專利名稱：尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶在水稻中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的應(yīng)用。具體地說，本發(fā)明涉及利用尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因改變水稻的花粉育性和產(chǎn)量性狀，在培育新型不育系和高產(chǎn)新品種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-Glucose Pyrophosphorylase，UGPase)首先由Munch Petersen等于1953年在酵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)(Munch Petersen A，Kalckar HM，Cutolo E et al 1953 Uridyl transferase and the formation of uridine triphosphate.Nature1721036-1037)。該蛋白質(zhì)在自然界廣泛分布，目前已在較多的動、植物中發(fā)現(xiàn)并已分離純化。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶催化一種依賴鎂的可逆反應(yīng)，即轉(zhuǎn)移尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的尿苷至Mg-PPi形成葡萄糖-1-磷酸(Glc-1-P)和Mg-UTP。反應(yīng)式如下Glc-1-P+UTP＝PPi+UDPGUDPG是高等植物中主要活化糖的形式，作為葡萄糖基供體參與蔗糖、淀粉、纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)以及糖脂、糖蛋白的合成代謝。在植物光合組織中，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶與蔗糖磷酸鹽合成酶(SPS)偶聯(lián)，將光合作用產(chǎn)生的碳用于蔗糖合成。而發(fā)育種子和塊莖等組織內(nèi)，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶與胞液中的AGPase相偶聯(lián)，形成ADPG，參與造粉體淀粉的合成。在生長旺盛的馬鈴薯塊莖中，吸收的蔗糖被胞液內(nèi)SuSy降解形成果糖和UDPG，UDPG為尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶所用，最終合成淀粉。而發(fā)芽期的根莖則需要降解淀粉生成蔗糖，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶催化合成較多的UDPG，用于蔗糖合成，并衍生成其它的二磷酸核苷糖參與果膠質(zhì)、半纖維素、糖脂和糖蛋白的合成。
尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶處于蔗糖和淀粉途徑的交叉點(diǎn)。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶在蔗糖和淀粉代謝轉(zhuǎn)換中的作用對于谷類作物的種子特別重要。例如，大麥種子中胞液尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶可直接與胞液AGPase偶聯(lián)，將蔗糖生成的Glc-1-P用于ADPG的形成，在蔗糖代謝與淀粉形成間建立起重要的連接。這樣，PPi在AGP反應(yīng)與UGP反應(yīng)間可被循環(huán)利用，假定兩反應(yīng)緊密偶聯(lián)，則從UDPG至ADPG的轉(zhuǎn)化無需PPi輸入便可順利進(jìn)行(見下圖)。
人們一直試圖通過控制尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表達(dá)來調(diào)控生長發(fā)育。研究證明，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶缺失的粘菌不能進(jìn)行正常的生長、發(fā)育(Ragheb JA，Dottin PR 1987 Structure and sequence of a UDP glucosepyrophosphorylase gene of Dictyostelium discoideum.Nucleic Acids Res153891-3908)；尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶缺失的大腸桿菌則不能參與Leloir途徑的半乳糖代謝，因而不能形成正常的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜(Weissbom AE，Liu Q，Rumley MK et al 1994 UTP-glucose-1-phosphate uridyltransferase of Escherichia coliisolation and DNA sequence of the galU gene and purification of the emzyme.JBacteriol 1762611-2618)。哺乳動物細(xì)胞中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶缺失會引起細(xì)胞膜糖蛋白合成的降低，影響細(xì)胞正常分化和完整性(Hassid WZ 1969Biosynthesis of oligosaccharides and polysaccharides in plants.Science 165137-144)。在擬南芥中，通過抑制尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性降低了糖的含量(Johansson H 2003 Gene regulation of UDP-glucose synthesis and metabolism inplants.PhD thesis，Ume University，Ume，Sweden)。但在馬鈴薯中通過反義RNA抑制了96％的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性的情況下，實(shí)驗(yàn)組和對照組的生長和發(fā)育卻無顯著的差異(Zrenner R，Willmitzer L，Sonnewald U 1993 Analysis of theexpression of potato uridinediphosphate-glucose pyrophosphorylase and its inhibition byantisense RNA.Planta 190247-252)。在酵母中，轉(zhuǎn)入尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的轉(zhuǎn)化子其酶活性高于對照組40倍，但生長率并沒有得到提高(Daran JM，Dallies N，Thines-Sempoux D，F(xiàn)rancois J(1995)Genetic and biochemicalcharacterization of the UGP1 gene encoding UDP-glucose pyrophosphorylase fromSaccharomyces cerevisiae.Eur J Biochem 233520-530)。目前為止，人們還沒有發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表達(dá)能改變水稻的花粉育性和改良水稻的產(chǎn)量性狀。而控制水稻等植物的育性，改良產(chǎn)量性狀，提高產(chǎn)量，是人們從事作物育種所一直追求的目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在水稻中的應(yīng)用，水稻植物生長更旺盛，結(jié)實(shí)更多，產(chǎn)量性狀明顯改善，使水稻的植株更為高大，結(jié)實(shí)粒數(shù)和單株粒重等產(chǎn)量性狀得到明顯改善。
