專利名稱：一種制備d-氨基酸氧化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種制備黃素蛋白酶D-氨基酸氧化酶的方法。具體涉及，通過構(gòu)建重組工程菌株獲得高效生產(chǎn)突變D-氨基酸氧化酶的方法。
背景技術(shù)：
D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase.EC 1.4.3.3.DAAO)是一種以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作為輔基的典型黃素酶，廣泛存在于動(dòng)物和多種微生物中。天然酶蛋白為86kDa的二聚體，具有催化氧化頭孢菌素C活力。哺乳動(dòng)物的DAAO與輔基FAD結(jié)合較松，輔基易丟失而使酶失活；而某些酵母與輔基FAD結(jié)合較強(qiáng)，有較高活性。實(shí)際應(yīng)用中，三角酵母的DAAO是最常用并且最具應(yīng)用潛力(Dominguez，A，Yeast 1997，131399-1408)。DAAO催化D-氨基酸氧化脫氨生成α-酮酸，可用于催化氧化消旋氨基酸生產(chǎn)L-氨基酸和α-酮酸。在半合成頭孢菌素的酶法合成工業(yè)中，DAAO與GL-7ACA酰化酶雙酶催化是目前最有前景的酶法生產(chǎn)7-ACA的途徑。頭孢菌素C經(jīng)DAAO催化氧化脫氨產(chǎn)生α-酮基己二酰-7-氨基頭孢烷酸，若有H2O2存在，便自發(fā)氧化脫羧形成戊二酰-7-氨基頭孢烷酸(GL-7ACA)(Shewale，JG，J.Biotechnol.1999，7511-22)。GL-7-ACA?；高M(jìn)一步催化GL-7ACA脫戊二酰生成7-ACA。
目前，從多種來源的DAAO基因已獲得了克隆，并且在大腸桿菌和酵母中實(shí)現(xiàn)了重組表達(dá)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有可誘導(dǎo)的強(qiáng)啟動(dòng)子，可以達(dá)到高密度培養(yǎng)和高效表達(dá)，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。有報(bào)道，利用畢赤酵母表達(dá)來源于三角酵母Trigonopsis viabllis的DAAO已經(jīng)獲得較高水平表達(dá)(袁中一、于建中國(guó)專利CN1385521A)。然而，發(fā)現(xiàn)在DAAO的分離純化過程中，總伴隨著過氧化氫酶的活力，以常用的分離純化技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)二者的完全分離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)單、快速制備D-氨基酸氧化酶的方法。具體是通過構(gòu)建重組工程菌株獲得高效生產(chǎn)突變D-氨基酸氧化酶的方法。
本發(fā)明采用DNA重組技術(shù)改造三角酵母野生型DAAO基因，將Histag融合于野生型酶基因的N-末端和C-末端，在畢赤酵母中既實(shí)現(xiàn)了突變酶的高效表達(dá)，又可用親和層析簡(jiǎn)單快速地獲得高純度的DAAO。純化的酶可用于高效氧化轉(zhuǎn)化頭孢菌素C-產(chǎn)生戊二酰-7-ACA，與GL-7-ACA?；嘎?lián)用可生產(chǎn)7-ACA.。
本發(fā)明通過下述方法和步驟進(jìn)行，1，突變D-氨基酸氧化酶基因，以質(zhì)粒pPIC3.5K-DAAO為模板，在DAAO編碼序列的5’端和3’端按常規(guī)方法分別導(dǎo)入連續(xù)編碼6個(gè)組氨酸的Histag序列，獲突變基因，對(duì)應(yīng)的突變D-氨基酸氧化酶N端和C端都有組氨酸序列。也可以在DAAO編碼序列的5’端或3’端各單獨(dú)引入6個(gè)組氨酸的Histag序列，對(duì)應(yīng)的突變D-氨基酸氧化酶N端或C端有組氨酸序列。
2，構(gòu)建突變酶表達(dá)菌株，上述突變基因被平端克隆到pBluescript(SK+)，再經(jīng)NotI和BamHI酶切后克隆到同樣酶切的載體pPIC3.5K，得到重組質(zhì)粒pPIC3.5K-hisDAAO。所述重組質(zhì)粒用SalI線性化，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主細(xì)胞GS115，通過PCR法篩選得到陽性重組菌株，再通過酶活力測(cè)定篩選出高產(chǎn)菌株，命名為Fudan0112，(已于2004年3月3日保藏，保藏單位CGMCC，北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)，保藏編號(hào)CGMCC No.1103，微生物分類名稱Pichia.Postori)s。
