專利名稱：一種將穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入黃色短桿菌的電轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物材料導(dǎo)入已知微生物宿主菌載體獲得重組質(zhì)粒的方法，具體涉及到一種將重組穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入黃色短桿菌的高效電轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
黃色短桿菌，屬于短桿菌屬，常用于發(fā)酵生產(chǎn)各種氨基酸。由于其革蘭氏染色陽性，無法通過制作感受態(tài)導(dǎo)入外源DNA，因而必須通過電轉(zhuǎn)化等方法，將外源DNA導(dǎo)入黃色短桿菌，以構(gòu)建重組菌。日常，人們在將一種能在大腸桿菌和黃色短桿菌中穿梭表達的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入黃色短桿菌的過程中發(fā)現(xiàn)，以大腸桿菌DH5α為宿主菌獲得的重組質(zhì)粒，由于受到甲基化修飾作用，在導(dǎo)入某些黃色短桿菌菌種后，會被這些菌體內(nèi)的限制性內(nèi)切酶識別并切割成片段，因而很難獲得含有完整重組質(zhì)粒的菌株。為了克服這些困難，人們亟待需要發(fā)明一種有效的方法，可以減少大腸桿菌對穿梭質(zhì)粒的甲基化修飾作用，以及黃色短桿菌對穿梭質(zhì)粒的限制性酶切作用，使該穿梭質(zhì)粒能夠通過電轉(zhuǎn)化方法高效地導(dǎo)入黃色短桿菌中，實現(xiàn)穩(wěn)定復(fù)制和傳遞。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前在大腸桿菌和黃色短桿菌中穿梭表達的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入黃色短桿菌的過程中，以大腸桿菌DH5α為宿主菌獲得的重組質(zhì)粒，由于受到甲基化修飾作用，在導(dǎo)入某些黃色短桿菌菌種后，會被這些菌體內(nèi)的限制性內(nèi)切酶識別并切割成片段，因而很難獲得含有重組質(zhì)粒的問題。
本發(fā)明研究并掌握將一種能在大腸桿菌和黃色短桿菌中穿梭表達的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入黃色短桿菌的快速有效的方法。即本發(fā)明提供一種特殊的培養(yǎng)基。
本發(fā)明提供一種將黃色短桿菌菌進行處理的方法。
本發(fā)明提供一種特殊的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方硫酸銨 1.8～2.2g/l磷酸二氫鉀 13～14g/l七水合硫酸亞鐵 0.45～0.65mg/l七水合硫酸鎂 0.2～0.3g/l在對攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α進行培養(yǎng)的過程中，減少大腸桿菌對穿梭質(zhì)粒的甲基化修飾作用。
本發(fā)明還提供一種將黃色短桿菌菌體進行適當(dāng)處理的方法，即利用0.5～2μg/ml氨芐青霉素和0.1～1.5％吐溫80對黃色短桿菌的菌體進行處理，可在菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上形成小孔，引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流，因而細(xì)胞正常的生長和代謝受到影響，使其處于休眠態(tài)，以減少黃色短桿菌對穿梭質(zhì)粒的限制性酶切作用。使該穿梭質(zhì)粒能夠通過電轉(zhuǎn)化方法高效地導(dǎo)入黃色短桿菌中，并能穩(wěn)定復(fù)制和傳遞。
通過以上技術(shù)發(fā)明，可達到如下效果1、通過采用本發(fā)明提供的特殊培養(yǎng)基對攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α進行培養(yǎng)，可明顯減少大腸桿菌對穿梭質(zhì)粒的甲基化修飾作用。同時，使待轉(zhuǎn)化黃色短桿菌處于休眠態(tài)。
2、使該穿梭質(zhì)粒能夠通過電轉(zhuǎn)化方法高效地導(dǎo)入黃色短桿菌中，并能穩(wěn)定復(fù)制和傳遞。電轉(zhuǎn)化效率達到2.0×103。而采用一般的電轉(zhuǎn)化方法很難獲得含有重組質(zhì)粒的菌株。


略
具體實施例方式