實(shí)際上，本發(fā)明涉及尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在提高水稻產(chǎn)量中的應(yīng)用，水稻體內(nèi)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)增強(qiáng)，使植株的產(chǎn)量性狀得到改善，產(chǎn)量提高，用于培育高產(chǎn)新品種。
還涉及尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在控制水稻育性中的應(yīng)用，水稻體內(nèi)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯受到抑制，并引起水稻的花粉敗育，導(dǎo)致自交不結(jié)實(shí)，用于培育雄性不育系。
人們很早就知道尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶是生物體內(nèi)糖代謝過程中的一種重要的酶，然而，人們一直沒有發(fā)現(xiàn)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因具有控制植物育性和提高植物產(chǎn)量的功能。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，使水稻體內(nèi)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)增強(qiáng)時，植株更為高大，產(chǎn)量性狀明顯改善，產(chǎn)量提高。當(dāng)水稻體內(nèi)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)被抑制時，水稻植株便出現(xiàn)雄性敗育，花粉為100％典敗型不育。
因此，本發(fā)明的第一個方面是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得高效表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的植株，使轉(zhuǎn)基因水稻的產(chǎn)量性狀得到改良，提供了尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在提高水稻產(chǎn)量、培育高產(chǎn)新品種中的用途。
本發(fā)明的第二個方面是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)抑制植物體內(nèi)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表達(dá)，從而使水稻出現(xiàn)花粉不育，提供了尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在控制水稻育性、培育新型不育系中的用途。
在本發(fā)明中，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因來源于植物的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因。在本發(fā)明的實(shí)施例中，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，更優(yōu)選的是編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的基因。但是。編碼尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQID NO1所示的編碼區(qū)序列相同，或者是指編碼具有SED ID NO2的蛋白質(zhì)但與SEDID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核苷酸序列。
本發(fā)明中所指的轉(zhuǎn)化包括花粉管通道法，基因槍法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，更優(yōu)選農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。具體的，在有利于表達(dá)載體導(dǎo)入的條件下，將含有包括尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表達(dá)載體導(dǎo)入水稻植株之中，使目的基因在植物體中的表達(dá)增強(qiáng)或表達(dá)抑制。
在本發(fā)明中通過選擇性篩選出尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株，并進(jìn)一步篩選出生長和產(chǎn)量性狀得到改良的植株。在此基礎(chǔ)上更進(jìn)一步篩選出顯現(xiàn)生長和產(chǎn)量性狀得到改良的植株的種子。
在本發(fā)明中通過選擇性篩選出尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)被抑制的轉(zhuǎn)基因植株，并進(jìn)一步篩選出花粉不育的植株。在此基礎(chǔ)上，通過與正?？捎仓甑幕亟欢@得種子。
眾多文獻(xiàn)報道已經(jīng)分離了尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，不同生物的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因其核苷酸序列同源性較高，但均編碼尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的氨基酸序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過在Gene bankTM等數(shù)據(jù)庫中檢索得到尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的核苷酸序列。本發(fā)明從水稻克隆出的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
根據(jù)已知的核苷酸序列，利用分子生物學(xué)方法，可以直接從各種植物中分離用于本發(fā)明的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，構(gòu)建表達(dá)載體?？蛇x擇地，利用已經(jīng)分離和克隆到載體的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因。或者，根據(jù)已知的核苷酸序列合成該基因。
