測到血管特有的獨(dú)特和強(qiáng)染色模式。這個(gè)模式的典型實(shí)例示于圖19中A組。從圖19中B組可以意識到，通過頸動脈灌注鹽水的程序能完全除去這種內(nèi)源過氧化物酶活性。這些結(jié)果表明血液中確實(shí)存在妨礙內(nèi)源性過氧化物酶，這在血漿樣品中已經(jīng)用針對HRP的標(biāo)準(zhǔn)比色測定方法觀測到。游離HRP注射的動物的充分灌注的腦的TMB染色的冷凍切片示出與充分灌注的對照腦一樣，無可見的染色(圖19，C和D組示出兩個(gè)不同動物的代表性照片)。然而，CRM197-HRP綴合物注射的動物的充分灌注的腦的TMB染色的冷凍切片示出與小血管相關(guān)的特征性染色模式(圖19，E和F組示出代表性照片(E和F來自相同的動物))。另外，在這些動物中觀測到遍布整個(gè)切片的一些穿過血管滲出的(即轉(zhuǎn)運(yùn)的)HRP特有的獨(dú)特的染色區(qū)域(圖19，F(xiàn)、G和H組示出三個(gè)不同動物的代表性照片)。相反，TrF-HRP綴合物注射的動物的充分灌注的腦的TMB染色的冷凍切片示出少許(如果存在的話)非常微弱的與小血管相關(guān)的染色模式(圖19，I和J及K和L組示出兩個(gè)不同動物的兩張代表性照片)?？傊?，這些結(jié)果與得自腦皮質(zhì)勻漿的數(shù)據(jù)一致，再一次表明與40kDa物質(zhì)(即HRP)綴合的CRM197在腦皮質(zhì)中被特異性吸收，游離HRP及與TrF綴合的HRP則否。
其中腦中CRM197分布用小鼠抗白喉毒素通過對白喉毒素的免疫組織化學(xué)染色的冷凍切片示出遍布整個(gè)切片的微弱的均勻分布的模式(圖20，A和D組示出來自相同動物的兩張代表性照片的放大圖)。這個(gè)染色模式在游離的HRP和TrF-HRP綴合物注射的動物中未觀測到(圖20，B和E組及C和F組分別示出來自相同動物的兩張代表性照片的放大圖)。總而言之，這些結(jié)果表明CRM197(裂解或仍與HRP綴合)在腦部被吸收。
當(dāng)考慮到所有示出的方法及與關(guān)于DTR的現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域可利用的方法組合時(shí)，提議如下將藥物輸送至并穿過血腦屏障的作用機(jī)制在藥物或脂質(zhì)體綴合的載體蛋白(例如CRM197)的B結(jié)構(gòu)域與白喉毒素受體特異性結(jié)合之后，該載體蛋白/藥物復(fù)合物被胞吞。由于pH改變誘導(dǎo)的載體蛋白構(gòu)象改變，因此載體蛋白/藥物復(fù)合物的T結(jié)構(gòu)域插入內(nèi)體膜中，隨后A結(jié)構(gòu)域(包括藥物復(fù)合物)易位至細(xì)胞溶膠中。此后，藥物和載體蛋白(切割的或仍綴合的)被轉(zhuǎn)運(yùn)穿過血腦屏障。由于一部分內(nèi)體可能在溶酶體中死亡，因此這個(gè)作用機(jī)制也用作將治療劑輸送至溶酶體的方式。在這種情況中，特別優(yōu)選與酶(例如在患有溶酶體貯積病的患者中缺乏的酶)的綴合物。
表1“脂多糖敏感性(LPSS)”基因、其SEQ ID NO號、LPS作用(表示為上調(diào)(up)、下調(diào)(down)、差異(dif+或dif-))、其登記號(RefSeq)、基因符號和描述(或基因名稱)。
表2LPSS基因的LPS應(yīng)答(全局規(guī)模強(qiáng)度平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差)
序列表
<110> to-BBB控股股份有限公司
<120> 炎癥狀態(tài)下在血腦屏障中差異表達(dá)的核酸
<130> P206561EP
<140> P206561EP
<141> 2001-02-11
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<170> PatentIn version 3.1
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370 375 380
Gly Gly His Gly His Asp Pro Lys Ser Gly Phe Arg Ile Tyr Phe Cys
385 390 395 400
Gln Ile Pro Cys Leu Asn Gly Gly Arg Cys Ile Gly Arg Asp Glu Cys
405 410 415
Trp Cys Pro Ala Asn Ser Thr Gly Lys Phe Cys His Leu Pro Ile Pro
420 425 430
Gln Pro Asp Arg Glu Pro Pro Gly Arg Gly Ser Arg Pro Arg Ala Leu
435 440 445
Leu Glu Ala Pro Leu Lys Gln Ser Thr Phe Thr Leu Pro Leu Ser Asn
450 455 460
Gln Leu Ala Ser Val Asn Pro Ser Leu Val Lys Val His Ile His His
465 470 475 480
Pro Pro Glu Ala Ser Val Gln Ile His Gln Val Ala Gln Val Arg Gly
485 490 495
Gly Val Glu Glu Ala Leu Val Glu Asn Ser Val Glu Thr Arg Pro Pro
500 505 510
Pro Trp Leu Pro Ala Ser Pro Gly His Ser Leu Trp Asp Ser Asn Asn
515 520 525
Ile Pro Ala Arg Ser Gly Glu Pro Pro Arg Pro Leu Pro Pro Ala Ala
530 535 540
Pro Arg Pro Arg Gly Leu Leu Gly Arg Cys Tyr Leu Asn Thr Val Asn
545 550 555 560
Gly Gln Cys Ala Asn Pro Leu Leu Glu Leu Thr Thr Gln Glu Asp Cys
565 570 575
Cys Gly Ser Val Gly Ala Phe Trp Gly Val Thr Leu Cys Ala Pro Cys
580 585 590
Pro Pro Arg Pro Ala Ser Pro Val Ile Glu Asn Gly Gln Leu Glu Cys
595 600 605
Pro Gln Gly Tyr Lys Arg Leu Asn Leu Thr His Cys Gln Asp Ile Asn
610 615 620
Glu Cys Leu Thr Leu Gly Leu Cys Lys Asp Ala Glu Cys Val Asn Thr
625 630 635 640
Arg Gly Ser Tyr Leu Cys Thr Cys Arg Pro Gly Leu Met Leu Asp Pro
645 650 655
Ser Arg Ser Arg Cys Val Ser Asp Lys Ala Ile Ser Met Leu Gln Gly
660 665 670
Leu Cys Tyr Arg Ser Leu Gly Pro Gly Thr Cys Thr Leu Pro Leu Ala
675 680 685
Gln Arg Ile Thr Lys Gln Ile Cys Cys Cys Ser Arg Val Gly Lys Ala
690 695 700
Trp Gly Ser Glu Cys Glu Lys Cys Pro Leu Pro Gly Thr Glu Ala Phe
705 710 715 720
Arg Glu Ile Cys Pro Ala Gly His Gly Tyr Thr Tyr Ala Ser Ser Asp
725 730 735
Ile Arg Leu Ser Met Arg Lys Ala Glu Glu Glu Glu Leu Ala Arg Pro
740 745 750
Pro Arg Glu Gln Gly Gln Arg Ser Ser Gly Ala Leu Pro Gly Pro Ala
755 760 765
Glu Arg Gln Pro Leu Arg Val Val Thr Asp Thr Trp Leu Glu Ala Gly
770 775 780
Thr Ile Pro Asp Lys Gly Asp Ser Gln Ala Gly Gln Val Thr Thr Ser
785 790 795 800
Val Thr His Ala Pro Ala Trp Val Thr Gly Asn Ala Thr Thr Pro Pro
805 810 815
Met Pro Glu Gln Gly Ile Ala Glu Ile Gln Glu Glu Gln Val Thr Pro
820 825 830
Ser Thr Asp Val Leu Val Thr Leu Ser Thr Pro Gly Ile Asp Arg Cys
835 840 845
Ala Ala Gly Ala Thr Asn Val Cys Gly Pro Gly Thr Cys Val Asn Leu
850 855 860
Pro Asp Gly Tyr Arg Cys Val Cys Ser Pro Gly Tyr Gln Leu His Pro
865 870 875 880
Ser Gln Ala Tyr Cys Thr Asp Asp Asn Glu Cys Leu Arg Asp Pro Cys
885 890 895
Lys Gly Lys Gly Arg Cys Ile Asn Arg Val Gly Ser Tyr Ser Cys Phe
900 905 910
Cys Tyr Pro Gly Tyr Thr Leu Ala Thr Ser Gly Ala Thr Gln Glu Cys
915 920 925
Gln Asp Ile Asn Glu Cys Glu Gln Pro Gly Val Cys Ser Gly Gly Gln
930 935 940
Cys Thr Asn Thr Glu Gly Ser Tyr His Cys Glu Cys Asp Gln Gly Tyr
945 950 955 960
Ile Met Val Arg Lys Gly His Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Arg His
965 970 975
Pro Gly Thr Cys Pro Asp Gly Arg Cys Val Asn Ser Pro Gly Ser Tyr
980 985 990
Thr Cys Leu Ala Cys Glu Glu Gly Tyr Arg Gly Gln Ser Gly Ser Cys
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1010 1015 1020
Lys Cys Thr Asn Leu Glu Gly Ser Phe Arg Cys Ser Cys Glu Gln
1025 1030 1035
Gly Tyr Glu Val Thr Ser Asp Glu Lys Gly Cys Gln Asp Val Asp
1040 1045 1050
Glu Cys Ala Ser Arg Ala Ser Cys Pro Thr Gly Leu Cys Leu Asn
1055 1060 1065
Thr Glu Gly Ser Phe Ala Cys Ser Ala Cys Glu Asn Gly Tyr Trp
1070 1075 1080
Val Asn Glu Asp Gly Thr Ala Cys Glu Asp Leu Asp Glu Cys Ala
1085 1090 1095
Phe Pro Gly Val Cys Pro Ser Gly Val Cys Thr Asn Thr Ala Gly
1100 1105 1110
Ser Phe Ser Cys Lys Asp Cys Asp Gly Gly Tyr Arg Pro Ser Pro
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Leu Gly Asp Ser Cys Glu Asp Val Asp Glu Cys Glu Asp Pro Gln
1130 1135 1140
Ser Ser Cys Leu Gly Gly Glu Cys Lys Asn Thr Val Gly Ser Tyr
1145 1150 1155
Gln Cys Leu Cys Pro Gln Gly Phe Gln Leu Ala Asn Gly Thr Val
1160 1165 1170
Cys Glu Asp Val Asn Glu Cys Met Gly Glu Glu His Cys Ala Pro
1175 1180 1185
His Gly Glu Cys Leu Asn Ser His Gly Ser Phe Phe Cys Leu Cys
1190 1195 1200
Ala Pro Gly Phe Val Ser Ala Glu Gly Gly Thr Ser Cys Gln Asp
1205 1210 1215
Val Asp Glu Cys Ala Thr Thr Asp Pro Cys Val Gly Gly His Cys
1220 1225 1230
Val Asn Thr Glu Gly Ser Phe Asn Cys Leu Cys Glu Thr Gly Phe
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Gln Pro Ser Pro Glu Ser Gly Glu Cys Val Asp Ile Asp Glu Cys
1250 1255 1260
Glu Asp Tyr Gly Asp Pro Val Cys Gly Thr Trp Lys Cys Glu Asn
