專利名稱：新型酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型的酶。
背景技術(shù)：
蛋白酶可被用于多種多樣的產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域。例如，在測(cè)定血清中的糖化白蛋白等糖化蛋白時(shí)，要使用這種酶，血清中的糖化白蛋白是診斷和治療糖尿病的重要指標(biāo)。
應(yīng)用蛋白酶測(cè)定糖化蛋白的方法可如下進(jìn)行。例如，用蛋白酶水解糖化蛋白，讓水解產(chǎn)物與果糖基氨基酸氧化酶(以下稱作“FAOD”)反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定所生成的過(guò)氧化氫量或消耗的氧量可知道糖化蛋白質(zhì)的量。蛋白酶可使用特開(kāi)平5-192193號(hào)公報(bào)、特開(kāi)平7-289253號(hào)公報(bào)中公開(kāi)的。
如此，因?yàn)轭A(yù)先用蛋白酶處理了糖化蛋白質(zhì)，上面所講的FAOD就很容易作用于糖化氨基酸和糖化肽，而對(duì)糖化蛋白質(zhì)自身很難產(chǎn)生作用。尤其是糖化的血紅蛋白(以下，計(jì)作“HbAlc”)，由于其糖化部分是β鏈N末端的氨基酸殘基，F(xiàn)AOD對(duì)這部分的作用很容易，所以要尋求能處理HbAlc的蛋白酶。
發(fā)明的公開(kāi)本發(fā)明的目的是提供上述能處理糖化蛋白質(zhì)，使FAOD對(duì)糖化蛋白質(zhì)和糖化肽的作用容易的酶。
首先，本發(fā)明者們研究了各種FAOD中，對(duì)α-氨基鍵合了糖的糖化蛋白質(zhì)、糖化肽及糖化氨基酸等起作用的FAOD的作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述FAOD對(duì)α-氨基鍵合了糖的糖化氨基酸作用良好，但對(duì)上述糖化蛋白質(zhì)和糖化肽的作用很難?；诖?，本發(fā)明者們分離培養(yǎng)了自然界的各種菌，檢測(cè)了它們產(chǎn)生的酶，結(jié)果成功地分離出能從α-氨基(N末端氨基)鍵合了糖的糖化蛋白質(zhì)、糖化肽中釋放出α-氨基糖化了的氨基酸(α-Glycated Amino acid，以下稱作α-GA)的新型酶的生產(chǎn)菌，完成了本發(fā)明。因?yàn)閼?yīng)用本發(fā)明的新型酶(α-Glycated Amino acid Releasing Enzyme，以下稱作α-GARE)可以從上述糖化蛋白質(zhì)和糖化肽中釋放出α-GA，所以應(yīng)用對(duì)α-GA發(fā)揮優(yōu)良作用的FAOD進(jìn)行HbAlc的臨床檢驗(yàn)等可實(shí)用化。除用于HbAlc的測(cè)定外，也可在其它糖化蛋白質(zhì)的測(cè)定等不同領(lǐng)域應(yīng)用。除本發(fā)明的促進(jìn)α-GARE和α-GA釋放的機(jī)能外，還有其它的催化機(jī)能，例如切斷其它肽鍵合的機(jī)能。本發(fā)明者們分離出的菌體有棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)等菌體。本發(fā)明的α-GARE不限于來(lái)源于這些菌體。
本發(fā)明的α-GARE釋放的糖化氨基酸，并不特別限定于其α-氨基發(fā)生糖化，但如前所述，由于HbAlc的N末端纈氨酸殘基發(fā)生糖化，所以優(yōu)選釋放的α-GA為糖化的纈氨酸(以下稱作α-GV)。
本發(fā)明的α-GARE是如下所示的兩種類的α-GARE。