在本發(fā)明中的具體實(shí)施例1中，應(yīng)用兩種引物UGPF(5’-ATTGGATCCATGGCGGTCGCCGCCGACGTG-3’)UGPR(5’-CCGGGATCCTCAAAGATCCTCCGGACCGTTG-3’)以克隆有尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶全長基因的質(zhì)粒作模板DNA，通過PCR方式合成并獲得全長的水稻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因。用BamHI 37℃消化該全長基因并克隆到表達(dá)載體中。
本發(fā)明中的“表達(dá)載體”包括尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因增強(qiáng)表達(dá)載體和抑制表達(dá)載體。本發(fā)明提供的增強(qiáng)表達(dá)載體，其啟動子能夠使尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在植物細(xì)胞中能將該基因高效轉(zhuǎn)錄成mRNA。這樣的啟動子可以是非植物來源的啟動子如椰菜花葉病毒35S(CaMV35S)等，或植物來源的啟動子。通過選擇合適的啟動子，可以產(chǎn)生生長加快產(chǎn)量增加的植株。優(yōu)選的啟動子是CaMV35S啟動子和玉米泛素Ubiquitin啟動子。
本發(fā)明提供的抑制表達(dá)載體包括RNAi載體或反義RNA載體。RNAi載體上克隆有尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的一段雙鏈RNA，轉(zhuǎn)入植物中后，使得內(nèi)源的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因不能表達(dá)，從而導(dǎo)致內(nèi)源尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因基因的沉默。反義RNA載體上插入尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的反義RNA，轉(zhuǎn)入植物中后，使得植物體內(nèi)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因mRNA降解，或翻譯被抑制，達(dá)到抑制內(nèi)源的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)的目的。
通過鈣處理、冰凍和融化、或電穿孔等方法將構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入到具有植物感染能力的土壤農(nóng)桿菌中，通過植物細(xì)胞與含有表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌的接觸，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞，然后再生出轉(zhuǎn)基因植株。這些方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的技術(shù)。同樣，通過基因槍注射法和花粉管通道法也可獲得所需要的轉(zhuǎn)基因植物。
在本發(fā)明中的具體實(shí)施例3中，水稻的愈傷組織在農(nóng)桿菌液中浸泡15-20分鐘，然后共培養(yǎng)2天，再在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選擇性培養(yǎng)基為含有Carb和潮霉素的MS培養(yǎng)基。愈傷組織轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基上每隔10-15天繼代1次，然后轉(zhuǎn)移至含有植物激素KT的MS培養(yǎng)基中再生出小苗，待再生苗長至5cm時移至含有NAA的生根培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)基因植株生根后，移栽至盆栽或田間栽培，從而獲得植物和種子。
在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)化增強(qiáng)表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因T1代植株按照常規(guī)方法栽培，待到成熟后，通過考種，選擇出生長旺盛和單株產(chǎn)量增加的植株，收獲種子，進(jìn)而培育成高產(chǎn)新品種。
轉(zhuǎn)化抑制表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因T1代植株按照常規(guī)方法栽培，抽穗時取出花藥，通過碘化鉀染色方法，觀察花粉粒的育性，選擇出完全不育的植株。通過與正常植株雜交，收獲種子，培育出新型不育材料。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)①指出了尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因不曾發(fā)現(xiàn)和記載的新性能。自1953年從酵母中分離出尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶以來，人們知道尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶是生物糖代謝中的一種重要酶。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)提高后，水稻植物生長更旺盛，結(jié)實(shí)更多，產(chǎn)量性狀明顯改善；而通過RNAi等方法抑制尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表達(dá)后，水稻植株的生長沒有受到影響，但是，花粉明顯減少，花粉100％不育。這些都是不為人們所知的新性能而且，這些新的性能賦予轉(zhuǎn)移因植物新的用途。②通過轉(zhuǎn)基因手段，提高尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在水稻中的表達(dá)水平，從而使水稻的植株更為高大，結(jié)實(shí)粒數(shù)和單株粒重等產(chǎn)量性狀得到明顯改善。而且這些性狀能夠在后代中穩(wěn)定遺傳，在育種中用于培養(yǎng)高產(chǎn)新品種。③通過RNAi和反義RNA等技術(shù)，抑制水稻中的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表達(dá)，從而使水稻的花粉敗育，并且敗育徹底，在育種中用于培育新的雄性不育水稻材料。
本發(fā)明中所用的術(shù)語“增強(qiáng)表達(dá)”，指尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因轉(zhuǎn)入水稻中之后，使受體植物尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平提高。
本發(fā)明中所用的術(shù)語“抑制表達(dá)”，指尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因通過RNAi載體和反義RNA載體轉(zhuǎn)入水稻中之后，使受體植物尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平降低。