1265 1270 1275
Ser Pro Gly Ser Tyr Arg Cys Val Leu Gly Cys Gln Pro Gly Phe
1280 1285 1290
His Met Ala Pro Asn Gly Asp Cys Ile Asp Ile Asp Glu Cys Ala
1295 1300 1305
Asn Asp Thr Met Cys Gly Ser His Gly Phe Cys Asp Asn Thr Asp
1310 1315 1320
Gly Ser Phe Arg Cys Leu Cys Asp Gln Gly Phe Glu Ile Ser Pro
1325 1330 1335
Ser Gly Trp Asp Cys Val Asp Val Asn Glu Cys Glu Leu Met Leu
1340 1345 1350
Ala Val Cys Gly Ala Ala Leu Cys Glu Asn Val Glu Gly Ser Phe
1355 1360 1365
Leu Cys Leu Cys Ala Ser Asp Leu Glu Glu Tyr Asp Ala Gln Glu
1370 1375 1380
Gly His Cys Arg Pro Arg Gly Ala Gly Gly Gln Ser Met Ser Glu
1385 1390 1395
Ala Pro Thr Gly Asp His Ala Pro Ala Pro Thr Arg Met Asp Cys
1400 1405 1410
Tyr Ser Gly Gln Lys Gly His Ala Pro Cys Ser Ser Val Leu Gly
1415 1420 1425
Arg Asn Thr Thr Gln Ala Glu Cys Cys Cys Thr Gln Gly Ala Ser
1430 1435 1440
Trp Gly Asp Ala Cys Asp Leu Cys Pro Ser Glu Asp Ser Ala Glu
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Phe Ser Glu Ile Cys Pro Ser Gly Lys Gly Tyr Ile Pro Val Glu
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Gly Ala Trp Thr Phe Gly Gln Thr Met Tyr Thr Asp Ala Asp Glu
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Cys Val Ile Phe Gly Pro Gly Leu Cys Pro Asn Gly Arg Cys Leu
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1505 1510 1515
Tyr Asp Ala Ser His Lys Lys Cys Glu Asp His Asp Glu Cys Gln
1520 1525 1530
Asp Leu Ala Cys Glu Asn Gly Glu Cys Val Asn Thr Glu Gly Ser
1535 1540 1545
Phe His Cys Phe Cys Ser Pro Pro Leu Thr Leu Asp Leu Ser Gln
1550 1555 1560
Gln Arg Cys Met Asn Ser Thr Ser Ser Thr Glu Asp Leu Pro Asp
1565 1570 1575
His Asp Ile His Met Asp Ile Cys Trp Lys Lys Val Thr Asn Asp
1580 1585 1590
Val Cys Ser Glu Pro Leu Arg Gly His Arg Thr Thr Tyr Thr Glu
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1610 1615 1620
Cys Pro Pro Arg Ser Ser Glu Val Tyr Ala Gln Leu Cys Asn Val
1625 1630 1635
Ala Arg Ile Glu Ala Glu Arg Glu Ala Gly Val His Phe Arg Pro
1640 1645 1650
Gly Tyr Glu Tyr Gly Pro Gly Pro Asp Asp Leu His Tyr Ser Ile
1655 1660 1665
Tyr Gly Pro Asp Gly Ala Pro Phe Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Glu
1670 1675 1680
Asp Thr Val Pro Glu Pro Ala Phe Pro Asn Thr Ala Gly His Ser
1685 1690 1695
Ala Asp Arg Thr Pro Ile Leu Glu Ser Pro Leu Gln Pro Ser Glu
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Glu Asn Gly Arg Cys Val Arg Val Arg Glu Gly Tyr Thr Cys Asp
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Cys Phe Glu Gly Phe Gln Leu Asp Ala Ala His Met Ala Cys Val
1760 1765 1770
Asp Val Asn Glu Cys Asp Asp Leu Asn Gly Pro Ala Val Leu Cys
1775 1780 1785
Val His Gly Tyr Cys Glu Asn Thr Glu Gly Ser Tyr Arg Cys His
1790 1795 1800
Cys Ser Pro Gly Tyr Val Ala Glu Ala Gly Pro Pro His Cys Thr
1805 1810 1815
Ala Lys Glu
1820
<210>14
<211>277
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>14
Met Ile Ile Leu Ile Tyr Leu Phe Leu Leu Leu Trp Glu Asp Thr Gln
1 5 10 15
Gly Trp Gly Phe Lys Asp Gly Ile Phe His Asn Ser Ile Trp Leu Glu
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Arg Ala Ala Gly Val Tyr His Arg Glu Ala Arg Ser Gly Lys Tyr Lys
35 40 45
Leu Thr Tyr Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe Glu Gly Gly His
50 55 60
Leu Ala Thr Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe His
65 70 75 80
Val Cys Ala Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro Ile
85 90 95
Val Lys Pro Gly Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr Gly Ile Ile Asp
100 105 110
Tyr Gly Ile Arg Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp Ala Tyr Cys Tyr
115 120 125
Asn Pro His Ala Lys Glu Cys Gly Gly Val Phe Thr Asp Pro Lys Arg
130 135 140
Ile Phe Lys Ser Pro Gly Phe Pro Asn Glu Tyr Glu Asp Asn Gln Ile
145 150 155 160
Cys Tyr Trp His Ile Arg Leu Lys Tyr Gly Gln Arg Ile His Leu Ser
165 170 175
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180 185 190
Val Glu Ile Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Val His Gly Phe Val Gly Arg
195 200 205
Tyr Cys Gly Asp Glu Leu Pro Asp Asp Ile Ile Ser Thr Gly Asn Val
210 215 220
Met Thr Leu Lys Phe Leu Ser Asp Ala Ser Val Thr Ala Gly Gly Phe
225 230 235 240
Gln Ile Lys Tyr Val Ala Met Asp Pro Val Ser Lys Ser Ser Gln Gly
245 250 255
Lys Asn Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Asn Lys Asn Phe Leu Ala Gly
260 265 270
Arg Phe Ser His Leu
275
<210>15
<211>232
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>15
Met Lys Glu Arg Arg Ala Pro Gln Pro Val Val Ala Arg Cys Lys Leu
1 5 10 15
Val Leu Val Gly Asp Val Gln Cys Gly Lys Thr Ala Met Leu Gln Val
20 25 30
Leu Ala Lys Asp Cys Tyr Pro Glu Thr Tyr Val Pro Thr Val Phe Glu
35 40 45
Asn Tyr Thr Ala Cys Leu Glu Thr Glu Glu Gln Arg Val Glu Leu Ser
50 55 60
Leu Trp Asp Thr Ser Gly Ser Pro Tyr Tyr Asp Asn Val Arg Pro Leu
65 70 75 80
Cys Tyr Ser Asp Ser Asp Ala Val Leu Leu Cys Phe Asp Ile Ser Arg
85 90 95
Pro Glu Thr Val Asp Ser Ala Leu Lys Lys Trp Arg Thr Glu Ile Leu
100 105 110
Asp Tyr Cys Pro Ser Thr Arg Val Leu Leu Ile Gly Cys Lys Thr Asp
115 120 125
Leu Arg Thr Asp Leu Ser Thr Leu Met Glu Leu Ser His Gln Lys Gln
130 135 140
Ala Pro Ile Ser Tyr Glu Gln Gly Cys Ala Ile Ala Lys Gln Leu Gly
145 150 155 160
Ala Glu Ile Tyr Leu Glu Gly Ser Ala Phe Thr Ser Glu Lys Ser Ile
165 170 175
His Ser Ile Phe Arg Thr Ala Ser Met Leu Cys Leu Asn Lys Pro Ser
180 185 190
Pro Leu Pro Gln Lys Ser Pro Val Arg Ser Leu Ser Lys Arg Leu Leu
195 200 205
His Leu Pro Ser Arg Ser Glu Leu Ile Ser Ser Thr Phe Lys Lys Glu
210 215 220
Lys Ala Lys Ser Cys Ser Ile Met
225 230
<210>16
<211>283
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>16
Met Pro Glu Ser Leu Asp Ser Pro Thr Ser Gly Arg Pro Gly Val Thr
1 5 10 15
Thr His Ser Thr Arg Thr Pro Gly Thr Glu Ile Gln Thr Ile Ile Ser
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Asn Pro Val Pro Lys Met Glu Glu Ala Lys Ser Gln Ser Leu Glu Glu
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Asp Phe Glu Gly Gln Ala Thr His Thr Gly Pro Lys Gly Val Ile Asn
50 55 60
Asp Trp Arg Lys Phe Lys Leu Glu Ser Gln Asp Ser Asp Ser Ile Pro
65 70 75 80
Pro Ser Lys Lys Glu Ile Leu Arg Gln Met Ser Ser Pro Gln Ser Arg
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Gly Pro Arg Tyr Gly Phe Val Tyr Glu Leu Glu Thr Gly Lys Gln Phe
