專利名稱：實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)血液樣品中癌細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種新的檢測(cè)血液中微量癌細(xì)胞的方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是威脅人類健康的重要疾病，目前全球每年至少有700萬人死于惡性腫瘤，其中我國(guó)約130萬，惡性腫瘤已成為繼心腦血管病之后人類因疾病死亡的第二位原因。惡性腫瘤中90％以上屬于上皮來源的實(shí)體腫瘤(俗稱癌癥，如肺癌、肝癌、胃癌等)，這些惡性實(shí)體腫瘤(以下簡(jiǎn)稱腫瘤)致死的主要原因是轉(zhuǎn)移，尤其是全身轉(zhuǎn)移。臨床觀察到，對(duì)病理檢查無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期腫瘤患者，根治性手術(shù)后仍有相當(dāng)一部分因全身轉(zhuǎn)移而最終死亡，提示在手術(shù)時(shí)體內(nèi)已經(jīng)存在少量癌細(xì)胞全身播散但應(yīng)用現(xiàn)有的診斷手段(如影像學(xué)和核醫(yī)學(xué)等)尚無法發(fā)現(xiàn)，這類隱匿性的轉(zhuǎn)移(OccultMetastasis，或稱微轉(zhuǎn)移，Micrometastasis)是患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要根源。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)揭示，當(dāng)瘤重達(dá)到1克(直徑≥1cm)時(shí)，每天約有106癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤脫落進(jìn)入血液，這些癌細(xì)胞在血液中很少死亡，它們通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)到各器官后很快穿越血管內(nèi)皮屏障進(jìn)入組織，其中98％的癌細(xì)胞在組織內(nèi)凋亡并被機(jī)體清除，但仍有2％的癌細(xì)胞存活下來并發(fā)展成為轉(zhuǎn)移病灶。德國(guó)學(xué)者曾對(duì)骨髓中的微轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，證明此類癌細(xì)胞能夠在體外生長(zhǎng)，并且癌細(xì)胞活躍生長(zhǎng)者生存期短。因此，血液中出現(xiàn)癌細(xì)胞是腫瘤轉(zhuǎn)移的一項(xiàng)早期預(yù)警指標(biāo)，預(yù)示轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增高。
建立腫瘤轉(zhuǎn)移的早期預(yù)警系統(tǒng)在臨床上具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，因?yàn)樵撓到y(tǒng)不僅有助于對(duì)患者進(jìn)行預(yù)后評(píng)估，而且更重要的是可以對(duì)術(shù)后轉(zhuǎn)移進(jìn)行早期診斷和及時(shí)治療，以期鞏固療效和改善預(yù)后。此外，檢測(cè)血液中癌細(xì)胞還可以作為評(píng)估晚期腫瘤化療療效的一項(xiàng)分子標(biāo)志，文獻(xiàn)報(bào)道，化療后血液中癌細(xì)胞消失者預(yù)后好、生存期長(zhǎng)。因此近十年來從血液中檢測(cè)癌細(xì)胞受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。隨著現(xiàn)代免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前已經(jīng)能夠?qū)ρ褐械奈⒘堪┘?xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，表1列舉了近年來對(duì)6種常見腫瘤患者血液中癌細(xì)胞檢測(cè)的若干結(jié)果，上述報(bào)道中有6篇附有2年以上的隨訪結(jié)果，證明血液中檢出癌細(xì)胞與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。根據(jù)上海市腫瘤研究所的最新統(tǒng)計(jì)資料，這些腫瘤的發(fā)病率居上海市區(qū)惡性腫瘤的前10位，占惡性腫瘤總發(fā)病率的70％以上。
表1惡性實(shí)體腫瘤患者血液中微量癌細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

注CEA癌胚抗原；CK細(xì)胞角蛋白；S5A肺癌特異性單抗識(shí)別的抗原；MAGE黑色素瘤抗原；EPCAM上皮細(xì)胞粘附分子。RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)；FCM流式細(xì)胞儀檢測(cè)；IHC免疫組化。
但是，目前血液中癌細(xì)胞的檢測(cè)技術(shù)還不完善，存在許多問題，一是檢測(cè)方法不統(tǒng)一，包括各家采用的檢測(cè)技術(shù)和腫瘤標(biāo)志不一致，研究結(jié)果很難相互比較；二是敏感性較低，通常只能從105正常血細(xì)胞中檢出1個(gè)癌細(xì)胞，其檢測(cè)極限相當(dāng)于40-100個(gè)癌細(xì)胞/ml全血(按每毫升血含4-10×106白細(xì)胞計(jì)算)，可能會(huì)有一部分患者漏診；三是大部分腫瘤標(biāo)志基因在正常白細(xì)胞中有“非法表達(dá)”(Illegitimate Expression)現(xiàn)象，如采用RT-PCR檢測(cè)CK-19 mRNA在一部分健康人外周血中可能出現(xiàn)“假陽(yáng)性”。