本文中所用的術(shù)語“尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶”是指一類從植物中分離的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶。最優(yōu)選的是具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
本文中的“基因”是指將編碼構(gòu)成蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸的核苷酸序列，這些序列可以是DNA形式或者RNA形式，DNA形式包括cDNA，基因組DNA，或人工化學(xué)合成的DNA。DNA可以是單鏈的或者是雙鏈的，編碼成熟蛋白質(zhì)的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者為簡并的變異體。簡并的變異體在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差異的核苷酸序列。
本發(fā)明中所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因植物”是指含有導(dǎo)入的基因并能夠穩(wěn)定地或瞬時地表達(dá)所導(dǎo)入的基因并產(chǎn)生具有特定的生物學(xué)性狀的植物。


圖1植物表達(dá)載體T-DNA區(qū)示意圖A增強(qiáng)表達(dá)載體 B抑制表達(dá)載體-RNAi載體hyp為潮霉素抗性基因，Ubil promoter為玉米泛素啟動子，NOS尾巴為轉(zhuǎn)錄終止子。A中箭頭所示為尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的插入方向；該載體導(dǎo)入植物后，是轉(zhuǎn)基因植物的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表達(dá)增強(qiáng)；B中箭頭所示為尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因片斷在intron兩邊正向和反向插入，導(dǎo)入植物后可形成具有抑制功能的hpRNA，是轉(zhuǎn)基因植物中的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)受到抑制。
圖2轉(zhuǎn)基因水稻的PCR鑒定
1為200bp ladder，2為陽性質(zhì)粒對照，3為對照植株，4-15為轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)基因植株中，外源尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因片已成功導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植株中。
圖3轉(zhuǎn)基因水稻的Southern雜交鑒定1為對照植株，2-8為轉(zhuǎn)基因植株，箭頭所指條帶顯示在轉(zhuǎn)基因植株中不同拷貝數(shù)的外源尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的導(dǎo)入。
圖4轉(zhuǎn)基因水稻的Northern blotting鑒定1為對照植株，2-9為轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)基因植株中，4號和9號植株的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)被抑制，其余植株均為增強(qiáng)表達(dá)。
圖5轉(zhuǎn)基因水稻花粉育性鑒定A為對照植株的正常花粉；B為尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)被抑制的水稻花粉，為100％典敗型不育花粉；C為尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因增強(qiáng)表達(dá)的水稻花粉，為正?；ǚ?。
圖6轉(zhuǎn)基因水稻與普通水稻的植株圖中A為尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因增強(qiáng)表達(dá)的水稻和對照植株，顯示基因增強(qiáng)表達(dá)植株的生長和產(chǎn)量優(yōu)勢；B為尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)被抑制的水稻和對照植株，顯示表達(dá)被抑制的植株不能正常結(jié)實(shí)。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不是以此限制本發(fā)明。
實(shí)施例1尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的增強(qiáng)表達(dá)載體構(gòu)建如圖1A所示，本實(shí)驗(yàn)使用兩種引物，其核酸序列分別為UGPF(5’-ATTGGATCCATGGCGGTCGCCGCCGACGTG-3’)和UGPR(5’-CCGGGATCCTCAAAGATCCTCCGGACCGTTG-3’)。以UGPF/UGPR作為引物組合，以克隆有水稻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶全長基因的質(zhì)粒作模板DNA，通過PCR(94℃ 3min；94℃ 1min，68℃ 1min30s，26cycles；68℃ 10min)方式合成并獲得全長的水稻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的全長基因。用限制性內(nèi)切酶BamHI 37℃酶切尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，并將其連接入經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH1酶切、并經(jīng)堿性磷酸酶去磷的中間載體pU1301中，使得尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因置于泛素啟動子和NOS尾巴之間，得到增強(qiáng)表達(dá)載體；該表達(dá)載體的插入片段經(jīng)DNA測序鑒定后，用來轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。該表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中之后，可使轉(zhuǎn)基因植株中的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表達(dá)增強(qiáng)。