首先，一種α-GARE(以下叫做α-GARE-1)是來(lái)源于棒狀桿菌屬(Corynebacterium)的菌體，特別優(yōu)選來(lái)自解脲棒狀桿菌KDK1002(Corynebacterium ureolyticum KDK 1002)。該解脲棒狀桿菌KDK1002(Corynebacterium ureolyticum KDK 1002)是本發(fā)明者們從土壤中分離出的新型菌體，保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(NIBH)(日本國(guó)305-0046茨城縣筑波市東1丁目1-3)，保藏號(hào)為FERMP-17135(保藏日平成11年1月11日)。本菌體的菌學(xué)特征如下。
(形態(tài)特征)本菌體的現(xiàn)狀是大小0.8×1.2μm的桿菌，非運(yùn)動(dòng)性。
(培養(yǎng)性質(zhì))讓該菌體在普通瓊脂培養(yǎng)基上生育時(shí)，其菌落的形態(tài)是低凸起的圓形，其菌落的顏色為乳白色。
(生理學(xué)特性)革蘭氏染色陽(yáng)性氧要求性厭氧硝酸鹽還原-吡嗪酰胺酶+吡咯烷基烯丙基酰胺酶-堿性磷酸酶-
β-葡萄糖醛酸酶-B-半乳糖苷酶-α-葡萄糖苷酶-N-乙酰-β-葡萄糖胺酶-七葉苷(葡萄糖苷酶)-脲酶+液化明膠-β-溶血性-碳水化合物的發(fā)酵性-葡萄糖-核糖-木糖-甘露醇-麥芽糖-乳糖-白糖-糖原-第二種α-GARE(以下叫做α-GARE-2)是來(lái)源于假單胞菌屬(Pseudomonas)的菌體，特別優(yōu)選來(lái)自產(chǎn)堿假單胞菌KDK1001(Pseudomonas alcaligenes KDK 1001)。該產(chǎn)堿假單胞菌KDK1001(Pseudomonas alcaligenes KDK 1001)是本發(fā)明者們從土壤中分離出的新型菌體，保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(NIBH)(日本國(guó)305-0046茨城縣筑波市東1丁目1-3)，保藏號(hào)為FERM P-17133(保藏日平成11年1月11日)。本菌體的菌學(xué)特征如下。
(形態(tài)特征)本菌體的現(xiàn)狀是大小0.3×1.0-1.5μm的桿菌，通過(guò)鞭毛進(jìn)行運(yùn)動(dòng)。
(培養(yǎng)性質(zhì))讓該菌體在普通瓊脂培養(yǎng)基上生育時(shí)，其菌落的形態(tài)是低凸起的圓形，表面光滑。其菌落的顏色由半透明變化為淡黃色。用Mac Conkey培養(yǎng)基(Mac Conkey，下同〕也可看到生育，但很難說(shuō)良好。另外，培養(yǎng)溫度為40℃是不生育。
(生理學(xué)特性)革蘭氏染色陰性氧要求性需氧硝酸鹽還原+吲哚生產(chǎn)-葡萄糖酸性化-精氨酸二氫酶-脲酶-七葉苷水解+明膠水解-β-半乳糖苷酶+葡萄糖生產(chǎn)的氣體-底物利用能力葡萄糖+L-阿拉伯糖+D-甘露糖+D-甘露醇+N-乙酰-D-葡萄糖胺-麥芽糖+葡萄糖酸鉀+n-癸酸+肥酸-DL-蘋(píng)果酸+檸檬酸鈉-乙酸苯-前面所講的糖化蛋白質(zhì)或糖化肽的測(cè)定方法是用酶消化糖化蛋白質(zhì)或糖化肽以后，讓消化產(chǎn)物與FAOD反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定這種氧化還原反應(yīng)進(jìn)行。本發(fā)明的糖化蛋白質(zhì)或糖化肽測(cè)定方法的特征是上述方法中的酶應(yīng)用本發(fā)明的新型酶(α-GARE)。本發(fā)明的測(cè)定方法中所使用的α-GARE要根據(jù)測(cè)定的糖化蛋白質(zhì)和糖化肽的種類、它們的濃度適當(dāng)選擇，使用一種也可，兩種以上并用也可。另外，為了使上述α-GARE的作用容易發(fā)揮，可預(yù)先用其它酶對(duì)糖化蛋白質(zhì)(例如，蛋白酶等)進(jìn)行消化。