3，發(fā)酵、培養(yǎng)、分離突變D-氨基酸氧化酶，將上述所得高產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后，通過突變D-氨基酸氧化酶N端和C端帶有Histag序列與親和樹脂上Ni離子的特異性親和吸附分離D-氨基酸氧化酶。最高酶產(chǎn)量達(dá)到4000IU/ml。所得的菌體經(jīng)超聲破壁、低溫離心所得上清作為粗酶液，再通過Ni柱進(jìn)行親和層析，洗脫梯度為0、5mmol/L、25mmol/L、50mmol/L、100mmol/L咪唑的磷酸緩沖液，純化的酶回收率為50％。
本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞購(gòu)自Invitrogen公司，基因來源于專利CN 1385521A所描述的菌株和質(zhì)粒。


圖1是本發(fā)明的包含突變D-氨基酸氧化酶基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建圖，
圖2是本發(fā)明的SDS-PAGE電泳圖譜其中1為陽性重組菌的胞內(nèi)蛋白；2為空載體pPIC3.5k轉(zhuǎn)化的重組菌胞內(nèi)蛋白；3為低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，圖3是本發(fā)明的畢赤酵母重組菌株表達(dá)D-氨基酸氧化酶的活力曲線，具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 獲得突變D-氨基酸氧化酶基因根據(jù)已知的三角酵母Trigonopsis Vriabllis的DAAO基因序列和組氨酸對(duì)應(yīng)的密碼子設(shè)計(jì)突變引物如下5’primer 5’GGATCCATGCACCATCATCATCATCAT ATGGCTAAAA TCGTTGTT3’primer 5’GCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATG AAGGTTT GGACGAGTAAG模板基因來源于專利CN 1385521A所描述的質(zhì)粒pPIC3.5K-DAAO，用高保真PCR(Pfu酶，購(gòu)自博彩)擴(kuò)增DAAO基因，并且分別在編碼序列的5’和3’端分別導(dǎo)入連續(xù)編碼6個(gè)組氨酸的Histag序列，并且分別引入NotI和BamHI對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，40℃30s，72℃ 75s，5個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 75s，30個(gè)循環(huán)；最后，72℃ 10min，1個(gè)循環(huán)。
PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，采用DNA膠回收試劑盒(購(gòu)自Promega)回收突變DAAO基因片段。
實(shí)施例2 突變DAAO基因平端克隆到質(zhì)粒pBluescript(SK+)質(zhì)粒pBluescript(SK+)以SmaI線性化，作為平端克隆的載體。膠回收的突變DAAO基因片段與所述載體進(jìn)行體外連接，反應(yīng)體系(20μl)如下pBluescript(SK+)2μlPCR產(chǎn)物 10μl10倍連接緩沖液 2μlT4 DNA連接酶(1U/μl)1μl水 5μl混合物于16℃反應(yīng)過夜。所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐抗性的LB平板，挑選白色轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒DNA，所得DNA用PCR法和酶切法證明重組質(zhì)粒為pSK-DAAO。
實(shí)施例3 構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5K-hisDAAO
將pSK-DAAO用NotI和BamHI雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收約1.3Kb的片段，再與經(jīng)同樣雙酶切的pPIC3.5K質(zhì)粒進(jìn)行體外連接，反應(yīng)體系如下pPIC3.5k(NotI和BamHI切) 2μlDAAO基因片斷 15μl10x連接緩沖液2μlT4 DNA連接酶 1μ上述混合物于16℃反應(yīng)過夜。所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐抗性的LB平板，挑選轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒DNA，所得DNA用PCR法和酶切法證明重組質(zhì)粒為pPIC3.5K-DAAO。