實(shí)施例2尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的RNAi載體構(gòu)建如圖1B所示，本實(shí)驗(yàn)使用四種引物，其核酸序列分別為F1(5’-TCTCTCGAGTCTAGACCTTATTGTGATTC 3’)R1(5’-ATTAAGCTTATTCACATGCTCATCAGGGAC 3’)F2(5’-CCTCTCGAGCCTTATTGTGATTCAAATTGAG 3’)R2(5’-GAAAAGCTTGAATTCATTCACATGCTCATC 3’)A、將尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的部分編碼區(qū)正向插入到pHANNIBAL載體的第一個多接頭位點(diǎn)中1目的片段的擴(kuò)增 使用引物對F1/R1擴(kuò)增尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的編碼區(qū)；2酶切與連接 將純化的PCR產(chǎn)物用Xho I和EcoR I雙酶切后與同樣雙酶切的pHANNIBAL載體連接；3重組質(zhì)粒的酶切鑒定 構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F’，小量抽提質(zhì)粒，純化后進(jìn)行Xho I和EcoR I雙酶切以鑒定陽性克隆，并將其命名為pKAN-1。
B、將尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的相同編碼區(qū)反向插入到pKAN-1的另一多接頭位點(diǎn)中1目的片段的擴(kuò)增 使用引物對F2/R2擴(kuò)增尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的編碼區(qū)；2酶切與連接 將純化的PCR產(chǎn)物用Xba I和Hind III雙酶切后與同樣雙酶切的pHAN-1載體連接；3重組質(zhì)粒的酶切鑒定 構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F’，小量抽提質(zhì)粒，純化后進(jìn)行Xba I和Hind III雙酶切以鑒定陽性克隆，并將其命名為pKAN-2。
C、將pKAN-2中的hpRNA片段克隆并連接到pU1301上，得到尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因抑制表達(dá)載體。該表達(dá)載體的插入片段經(jīng)DNA測序鑒定后，用來轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。
該載體轉(zhuǎn)入植物中之后，可使轉(zhuǎn)基因植株的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表達(dá)受到抑制。
實(shí)施例3農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因水稻植株的篩選A.愈傷組織的誘導(dǎo)1.剝?nèi)シN子的外穎、內(nèi)穎，選擇成熟飽滿的水稻種子，裝入50ml離心管。
2.蒸餾水30ml清洗3次，70％乙醇浸泡2min，蒸餾水清洗3次，再用0.15％HgCl2浸泡15-20min，同時100rpm振蕩。
3.在無菌臺打開離心管，倒出HgCl2，用無菌水清洗種子4、5次后，把種子倒在滅菌的濾紙，放置約1h。
4.將種子置入N6固體培養(yǎng)基(10粒/25ml/瓶)，種胚朝上或接觸培養(yǎng)基，28℃，暗培養(yǎng)4周，誘導(dǎo)出水稻愈傷組織。
5.觀察誘導(dǎo)的愈傷組織，把淡黃色、致密的胚性愈傷與小盾牌分離后，轉(zhuǎn)入新的N6，繼代培養(yǎng)2周。
B.前培養(yǎng)選擇致密、相對干燥的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移至新的N6培養(yǎng)基上，28℃下暗培養(yǎng)2天。
C.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)和懸浮1.將帶有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌適量涂布接種在含有相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，對于LBA4404，28℃下暗培養(yǎng)36h即可。
2.向50ml離心管加入30ml 1/2 N6AS。然后，取滅菌小勺刮取農(nóng)桿菌，用勺背面將菌體貼在管壁輕輕拍散，使細(xì)菌懸液的OD600達(dá)到0.8～1.0。
D.感染和共培養(yǎng)1.感染把經(jīng)過前培養(yǎng)的愈傷組織集中至一個平皿，一次性轉(zhuǎn)入菌液中，輕輕轉(zhuǎn)動管子使菌液均勻分布，感染時間約15-25min。
2.共培養(yǎng)將菌液倒出，把愈傷組織在無菌濾紙上放置2h，保證菌液被吸干，接至1/2 N6AS中，20℃，暗培養(yǎng)1.5-2d。
E.農(nóng)桿菌的去除1.將共培養(yǎng)的愈傷組織裝入50ml離心管，用無菌水清洗3次以上，至液體比較清亮。
2.最后一次倒出無菌水，加入含有頭孢霉素(500mg/L)的N6液體培養(yǎng)基，于100rpm下，振蕩15-20min，重復(fù)2-3次。
1.將愈傷組織倒在無菌濾紙上吸干2h以上。
F.愈傷組織的篩選1.將干燥的愈傷組織轉(zhuǎn)入含有頭孢霉素(250mg/L)的N6培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)7-10d。
2.將沒有被農(nóng)桿菌污染的愈傷組織轉(zhuǎn)入含有頭孢霉素(250mg/L)和潮霉素(50mg/L)的N6培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)15～20d。
3.將愈傷組織轉(zhuǎn)入僅含有潮霉素(50mg/L)的N6培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)15～20d。
4.再一次將愈傷組織轉(zhuǎn)入僅含有潮霉素(50mg/L)的N6培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)15～20d。
G.分化與移栽1.將最后一次篩選的愈傷組織移入含有潮霉素(50mg/L)的MS培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)，12-15d。
2.選出長勢良好的淡黃色愈傷組織，移入MS培養(yǎng)基中，光培養(yǎng)15-20d，可看到有綠芽長出，一般15d換一次培養(yǎng)基。
3.當(dāng)綠芽的長度達(dá)到5cm左右時，剝?nèi)ブ車嘤嗟挠鷤M織，剪去根，移入1/2 MS生根培養(yǎng)中。長出根系后，將苗浸泡于自來水中，2天后即可將苗轉(zhuǎn)入土壤中，按常規(guī)方法栽種至成熟。
H.PCR檢測小量法提取轉(zhuǎn)基因水稻植株和對照植株的基因組DNA。分別用gus(5’-CTGTAGAAACCCCAACCCG-3’；5’-CCTTTGCCACGTAAGTCCG-3’)、hpt(5’AAAAGCCTGAACTCACCG-3’，5’-GCTCCATACAAGCCAACC-3’)、基因的相關(guān)引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因植株和對照植株的基因組DNA，并以pU1301質(zhì)粒作陽性對照。通過PCR(94℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，33cycles；72℃ 10min；4℃ 5min)來篩選陽性植株。PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖膠電泳分析，結(jié)果如圖2所示，可以獲得轉(zhuǎn)基因植株。
實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因水稻植株的Southern blotting鑒定A CTAB法制備植物總DNA1.稱取水稻樣本新鮮葉片8克，剪碎放入預(yù)凍的研缽中，用液氮磨成粉末。