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Leu Glu Thr Ile Glu Lys Glu Leu Lys Ile Thr Thr Ile Val Val His
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Ile Tyr Glu Asp Gly Ile Lys Gly Cys Asp Ala Leu Asn Ser Ser Leu
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Thr Cys Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ile Val Lys Phe Cys Lys Ile Lys
195 200 205
Ala Ser Asn Thr Gly Ala Gly Asp Arg Phe Ser Leu Asp Val Leu Pro
210 215 220
Thr Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Gly Glu Leu Ile Ser Asn Phe Ile Ser
225 230 235 240
Val Ala Glu Gln Phe Ala Glu Glu Phe Phe Ala Gly Asp Val Glu Ser
245 250 255
Phe Leu Asn Glu Tyr Gly Leu Leu Pro Glu Arg Glu Val His Val Leu
260 265 270
Glu His Thr Lys Ile Glu Glu Glu Asp Val Glu
275 280
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<211>194
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>17
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1 5 10 15
Ser Arg Lys Met Ser Ile Gln Glu Tyr Glu Leu Ile His Lys Glu Lys
20 25 30
Glu Asp Glu Asn Cys Leu Arg Lys Tyr Arg Arg Gln Cys Met Gln Asp
35 40 45
Met His Gln Lys Leu Ser Phe Gly Pro Arg Tyr Gly Phe Val Tyr Glu
50 55 60
Leu Glu Thr Gly Lys Gln Phe Leu Glu Thr Ile Glu Lys Glu Leu Lys
65 70 75 80
Ile Thr Thr Ile Val Val His Ile Tyr Glu Asp Gly Ile Lys Gly Cys
85 90 95
Asp Ala Leu Asn Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ile
100 105 110
Val Lys Phe Cys Lys Ile Lys Ala Ser Asn Thr Gly Ala Gly Asp Arg
115 120 125
Phe Ser Leu Asp Val Leu Pro Thr Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Gly Glu
130 135 140
Leu Ile Ser Asn Phe Ile Ser Val Ala Glu Gln Phe Ala Glu Glu Phe
145 150 155 160
Phe Ala Gly Asp Val Glu Ser Phe Leu Asn Glu Tyr Gly Leu Leu Pro
165 170 175
Glu Arg Glu Val His Val Leu Glu His Thr Lys Ile Glu Glu Glu Asp
180 185 190
Val Glu
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<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>18
Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala Val
1 5 10 15
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20 25 30
Trp Thr Ser Arg Trp Ile Glu Ser Lys His Lys Ser Asp Phe Gly Lys
35 40 45
Phe Val Leu Ser Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Asp Glu Glu Lys Asp Lys
50 55 60
Gly Leu Gln Thr Ser Gln Asp Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ser
65 70 75 80
Phe Glu Pro Phe Ser Asn Lys Gly Gln Thr Leu Val Val Gln Phe Thr
85 90 95
Val Lys His Glu Gln Asn Ile Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys Leu
100 105 110
Phe Pro Asn Ser Leu Asp Gln Thr Asp Met His Gly Asp Ser Glu Tyr
115 120 125
Asn Ile Met Phe Gly Pro Asp Ile Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys Val
130 135 140
His Val Ile Phe Asn Tyr Lys Gly Lys Asn Val Leu Ile Asn Lys Asp
145 150 155 160
Ile Arg Cys Lys Asp Asp Glu Phe Thr His Leu Tyr Thr Leu Ile Val
165 170 175
Arg Pro Asp Asn Thr Tyr Glu Val Lys Ile Asp Asn Ser Gln Val Glu
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Ser Gly Ser Leu Glu Asp Asp Trp Asp Phe Leu Pro Pro Lys Lys Ile
195 200 205
Lys Asp Pro Asp Ala Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Arg Ala Lys
210 215 220
Ile Asp Asp Pro Thr Asp Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Lys Pro Glu
225 230 235 240
His Ile Pro Asp Pro Asp Ala Lys Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Glu
245 250 255
Met Asp Gly Glu Trp Glu Pro Pro Val Ile Gln Asn Pro Glu Tyr Lys
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Ile Tyr Ala Tyr Asp Asn Phe Gly Val Leu Gly Leu Asp Leu Trp Gln
305 310 315 320
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325 330 335
Ala Tyr Ala Glu Glu Phe Gly Asn Glu Thr Trp Gly Val Thr Lys Ala
340 345 350
Ala Glu Lys Gln Met Lys Asp Lys Gln Asp Glu Glu Gln Arg Leu Lys
355 360 365
Glu Glu Glu Glu Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Glu Glu Ala Glu Asp
370 375 380
Lys Glu Asp Asp Glu Asp Lys Asp Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Asp
385 390 395 400
Lys Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Val Pro Gly Gln Ala Lys Asp Glu
405 410 415
Leu
<210>19
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<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>19
Met Arg Val Gly Pro Val Arg Ser Ala Met Ser Gly Ala Ser Gln Pro
1 5 10 15
Arg Gly Pro Ala Leu Leu Phe Pro Ala Thr Arg Gly Val Pro Ala Lys
20 25 30
Arg Leu Leu Asp Ala Asp Asp Ala Ala Ala Val Ala Ala Lys Cys Pro
35 40 45
Arg Leu Ser Glu Cys Ser Ser Pro Pro Asp Tyr Leu Ser Pro Pro Gly
50 55 60
Ser Pro Cys Ser Pro Gln Pro Pro Pro Ala Ala Pro Gly Ala Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Gly Ser Ala Pro Gly Pro Ser Arg Ile Ala Asp Tyr Leu Leu
85 90 95
Leu Pro Leu Ala Glu Arg Glu His Val Ser Arg Ala Leu Cys Ile His
100 105 110
Thr Gly Arg Glu Leu Arg Cys Lys Val Phe Pro Ile Lys His Tyr Gln
115 120 125
Asp Lys Ile Arg Pro Tyr Ile Gln Leu Pro Ser His Ser Asn Ile Thr
130 135 140
Gly Ile Val Glu Val Ile Leu Gly Glu Thr Lys Ala Tyr Val Phe Phe
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Glu Lys Asp Phe Gly Asp Met His Ser Tyr Val Arg Ser Arg Lys Arg
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Leu Arg Glu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Phe Lys Gln Ile Val Ser Ala
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Val Ala His Cys His Gln Ser Ala Ile Val Leu Gly Asp Leu Lys Leu
195 200 205
Arg Lys Phe Val Phe Ser Thr Glu Glu Arg Thr Gln Leu Arg Leu Glu
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Ser Leu Glu Asp Thr His Ile Met Lys Gly Glu Asp Asp Ala Leu Ser
225 230 235 240
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245 250 255
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275 280 285
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340 345 350
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355 360 365
Ser Phe Phe Cys
370
<210>20
<211>352
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>20
Met Glu Gly Ile Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Glu Met
1 5 10 15
Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu
20 25 30
Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu Pro Thr Ile Tyr Ser Ile Ile
35 40 45
Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu Val Ile Leu Val Met Gly
50 55 60
Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp Lys Tyr Arg Leu His Leu
65 70 75 80
Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val
85 90 95
Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly Asn Phe Leu Cys Lys Ala Val
100 105 110
His Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser Ser Val Leu Ile Leu Ala
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130 135 140
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Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln His Ile Met Val Gly Leu
195 200 205
Ile Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser Cys Tyr Cys Ile Ile Ile Ser
210 215 220
Lys Leu Ser His Ser Lys Gly His Gln Lys Arg Lys Ala Leu Lys Thr
225 230 235 240
Thr Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe Ala Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr
245 250 255
Ile Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile Leu Leu Glu Ile Ile Lys Gln
260 265 270
Gly Cys Glu Phe Glu Asn Thr Val His Lys Trp Ile Ser Ile Thr Glu
275 280 285
Ala Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Phe
290 295 300
Leu Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala Gln His Ala Leu Thr Ser Val
305 310 315 320
Ser Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ile Leu Ser Lys Gly Lys Arg Gly Gly
325 330 335
His Ser Ser Val Ser Thr Glu Ser Glu Ser Ser Ser Phe His Ser Ser
340 345 350
<210>21
<211>638
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>21
Met Asp Leu Trp Gln Leu Leu Leu Thr Leu Ala Leu Ala Gly Ser Ser
1 5 10 15
Asp Ala Phe Ser Gly Ser Glu Ala Thr Ala Ala Ile Leu Ser Arg Ala
20 25 30
Pro Trp Ser Leu Gln Ser Val Asn Pro Gly Leu Lys Thr Asn Ser Ser
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Lys Glu Pro Lys Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg Glu Thr Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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Pro Ile Leu Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val Asp Lys
210 215 220
Glu Tyr Glu Val Arg Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn Ser Gly Asn Tyr
225 230 235 240
Gly Glu Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met Ser Gln
245 250 255
Phe Thr Cys Glu Glu Asp Phe Tyr Phe Pro Trp Leu Leu Ile Ile Ile
260 265 270
Phe Gly Ile Phe Gly Leu Thr Val Met Leu Phe Val Phe Leu Phe Ser
275 280 285
Lys Gln Gln Arg Ile Lys Met Leu Ile Leu Pro Pro Val Pro Val Pro
290 295 300
Lys Ile Lys Gly Ile Asp Pro Asp Leu Leu Lys Glu Gly Lys Leu Glu
305 310 315 320
Glu Val Asn Thr Ile Leu Ala Ile His Asp Ser Tyr Lys Pro Glu Phe
325 330 335
His Ser Asp Asp Ser Trp Val Glu Phe Ile Glu Leu Asp Ile Asp Glu
340 345 350
Pro Asp Glu Lys Thr Glu Glu Ser Asp Thr Asp Arg Leu Leu Ser Ser
355 360 365
Asp His Glu Lys Ser His Ser Asn Leu Gly Val Lys Asp Gly Asp Ser
370 375 380
Gly Arg Thr Ser Cys Cys Glu Pro Asp Ile Leu Glu Thr Asp Phe Asn
385 390 395 400
Ala Asn Asp Ile His Glu Gly Thr Ser Glu Val Ala Gln Pro Gln Arg
405 410 415
Leu Lys Gly Glu Ala Asp Leu Leu Cys Leu Asp Gln Lys Asn Gln Asn
420 425 430
Asn Ser Pro Tyr His Asp Ala Cys Pro Ala Thr Gln Gln Pro Ser Val
435 440 445
Ile Gln Ala Glu Lys Asn Lys Pro Gln Pro Leu Pro Thr Glu Gly Ala
450 455 460
Glu Ser Thr His Gln Ala Ala His Ile Gln Leu Ser Asn Pro Ser Ser
465 470 475 480
Leu Ser Asn Ile Asp Phe Tyr Ala Gln Val Ser Asp Ile Thr Pro Ala
485 490 495
Gly Ser Val Val Leu Ser Pro Gly Gln Lys Asn Lys Ala Gly Met Ser
500 505 510
Gln Cys Asp Met His Pro Glu Met Val Ser Leu Cys Gln Glu Asn Phe
515 520 525
Leu Met Asp Asn Ala Tyr Phe Cys Glu Ala Asp Ala Lys Lys Cys Ile
530 535 540
Pro Val Ala Pro His Ile Lys Val Glu Ser His Ile Gln Pro Ser Leu
545 550 555 560
Asn Gln Glu Asp Ile Tyr Ile Thr Thr Glu Ser Leu Thr Thr Ala Ala
565 570 575
Gly Arg Pro Gly Thr Gly Glu His Val Pro Gly Ser Glu Met Pro Val
580 585 590
Pro Asp Tyr Thr Ser Ile His Ile Val Gln Ser Pro Gln Gly Leu Ile
595 600 605
Leu Asn Ala Thr Ala Leu Pro Leu Pro Asp Lys Glu Phe Leu Ser Ser
610 615 620
Cys Gly Tyr Val Ser Thr Asp Gln Leu Asn Lys Ile Met Pro
625 630 635
<210>22
<211>208
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>22
Met Lys Leu Leu Pro Ser Val Val Leu Lys Leu Phe Leu Ala Ala Val
1 5 10 15
Leu Ser Ala Leu Val Thr Gly Glu Ser Leu Glu Arg Leu Arg Arg Gly
20 25 30
Leu Ala Ala Gly Thr Ser Asn Pro Asp Pro Pro Thr Val Ser Thr Asp
35 40 45
Gln Leu Leu Pro Leu Gly Gly Gly Arg Asp Arg Lys Val Arg Asp Leu
50 55 60
Gln Glu Ala Asp Leu Asp Leu Leu Arg Val Thr Leu Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Gln Ala Leu Ala Thr Pro Asn Lys Glu Glu His Gly Lys Arg Lys Lys
85 90 95
Lys Gly Lys Gly Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro Cys Leu Arg Lys Tyr
100 105 110
Lys Asp Phe Cys Ile His Gly Glu Cys Lys Tyr Val Lys Glu Leu Arg
115 120 125
Ala Pro Ser Cys Ile Cys His Pro Gly Tyr His Gly Glu Arg Cys His
130 135 140
Gly Leu Ser Leu Pro Val Glu Asn Arg Leu Tyr Thr Tyr Asp His Thr
145 150 155 160
Thr Ile Leu Ala Val Val Ala Val Val Leu Ser Ser Val Cys Leu Leu
165 170 175
Val Ile Val Gly Leu Leu Met Phe Arg Tyr His Arg Arg Gly Gly Tyr
180 185 190
Asp Val Glu Asn Glu Glu Lys Val Lys Leu Gly Met Thr Asn Ser His
195 200 205
<210>23
<211>441
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>23
Met Val Pro Pro Lys Leu His Val Leu Phe Cys Leu Cys Gly Cys Leu
1 5 10 15
Ala Val Val Tyr Pro Phe Asp Trp Gln Tyr Ile Asn Pro Val Ala His
20 25 30
Met Lys Ser Ser Ala Trp Val Asn Lys Ile Gln Val Leu Met Ala Ala
35 40 45
Ala Ser Phe Gly Gln Thr Lys Ile Pro Arg Gly Asn Gly Pro Tyr Ser
50 55 60
Val Gly Cys Thr Asp Leu Met Phe Asp His Thr Asn Lys Gly Thr Phe
65 70 75 80
Leu Arg Leu Tyr Tyr Pro Ser Gln Asp Asn Asp Arg Leu Asp Thr Leu
85 90 95
Trp Ile Pro Asn Lys Glu Tyr Phe Trp Gly Leu Ser Lys Phe Leu Gly
100 105 110
Thr His Trp Leu Met Gly Asn Ile Leu Arg Leu Leu Phe Gly Ser Met
115 120 125
Thr Thr Pro Ala Asn Trp Asn Ser Pro Leu Arg Pro Gly Glu Lys Tyr
130 135 140
Pro Leu Val Val Phe Ser His Gly Leu Gly Ala Phe Arg Thr Leu Tyr
145 150 155 160
Ser Ala Ile Gly Ile Asp Leu Ala Ser His Gly Phe Ile Val Ala Ala
165 170 175
Val Glu His Arg Asp Arg Ser Ala Ser Ala Thr Tyr Tyr Phe Lys Asp
180 185 190
Gln Ser Ala Ala Glu Ile Gly Asp Lys Ser Trp Leu Tyr Leu Arg Thr
195 200 205
Leu Lys Gln Glu Glu Glu Thr His Ile Arg Asn Glu Gln Val Arg Gln
210 215 220