實(shí)施例4表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115所構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5k-DAAO用Sa/I酶切線性化。宿主菌P.pastorisGS115(his mut+)培養(yǎng)至OD為1.6-1.8，制備電感受態(tài)細(xì)胞，與上述質(zhì)?；旌?，再以GIBCOL BRL電轉(zhuǎn)化儀CELL-PORATOR電轉(zhuǎn)化，其中電壓1500V，電容50μF，電阻4kΩ，向轉(zhuǎn)化杯中加入0.5ml 1mol/L冷山梨醇，取200μl涂于MD平板，30℃培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。將轉(zhuǎn)化子分別涂于MM和MD平板篩選Mut+轉(zhuǎn)化子，用PCR篩選陽性菌株，將得到的陽性菌株表達(dá)，篩得高產(chǎn)菌株，其中PDH12株表達(dá)水平最高。
實(shí)施例5 PCR方法篩選陽性畢赤酵母重組菌株將MD平板上的轉(zhuǎn)化子分別接入3ml YPD試管培養(yǎng)，按酵母質(zhì)粒DNA抽提試劑盒提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA。按如下PCR反應(yīng)體系做PCR反應(yīng)10X緩沖液 2.5μldNTP(25mM each) 0.5μl5’DAAO Primer1μl3’DAAO Primer1μl模板 1μlTaq DNA聚合酶 0.5μl水18.5μl以上混合物共25μl按實(shí)施例1條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。
實(shí)施例6重組甲醇酵母菌株表達(dá)D-氨基酸氧化酶從YPD斜面培養(yǎng)基挑選單菌落，接入含30mlBMGY培養(yǎng)基的250ml搖瓶，28-30℃，220r/min，培養(yǎng)24h，取1.5ml轉(zhuǎn)入40ml基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基生長(zhǎng)24h，離心(4000rpm，5min)，棄上清，菌體用40ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮，培養(yǎng)。每6h取菌體測(cè)DAAO活力，每24h補(bǔ)甲醇至其終濃度為0.5％。
實(shí)施例7發(fā)酵罐中畢赤酵母重組菌株表達(dá)D-氨基酸氧化酶發(fā)酵罐為美國(guó)NBS公司Bio F110自動(dòng)控制發(fā)酵系統(tǒng)，含pH自動(dòng)調(diào)節(jié)、溫度自動(dòng)控制、溶氧監(jiān)測(cè)、攪拌、進(jìn)氣系統(tǒng)。
發(fā)酵參數(shù)設(shè)置 溫度30℃；pH6.0；D0(溶氧濃度)35％；攪拌200-800r/min.
種子液制備從YPD斜面培養(yǎng)基挑選單菌落，接入含BMGY培養(yǎng)基40ml的搖瓶，28-30℃，220r/min培養(yǎng)24h，作為一級(jí)種子液。再以5％的接種量接入BMGY 400ml，同樣條件下培養(yǎng)12-14h，至A600約8左右，作為發(fā)酵罐種子液。
發(fā)酵培養(yǎng)14L發(fā)酵罐裝入6L基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)液，種子液以8-10％的接種量接入發(fā)酵罐。菌種生長(zhǎng)初期，通過溶氧攪拌關(guān)聯(lián)系統(tǒng)，使DO維持在35％左右。攪拌達(dá)800r/min，解除溶氧攪拌關(guān)聯(lián)。視DO陡然上升情況，流加50％甘油，4h后停止。甘油耗完，開始流加甲醇，流加速度以維持DO 35％為宜。定時(shí)取樣測(cè)菌重及活力，適時(shí)放罐，最終菌體密度達(dá)180g/L(濕重)，酶活力4000IU/mL。
實(shí)施例8分離和純化D-氨基酸氧化酶誘導(dǎo)后所得的菌體用3倍體積的磷酸緩沖液懸浮，經(jīng)超聲波超聲16min.4℃離心(12000rpm，20min)，用30％硫酸銨沉淀上清，4℃離心(12000rpm，20min)，上清液作為上柱樣品液。
Ni螯合樹脂裝入層析柱，平衡好后加入待分離樣品，依次用含0、5mmol/L、50mmol/L、100mmol/L的磷酸緩沖液洗脫，分別收集含蛋白洗脫液，SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果表明，含50mmol/L咪唑的洗脫峰中含有目的蛋白。
實(shí)施例9 HisDAAO轉(zhuǎn)化CPC-Na上述純化產(chǎn)物與2％的CPC-Na混合，25℃振蕩反應(yīng)3h，經(jīng)HPLC檢測(cè)3hCPC-Na轉(zhuǎn)化完全，生成物為GL-7ACA。
實(shí)施例10 DAAO活力測(cè)定取培養(yǎng)液1ml，離心，菌體用含30％丙酮的焦磷酸緩沖液(0.05mol/L，pHg.5)10ml重新懸浮，25℃水浴輕微震蕩30min，離心，用生理鹽水洗滌，菌體加入0.05mol/L的DL-蛋氨酸5ml，37℃水浴震蕩30min。用10％三氯乙酸3ml終止反應(yīng)，稀釋10倍，取1ml，加2，4-二硝基苯肼(0.2％)0.4ml，靜置10min，加3mol/LNaOH 1.5ml，靜置15min，離心取上清，測(cè)A550。