2.轉(zhuǎn)移粉末到預(yù)凍于-20℃的玻璃瓶中，加入適量預(yù)熱至100℃的1.5×CTAB抽提液，迅速攪勻后置于56℃水浴中溫浴20分鐘。
3.取出玻璃瓶，冷卻至室溫(切忌低于15℃，以免CTAB發(fā)生沉淀)，將瓶中混合液倒入一支50ml離心管中，加入20ml氯仿/異戊醇(24∶1)。反復(fù)顛倒充分混勻，室溫下以4000rpm的速度離心20分鐘。
4.將上層液倒入另一新的50ml離心管，加入1/10體積10％CTAB(預(yù)熱至56℃)及等體積的氯仿/異戊醇，充分混勻，4000rpm室溫離心20分鐘。
5.轉(zhuǎn)移上清液至另一新的50ml離心管，加入等量的1％CTAB沉淀液，輕輕搖晃直至形成DNA絮狀沉淀。3000rpm離心10分鐘，使DNA沉淀于管底。
6.加入5ml 1M NaCl及5μl RNaseA，置于56℃水浴中過夜。待DNA完全溶解后，加10ml 95％冰乙醇使DNA沉淀。挑出DNA，用76％乙醇浸泡30分鐘脫鹽，再用95％乙醇脫水5分鐘。
7.風(fēng)干DNA，溶于適量TE溶液中，存于4℃?zhèn)溆谩?br> B.DNA的限制性消化，電泳與Southern轉(zhuǎn)移1.電泳檢測總DNA質(zhì)量。調(diào)節(jié)所有樣品DNA濃度至200-400ng/μl。
2.每樣品取2.5ng總DNA，用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，反應(yīng)體積為15μl。置于37℃恒溫箱中6小時后，加入1.5μl溴酚蘭終止酶切反應(yīng)，并用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切質(zhì)量。酶切反應(yīng)液配方如下DNA 2.5ng10×buffer1.5μlRestriction Enzyme8.0unit加水至15μl3.通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，電泳緩沖液為1×TAE，電壓40V，過夜。
4.將凝膠切成19.5×9.5cm大小，放在0.2N HCl中變性8分鐘，迅速用0.4N NaOH溶液作為轉(zhuǎn)移液通過毛細(xì)作用原理使膠上DNA片段轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜上。轉(zhuǎn)移24小時后取出膜，用2×SSC漂洗兩次(各5分鐘)，晾干放入100-120℃真空烘箱中烘烤3小時，使DNA固定于膜上。
C.探針標(biāo)記1.取適量待標(biāo)記的探針DNA，加水至一定體積，于100℃干浴變性10分鐘，冰浴5分鐘。
2.預(yù)先配制dNTP、隨機(jī)引物緩沖液和Klenow Fragment酶混合液，分裝到裝有探針DNA的Eppendorf管。
3.最后往管中加入適量體積α-32P-dctp，混勻，25℃溫浴2小時以上。
D.Southern雜交1.將新雜交膜用2×SSC打濕，裝入雜交袋中。加入適量體積(10-20ml)預(yù)熱至65℃的預(yù)雜交液，趕出氣泡，封口后于65℃恒溫?fù)u床預(yù)雜交10小時以上。使用過的舊膜雜交3小時左右即可。
2.取出標(biāo)記好的探針，加入500μl雜交液，于100℃干浴變性10分鐘，冰浴5分鐘。
3.將變性探針加入雜交袋中，趕出氣泡并封口，于65℃恒溫?fù)u床中雜交8-10小時。
E.洗膜，壓片及顯影1、雜交完成后，取出雜交膜，用2×SSC，0.1％SDS洗液在室溫下冷漂洗一次，再用預(yù)熱至65℃的洗液(1×SSC或0.5×SSC，0.1％SDS)于65℃搖床熱洗兩次，各15分鐘。晾半干，迅速用保鮮膜包裹，放入暗夾。
2、在暗室里裝入X-光片，把暗夾放在-20℃冰箱中放射自顯影4-7天，沖洗X-光片。
Southern blotting鑒定結(jié)果如圖3所示，根據(jù)鑒定結(jié)果，可選擇出外源尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因整合的轉(zhuǎn)基因植株。
實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因水稻植株的Northern blotting鑒定A.RNA的提取RNA提取用TRIZOL Reagent試劑盒(GIBCOL/BRL)，按試劑盒提供的操作指南進(jìn)行。
1.先將轉(zhuǎn)基因水稻幼苗在液氮中研磨成粉。將粉末分裝到Eppendorf中，每管分裝100mg左右。每管加入1ml TRIZOL試劑，混勻，室溫放置5min。加入氯仿200μl，用力振蕩15sec，室溫孵育2～3min。
2. 4℃下離心(12000×g，15min)，混合物分為紅色的酚-氯仿相(下相)、白色的中間相以及無色的上層水相。RNA在上層水相中。
3.轉(zhuǎn)移上層水相(500μl)到一個新的Eppendorf管中，加入1ml無水乙醇，以沉淀RNA。
4.室溫孵育10min以上，4℃條件下離心(12 000×g，10min)，可見白色的RNA沉淀貼于管底壁。
5.吸棄上清，用70％的乙醇洗滌RNA沉淀一次，4℃條件下離心(7 500×g，5min)6.吸棄上清，空氣中自然干燥，用DEPC水溶解沉淀，-70℃保存?zhèn)溆谩Ｓ米贤夥止夤舛扔嫓y定RNA濃度及存度，A260/A280＞1.8。
B.RNA電泳1.MOPS/甲醛凝膠制備 含1.5％的瓊脂糖，0.7M的甲醛，1×MOPS。
2.RNA樣品的制備和電泳 向Eppendorf管中加入8μl RNA，5.5μl甲醛，15μl甲酰胺，1.5μl 10×MOPS。于55℃加熱樣品15min使RNA變性，再加入3μl溴酚蘭和1μl溴化乙錠。上樣后，選擇最適條件進(jìn)行電泳。持續(xù)電泳約3h，直到溴分蘭到達(dá)凝膠底部。
C.通過毛細(xì)管原理將RNA轉(zhuǎn)移至膜上電泳后，用雙蒸水漂洗凝膠15min，并輕緩搖動。然后，再用10×SSC浸泡凝膠兩次，每次15min，輕緩搖動。用10×SSC作為轉(zhuǎn)移液，通過毛細(xì)管作用原理使凝膠中的RNA轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜上，轉(zhuǎn)移24h后取出膜，晾干放入80℃烘箱中烘烤2h，使RNA固定于膜上。
D.探針標(biāo)記1.模板制備 調(diào)整DNA濃度至25ng/μl，95～100℃干浴變性2min，快速置于冰上。
2.在冰上依次向Eppendorf管中加入水35μl，Labeling 5×buffer 5μl，unlabeled dNTP(dATP，dGTP，dTTP均為1.5mM)2μl，變性DNA模板1μl，BSA2μl，[α-32P]dCTP 5μl，DNA聚合酶Klenow片段1μl混勻，室溫標(biāo)記1h。
E.雜交、洗膜與放射自顯影同Southern blotting。所得結(jié)果如附圖4，根據(jù)Northern blotting鑒定結(jié)果，結(jié)合植株的形態(tài)分析，選擇出尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)增強(qiáng)或抑制的植株。
實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因水稻的花粉育性鑒定1水稻栽培轉(zhuǎn)基因水稻和作為對照的轉(zhuǎn)基因受體水稻品種H1493于春季5月上旬播種于武漢大學(xué)水稻研究基點(diǎn)試驗(yàn)田，28天秧齡，按5×8寸規(guī)格移栽，其后，保持肥水供應(yīng)，栽種植株至成熟按常規(guī)方法管理，記錄生育期。