因此，本領(lǐng)域中迫切需要建立一種敏感性高、特異性好、適用面廣的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明第一方面提供了一種體外檢測(cè)樣品中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的方法，所述方法包括以下步驟在端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因第1521-1819位核苷酸區(qū)間制備標(biāo)準(zhǔn)品；根據(jù)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因第1657-1787位核苷酸區(qū)間設(shè)計(jì)引物及Tagman探針；用Taqman技術(shù)對(duì)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶mRNA的拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析。
本發(fā)明第二方面還提供了一種體外實(shí)時(shí)定量檢測(cè)血液樣品中癌細(xì)胞的方法，它包括以下步驟用磁性分選技術(shù)從血液樣品中分離上皮細(xì)胞粘附分子陽(yáng)性細(xì)胞；從上述細(xì)胞中抽提RNA并獲得cDNA；在端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因第1521-1819位核苷酸區(qū)間制備標(biāo)準(zhǔn)品；根據(jù)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因第1657-1787位核苷酸區(qū)間設(shè)計(jì)引物及Tagman探針；用Taqman技術(shù)對(duì)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶mRNA的拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析。
本發(fā)明第三方面提供了一種用于定量檢測(cè)血液樣品中癌細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包含引物，DNA標(biāo)準(zhǔn)品和Taqman探針，其中所述引物及探針是根據(jù)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因第1657-1787位核苷酸區(qū)間設(shè)計(jì)得到，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因第1521-1819位核苷酸區(qū)間制得。
本發(fā)明的方法通過免疫磁性分選技術(shù)從血液中分離上皮細(xì)胞粘附分子(EPCAM)陽(yáng)性細(xì)胞后，采用單個(gè)細(xì)胞實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)俘獲的上皮細(xì)胞中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)mRNA表達(dá)，從而對(duì)血液中的癌細(xì)胞作出診斷。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是一，可用于幾乎所有上皮性惡性腫瘤的檢測(cè)，適用面廣；二，可以對(duì)每毫升僅含1個(gè)癌細(xì)胞的血液樣本進(jìn)行檢測(cè)，具有較高的特異性和敏感性。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了hTERT基因表達(dá)的常規(guī)PCR分析結(jié)果。
圖2顯示了hTERT基因表達(dá)值經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的細(xì)胞數(shù)量與檢測(cè)結(jié)果呈線性關(guān)系。
圖3A和圖3B顯示了hTERT基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的結(jié)果。
圖4A和圖4B顯示了GAPDH基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的結(jié)果。
具體實(shí)施方案針對(duì)本領(lǐng)域中所存在的上述問題，本發(fā)明提出了一套新的解決方案。
首先，本發(fā)明選擇上皮細(xì)胞粘附分子(Epithelial Cell Adhesion Molecule，EPCAM)和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(Human Telomerase Reverse Transcriptase，hTERT)作為區(qū)分癌細(xì)胞、正常上皮細(xì)胞和血液中白細(xì)胞的分子標(biāo)志，從而提供了能夠適用所有實(shí)體腫瘤的檢測(cè)技術(shù)。
