專利名稱：口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片制作方法和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片及其制作方法及利用該口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片對于患者口腔根管微生物感染的檢測方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在已經(jīng)知道牙髓根尖周病主要是以厭氧菌為主的混合感染。自70年代以來，由于厭氧培養(yǎng)技術(shù)的重大突破，越來越多的厭氧菌從感染牙髓和根管中分離出來，使人們重新認識到厭氧菌才是牙髓根尖周病的優(yōu)勢菌，厭氧菌在牙髓根尖周感染中的作用也越來越受重視。目前比較公認的感染根管優(yōu)勢菌主要有專性厭氧菌(卟啉菌Porphyromonas、普氏菌Prevotella、消化鏈球菌Peptostreptococcus、具核梭桿菌Fusobacteriumnucleatum、Veillonella parvula)，兼性厭氧菌(放線菌Actinomyces、乳桿菌Lactobacillus、糞腸球菌Enterococcus faecalis、變形鏈球菌Streptococcusmutans)，等。雖然培養(yǎng)方法越來越先進，但有學(xué)者估計，即使用最好的培養(yǎng)方法也僅能得到20％至70％的細菌，也就是說根管中的很多細菌還是被漏檢了。因此光靠培養(yǎng)的方法，使人們對感染根管細菌的認識受到一定的局限性。另外，由于培養(yǎng)法還存在著費時、費力、靈敏度較低等缺點，其作為微生物檢測的金標準地位已受到部分學(xué)者的質(zhì)疑。
而對于較常用的生化鑒定法，由于感染根管中的一些優(yōu)勢菌在分類學(xué)上非常接近，生化特性近于相似，用生化鑒定法很容易造成假陽性或假陰性。
自80年代以來，分子生物學(xué)得到了空前的發(fā)展，許多研究表明在檢測細菌方面分子生物學(xué)方法比培養(yǎng)法敏感度更高，尤其對于那些較難培養(yǎng)或目前根本培養(yǎng)不出的細菌。Choi等用PCR擴增16SrRNA基因的方法檢查一個牙周炎患者的齦下菌斑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20種不能培養(yǎng)的螺旋體；Conrads等則用16SrDNA引導(dǎo)的PCR首次在根管內(nèi)發(fā)現(xiàn)福賽類桿菌。因此將分子生物學(xué)方法用于根管細菌的檢測，不僅會使我們目前的根管細菌學(xué)理論得到鞏固，而且還可起到進一步發(fā)展和補充作用。
目前報道較多的方法主要有PCR法、PCR加雜交法等，這些方法雖然大大提高了檢測的靈敏度，簡化了檢測手續(xù)，但也存在一些不足之處。其中最局限的是上述方法在一次實驗中只能檢測一種或幾種微生物，檢測微生物的種類非常少。這對于一個感染根管細菌標本中就含有數(shù)十種細菌的實際情況來說，要達到一個較理想的檢測還是相當難的。
生物芯片是最近十年發(fā)展起來的應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的一項新技術(shù)，它是以核酸分子雜交技術(shù)為基本原理，并結(jié)合機械制造技術(shù)、計算機技術(shù)等其他諸多高新科技，被廣泛運用于核酸序列測定、基因突變檢測、基因表達情況分析等領(lǐng)域。近年來將生物芯片運用于微生物的檢測和分類的報道也越來越多。設(shè)計合成特異性微生物探針，將其點樣于芯片上，待測微生物樣品經(jīng)DNA抽提，PCR標記，即可與芯片進行雜交反應(yīng)，經(jīng)掃描測讀，輸出結(jié)果，經(jīng)分析可判斷出樣品中微生物種類。相對于一般的分子生物學(xué)方法，用生物芯片檢測微生物更具有大容量、靈敏、快速、準確、高效、簡便等優(yōu)點，具有廣闊的應(yīng)用前景。而生物芯片檢測法的這些優(yōu)點，正是符合感染根管細菌標本檢測的理想方法。
許多文獻報道了相關(guān)的技術(shù)，如1.Choi BK，Paster BJ，Dewhirst FE，Gobel UB.Diversity of cultivableand uncultivable oral spirochetes from a patient with severe destructiveperiodontitis.Infect Immun 1994；621889-95.
2.Conrads G，Gharbia SE，Lampert F，Shah HN.The use of a 16S rDNAdirected PCR for the detection of endodontopathogenic bacteria.J Endodon1997；23433-8.
3.Jung II-Y，Choi B-K，Kum K-Y，et al.Molecular epidemiology andassociation of putative pathogens in root canal infection.J Endodon 2000；26599-604.