為實現(xiàn)上述技術(shù)效果，本發(fā)明的
具體實施例方式1、本發(fā)明選用的重組穿梭質(zhì)粒pECA1含有質(zhì)粒pBL1和pUC18的復(fù)制起點以及外源基因片段，可在黃色短桿菌和大腸桿菌DH5α中穿梭復(fù)制和表達。當(dāng)采用豐富培養(yǎng)基對攜帶穿梭質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α進行培養(yǎng)時，質(zhì)粒DNA由于受到甲基化修飾作用，在導(dǎo)入某些黃色短桿菌菌種后，會被這些菌體內(nèi)的限制性內(nèi)切酶識別并切割成片段，因而很難獲得含有完整重組質(zhì)粒的菌株。
本發(fā)明通過采用下述培養(yǎng)基對攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α進行培養(yǎng)，可明顯減少大腸桿菌對穿梭質(zhì)粒的甲基化修飾作用。
培養(yǎng)基配方硫酸銨 2g/l磷酸二氫鉀 13.6g/l七水合硫酸亞鐵 0.5mg/l七水合硫酸鎂 0.25g/l2、將上述培養(yǎng)基用氫氧化鉀調(diào)pH值為7.0，分裝成小瓶滅菌，接種前加入無菌的葡萄糖溶液至終濃度為2g/l；加入無菌的鹽酸硫胺素溶液至終濃度為0.5mg/l；加入氯霉素溶液至終濃度為20μg/ml。
3、將攜帶pECA1大腸桿菌DH5α接種在培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12～14小時，收獲細(xì)胞，堿解法提取質(zhì)粒DNA，氯化銫-溴化乙錠平衡梯度離心法純化質(zhì)粒DNA，并溶于適量的無菌水中使DNA濃度為8～10μg/ml。
4、待轉(zhuǎn)化黃色短桿菌C-12的準(zhǔn)備。該菌種可通過中國微生物管理委員會普通微生物保藏中心購置，也可通過市場購置，只要對大腸桿菌DH5α來源的質(zhì)粒DNA具有強的限制性酶切作用的菌種即可。
5、將裝有菌體的三角瓶在冰上放置10分鐘，倒入預(yù)冷的離心管中4℃下6000轉(zhuǎn)離心10分鐘，小心倒去上清液，10％甘油洗滌4次，將菌體溶于300μl10％甘油備用。
6、采用Bio-Rad MicroPulserTM型電擊儀，0.2cm電擊杯，吸取20μl新鮮制備的菌懸液，加入1～2μl的質(zhì)粒DNA，混勻后加入預(yù)冷的電擊杯內(nèi)。調(diào)節(jié)電擊儀，使用Ec2標(biāo)準(zhǔn)程序，啟動電脈沖，儀器應(yīng)顯示出6ms內(nèi)具有12.5kV/cm的電場強度。
7、取出電擊杯，吸出混懸液，加入1ml SOC培養(yǎng)液，30℃輕柔振蕩培養(yǎng)2小時。
8、吸取200μl電擊轉(zhuǎn)化細(xì)胞，鋪于含有20μg/ml氯霉素的LB瓊脂板，30℃倒置培養(yǎng)3～5天，可見轉(zhuǎn)化克隆出現(xiàn)。
實施例一培養(yǎng)基配方一硫酸銨 2g/l磷酸二氫鉀 13.6g/l七水合硫酸亞鐵 0.5mg/l七水合硫酸鎂 0.25g/l利用上述培養(yǎng)基，通過對攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α進行培養(yǎng)，達到減少大腸桿菌對穿梭質(zhì)粒的甲基化修飾作用，使待轉(zhuǎn)化黃色短桿菌處于休眠態(tài)，將穿梭質(zhì)粒能夠通過電轉(zhuǎn)化方法高效地導(dǎo)入黃色短桿菌中，并能實現(xiàn)穩(wěn)定復(fù)制和傳遞。
實施例二培養(yǎng)基配方二硫酸銨 1.8g/l磷酸二氫鉀 13g/l七水合硫酸亞鐵 0.45mg/l
七水合硫酸鎂 0.2g/l利用上述培養(yǎng)基，通過對攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α進行培養(yǎng)，達到減少大腸桿菌對穿梭質(zhì)粒的甲基化修飾作用，使待轉(zhuǎn)化黃色短桿菌處于休眠態(tài)，將穿梭質(zhì)粒能夠通過電轉(zhuǎn)化方法高效地導(dǎo)入黃色短桿菌中，并能實現(xiàn)穩(wěn)定復(fù)制和傳遞。
實施例三培養(yǎng)基配方三硫酸銨 2.1g/l磷酸二氫鉀 13.9g/l七水合硫酸亞鐵 0.64mg/l七水合硫酸鎂 0.3g/l利用上述培養(yǎng)基，通過對攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α進行培養(yǎng)，達到減少大腸桿菌對穿梭質(zhì)粒的甲基化修飾作用，使待轉(zhuǎn)化黃色短桿菌處于休眠態(tài)，將穿梭質(zhì)粒能夠通過電轉(zhuǎn)化方法高效地導(dǎo)入黃色短桿菌中，并能實現(xiàn)穩(wěn)定復(fù)制和傳遞。