Arg Ala Lys Glu Cys Ser Gln Ala Leu Ser Leu Ile Leu Asp Ile Asp
225 230 235 240
His Gly Lys Pro Val Lys Asn Ala Leu Asp Leu Lys Phe Asp Met Glu
245 250 255
Gln Leu Lys Asp Ser Ile Asp Arg Glu Lys Ile Ala Val Ile Gly His
260 265 270
Ser Phe Gly Gly Ala Thr Val Ile Gln Thr Leu Ser Glu Asp Gln Arg
275 280 285
Phe Arg Cys Gly Ile Ala Leu Asp Ala Trp Met Phe Pro Leu Gly Asp
290 295 300
Glu Val Tyr Ser Arg Ile Pro Gin Pro Leu Phe Phe Ile Asn Ser Glu
305 310 315 320
Tyr Phe Gln Tyr Pro Ala Asn Ile Ile Lys Met Lys Lys Cys Tyr Ser
325 330 335
Pro Asp Lys Glu Arg Lys Met Ile Thr Ile Arg Gly Ser Val His Gln
340 345 350
Asn Phe Ala Asp Phe Thr Phe Ala Thr Gly Lys Ile Ile Gly His Met
355 360 365
Leu Lys Leu Lys Gly Asp Ile Asp Ser Asn Val Ala Ile Asp Leu Ser
370 375 380
Asn Lys Ala Ser Leu Ala Phe Leu Gln Lys His Leu Gly Leu His Lys
385 390 395 400
Asp Phe Asp Gln Trp Asp Cys Leu Ile Glu Gly Asp Asp Glu Asn Leu
405 410 415
Ile Pro Gly Thr Asn Ile Asn Thr Thr Asn Gln His Ile Met Leu Gln
420 425 430
Asn Ser Ser Gly Ile Glu Lys Tyr Asn
435 440
<210>24
<211>171
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>24
Met Ala Lys Phe Val Ile Arg Pro Ala Thr Ala Ala Asp Cys Ser Asp
1 5 10 15
Ile Leu Arg Leu Ile Lys Glu Leu Ala Lys Tyr Glu Tyr Met Glu Glu
20 25 30
Gln Val Ile Leu Thr Glu Lys Asp Leu Leu Glu Asp Gly Phe Gly Glu
35 40 45
His Pro Phe Tyr His Cys Leu Val Ala Glu Val Pro Lys Glu His Trp
50 55 60
Thr Pro Glu Gly His Ser Ile Val Gly Phe Ala Met Tyr Tyr Phe Thr
65 70 75 80
Tyr Asp Pro Trp Ile Gly Lys Leu Leu Tyr Leu Glu Asp Phe Phe Val
85 90 95
Met Ser Asp Tyr Arg Gly Phe Gly Ile Gly Ser Glu Ile Leu Lys Asn
100 105 110
Leu Ser Gln Val Ala Met Arg Cys Arg Cys Ser Ser Met His Phe Leu
115 120 125
Val Ala Glu Trp Asn Glu Pro Ser Ile Asn Phe Tyr Lys Arg Arg Gly
130 135 140
Ala Ser Asp Leu Ser Ser Glu Glu Gly Trp Arg Leu Phe Lys Ile Asp
145 150 155 160
Lys Glu Tyr Leu Leu Lys Met Ala Thr Glu Glu
165 170
<210>25
<211>394
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>25
Met Ala Leu Leu Asp Leu Ala Leu Glu Gly Met Ala Val Phe Gly Phe
1 5 10 15
Val Leu Phe Leu Val Leu Trp Leu Met His Phe Met Ala Ile Ile Tyr
20 25 30
Thr Arg Leu His Leu Asn Lys Lys Ala Thr Asp Lys Gln Pro Tyr Ser
35 40 45
Lys Leu Pro Gly Val Ser Leu Leu Lys Pro Leu Lys Gly Val Asp Pro
50 55 60
Asn Leu Ile Asn Asn Leu Glu Thr Phe Phe Glu Leu Asp Tyr Pro Lys
65 70 75 80
Tyr Glu Val Leu Leu Cys Val Gln Asp His Asp Asp Pro Ala Ile Asp
85 90 95
Val Cys Lys Lys Leu Leu Gly Lys Tyr Pro Asn Val Asp Ala Arg Leu
100 105 110
Phe Ile Gly Gly Lys Lys Val Gly Ile Asn Pro Lys Ile Asn Asn Leu
115 120 125
Met Pro Gly Tyr Glu Val Ala Lys Tyr Asp Leu Ile Trp Ile Cys Asp
130 135 140
Ser Gly Ile Arg Val Ile Pro Asp Thr Leu Thr Asp Met Val Asn Gln
145 150 155 160
Met Thr Glu Lys Val Gly Leu Val His Gly Leu Pro Tyr Val Ala Asp
165 170 175
Arg Gln Gly Phe Ala Ala Thr Leu Glu Gln Val Tyr Phe Gly Thr Ser
180 185 190
His Pro Arg Tyr Tyr Ile Ser Ala Asn Val Thr Gly Phe Lys Cys Val
195 200 205
Thr Gly Met Ser Cys Leu Met Arg Lys Asp Val Leu Asp Gln Ala Gly
210 215 220
Gly Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Ile Ala Glu Asp Tyr Phe Met Ala
225 230 235 240
Lys Ala Ile Ala Asp Arg Gly Trp Arg Phe Ala Met Ser Thr Gln Val
245 250 255
Ala Met Gln Ash Ser Gly Ser Tyr Ser Ile Ser Gln Phe Gln Ser Arg
260 265 270
Met Ile Arg Trp Thr Lys Leu Arg Ile Asn Met Leu Pro Ala Thr Ile
275 280 285
Ile Cys Glu Pro Ile Ser Glu Cys Phe Val Ala Ser Leu Ile Ile Gly
290 295 300
Trp Ala Ala His His Val Phe Arg Trp Asp Ile Met Val Phe Phe Met
305 310 315 320
Cys His Cys Leu Ala Trp Phe Ile Phe Asp Tyr Ile Gln Leu Arg Gly
325 330 335
Val Gln Gly Gly Thr Leu Cys Phe Ser Lys Leu Asp Tyr Ala Val Ala
340 345 350
Trp Phe Ile Arg Glu Ser Met Thr Ile Tyr Ile Phe Leu Ser Ala Leu
355 360 365
Trp Asp Pro Thr Ile Ser Trp Arg Thr Gly Arg Tyr Arg Leu Arg Cys
370 375 380
Gly G1y Thr Ala Glu Glu Ile Leu Asp Val
385 390
權(quán)利要求書
(按照條約第19條的修改)
1.一種調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的方法，所述方法包括改變內(nèi)皮細(xì)胞中LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平的步驟，所述LPSS多肽具有與SEQID NO22、1-21和23-25所示的一種氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的方法，其中LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平通過調(diào)節(jié)編碼該多肽的核苷酸序列的表達(dá)水平而改變。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中內(nèi)皮細(xì)胞通透性通過增加LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平而降低，所述LPSS多肽具有與選自SEQ ID NO2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示的氨基酸序列組成的一組中的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平通過將一種表達(dá)載體導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞而增加，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽的核苷酸序列，且所述核苷酸序列在能驅(qū)動該核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中內(nèi)皮細(xì)胞的通透性通過降低LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平而降低，所述LPSS多肽具有與選自SEQ IDNO22、1、5、12、13、14、15、16、17、18和21所示的氨基酸序列組成的一組中的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求5的方法，其中多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平通過將一種表達(dá)載體導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞而降低，其中所述表達(dá)載體包含能抑制編碼所述多肽的核苷酸序列表達(dá)的反義核苷酸序列，且所述反義核苷酸序列在能驅(qū)動反義核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
7.權(quán)利要求1或2的方法，其中內(nèi)皮細(xì)胞的通透性通過增加LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平而增加，所述LPSS多肽具有與選自SEQ IDNO22、1、5、12、13、14、15、16、17、18和21所示氨基酸序列組成的一組中的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求7的方法，其中LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平通過將一種表達(dá)載體導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞而增加，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽的核苷酸序列，且所述核苷酸序列在能驅(qū)動該核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
9.權(quán)利要求1或2的方法，其中內(nèi)皮細(xì)胞通透性通過降低LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平而增加，所述LPSS多肽具有與選自SEQ ID NO2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示氨基酸序列組成的一組中的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求9的方法，其中LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平通過將一種表達(dá)載體導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞中而降低，所述表達(dá)載體包含能抑制編碼所述多肽的核苷酸序列表達(dá)的反義核苷酸序列，且所述反義核苷酸序列在能驅(qū)動該反義核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法，其中內(nèi)皮細(xì)胞是微血管細(xì)胞，優(yōu)選是腦微血管細(xì)胞。