4.Siqueira Jr，Rocas IN，Oliveira JCM，et al.Detection of putative oralpathogens in acuteperiradicular abscesses by 16S rDNA-Directed polymerasechain reaction.J Endodon 2001；27164-7.
5.Call DR，Brockman FJ，Chandler DP.Detecting and genotypingEscherichia Coli O157H7 using multiplexed PCR and nucleic acidmicroarrays.Int J Microbiol 2001 Jul 20；67(1-2)71-80.
6.Cho JC，Tiedje JM.Bacterial species determination from DNA-DNAhybridization by using genome fragments and DNA microarrays.Appl EnvironMicrobiol 2001 Aug；67(8)3677-82.
因此，開發(fā)研究一種新的生物芯片，用于對口腔根管微生物感染的檢測，是人們所十分期望的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是公開一種口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的檢測低通量、靈敏度不高和檢測速度較慢的缺陷，以滿足醫(yī)療領(lǐng)域的需要；本發(fā)明需要解決技術(shù)問題之二是提供所述口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片的制作方法；本發(fā)明再一個需要解決的技術(shù)問題是公開所述口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片的使用方法。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是這樣的本研究目的利用細菌16SrRNA基因保守區(qū)設(shè)計一對引物，可擴出所有細菌，再利用其可變區(qū)設(shè)計特異性探針可鑒定細菌的原理，通過已知口腔微生物的DNA序列，設(shè)計制作出特異性寡核苷酸探針，制成微陣列芯片，初步構(gòu)建能達到定性檢測十五種感染根管細菌(具核梭桿菌Fusobacteriumnucleatum、微小消化鏈球菌Peptostreptococcus micros、牙髓卟啉菌Porphyromonas endodontalis、牙齦卟啉菌Porphyromonas gingivalis、中間普氏菌Prevotella intermedia、變黑普氏菌Prevotella nigrescens、口普氏菌Prevotella oris，福賽類桿菌Bacteroides forsythus、糞腸球菌Enterococcusfaecalis、變形鏈球菌Streptococcus mutans、血鏈球菌Streptococcus sanguis，內(nèi)氏放線菌Actinomyces naeslundii、衣氏放線菌Actinomyces israelii、粘性放線菌Actinomyces viscosus、伴放線放線桿菌Actinobacillusactinomycetemcomitans)的微陣列芯片平臺，并將構(gòu)建平臺應(yīng)用于臨床感染根管細菌學(xué)樣本檢測，期望利用此平臺發(fā)現(xiàn)新的致病菌或突變株，并進一步闡明其對病因、發(fā)病機理、臨床治療及預(yù)后的影響。
本發(fā)明的口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片，其特征是在醛基修飾的載玻片表面點陣并固定有下列16條探針

本發(fā)明的口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片的制作方法，包括如下步驟(1)芯片上探針的設(shè)計根據(jù)感染口腔根管微生物基因組DNA序列，設(shè)計使每個探針解鏈溫度相近，(上下波動5℃)以避免發(fā)夾，二聚體形成，相同序列盡量減少(避免單一堿基連續(xù)重復(fù)7次以上)，陽性探針選取所有檢測菌在16SrRNA上保守的序列，并確定上述16條探針；(2)芯片的制備探針合成，為了減少雜交時的空間位阻，合成時，在16條探針的寡核苷酸5’端加上一段10聚的Poly T，即連接臂，同時進行氨基修飾。用去離子水將探針稀釋，并與點樣液等體積混合，使終濃度為10uM，采用常規(guī)的方法點陣于醛基修飾的載玻片表面，并固定，如可通過Cartesianmicroarray制作系統(tǒng)點陣于醛基修飾的載玻片表面，置于約75％的相對濕度、室溫條件下48-72小時進行固定。取出后于沸水中煮30秒，晾干，于4℃保存，即制成了具有16條探針的口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片。