實施例四待轉(zhuǎn)化黃色短桿菌C-12的制備待轉(zhuǎn)化黃色短桿菌C-12可通過中國微生物管理委員會普通微生物保藏中心購置，也可通過市場購置，只要對大腸桿菌DH5α來源的質(zhì)粒DNA具有強的限制性酶切作用的菌種即可。
將6日內(nèi)新活化的菌種先接種在10ml液體LB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)8小時，其O.D.550約為0.2左右，取1ml接種于內(nèi)裝100ml液體LB的500ml三角燒瓶中30℃繼續(xù)培養(yǎng)至O.D.550約為1.0。加入終濃度為0.5μg/ml的氨芐青霉素和終濃度為1.5％的吐溫80，輕微振蕩1小時。氨芐青霉素和吐溫80均對黃色短桿菌的細(xì)胞壁具有一定的破壞作用，可在菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上形成小孔，引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流，因而細(xì)胞正常的生長和代謝受到影響，但細(xì)菌并未死亡，而是處于一種休眠態(tài)，待條件適宜時，可以繼續(xù)生長繁殖。
權(quán)利要求
1.一種能在大腸桿菌和黃色短桿菌中穿梭表達的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入黃色短桿菌的快速有效的方法，其特征在于，通過采用專用培養(yǎng)基對攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α進行培養(yǎng)，并將目的菌進行休眠態(tài)處理。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于配方硫酸銨 1.8～2.2g/l磷酸二氫鉀 13～14g/l七水合硫酸亞鐵 0.45～0.65mg/l七水合硫酸鎂 0.2～0.3g/l通過對攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α在上述培養(yǎng)基培養(yǎng)過程中，減少大腸桿菌對穿梭質(zhì)粒的甲基化修飾作用。
3.如權(quán)利要求1所述的將黃色短桿菌目的菌進行休眠態(tài)處理，其特征在于，用終濃度0.5～2μg/ml的氨芐青霉素和0.1～1.5％吐溫80對黃色短桿菌的細(xì)胞壁破壞處理，在菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上形成小孔，引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流，使細(xì)胞正常的生長和代謝受到影響，使其處于休眠態(tài)，以減少黃色短桿菌對穿梭質(zhì)粒的限制性酶切，使該穿梭質(zhì)粒能夠通過電轉(zhuǎn)化方法高效地導(dǎo)入黃色短桿菌中，并能穩(wěn)定復(fù)制和傳遞。
全文摘要
本發(fā)明公開一種能在大腸桿菌和黃色短桿菌中穿梭表達的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入黃色短桿菌的快速有效的方法。本發(fā)明通過對攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α在一種特殊的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)過程中，將黃色短桿菌菌進行休眠態(tài)處理工藝?？朔嗽诖竽c桿菌和黃色短桿菌中穿梭表達的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入黃色短桿菌的過程中，以大腸桿菌DH5α為宿主菌獲得的重組質(zhì)粒過程中，減少大腸桿菌對穿梭質(zhì)粒的甲基化修飾作用，以及黃色短桿菌對穿梭質(zhì)粒的限制性酶切作用，使該穿梭質(zhì)粒能夠通過電轉(zhuǎn)化方法高效地導(dǎo)入黃色短桿菌中，并能穩(wěn)定復(fù)制和傳遞，電轉(zhuǎn)化效率達到2.0×10
文檔編號C12N15/77GK1718732SQ200410060200
公開日2006年1月11日 申請日期2004年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月7日
發(fā)明者崔春生, 謝玉清 申請人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所