EPCAM是二十世紀(jì)七十年代研究腫瘤特異性單克隆抗體時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種胃腸道腫瘤抗原，近二十余年來的研究顯示該抗原是實(shí)體腫瘤的一種共同抗原，在肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、食道癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、宮頸癌、卵巢癌、膀胱癌和腎細(xì)胞癌等實(shí)體腫瘤中均呈高表達(dá)。EPCAM屬于分子量約40KD的細(xì)胞膜糖蛋白，其主要功能是作為細(xì)胞膜的離子通道并涉及細(xì)胞之間的同源性粘附，并且EPCAM過表達(dá)抑制了上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(E-Cadherin)介導(dǎo)的細(xì)胞粘附，從而有利于癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，因而活躍增殖的高轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞其抗原表達(dá)較高。臨床研究表明，EPCAM過表達(dá)者容易轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差。但EPCAM在正常上皮細(xì)胞表面也有表達(dá)，因而該抗原作為腫瘤標(biāo)志的特異性不夠理想。
腫瘤細(xì)胞的一個(gè)基本特征是無限制增殖，該特征與hTERT mRNA異常表達(dá)有關(guān)。目前已知細(xì)胞增殖受染色體末端的DNA序列控制，這段DNA由TTAGGG重復(fù)序列組成，稱為端粒。當(dāng)細(xì)胞每次分裂后，端粒就丟失約150個(gè)堿基長(zhǎng)度的DNA片段，因此隨著細(xì)胞的不斷增殖，其端粒DNA長(zhǎng)度不斷縮短，但端粒DNA縮短到一定程度時(shí)，細(xì)胞就停止生長(zhǎng)進(jìn)入老化期死亡。惡性腫瘤細(xì)胞通過啟動(dòng)端粒酶基因表達(dá)逃脫上述控制。端粒酶是人體細(xì)胞內(nèi)的一種逆轉(zhuǎn)錄酶，由端粒RNA、端粒酶相關(guān)蛋白(TEP1)和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT組成，當(dāng)TEP1與DNA末端的端粒序列結(jié)合時(shí)，hTERT就能夠以端粒RNA為模板復(fù)制端粒DNA，從而使得癌細(xì)胞維持恒定的端粒長(zhǎng)度，有利于癌細(xì)胞無限制生長(zhǎng)。由于成年人體內(nèi)絕大部分細(xì)胞，除了原始的干細(xì)胞、生殖細(xì)胞和活化的淋巴細(xì)胞外，均缺乏端粒酶活性，也不表達(dá)hTERT mRNA，而85％以上的腫瘤中均可以檢測(cè)到端粒酶活性和hTERT mRNA，這一特性使得hTERT成為腫瘤細(xì)胞的一種理想標(biāo)志。
因此，將EPCAM與hTERT組合可以鑒別正常上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞，正常上皮細(xì)胞的表型為EPCAM+hTERT-，而癌細(xì)胞為EPCAM+hTERT+。
第二，在血液中正常白細(xì)胞與癌細(xì)胞的鑒別也是一個(gè)十分棘手的問題。由于血液中癌細(xì)胞含量甚少，采用病理形態(tài)觀察無法找到癌細(xì)胞。目前普遍采用RT-PCR等高度敏感的分子檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行分析，但由于正常白細(xì)胞存在腫瘤標(biāo)志基因的非法表達(dá)現(xiàn)象，假陽(yáng)性問題很難排除。通過使用免疫磁性分選技術(shù)，可以排除檢測(cè)過程中正常白細(xì)胞的干擾、消除假陽(yáng)性和提高癌細(xì)胞診斷率。
第三，采用磁性分選技術(shù)從血液中分離獲得的EPCAM+細(xì)胞多數(shù)是腫瘤細(xì)胞，但其中含有少量正常上皮細(xì)胞的可能性還不能完全排除，因此尚需進(jìn)一步鑒別。但經(jīng)過磁性分選后得到的細(xì)胞數(shù)量很少，必須采用高度敏感的檢測(cè)技術(shù)才能分析。目前國(guó)外已有采用RT-PCR或IHC等技術(shù)分析俘獲的上皮細(xì)胞中癌細(xì)胞成分的成功報(bào)道，但這些分析方法的敏感性還可以進(jìn)一步提高，例如，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)至少能夠使檢測(cè)的敏感性提高100倍以上。
實(shí)時(shí)定量PCR是根據(jù)Taqman技術(shù)發(fā)展起來的一項(xiàng)新穎的基因檢測(cè)方法，其原理是將靶基因特異性的一組引物和熒光標(biāo)記探針與模板cDNA進(jìn)行雜交，然后在多聚酶鏈反應(yīng)過程中利用Taq酶的3’-核酸外切酶活性水解探針3’-端的熒光淬滅基團(tuán)，獲得熒光激發(fā)信號(hào)，后者與模板量呈正相關(guān)。應(yīng)用這一技術(shù)可以從1-10pg RNA中檢測(cè)到靶基因mRNA的表達(dá)，由于1個(gè)細(xì)胞中至少含有10pg RNA，因而實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)極限可以達(dá)到1個(gè)細(xì)胞/樣本。