本發(fā)明的口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片用于患者口腔根管微生物感染的檢測方法，其特征在于包括下列步驟(1)樣品制備臨床選取急慢性根尖周炎的患牙，先對患牙表面進行消毒，然后開髓探查到根管，選用合適的消毒紙尖插入根管直達根尖部位，放置一分鐘后，取出紙尖放入盛有轉(zhuǎn)運液的離心管中，試劑盒提取DNA。
(2)樣品DNA的PCR擴增并標記取制備好的DNA樣品5ul與20ul PCR擴增體系混合，(擴增體系包括2.5ul 10*PCR反應(yīng)緩沖液，2ul各2.5mM的dATP、dGTP、dCTP、dTTP，各15pmol的上游及下游引物，其中下游引物為5’端CY5熒光標記，1.25Upfu DNA聚合酶)通過以下熱循環(huán)過程制備熒光標記的DNA樣品目的片段首先94℃，5min，以94℃，20s，52℃，20s，72℃，20s循環(huán)30次，最后，72℃延伸5min。
(3)PCR擴增產(chǎn)物與口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片雜交取經(jīng)PCR擴增并標記熒光的目的DNA片段4ul，與10ul雜交液混勻，98℃變性5min，迅速插入冰浴，然后滴于芯片表面的點陣區(qū)域，蓋上蓋玻片，置于42℃濕盒中雜交30min，然后于洗液(2×SSC，0.1％SDS)中蕩洗5min，涼干。
(4)結(jié)果獲得用激光共聚焦掃描儀(GenePix 4000B)以合適的掃描強度掃描上述第(3)步的雜交芯片，配合其配套軟件分析，最終獲得實驗結(jié)果。
本發(fā)明的優(yōu)點與效果(1)本發(fā)明的口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片只需一次PCR擴增反應(yīng)和快速雜交反應(yīng)就可確定15種口腔根管微生物感染菌的種類，具有高的靈敏度和雜交特異性，使臨床檢測成為可能。
(2)本發(fā)明的口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片，具有操作簡便、快速的特點，整個實驗過程只需4-6小時，優(yōu)于常規(guī)的方法。
(3)本發(fā)明所采用的陽性探針和陰性探針，使雜交過程更為清楚和準確。


圖1口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片的點樣矩陣2具核梭桿菌Fusobacterium nucleatum的芯片檢測結(jié)果圖3牙齦卟啉菌Porphyromonas gingivalis的芯片檢測結(jié)果具體實施方式
實施例1芯片的制備和探針設(shè)計在醛基修飾的載玻片表面點陣并固定有下列16條探針

(1)芯片上探針的設(shè)計根據(jù)檢測菌16SrRNA基因組DNA序列，設(shè)計使每個探針解鏈溫度相近，上下波動5℃，二聚體形成，單一堿基連續(xù)重復(fù)7次，陽性探針選取所檢測菌的保守序列區(qū)。
(2)芯片的制備探針合成，為了減少雜交時的空間位阻，合成時，在16條探針的寡核苷酸5’端加上一段10聚的Poly T(連接臂)，同時進行氨基修飾。用去離子水將探針稀釋，并與點樣液等體積混合，使終濃度為10uM，通過芯片點樣儀點陣于醛基修飾的載玻片表面，置于75％的相對濕度、室溫條件下60小時進行固定。取出后于沸水浴中30秒，晾干，4℃保存，即制成了具有16條探針的口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片，見圖1。由圖1可見，每一種探針重復(fù)點四個點，左兩列為陽性探針(control)，即對雜交過程檢測的探針。陰性對照為水。右邊每一行四個一組的為一種檢測菌特異探針。文字相對應(yīng)于點樣矩陣探針菌種的名稱。
實施例2樣品的處理和標記對二例(其中1例為具核梭桿菌Fusobacterium nucleatum的標本，另1例為牙齦卟啉菌Porphyromonas gingivalis的標本)，用常規(guī)辦法處理樣品，備用。
樣品的PCR擴增和標記處理取制備好的DNA樣品5ul與20ul PCR擴增體系混合，(擴增體系包括2.5ul 10*PCR反應(yīng)緩沖液，2ul各2.5mM的dATP、dGTP、dCTP、dTTP，各15pmol的上游及下游引物，其中游引物為5’端CY5熒光標記，1.25U pfu DNA聚合酶)通過以下熱循環(huán)過程制備熒光標記的DNA樣品目的片斷首先94℃，5min，以94℃，20s，52℃，20s，72℃，20s循環(huán)30次，最后，72℃延伸5min。
實施例3PCR擴增產(chǎn)物與口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片雜交取經(jīng)PCR擴增并標記熒光的目的DNA片段4ul，與10ul雜交液混勻，98℃變性5min，迅速插入冰浴，然后滴于芯片表面的點陣區(qū)域，蓋上蓋玻片，置于42℃濕盒中雜交30min，然后于洗液(2×SSC，0.1％SDS)中蕩洗5mins，涼干。用激光共聚焦掃描儀(GenePix 4000B)以合適的掃描強度掃描上述第(3)步的雜交芯片，配合其配套軟件分析，最終獲得實驗結(jié)果。結(jié)果如圖2、圖3所示。