所述的酶單位定義每分鐘生成1umol酮酸所需的酶量定義為1單位的DAAO，酶單位計(jì)算公式為活力IU/ml＝K×OD×M×1000/30×D其中K標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率0.592；M稀釋倍數(shù)；D所取菌液體積(ml)。
突變基因序列Organization Applicant----------------------Street醫(yī)學(xué)院路138號(hào)City上海State上海Country中華人民共和國(guó)PostalCode200032PhoneNumber64037324FaxNumber64037324EmailAddresspatent@shmu.edu.cn<110>OrganizationName復(fù)旦大學(xué)Application Project-------------------<120>Title一種制備D-氨基酸氧化酶的方法<130>AppFileReference<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate____-__-__Sequence--------<213>OrganismNameTrigonopsis Vriabllis<400>PreSequenceStringggatccatgc accatcatca tcatcatatg ccggtgttgc cggtttaact acagctcttc60aacttcttcg taaaggacat gaggttacaa ttgtgtccga gtttacgccc ggtgatctta120gtatcggata tacctcgcct tgggcaggtg ccaactggct cacattttac gatggaggca180agttagccga ctacgatgcc gtctcttatc ctatcttgcg agagctggct cgaagcagcc240ccgaggctgg aattcgactc atcagccaac gctcccatgt tctcaagcgt gatcttccta
300aactggaagt tgccatgtcg gccatctgtc aacgcaatcc ctggttcaaa aacacagtcg360attctttcga gattatcgag gacaggtcca ggattgtcca cgatgatgtg gcttatctag420tcgaatttcg ttccgtttgt atccacaccg gagtctactt gaactggctg atgtcccaat480gcttatcgct cggcgccacg gtggttaaac gtcgagtgaa ccatatcaag gatgccaatt540tactacactc ctcaggatca cgccccgacg tgattgtcaa ctgtagtggt aaacgtcgag600tgaaccatat caaggatgcc aatttactac actcctcagg atcacgcccc gacgtgattg660tcaactgtag tggtctcttt gcccggttct tgggaggcgt cgaggacaag aagatgtacc720ctattcgagg acaagtcgtc cttgttcgaa actctcttcc ttttatggcc tccttttcca 780gcactcctgaaaaagaaaat gaagacgaag ctctatatat catgacccga ttcgatggta 840cttctatcat tggcggttgtttccaaccca acaactggtc atccgaaccc gatccttctc 900tcacccatcg aatcctgtct agagccctcgaccgattccc ggaactgacc aaagatggcc 960ctcttgacat tgtgcgcgaa tgcgttggccaccgtcctgg tagagagggc ggtccccgag 1020tagaattaga gaagatcccc ggcgttggctttgttgtcca taactatggt gccgccggtg 1080ctggttacca atcctcttac ggcatggctg atgaagctgtttcttacgtc gaaagagctc 1140ttactcgtcc aaacctttag aaatcatggt agtagtagta gtagtaattcgccggcg 1197<212>TypeDNA<211>Length1197SequenceName突變D-氨基酸氧化酶基因
權(quán)利要求