本發(fā)明提供了一種單個(gè)細(xì)胞實(shí)時(shí)定量PCR(Single Cell Quantitative Real-time PCR)技術(shù)，用于檢測(cè)hTERT基因表達(dá)，其檢測(cè)極限達(dá)到1個(gè)細(xì)胞/樣本，與常規(guī)PCR比較敏感性提高了100倍。
本發(fā)明另一方面還提供了一套PCR引物及探針，能夠特異性地?cái)U(kuò)增hTERT和內(nèi)參照基因GAPDH的mRNA。具體而言，發(fā)明者根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中公開發(fā)表的hTERT(AF015950)和GAPDH(M33197)基因序列，采用美國(guó)賽百盛公司提供的引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因第1521-1819位核苷酸區(qū)間和第1657-1787位核苷酸區(qū)間分別設(shè)計(jì)了2組引物和探針，建立了hTERT和GAPDH的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法。
然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠理解，列舉上述具體的兩組引物和探針僅僅是為了描述本發(fā)明，它們并不起任何限制性的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了本說明書后，能夠采用常規(guī)的手段在端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因第1521-1819位核苷酸區(qū)間內(nèi)通過適當(dāng)選擇其他引物來合成DNA標(biāo)準(zhǔn)品，也能夠在端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因第1657-1787位核苷酸區(qū)間內(nèi)選擇其它合適的引物和探針來達(dá)到本發(fā)明的目的。
實(shí)時(shí)定量PCR通常分為相對(duì)定量和絕對(duì)定量二類。相對(duì)定量分析以靶基因陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)，通過分析靶基因與內(nèi)參照基因(如GAPDH等)的比值，獲得待測(cè)樣本中靶基因表達(dá)的相對(duì)值。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是容易開發(fā)，但所得的數(shù)值受陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞的影響，不同的實(shí)驗(yàn)室若采用不同的陽(yáng)性細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)，則結(jié)果難以相互比較。絕對(duì)定量是采用拷貝數(shù)已知的DNA片段作為標(biāo)準(zhǔn)，該片段可采用基因克隆或PCR擴(kuò)增獲得。由于絕對(duì)定量檢測(cè)是以一種可以標(biāo)準(zhǔn)化的DNA參照物作為基準(zhǔn)，因而不同實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果具有可比性。絕對(duì)定量PCR檢測(cè)技術(shù)是定量PCR的發(fā)展方向，近年來已被越來越多的研究者所采用。目前國(guó)外多采用相對(duì)定量PCR檢測(cè)癌細(xì)胞中hTERT mRNA表達(dá)，其局限性已被大家所認(rèn)識(shí)。本發(fā)明采用絕對(duì)定量PCR方法較好地解決了上述問題。
癌細(xì)胞稀釋試驗(yàn)顯示，該方法的檢測(cè)極限達(dá)到1個(gè)癌細(xì)胞/樣本，因而發(fā)明者將該技術(shù)稱為單個(gè)細(xì)胞實(shí)時(shí)定量PCR(Single Cell Quantitative Real-time PCR)。將該方法與常規(guī)PCR進(jìn)行了比較，證明實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的敏感性可以提高100倍。此外，發(fā)明者應(yīng)用該方法對(duì)10例正常肺組織和55例肺癌組織中hTERT mRNA含量進(jìn)行了分析，確定了正常肺組織中hTERT基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)值。按此標(biāo)準(zhǔn)，肺癌組織中hTERT陽(yáng)性表達(dá)率為69.1％。
另外，發(fā)明者對(duì)27例健康人和60例晚期肺癌病人血液中癌細(xì)胞進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示健康人血液經(jīng)EPCAM特異性免疫磁性分選后未能檢出癌細(xì)胞，肺癌病人血液中癌細(xì)胞檢測(cè)陽(yáng)性率為71.7％。說明本申請(qǐng)具有高度的特異性和敏感性，可以對(duì)血液中存在的微量癌細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。
以下借助非限制性實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。