12.一種治療或預(yù)防患者微血管通透性修飾失調(diào)的方法，所述方法包括藥理學(xué)改變患者微血管內(nèi)皮細(xì)胞中一種多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平，所述多肽具有與SEQ ID NO22、1-21和23-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的一種氨基酸序列，所述改變足以降低微血管通透性修飾失調(diào)的癥狀。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述方法包括給予患者治療有效量的一種藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含具有與SEQ ID NO22、1-21和23-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的多肽，或者包含編碼該多肽的核苷酸序列的核酸分子。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述多肽是LPSS多肽，其具有與選自SEQ ID NO2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示氨基酸序列組成的一組中的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求13或14的方法，其中所述核酸分子是一種基因治療載體，其中所述核苷酸序列在能驅(qū)動所述核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)選在微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述方法包括給予患者治療有效量的一種藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含LPSS多肽的一種拮抗劑，所述LPSS多肽具有與選自SEQ ID NO22、1、5、12、13、14、15、16、17、18和21所示氨基酸序列組成的一組中的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，其中優(yōu)選所述拮抗劑是該多肽的抗體。
17.權(quán)利要求12的方法，其中所述方法包括給予患者治療有效量的包含一種基因治療載體的藥物組合物的步驟，其中所述基因治療載體包含能抑制編碼LPSS多肽的核苷酸序列表達(dá)的一種反義核苷酸序列，所述LPSS多肽具有與選自SEQ ID NO22、1、5、12、13、14、15、16、17、18和21所示氨基酸序列組成的一組中的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，且其中所述反義核苷酸序列在能驅(qū)動該反義核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)選微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
18.權(quán)利要求12-17任一項(xiàng)的方法，其中微血管通透性失調(diào)選自神經(jīng)退行性疾病，如腦血管意外(CVA)、阿爾茨海默病(AD)、血管相關(guān)性癡呆、克雅氏病(CJD)、牛海綿狀腦病(BSE)、帕金森病(PD)、腦外傷、多發(fā)性硬化(MS)、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(ALS)、杭廷頓氏舞蹈癥；具有CNS成分的外周失調(diào)，如敗血癥休克、肝性腦病、(糖尿病性)高血壓、糖尿病微血管病變、昏睡病、惠普耳病、杜興氏肌營養(yǎng)不良(DMD)、天冬氨酰葡糖胺尿癥、膽固醇酯貯積病、沃耳曼病、胱氨酸過多癥、Danon病、法布萊氏病、法伯脂肪性肉芽腫病、法伯病、巖藻糖代謝病、半乳糖唾液酸沉積癥I/II型、Gaucher病I/II/III型、Gaucher病、球樣細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、克臘比病、糖原貯積病II、龐帕氏病、GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥I/II/III型、GM2-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥I型、泰薩二氏病、GM2-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥II型、山霍夫氏病、GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥、α-甘露糖苷過多癥I/II型、甘露糖苷過多癥、異染色性腦白質(zhì)障礙癥、粘脂糖癥I型、唾液酸沉積癥1/11型粘脂糖癥11/111型1-細(xì)胞病、粘脂糖癥IIIC型假赫爾勒多種營養(yǎng)不良、粘多糖代謝病I型、粘多糖代謝病II型、亨特氏綜合征、粘多糖代謝病IIIA型、山菲立普綜合征、粘多糖代謝病IIIB型、粘多糖代謝病IIIC型、粘多糖代謝病IIID型、粘多糖代謝病IVA型、莫爾基奧綜合征、粘多糖代謝病IVB型莫爾基奧綜合征、粘多糖代謝病VI型、粘多糖代謝病VII型、斯利綜合征、粘多糖代謝病IX型、多種硫酸酯酶缺陷、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥、CLN1巴騰病、尼皮二氏病A/B型、尼皮二氏病、尼皮二氏病C1型、尼皮二氏病C2型、致密性成骨不全癥、欣德勒病VII型、欣德勒病及唾液酸貯積癥病、(先兆)子癇；神經(jīng)精神失調(diào)，如抑郁癥、孤獨(dú)癥、焦慮性注意缺陷多動障礙(ADHD)、神經(jīng)精神性系統(tǒng)性紅斑狼瘡、雙相性精神障礙、精神分裂癥及其它精神??；其它CNS失調(diào)，如腦瘤、癲癇、偏頭痛、發(fā)作性睡病、失眠癥、慢性疲勞綜合征、高山病、腦炎、腦膜炎、AIDS相關(guān)性癡呆；及血管發(fā)生相關(guān)失調(diào)，如血管腫瘤、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、動脈粥樣硬化、卵巢過度刺激、牛皮癬、新血管化相關(guān)子宮內(nèi)膜異位癥、球囊血管成形術(shù)后再狹窄、疤痕組織過度增生、外周血管病、高血壓、炎癥性血管炎、雷諾氏病、雷諾氏現(xiàn)象、動脈瘤、動脈再狹窄、血栓性靜脈炎、淋巴管炎、淋巴水腫、創(chuàng)傷愈合及組織修復(fù)、缺血性再灌注損傷、心絞痛、心肌梗塞、慢性心臟病、心力衰竭如充血性心力衰竭、年齡相關(guān)性黃斑變性及骨質(zhì)疏松癥。
19.一種可逆性增加患者微血管通透性的方法，所述方法包括給予患者有效增加微血管通透性的量的一種藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含具有與SEQ ID NO22、1-21和23-25所示的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的多肽，或者包含編碼該多肽的核苷酸序列的核酸分子。
20.權(quán)利要求19的方法，其中LPSS多肽是具有與選自SEQ ID NO22、1、5、12、13、14、15、16、17、18和21所示氨基酸序列組成的一組中的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的一種多肽。
21.權(quán)利要求19或20的方法，其中所述核酸分子是一種基因治療載體，其中所述核苷酸序列在能驅(qū)動該核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)選微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
22.權(quán)利要求19的方法，所述方法包括給予患者治療有效量的一種藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含LPSS多肽的一種拮抗劑，LPSS多肽具有與選自SEQ ID NO2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示氨基酸序列組成的一組中的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，所述拮抗劑優(yōu)選是該多肽的抗體。
23.權(quán)利要求19的方法，所述方法包括給予患者治療有效量的包含一種基因治療載體的一種藥物組合物的步驟，所述基因治療載體包含能抑制編碼LPSS多肽的核苷酸序列表達(dá)的一種反義核苷酸序列，LPSS多肽具有與選自SEQ ID NO2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示氨基酸序列組成的一組中的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，且所述反義核苷酸序列在能驅(qū)動反義核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞、優(yōu)選微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
24.一種通過給予患有CNS或微血管失調(diào)或處于CNS或微血管失調(diào)危險(xiǎn)中的患者一種治療劑或診斷劑而治療或診斷CNS或微血管失調(diào)的方法，所述治療劑或診斷劑或其藥物可接受的載體與一種靶向劑綴合，所述靶向劑是與LPSS多肽特異性結(jié)合的一種制劑，LPSS多肽具有與SEQ ID NO22、1-21和23-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述LPSS多肽具有與SEQ ID NO22、1、5、12、13、14、15、16、17、18、19、21、23-25所示的一種氨基酸序列、優(yōu)選與SEQ ID NO22或21所示的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。
26.一種診斷患者微血管通透性狀態(tài)的方法，所述方法包括如下步驟
(a)確定患者微血管內(nèi)皮中編碼LPSS多肽的核酸序列的表達(dá)水平，LPSS多肽具有與SEQ ID NO22、1-21和23-25所示的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列；及
(b)將該核酸序列的表達(dá)水平與核酸序列表達(dá)水平的參考值相對比，參考值優(yōu)選是在健康個(gè)體的微血管內(nèi)皮中表達(dá)水平的平均值。
27.權(quán)利要求26的方法，其中核酸序列的表達(dá)水平通過確定該核酸序列編碼的LPSS多肽的量而間接確定。
28.權(quán)利要求26或27的方法，其中對比一種以上的核酸序列的表達(dá)水平。
29.權(quán)利要求26-28任一項(xiàng)的方法，其中表達(dá)水平是在得自患者的樣品中離體確定的。
30.權(quán)利要求26-29任一項(xiàng)的方法，其中所述方法是診斷微血管通透性失調(diào)或診斷對微血管通透性失調(diào)易感性的一種方法。
31.權(quán)利要求30的方法，其中微血管通透性失調(diào)選自神經(jīng)退行性疾病，如腦血管意外(CVA)、阿爾茨海默病(AD)、血管相關(guān)性癡呆、克雅氏病(CJD)、牛海綿狀腦病(BSE)、帕金森病(PD)、腦外傷、多發(fā)性硬化(MS)、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(ALS)、杭廷頓氏舞蹈癥；具有CNS成分的外周失調(diào)，如敗血癥休克、肝性腦病、(糖尿病性)高血壓、糖尿病微血管病變、昏睡病、惠普耳病、杜興氏肌營養(yǎng)不良(DMD)、天冬氨酰葡糖胺尿癥、膽固醇酯貯積病、沃耳曼病、胱氨酸過多癥、Danon病、法布萊氏病、法伯脂肪性肉芽腫病、法伯病、巖藻糖代謝病、半乳糖唾液酸沉積癥I/II型、Gaucher病I/II/III型、Gaucher病、球樣細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、克臘比病、糖原貯積病II、龐帕氏病、GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥I/II/III型、GM2-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥I型、泰薩二氏病、GM2-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥II型、山霍夫氏病、GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥、α-甘露糖苷過多癥I/II型、甘露糖苷過多癥、異染色性腦白質(zhì)障礙癥、粘脂糖癥I型、唾液酸沉積癥1/11型粘脂糖癥11/111型1-細(xì)胞病、粘脂糖癥IIIC型假赫爾勒多種營養(yǎng)不良、粘多糖代謝病I型、粘多糖代謝病II型、亨特氏綜合征、粘多糖代謝病IIIA型、山菲立普綜合征、粘多糖代謝病IIIB型、粘多糖代謝病IIIC型、粘多糖代謝病IIID型、粘多糖代謝病IVA型、莫爾基奧綜合征、粘多糖代謝病IVB型莫爾基奧綜合征、粘多糖代謝病VI型、粘多糖代謝病VII型、斯利綜合征、粘多糖代謝病IX型、多種硫酸酯酶缺陷、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥、CLN1巴騰病、尼皮二氏病A/B型、尼皮二氏病、尼皮二氏病C1型、尼皮二氏病C2型、致密性成骨不全癥、欣德勒病VII型、欣德勒病及唾液酸貯積癥病、(先兆)子癇；神經(jīng)精神失調(diào)，如抑郁癥、孤獨(dú)癥、焦慮性注意缺陷多動障礙(ADHD)、神經(jīng)精神性系統(tǒng)性紅斑狼瘡、雙相性精神障礙、精神分裂癥及其它精神??；其它CNS失調(diào)，如腦瘤、癲癇、偏頭痛、發(fā)作性睡病、失眠癥、慢性疲勞綜合征、高山病、腦炎、腦膜炎、AIDS相關(guān)性癡呆；及血管發(fā)生相關(guān)失調(diào)，如血管腫瘤、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、動脈粥樣硬化、卵巢過度刺激、牛皮癬、新血管化相關(guān)子宮內(nèi)膜異位癥、球囊血管成形術(shù)后再狹窄、疤痕組織過度增生、外周血管病、高血壓、炎癥性血管炎、雷諾氏病、雷諾氏現(xiàn)象、動脈瘤、動脈再狹窄、血栓性靜脈炎、淋巴管炎、淋巴水腫、創(chuàng)傷愈合及組織修復(fù)、缺血性再灌注損傷、心絞痛、心肌梗塞、慢性心臟病、心力衰竭如充血性心力衰竭、年齡相關(guān)性黃斑變性及骨質(zhì)疏松癥。