實施例4樣品的序列測定取制備好的DNA樣品10ul與90ul PCR擴增體系混合，(擴增體系包括10ul 10*PCR反應(yīng)緩沖液，8ul各2.5mM的dATP、dGTP、dCTP、dTTP，各50pmol的上游及下游引物，5U pfu DNA聚合酶)通過以下熱循環(huán)過程制備DNA樣品目的片段首先94℃，5min，以94℃，20s，52℃，20s，72℃，20s循環(huán)30次，最后，72℃延伸5min。送與博亞(BioAsia)生物工程公司進行測序。
芯片檢測結(jié)果與測序結(jié)果的符合率為100％。由此可見，用基因芯片來檢測曲霉菌種類靈敏度高，特異性為100％。
用口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片，從樣品制備到PCR擴增，到得到檢測結(jié)果，需4-6小時，大大縮短了病人的診斷時間，具有較好的臨床推廣使用價值。
權(quán)利要求
1.一種口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片，其特征在于，在經(jīng)修飾的載玻片表面點陣并固定有下列16條探針
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片，其特征在于，所使用的載玻片為醛基修飾的載玻片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片的制作方法，其特征在于，包括如下步驟(1)芯片上探針的設(shè)計根據(jù)口腔根管感染菌16SrRNA基因組DNA序列，設(shè)計使每個探針解鏈溫度相近，相同序列盡量減少，陽性探針選取所有檢測菌的保守序列區(qū)，并確定上述16條探針；(2)芯片的制備先在16條探針的寡核苷酸序列5’端加上一段10聚的Poly T，再進行氨基修飾，合成并修飾后的探針用去離子水稀釋，并與市售的點樣液等體積混合，使探針的終濃度為10uM，采用常規(guī)的方法點陣于醛基修飾的載玻片表面，并固定，即制成了具有16條探針的口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片的制作方法，其特征在于，設(shè)計使每個探針解鏈溫度上下波動5℃左右。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片的制作方法，其特征在于，避免單一堿基連續(xù)重復(fù)7次以上。
6.權(quán)利要求1～5任一項所述的口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片用于患者口腔根管微生物感染的檢測方法，其特征在于，包括下列步驟(1)樣品制備臨床選取急慢性根尖周炎的患牙，先對患牙表面進行消毒，然后開髓探查到根管，選用合適的消毒紙尖插入根管直達根尖部位，放置一分鐘后，再取出紙尖放入盛有轉(zhuǎn)運液的離心管中，運送至實驗室提取DNA。用華舜公司小量細菌DNA抽提試劑盒提取樣本DNA。(2)樣品DNA的PCR擴增并標記取制備好的DNA樣品5ul與20ul PCR擴增體系混合，通過以下熱循環(huán)過程制備熒光標記的DNA樣品目的片段首先94℃，5min，以94℃，20s，52℃，20s，72℃，20s，循環(huán)30次，最后，72℃延伸5min；(3)PCR擴增產(chǎn)物與口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片雜交取經(jīng)PCR擴增并標記熒光的目的DNA片段4ul，與10ul雜交液混勻，98℃變性5min，然后滴于芯片表面的點陣區(qū)域，蓋上蓋玻片，置于42℃濕盒中雜交30min，然后于洗液(2×SSC，0.1％SDS)中蕩洗5min，涼干；(4)結(jié)果獲得用激光共聚焦掃描儀掃描上述第(3)步的雜交芯片，配合其配套軟件分析，最終獲得實驗結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片的制備方法和使用方法。本發(fā)明的口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片，是根據(jù)16SrRNA基因組序列設(shè)計。芯片上所包含的每個特異檢測探針解鏈溫度相近，相同序列盡量減少；陽性探針選取所有檢測微生物16SrRNA基因中保守的序列區(qū)，設(shè)計與特異探針相近的解鏈溫度，不同的堿基序列的探針。在醛基修飾的載玻片表面點陣并固定。本發(fā)明的口腔根管微生物感染檢測微陣列芯片可用于患者口腔根管微生物感染的檢測。本發(fā)明的芯片只需一次PCR擴增反應(yīng)和雜交反應(yīng)就可確定口腔根管微生物感染的種類具有比PCR方法更高的靈敏度和特異性；與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，檢測時間大大縮短，使臨床檢測成為可能。
文檔編號C12Q1/68GK1635160SQ200410084259
公開日2005年7月6日 申請日期2004年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月17日
發(fā)明者楊夢蘇, 曹慧敏, 趙建龍, 唐子圣, 趙淑娟, 劉正 申請人:中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所