實(shí)施例1單個(gè)細(xì)胞實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)技術(shù)1.1材料與方法人體肺癌細(xì)胞株H460由美國(guó)德州大學(xué)MD Anderson癌癥中心Paul J Chiao教授惠贈(zèng)。胎牛血清及DMEM培養(yǎng)液為GIBCO公司產(chǎn)品。Trizol RNA抽提試劑盒購(gòu)自上海申能博采生物科技有限公司。RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)自立陶宛MBI Fermentas公司。PCR引物由上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程公司。
根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中公開發(fā)表的hTERT(AF015950)和GAPDH(M33197)基因序列，采用美國(guó)賽百盛公司提供的引物設(shè)計(jì)軟件，分別設(shè)計(jì)了2組引物(表2)。
表2 PCR引物及探針序列

選擇活躍增殖期細(xì)胞按試劑盒要求抽提總RNA，采用紫外分光光度計(jì)(Biophotometer，德國(guó)Eppendorf公司)測(cè)定A260及A280。
取2μg RNA按試劑盒要求合成cDNA，反應(yīng)體積為20μl。
(1)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)(a)DNA標(biāo)準(zhǔn)品制備應(yīng)用引物1對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購(gòu)自上海申能博彩公司)純化后采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定雙鏈DNA含量，純化產(chǎn)物中的基因拷貝數(shù)按下述公式計(jì)算基因拷貝數(shù)/μl＝A260/13.2×片斷長(zhǎng)度(kb)]×6.02×1011
(b)定量PCR反應(yīng)母液10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μl，250mM MgCl20.75μl，100mM上游及下游引物2各0.1μl(400nM)，50μM熒光素標(biāo)記探針0.1μl(200nM)，10mM dNTP 0.5μl，熱啟動(dòng)Taq酶(TaKaRa Ex Taq HS)0.25μl(1.25U)，加DEPC-H20至23μl。上述反應(yīng)母液保存于-70℃。
(c)定量PCR反應(yīng)液23μl反應(yīng)母液中加入2μl cDNA。
(d)定量PCR反應(yīng)條件50℃預(yù)熱300秒；95℃變性300秒；95℃20秒，60℃60秒，40個(gè)循環(huán)，60℃檢測(cè)；37℃30秒。
定量PCR儀為L(zhǎng)ightCycler(瑞士Roche公司)。
(2)常規(guī)PCR檢測(cè)PCR反應(yīng)混合液與定量PCR同，不含熒光素標(biāo)記探針，加石臘油30μl覆蓋。
PCR反應(yīng)條件為95℃變性5min；95℃30s，60℃45s，72℃72s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。
PCR產(chǎn)物經(jīng)1.6％瓊脂糖電泳100V 30min，RB染色攝片。
1.2結(jié)果A、實(shí)時(shí)定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線在基因拷貝數(shù)為105-108范圍內(nèi)，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)能夠給出線性結(jié)果，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R均＞0.999(見圖3和圖4)。此外，反應(yīng)母液保存于-70℃條件下在6個(gè)月內(nèi)非常穩(wěn)定，不同實(shí)驗(yàn)間誤差≤5％。
B、實(shí)時(shí)定量PCR與常規(guī)PCR結(jié)果比較將H460細(xì)胞稀釋至2×102/ml-2×107/ml，分別取50μl(內(nèi)含10-100萬個(gè)癌細(xì)胞)抽提RNA并全部用于合成cDNA。取cDNA產(chǎn)物的1/10(2μl)進(jìn)行常規(guī)PCR及定量PCR分析，比較二者的檢測(cè)敏感性。
圖1顯示了常規(guī)PCR的分析結(jié)果，表明該方法在100個(gè)癌細(xì)胞/樣本時(shí)可以觀察到產(chǎn)物條帶。
表3為采用定量PCR的分析結(jié)果，2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，在1-105細(xì)胞范圍內(nèi)，hTERT基因表達(dá)值與細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)(圖3)，檢測(cè)極限為1個(gè)癌細(xì)胞/反應(yīng)。因而定量PCR的檢測(cè)敏感性較常規(guī)PCR提高100倍。
表3 H460細(xì)胞系列稀釋后定量PCR檢測(cè)hTERT基因表達(dá)

*hTERT mRNA拷貝數(shù)/反應(yīng)實(shí)施例2肺癌組織hTERT基因表達(dá)的定量PCR分析2.1材料與方法55例非小細(xì)胞肺癌，男性42例，女性13例。所有腫瘤組織均經(jīng)病理檢查證實(shí)，組織類型為腺癌22例，鱗癌20例，腺鱗癌13例。病理分期為I期18例，II期12例，III期25例。