32.權(quán)利要求26-29任一項(xiàng)的方法，其中所述方法是評定恢復(fù)微血管通透性的治療效力的一種方法。
33.一種鑒別能調(diào)節(jié)微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的物質(zhì)的方法，所述方法包括如下步驟
(a)提供能表達(dá)一或多種編碼LPSS多肽的核酸序列的測試細(xì)胞群，所述LPSS多肽具有與SEQ ID NO22、1-21和23-25所示的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列；
(b)將測試細(xì)胞群與所述物質(zhì)接觸；
(c)確定編碼多肽的核酸序列在與所述物質(zhì)接觸的測試細(xì)胞群中的表達(dá)水平，所述多肽具有與SEQ ID NO22、1-21和23-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列；
(d)將該核酸序列的表達(dá)水平與在未與所述物質(zhì)接觸的測試細(xì)胞群中該核酸序列的表達(dá)水平相對比；及
(e)鑒別導(dǎo)致在與所述物質(zhì)接觸的測試細(xì)胞群與未與所述物質(zhì)接觸的測試細(xì)胞群之間所述核酸序列表達(dá)水平不同的物質(zhì)。
34.權(quán)利要求33的方法，其中核酸序列的表達(dá)水平通過確定該核酸序列編碼的LPSS多肽的量而間接確定。
35.權(quán)利要求33或34的方法，其中對比一種以上的核酸序列的表達(dá)水平。
36.權(quán)利要求33-35任一項(xiàng)的方法，其中測試細(xì)胞群包含內(nèi)皮細(xì)胞，優(yōu)選血管內(nèi)皮細(xì)胞，更優(yōu)選微血管內(nèi)皮細(xì)胞，最優(yōu)選腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
37.權(quán)利要求33-36任一項(xiàng)的方法，其中測試細(xì)胞群包含哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選人細(xì)胞。
38.權(quán)利要求33-37任一項(xiàng)的方法，其中與所述物質(zhì)接觸的測試細(xì)胞群和未與所述物質(zhì)接觸的測試細(xì)胞群均衍生自一種細(xì)胞群，優(yōu)選衍生自一種細(xì)胞系，更優(yōu)選衍生自一個(gè)細(xì)胞。
39.權(quán)利要求33-38任一項(xiàng)的方法，其中測試細(xì)胞群與一種輔助細(xì)胞群共培養(yǎng)，其中所述測試細(xì)胞群在濾膜的一側(cè)培養(yǎng)，輔助細(xì)胞群在濾膜的另一側(cè)培養(yǎng)，且所述輔助細(xì)胞群優(yōu)選包含星形膠質(zhì)細(xì)胞。
40.根據(jù)權(quán)利要求33-39任一項(xiàng)的方法鑒別的一種物質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的方法，所述方法包括改變內(nèi)皮細(xì)胞中LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平的步驟，所述LPSS多肽具有與SEQID NO1-25所示的一種氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的方法，其中LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平通過調(diào)節(jié)編碼該多肽的核苷酸序列的表達(dá)水平而改變。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中內(nèi)皮細(xì)胞通透性通過增加LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平而降低，所述LPSS多肽具有與選自SEQ ID NO2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示的氨基酸序列組成的一組中的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平通過將一種表達(dá)載體導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞而增加，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽的核苷酸序列，且所述核苷酸序列在能驅(qū)動該核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中內(nèi)皮細(xì)胞的通透性通過降低LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平而降低，所述LPSS多肽具有與選自SEQ IDNO1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示的氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求5的方法，其中多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平通過將一種表達(dá)載體導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞而降低，其中所述表達(dá)載體包含能抑制編碼所述多肽的核苷酸序列表達(dá)的反義核苷酸序列，且所述反義核苷酸序列在能驅(qū)動該反義核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
7.權(quán)利要求1或2的方法，其中內(nèi)皮細(xì)胞的通透性通過增加LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平而增加，所述LPSS多肽具有與選自SEQ IDNO1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求7的方法，其中LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平通過將一種表達(dá)載體導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞而增加，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽的核苷酸序列，且所述核苷酸序列在能驅(qū)動該核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
9.權(quán)利要求1或2的方法，其中內(nèi)皮細(xì)胞通透性通過降低LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平而增加，所述LPSS多肽具有與選自SEQ ID NO2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示氨基酸序列組成的一組中的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求9的方法，其中LPSS多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平通過將一種表達(dá)載體導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞中而降低，所述表達(dá)載體包含能抑制編碼所述多肽的核苷酸序列表達(dá)的反義核苷酸序列，且所述反義核苷酸序列在能驅(qū)動該反義核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法，其中內(nèi)皮細(xì)胞是微血管細(xì)胞，優(yōu)選是腦微血管細(xì)胞。
12.一種治療或預(yù)防患者微血管通透性修飾失調(diào)的方法，所述方法包括藥理學(xué)改變患者微血管內(nèi)皮細(xì)胞中一種多肽的活性或穩(wěn)態(tài)水平，所述多肽具有一種與SEQ ID NO1-25所示的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，所述改變足以降低微血管通透性修飾失調(diào)的癥狀。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述方法包括給予患者藥物有效量的一種藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含具有與SEQ ID NO1-25所示的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的多肽，或者包含編碼該多肽的核苷酸序列的核酸分子。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述多肽是LPSS多肽，其具有與選自SEQ ID NO2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示氨基酸序列組成的一組中的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求13或14的方法，其中所述核酸分子是一種基因治療載體，其中所述核苷酸序列在能驅(qū)動該核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)選在微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述方法包括給予患者治療有效量的一種藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含LPSS多肽的一種拮抗劑，所述LPSS多肽具有與選自SEQ ID NO1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示氨基酸序列組成的一組中的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，其中優(yōu)選所述拮抗劑是該多肽的抗體。
17.權(quán)利要求12的方法，其中所述方法包括給予患者治療有效量的包含一種基因治療載體的藥物組合物的步驟，其中所述基因治療載體包含能抑制編碼LPSS多肽的核苷酸序列表達(dá)的一種反義核苷酸序列，所述LPSS多肽具有與選自SEQ ID NO1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示氨基酸序列組成的一組中的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，且其中所述反義核苷酸序列在能驅(qū)動該反義核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)選微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