1，一種制備D-氨基酸氧化酶的方法，其特征是將D-氨基酸氧化酶基因修飾后轉(zhuǎn)化甲醇酵母宿主菌，實(shí)現(xiàn)突變酶高效表達(dá)，用親和層析分離純化高純度D-氨基酸氧化酶，包括下述步驟，1)突變D-氨基酸氧化酶基因，以質(zhì)粒pPIC3.5K-DAAO為模板，在DAAO編碼序列的5’端和3’端導(dǎo)入連續(xù)編碼6個(gè)組氨酸的Histag序列，獲突變基因；2)構(gòu)建突變酶表達(dá)菌株，步驟1)的突變基因平端克隆到pBluescript(SK+)，經(jīng)Not I和BamH I酶切后克隆到載體pPIC3.5K，得重組質(zhì)粒pPIC3.5K-hisDAAO，所述重組質(zhì)粒用Sal I線性化，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主細(xì)胞，PCR法、酶活力測(cè)定篩選陽性重組菌株Fudan0112，2004年3月3日保藏于CGMCC，保藏編號(hào)CGMCC No.1103；3)發(fā)酵、培養(yǎng)、分離突變D-氨基酸氧化酶，步驟2)的菌株發(fā)酵、培養(yǎng)，超聲破壁菌體、低溫離心得上清作為粗酶液，再經(jīng)Ni柱進(jìn)行親和層析，梯度洗脫。
2，根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備D-氨基酸氧化酶的方法，其特征是所述的突變D-氨基酸氧化酶的基因序列的5’端和3’端分別導(dǎo)入連續(xù)編碼6個(gè)組氨酸的序列，對(duì)應(yīng)的突變D-氨基酸氧化酶N端和C端都有組氨酸序列，或在所述的突變D-氨基酸氧化酶的序列的5’端或3’端各單獨(dú)引入6個(gè)組氨酸的Histag序列，對(duì)應(yīng)的突變D-氨基酸氧化酶N端或C端有組氨酸序列。
3，根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備D-氨基酸氧化酶的方法，其特征是所述的突變酶表達(dá)菌株的基因組DNA上鑲嵌了His序列的突變D-氨基酸氧化酶基因。
4，根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備D-氨基酸氧化酶的方法，其特征是所述的突變酶表達(dá)菌株的構(gòu)建包括以下步驟1)根據(jù)三角酵母Trigonopsis Vriabllis的DAAO基因序列和組氨酸對(duì)應(yīng)的密碼子設(shè)計(jì)突變引物，在基因序列的5’端和3’端分別導(dǎo)入連續(xù)編碼6個(gè)組氨酸的Histag序列，并且分別引入Not I和BamH I對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)；2)以質(zhì)粒pPIC3.5K-DAAO為模板，PCR擴(kuò)增突變DAAO基因，導(dǎo)入表達(dá)載體pPIC3.5K；3)重組質(zhì)粒pPIC3.5K-hisDAAO電轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌GS115，通過PCR、酶活力測(cè)定篩選陽性重組菌株。
5，根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備D-氨基酸氧化酶的方法，其特征是所述的步驟3)的突變D-氨基酸氧化酶的分離方法，是通過突變D-氨基酸氧化酶N端和C端帶有Histag序列與親和樹脂上Ni離子的特異性親和吸附分離D-氨基酸氧化酶，其中洗脫梯度為0、5mmol/L、25mmol/L、50mmol/L、100mmol/L咪唑的磷酸緩沖液，酶回收率為50％。。
6，根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備D-氨基酸氧化酶的方法，其特征是所述的步驟3)的突變D-氨基酸氧化酶的分離方法，
7，根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備D-氨基酸氧化酶的方法，其特征是所述的D-氨基酸氧化酶可直接用于催化頭孢菌素C生成GL-7ACA，與GL-7-ACA?；嘎?lián)用生成7-ACA.。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種制備黃素酶D－氨基酸氧化酶的方法。具體涉及，通過構(gòu)建重組工程菌株獲得高效生產(chǎn)突變D－氨基酸氧化酶的方法。本發(fā)明通過基因工程手段改造來源于三角酵母Trigonopsisv viabllis的野生型D－氨基酸氧化酶，將一段Histag融合于野生型酶的N末端和C末端，進(jìn)而通過親和層析實(shí)現(xiàn)突變酶的高效快速分離。酶在發(fā)酵液中的表達(dá)水平為4000IU/mL，高于野生型酶，Ni柱親和層析的回收率為50％。純化的酶可用于高效氧化轉(zhuǎn)化頭孢菌素C－產(chǎn)生戊二酰－7－ACA，與GL－7－ACA酰化酶聯(lián)用可生產(chǎn)7－ACA。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1560229SQ20041001682
公開日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月9日
發(fā)明者周佩, 馮美卿, 史訓(xùn)龍, 袁中一, 周 佩 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)