10例正常肺組織取自距離肺癌病灶5cm以上的手術(shù)切除肺葉，經(jīng)病理檢查不含癌組織。
實(shí)驗(yàn)所用試劑及方法詳見實(shí)施例1。
2.2結(jié)果10例正常肺組織中hTERT表達(dá)值為4.33±2.41(單位拷貝數(shù)/103GAPDH拷貝)。55例肺癌組織中hTERT表達(dá)值為45.82±159.11。以正常肺組織hTERT均數(shù)+2標(biāo)準(zhǔn)差(10.0)作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，則肺癌中hTERT陽(yáng)性率為69.1％(38/55例)。
實(shí)施例3肺癌病人外周血微轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞中hTERT基因表達(dá)的定量PCR分析3.1材料與方法60例IIIb-IV期肺癌患者，男性38例，女性22例，組織類型為腺癌55例，肺泡細(xì)胞癌5例，其中42例未接受過手術(shù)治療，20例為術(shù)后復(fù)發(fā)。
27例健康志愿者，男性20例，女性7例，均為在校大學(xué)生。
所有人員均在知情同意下采集外周血5ml，10U/ml肝素抗凝。
血液樣本經(jīng)1500rpm離心10min后去血漿，用生理鹽水加至5ml，然后每樣本中加入50μl EPCAM抗體交聯(lián)的免疫微球(挪威Dynal Biotech ASA公司)，在室溫下以30rpm轉(zhuǎn)速顛倒混勻2小時(shí)，按試劑盒要求分離陽(yáng)性細(xì)胞組分。-70℃保存待測(cè)。
實(shí)驗(yàn)所用試劑及方法詳見實(shí)施例1。
3.2結(jié)果27例健康人血液樣本中20例未檢測(cè)到GAPDH mRNA，表明經(jīng)磁性分選后未獲得上皮細(xì)胞。7例樣本檢測(cè)到GAPDH基因表達(dá)，但hTERT mRNA低于陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，說明所得的上皮細(xì)胞中不含癌細(xì)胞。
60例肺癌血液樣本11例未檢測(cè)到GAPDH mRNA表達(dá)，49例檢測(cè)到GAPDH基因表達(dá)，其中6例hTERT含量在陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)以下，其余43例中hTERT含量高于陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，癌細(xì)胞檢測(cè)陽(yáng)性率為71.7％(43/60例)。
表4列舉了腫瘤原發(fā)組織和外周血癌細(xì)胞中hTERT基因表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示，hTERT的陽(yáng)性檢出率在二者間基本相同。說明本申請(qǐng)具有高度的特異性和敏感性，可以對(duì)血液中存在的微量癌細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。
表4肺癌原發(fā)組織和外周血癌細(xì)胞hTERT基因表達(dá)分析

雖然上面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了具體描述，但是熟悉本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員均了解，在不違背本發(fā)明的原則和精神的情況下，根據(jù)本說明書及所附權(quán)利要求書中公開的內(nèi)容，可對(duì)本發(fā)明做出各種變動(dòng)和改進(jìn)。因此，所有這些變動(dòng)和改進(jìn)均應(yīng)包括在所附權(quán)利要求書中所要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
序列表<110>董，強(qiáng)剛<120>實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)血液樣品中癌細(xì)胞的方法<130>041070<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1cacatcgctc agacaccatg 20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2aggcattgct gatgatcttg a 21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3ggaaggtgaa ggtcggagtc 20<210>4
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4gaagatggtg atgggatttc 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>探針<400>5caagcttccc gttctcagcc 20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6ggaacaccaa gaagttcatc t 21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7acaccataac tccacacatc a 21<210>8