2花粉育性觀察在水稻抽穗期，每日早晨在田間從轉(zhuǎn)基因植株和對照植株上選取已抽出1/3的稻穗，放置于4℃冰箱中備用。檢查花粉粒育性時，在每個稻穗的中上部選取當(dāng)天開放的穎花，取出花藥放置于載玻片上，加1滴KI溶液，用鑷子夾碎花藥，除去殘?jiān)?，在顯微鏡下觀察。根據(jù)形態(tài)和染色程度，將花粉分?jǐn)∮驼？捎?種類型。對照水稻植株(圖5A)和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)增強(qiáng)植株(圖5C)的花粉粒飽滿，經(jīng)KI染為黑色；尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)被抑制的植株的花粉數(shù)量少(圖5B)，形狀不規(guī)則，空癟，不為KI染色。根據(jù)花粉育性和Northernblotting鑒定，選擇出尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)被抑制的雄性不育水稻。
實(shí)施例7轉(zhuǎn)基因水稻的產(chǎn)量性狀鑒定1水稻栽培方法同上。
2產(chǎn)量性狀鑒定水稻正常成熟后，收割對照水稻植株和轉(zhuǎn)基因水稻植株作產(chǎn)量性狀考察?？疾祉?xiàng)目包括株高，穗數(shù)，結(jié)實(shí)粒數(shù)，千粒重和單株粒重。如表一和附圖6A所示，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因增強(qiáng)表達(dá)的植株比較高大，穗數(shù)、實(shí)粒數(shù)和單株產(chǎn)量均比對照大幅度增加，表現(xiàn)出明顯的生長和產(chǎn)量優(yōu)勢。根據(jù)考種結(jié)果和Southernblotting、Northern blotting鑒定，選擇出產(chǎn)量性狀得到改良，產(chǎn)量提高的水稻。
尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)抑制的植株(圖6B)形態(tài)性狀與對照基本相同，但成熟時不結(jié)實(shí)，穗為直立。
表一尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因增強(qiáng)表達(dá)水稻與對照的產(chǎn)量性狀材料 穗數(shù)結(jié)實(shí)粒數(shù) 千粒重 單株產(chǎn)量與對照比(g) (g) (％)轉(zhuǎn)基因水稻39-745 2677 23.66 63.3203轉(zhuǎn)基因水稻39-146 2425 22.27 54 173轉(zhuǎn)基因水稻14-330 1842 23.89 44 141H1493(對照) 44 1291 24.131.1100
SEQUENCE LISTING<110>武漢大學(xué)<120>尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶在水稻中的應(yīng)用<130>尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶在水稻中的應(yīng)用<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1707<212>DNA<213>水稻<400>1ggcacgaggc tcctctcctc tcatctgaca tatctcctcc cgtcctttcg aagcctctcg 60aatcgcatcg ccgagccgga tggcggtcgc cgccgacgtg aagctcgagg gcctccgcgc120cgccaccgac aagctcgacc agatcagcga gaacgagaag tccgggttca tcagcctcgt180ttcgcgctac ctcagcggcg aggcggagca gatcgagtgg agtaagatcc agaccccgac240cgacgaggtg gtggttccct acgacacgct ctcggctgct cccgaagatc tcaacgagac300gaagaagctg ctcgacaaac tcgtcgtgct caagctcaat ggaggcctcg ggacgaccat360gggctgcact ggtcccaagt ctgtcattga agtccgcaat ggctttacgt ttctagacct420tattgtgatt caaattgagt ccctgaacaa gaagtatgga tgcaatgtcc ctttgcttct480aatgaactca ttcaacactc atgatgacac acagaagatt gttgagaagt actccaactc540caacattgaa attcacactt tcaaccagag ccaatatcct cgcattgtta ctgaagactt600cttgccactt ccaagcaagg ggaagactgg caaggatggc tggtatcccc caggccatgg660tgatgtgttc ccctccttga ataacagtgg aaaacttgat accttgttgg cacagggcaa720ggagtatgtc tttgtcgcga actcggacaa cttgggtgct attgttgaca tcaagatctt780aaaccacctg atccataacc agaacgagta ctgtatggag gttactccta aaacattggc840tgatgttaaa ggtggtaccc tcatctctta cgaagggaga gttcagctgt tggagattgc900tcaagtccct gatgagcatg tgaatgaatt caagtcaatt gagaagttca agatcttcaa960taccaacaac ctgtgggtaa acttgaaggc catcaagagg ctggtagaag ctgaagcact 1020taagatggaa atcattccta accctaagga agttgatggt gtgaaagttc tgcaactcga 1080aactgcagct ggagcagcca ttcggttctt tgaaaaagca attggcatta atgttccccg 1140
ctcgagattt ctgccagtca aggctacatc tgatttgttg cttgtacagt ctgatttgta 1200caccttggtc gatggctttg tcatccgcaa cccagccaga acaaacccat caaacccttc 1260gattgagctt ggacctgagt tcaagaaggt tgccaatttc ctggcccggt ttaagtcaat 1320ccccagcatt gtcgagcttg acaccttgaa ggtctctggt gatgtctggt tcggctctgg 1380agttacactc aagggtaagg tgaccatcac cgccaagtca gggaagttgg agatcccaga 1440tggagccgtg cttgagaaca aggacatcaa cggtccggag gatctttgag gctgctcacg 1500gaaaccttcc agatatattt agctgagcgt tttgtaattg tcgtgtgcat tcggcagcca 1560gggctcgatg atcccattac agaataattg taatcatctt