18.權(quán)利要求12-17任一項(xiàng)的方法，其中微血管通透性失調(diào)選自神經(jīng)退行性疾病，如腦血管意外(CVA)、阿爾茨海默病(AD)、血管相關(guān)性癡呆、克雅氏病(CJD)、牛海綿狀腦病(BSE)、帕金森病(PD)、腦外傷、多發(fā)性硬化(MS)、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(ALS)、杭廷頓氏舞蹈癥；具有CNS成分的外周失調(diào)，如敗血癥休克、肝性腦病、(糖尿病性)高血壓、糖尿病微血管病變、昏睡病、惠普耳病、杜興氏肌營養(yǎng)不良(DMD)、天冬氨酰葡糖胺尿癥(aspartylglucosaminuria)、膽固醇酯貯積病、沃耳曼病、胱氨酸過多癥、Danon病、法布萊氏病、法伯脂肪性肉芽腫病、法伯病、巖藻糖代謝病、半乳糖唾液酸沉積癥I/II型、Gaucher病I/II/III型、Gaucher病、球樣細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、克臘比病、糖原貯積病II、龐帕氏病、GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥I/II/III型、GM2-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥I型、泰薩二氏病、GM2-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥II型、山霍夫氏病、GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥、α-甘露糖苷過多癥I/II型、甘露糖苷過多癥、異染色性腦白質(zhì)障礙癥、粘脂糖癥I型、唾液酸沉積癥1/11型粘脂糖癥11/111型1-細(xì)胞病、粘脂糖癥IIIC型假赫爾勒多種營養(yǎng)不良、粘多糖代謝病I型、粘多糖代謝病II型、亨特氏綜合征、粘多糖代謝病IIIA型、山菲立普綜合征、粘多糖代謝病IIIB型、粘多糖代謝病IIIC型、粘多糖代謝病IIID型、粘多糖代謝病IVA型、莫爾基奧綜合征、粘多糖代謝病IVB型莫爾基奧綜合征、粘多糖代謝病VI型、粘多糖代謝病VII型、斯利綜合征、粘多糖代謝病IX型、多種硫酸酯酶缺陷、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥、CLN1巴騰病、尼皮二氏病A/B型、尼皮二氏病、尼皮二氏病Cl型、尼皮二氏病C2型、致密性成骨不全癥、欣德勒病VII型、欣德勒病及唾液酸貯積癥病、(先兆)子癇；神經(jīng)精神失調(diào)，如抑郁癥、孤獨(dú)癥、焦慮性注意缺陷多動障礙(ADHD)、神經(jīng)精神性系統(tǒng)性紅斑狼瘡、雙相性精神障礙、精神分裂癥及其它精神?。黄渌麮NS失調(diào)，如腦瘤、癲癇、偏頭痛、發(fā)作性睡病、失眠癥、慢性疲勞綜合征、高山病、腦炎、腦膜炎、AIDS相關(guān)性癡呆；及血管發(fā)生相關(guān)失調(diào)，如血管腫瘤、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、動脈粥樣硬化、卵巢過度刺激、牛皮癬、新血管化相關(guān)子宮內(nèi)膜異位癥、球囊血管成形術(shù)后再狹窄、疤痕組織過度增生、外周血管病、高血壓、炎癥性血管炎、雷諾氏病、雷諾氏現(xiàn)象、動脈瘤、動脈再狹窄、血栓性靜脈炎、淋巴管炎、淋巴水腫、創(chuàng)傷愈合及組織修復(fù)、缺血性再灌注損傷、心絞痛、心肌梗塞、慢性心臟病、心力衰竭如充血性心力衰竭、年齡相關(guān)性黃斑變性及骨質(zhì)疏松癥。
19.一種可逆性增加患者微血管通透性的方法，所述方法包括給予患者有效增加微血管通透性的量的一種藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含具有與SEQ ID NO1-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的多肽，或者包含編碼該多肽的核苷酸序列的核酸分子。
20.權(quán)利要求19的方法，其中LPSS多肽是具有與選自SEQ ID NO1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的一種多肽。
21.權(quán)利要求19或20的方法，其中所述核酸分子是一種基因治療載體，其中所述核苷酸序列在能驅(qū)動該核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)選微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
22.權(quán)利要求19的方法，所述方法包括給予患者治療有效量的一種藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含LPSS多肽的一種拮抗劑，LPSS多肽具有與選自SEQ ID NO2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，所述拮抗劑優(yōu)選是該多肽的抗體。
23.權(quán)利要求19的方法，所述方法包括給予患者治療有效量的包含一種基因治療載體的一種藥物組合物的步驟，所述基因治療載體包含能抑制編碼LPSS多肽的核苷酸序列表達(dá)的一種反義核苷酸序列，LPSS多肽具有與選自SEQ ID NO2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，且所述反義核苷酸序列在能驅(qū)動反義核苷酸序列在內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)選微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
24.一種通過給予患有CNS或微血管失調(diào)或處于CNS或微血管失調(diào)危險(xiǎn)中的患者一種治療劑或診斷劑而治療或診斷CNS或微血管失調(diào)的方法，所述治療劑或診斷劑或其藥物可接受的載體與一種靶向劑綴合，所述靶向劑是與LPSS多肽特異性結(jié)合的一種制劑，LPSS多肽具有與SEQ ID NO1-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述LPSS多肽具有與SEQ ID NO1、5、12、13、14、15、16、17、18、19、21-25所示氨基酸序列，優(yōu)選與SEQ ID NO21或22所示氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。
26.一種診斷患者微血管通透性狀態(tài)的方法，所述方法包括如下步驟
(a)確定患者微血管內(nèi)皮中編碼LPSS多肽的核酸序列
的表達(dá)水平，LPSS多肽具有與SEQ ID NO1-25所示氨基酸
序列有至少90％相同性的氨基酸序列；和
(b)將該核酸序列的表達(dá)水平與核酸序列表達(dá)水平的參考值相對比，參考值優(yōu)選是在健康個(gè)體的微血管內(nèi)皮中表達(dá)水平的平均值。
27.權(quán)利要求26的方法，其中核酸序列的表達(dá)水平通過確定該核酸序列編碼的LPSS多肽的量而間接確定。
28.權(quán)利要求26或27的方法，其中對比一種以上的核酸序列的表達(dá)水平。
29.權(quán)利要求26-28任一項(xiàng)的方法，其中表達(dá)水平是在得自患者的樣品中回體確定的。
30.權(quán)利要求26-29任一項(xiàng)的方法，其中所述方法是診斷微血管通透性失調(diào)或診斷對微血管通透性失調(diào)易感性的一種方法。
31.權(quán)利要求30的方法，其中微血管通透性失調(diào)選自神經(jīng)退行性疾病，如腦血管意外(CVA)、阿爾茨海默病(AD)、血管相關(guān)性癡呆、克雅氏病(CJD)、牛海綿狀腦病(BSE)、帕金森病(PD)、腦外傷、多發(fā)性硬化(MS)、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(ALS)、杭廷頓氏舞蹈癥；具有CNS成分的外周失調(diào)，如敗血癥休克、肝性腦病、(糖尿病性)高血壓、糖尿病微血管病變、昏睡病、惠普耳病、杜興氏肌營養(yǎng)不良(DMD)、天冬氨酰葡糖胺尿癥、膽固醇酯貯積病、沃耳曼病、胱氨酸過多癥、Danon病、法布萊氏病、法伯脂肪性肉芽腫病、法伯病、巖藻糖代謝病、半乳糖唾液酸沉積癥I/II型、Gaucher病I/II/III型、Gaucher病、球樣細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、克臘比病、糖原貯積病II、龐帕氏病、GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥I/II/III型、GM2-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥I型、泰薩二氏病、GM2-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥II型、山霍夫氏病、GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥、α-甘露糖苷過多癥I/II型、甘露糖苷過多癥、異染色性腦白質(zhì)障礙癥、粘脂糖癥I型、唾液酸沉積癥1/11型粘脂糖癥11/111型1-細(xì)胞病、粘脂糖癥IIIC型假赫爾勒多種營養(yǎng)不良、粘多糖代謝病I型、粘多糖代謝病II型、亨特氏綜合征、粘多糖代謝病IIIA型、山菲立普綜合征、粘多糖代謝病IIIB型、粘多糖代謝病IIIC型、粘多糖代謝病IIID型、粘多糖代謝病IVA型、莫爾基奧綜合征、粘多糖代謝病IVB型莫爾基奧綜合征、粘多糖代謝病VI型、粘多糖代謝病VII型、斯利綜合征、粘多糖代謝病IX型、多種硫酸酯酶缺陷、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥、CLN1巴騰病、尼皮二氏病A/B型、尼皮二氏病、尼皮二氏病Cl型、尼皮二氏病C2型、致密性成骨不全癥、欣德勒病VII型、欣德勒病及唾液酸貯積癥病、(先兆)子癇；神經(jīng)精神失調(diào)，如抑郁癥、孤獨(dú)癥、焦慮性注意缺陷多動障礙(ADHD)、神經(jīng)精神性系統(tǒng)性紅斑狼瘡、雙相性精神障礙、精神分裂癥及其它精神病；其它CNS失調(diào)，如腦瘤、癲癇、偏頭痛、發(fā)作性睡病、失眠癥、慢性疲勞綜合征、高山病、腦炎、腦膜炎、AIDS相關(guān)性癡呆；及血管發(fā)生相關(guān)失調(diào)，如血管腫瘤、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、動脈粥樣硬化、卵巢過度刺激、牛皮癬、新血管化相關(guān)子宮內(nèi)膜異位癥、球囊血管成形術(shù)后再狹窄、疤痕組織過度增生、外周血管病、高血壓、炎癥性血管炎、雷諾氏病、雷諾氏現(xiàn)象、動脈瘤、動脈再狹窄、血栓性靜脈炎、淋巴管炎、淋巴水腫、創(chuàng)傷愈合及組織修復(fù)、缺血性再灌注損傷、心絞痛、心肌梗塞、慢性心臟病、心力衰竭如充血性心力衰竭、年齡相關(guān)性黃斑變性及骨質(zhì)疏松癥。
32.權(quán)利要求26-29任一項(xiàng)的方法，其中所述方法是評定恢復(fù)微血管通透性的治療效力的一種方法。
33.一種鑒別能調(diào)節(jié)微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的物質(zhì)的方法，所述方法包括如下步驟
(a)提供能表達(dá)一或多個(gè)編碼LPSS多肽的核酸序列的測試細(xì)胞群，所述LPSS多肽具有與SEQ ID NO1-25所示的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列；
(b)將測試細(xì)胞群與所述物質(zhì)接觸；
(c)確定編碼多肽的核酸序列在與所述物質(zhì)接觸的測試細(xì)胞群中的表達(dá)水平，所述多肽具有與SEQ ID NO1-25所示的一種氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列；
(d)將該核酸序列的表達(dá)水平與在未與所述物質(zhì)接觸的測試細(xì)胞群中該核酸序列的表達(dá)水平相對比；及
(e)鑒別導(dǎo)致在與所述物質(zhì)接觸的測試細(xì)胞群與未與所述物質(zhì)接觸的測試細(xì)胞群之間核酸序列表達(dá)水平不同的物質(zhì)。
34.權(quán)利要求33的方法，其中核酸序列的表達(dá)水平通過確定該核酸序列編碼的LPSS多肽的量而間接確定。
35.權(quán)利要求33或34的方法，其中對比一種以上的核酸序列的表達(dá)水平。
36.權(quán)利要求33-35任一項(xiàng)的方法，其中測試細(xì)胞群包含內(nèi)皮細(xì)胞，優(yōu)選血管內(nèi)皮細(xì)胞，更優(yōu)選微血管內(nèi)皮細(xì)胞，最優(yōu)選腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
37.權(quán)利要求33-36任一項(xiàng)的方法，其中測試細(xì)胞群包含哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選人細(xì)胞。
38.權(quán)利要求33-37任一項(xiàng)的方法，其中與所述物質(zhì)接觸的測試細(xì)胞群和未與所述物質(zhì)接觸的測試細(xì)胞群均衍生自一種細(xì)胞群，優(yōu)選衍生自一種細(xì)胞系，更優(yōu)選衍生自一個(gè)細(xì)胞。
39.權(quán)利要求33-38任一項(xiàng)的方法，其中測試細(xì)胞群與一種輔助細(xì)胞群共培養(yǎng)，其中所述測試細(xì)胞群在濾膜的一側(cè)培養(yǎng)，輔助細(xì)胞群在濾膜的另一側(cè)培養(yǎng)，且所述輔助細(xì)胞群優(yōu)選包含星形膠質(zhì)細(xì)胞。
40.根據(jù)權(quán)利要求33-39任一項(xiàng)的方法鑒別的一種物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及核酸及其編碼的多肽，它們的表達(dá)在正在經(jīng)歷血腦屏障功能性的早期動態(tài)炎癥誘導(dǎo)的改變的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中被調(diào)節(jié)。這類多肽在本文被稱作脂多糖敏感性(LPSS)多肽。這些核酸和多肽可以用于控制需要這種生物學(xué)作用的哺乳動物血腦屏障性質(zhì)的方法中。這包括血腦/視網(wǎng)膜屏障、腦(包括眼)疾病以及外周血管疾病的診斷和治療。另外，本發(fā)明涉及抗LPSS多肽抗體或配體作為診斷探針、作為血腦屏障靶向劑或者作為治療劑的應(yīng)用，本發(fā)明還涉及LPSS多肽的表達(dá)、激活或生物活性的配體或調(diào)節(jié)劑作為診斷探針、治療劑或藥物輸送增強(qiáng)劑的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/12GK1788017SQ20048000961
公開日2006年6月14日 申請日期2004年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月10日
發(fā)明者彼得·亞普·蓋拉德, 阿爾貝圖斯·赫里特·德布爾, 阿吉恩·布林克 申請人:to-BBB控股股份有限公司