<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8ccgtctgcgt gaggagatc19<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9tccggtagaa aaagagcctg tt22<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>探針<400>10ggccaagttc ctgcactggc tga 2權(quán)利要求
1.一種體外檢測(cè)樣品中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟在端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因第1521-1819位核苷酸區(qū)間制備標(biāo)準(zhǔn)品；根據(jù)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因第1657-1787位核苷酸區(qū)間設(shè)計(jì)引物及Tagman探針；用Taqman技術(shù)對(duì)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶mRNA的拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析。
2.一種體外實(shí)時(shí)定量檢測(cè)血液樣品中癌細(xì)胞的方法，其特征在于，它包括以下步驟用磁性分選技術(shù)從血液樣品中分離上皮細(xì)胞粘附分子陽(yáng)性細(xì)胞；從上述細(xì)胞中抽提RNA并獲得cDNA；在端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因第1521-1819位核苷酸區(qū)間制備標(biāo)準(zhǔn)品；根據(jù)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因第1657-1787位核苷酸區(qū)間設(shè)計(jì)引物及Tagman探針；用Taqman技術(shù)對(duì)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶mRNA的拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析。
3.用于定量檢測(cè)血液樣品中癌細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含引物，DNA標(biāo)準(zhǔn)品和Taqman探針，其中所述引物及探針是根據(jù)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因第1657-1787位核苷酸區(qū)間設(shè)計(jì)得到，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因第1521-1819位核苷酸區(qū)間制得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中所述引物具有SEQ ID NO8、9所示的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中所述探針具有SEQ ID NO10所示的序列，且其5′端與熒光報(bào)告基團(tuán)相連，3′端與熒光淬滅基團(tuán)相連。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品用具有SEQ ID NO6和7所示序列的引物擴(kuò)增獲得。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種體外定量檢測(cè)血液樣品中癌細(xì)胞的方法，它包括以下步驟用磁性分選技術(shù)從血液樣品中分離上皮細(xì)胞粘附分子陽(yáng)性細(xì)胞；從上述細(xì)胞中抽提RNA并獲得cDNA；在端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因第1521－1819位核苷酸區(qū)間制備DNA標(biāo)準(zhǔn)品，在端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因第1657－1787位核苷酸區(qū)間設(shè)計(jì)引物及Tagman探針，用Taqman技術(shù)對(duì)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶mRNA的拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析。本發(fā)明還提供了在體外檢測(cè)樣品中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的方法以及用于定量檢測(cè)血液樣品中癌細(xì)胞的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/25GK1673387SQ200410017149
公開日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2004年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月24日
發(fā)明者董強(qiáng)剛 申請(qǐng)人:董強(qiáng)剛