ggcacatccg tacttctgtt 1620ttttggtgtg ccaagggcgt tgtatttcat ttacttaaat gatctcgtaa taccatagtt 1680ttgcatgcac aaaaaaaaaa aaaaaaa 1707<210>2<211>469<212>PRT<213>水稻<400>2Met Ala Val Ala Ala Asp Val Lys Leu Glu Gly Leu Arg Ala Ala Thr1 5 10 15Asp Lys Leu Asp Gln Ile Ser Glu Asn Glu Lys Ser Gly Phe Ile Ser20 25 30Leu Val Ser Arg Tyr Leu Ser Gly Glu Ala Glu Gln Ile Glu Trp Ser35 40 45Lys Ile Gln Thr Pro Thr Asp Glu Val Val Val Pro Tyr Asp Thr Leu50 55 60Ser Ala Ala Pro Glu Asp Leu Asn Glu Thr Lys Lys Leu Leu Asp Lys65 70 75 80Leu Val Val Leu Lys Leu Asn Gly Gly Leu Gly Thr Thr Met Gly Cys85 90 95Thr Gly Pro Lys Ser Val Ile Glu Val Arg Asn Gly Phe Thr Phe Leu100 105 110Asp Leu Ile Val Ile Gln Ile Glu Ser Leu Asn Lys Lys Tyr Gly Cys115 120 125
Asn Val Pro Leu Leu Leu Met Asn Ser Phe Asn Thr His Asp Asp Thr130 135 140Gln Lys Ile Val Glu Lys Tyr Ser Asn Ser Asn Ile Glu Ile His Thr145 150 155160Phe Asn Gln Ser Gln Tyr Pro Arg Ile Val Thr Glu Asp Phe Leu Pro165 170 175Leu Pro Ser Lys Gly Lys Thr Gly Lys Asp Gly Trp Tyr Pro Pro Gly180 185 190His Gly Asp Val Phe Pro Ser Leu Asn Asn Ser Gly Lys Leu Asp Thr195 200 205Leu Leu Ala Gln Gly Lys Glu Tyr Val Phe Val Ala Asn Ser Asp Asn210 215 220Leu Gly Ala Ile Val Asp Ile Lys Ile Leu Asn His Leu Ile His Asn225 230 235 240Gln Asn Glu Tyr Cys Met Glu Val Thr Pro Lys Thr Leu Ala Asp Val245 250 255Lys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Tyr Glu Gly Arg Val Gln Leu Leu Glu260 265 270Ile Ala Gln Val Pro Asp Glu His Val Asn Glu Phe Lys Ser Ile Glu275 280 285Lys Phe Lys Ile Phe Asn Thr Asn Asn Leu Trp Val Asn Leu Lys Ala290 295 300Ile Lys Arg Leu Val Glu Ala Glu Ala Leu Lys Met Glu Ile Ile Pro305 310 315 320Asn Pro Lys Glu Val Asp Gly Val Lys Val Leu Gln Leu Glu Thr Ala325 330 335Ala Gly Ala Ala Ile Arg Phe Phe Glu Lys Ala Ile Gly Ile Asn Val340 345 350Pro Arg Ser Arg Phe Leu Pro Val Lys Ala Thr Ser Asp Leu Leu Leu355 360 365Val Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Val Asp Gly Phe Val Ile Arg Asn370 375 380Pro Ala Arg Thr Asn Pro Ser Asn Pro Ser Ile Glu Leu Gly Pro Glu385 390 395 400
Phe Lys Lys Val Ala Asn Phe Leu Ala Arg Phe Lys Ser Ile Pro Ser405410 415Ile Val Glu Leu Asp Thr Leu Lys Val Ser Gly Asp Val Trp Phe Gly420425 430Ser Gly Val Thr Leu Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Lys Ser Gly435 440 445Lys Leu Glu Ile Pro Asp Gly Ala Val Leu Glu Asn Lys Asp Ile Asn450 455 460Gly Pro Glu Asp Leu46權(quán)利要求
1.一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在水稻中的應(yīng)用。
2.尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在提高水稻產(chǎn)量中的應(yīng)用。
3.尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在控制水稻育性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在水稻中的應(yīng)用。將尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因連接到增強(qiáng)表達(dá)載體或抑制表達(dá)載體中，再將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻之中，使轉(zhuǎn)基因水稻中的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)增強(qiáng)或表達(dá)抑制。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)增強(qiáng)的水稻，其生長加快，穗長、結(jié)實(shí)粒數(shù)和單株產(chǎn)量得到了提高。而尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)被抑制的水稻，表現(xiàn)為雄性不育，其花粉為100％典敗型不育，自交不結(jié)實(shí)，異交結(jié)實(shí)正常。本發(fā)明為應(yīng)用尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因改良水稻品種開辟了新的途徑。
文檔編號C12N15/52GK1614023SQ20041006117
公開日2005年5月11日 申請日期2004年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月23日
發(fā)明者何光存, 陳榮智, 祝莉莉, 何瑞鋒 申請人:武漢大學(xué)