本發(fā)明的測(cè)定方法中，上述氧化還原反應(yīng)的測(cè)定，優(yōu)選進(jìn)行由氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫量的測(cè)定或所消耗氧量的測(cè)定，進(jìn)行過(guò)氧化氫量的測(cè)定時(shí)，優(yōu)選應(yīng)用被過(guò)氧化物酶氧化而生色的底物(以下叫做生色性底物)進(jìn)行測(cè)定。除應(yīng)用上述過(guò)氧化物酶等酶學(xué)方法外，還可用其它方法測(cè)定過(guò)氧化氫含量，如通過(guò)電的方法。
上面所講的生色性底物包括N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲基氨基)二苯基胺鈉鹽(例如，商品名DA-64，和光純藥社制等)、鄰苯二胺(0PD)、特林達(dá)試劑與4-氨基安替比林組合的底物等。特林達(dá)試劑包括，如酚，酚的衍生物，苯胺衍生物，萘酚，萘酚衍生物，萘胺，萘胺衍生物等。另外，上述氨基安替比林之外，也可使用氨基安替比林衍生物，香草醛基二氨基磺酸，甲基苯基噻唑啉腙(MBTH)，磺基化的MBTH(SMPTH)等。這些生色底物中特別優(yōu)選N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’二(二甲基氨)二苯基胺鈉鹽。
如前所述，測(cè)定血細(xì)胞中的HbAlc有利于糖尿病的診斷，因此，本發(fā)明的測(cè)定方法中，測(cè)定對(duì)象的樣品優(yōu)選血細(xì)胞。但是，由于其它成分，如血細(xì)胞以外的血液成分(全血、血漿、血清等)，尿液和骨髓液等活體樣品，果汁等飲料，醬油、調(diào)味汁等食品中也包含糖化蛋白質(zhì)，所以測(cè)定的目標(biāo)樣品不限于血細(xì)胞。另外，測(cè)定目標(biāo)物并不限于上述HbAlc，還包括明膠、酪蛋白等其它糖化蛋白質(zhì)和糖化肽。
本發(fā)明的糖化蛋白質(zhì)或糖化肽的測(cè)定試劑盒是備有蛋白酶、FAOD、過(guò)氧化酶以及與過(guò)氧化酶反應(yīng)而被氧化的底物的測(cè)定試劑盒，其特征在于，上述蛋白酶包括本發(fā)明的α-GARE。通過(guò)應(yīng)用該試劑盒，可快速、簡(jiǎn)便地進(jìn)行本發(fā)明的測(cè)定方法。與前面一樣，α-GARE可以是一種，也可是兩種以上并用。
本發(fā)明的試劑盒中，被氧化的底物優(yōu)選上述的生色性底物，測(cè)定目標(biāo)物以及測(cè)定目標(biāo)樣品與前面相同。
本發(fā)明的α-GARE的制備方法，包括培養(yǎng)本發(fā)明新菌體的工序。照此可容易地制備本發(fā)明的α-GARE。
本發(fā)明的α-GARE制備方法，優(yōu)選還包括以下(a)-(c)所示的純化過(guò)程。
(a)從培養(yǎng)液中除去菌體，制備上清的工序。
(b)用乙醇沉淀上述上清中的蛋白質(zhì)的工序。
(c)用色譜分離上述蛋白質(zhì)的工序。
對(duì)上述純化過(guò)程沒(méi)有特殊限制，也可合用其它的純化步驟。例如，可只進(jìn)行(a)步，進(jìn)行2個(gè)以上的工序，再反復(fù)進(jìn)行同一工序。
如前所述，從菌體培養(yǎng)而得到的本發(fā)明α-GARE，可以是包含在培養(yǎng)液中的狀態(tài)，也可是純化狀態(tài)，只要是能從糖化蛋白質(zhì)中釋放出α-GA，不必拘泥于其純度。但是，若進(jìn)行純化，由于去除了培養(yǎng)液中α-GARE以外的成分，所以α-GARE的比活性增高。這樣在實(shí)際使用的時(shí)候，其使用量少，稱取簡(jiǎn)便。另外，用于各種反應(yīng)的時(shí)候，可避免α-GARE以外成分的影響。
對(duì)經(jīng)過(guò)如上純化工序而純化出的α-GARE進(jìn)行氨基酸序列的確定及基因序列的確定，制備出編碼本發(fā)明α-GARE的基因。該基因并不限定于表達(dá)上述α-GARE的必要基因，也包含，例如作為探針和引物使用的DNA片段和RNA等，還包括以α-GARE的基因序列為基礎(chǔ)化學(xué)合成的片段。應(yīng)用這些基因可制作重組體，從而進(jìn)行α-GARE的制備。本發(fā)明α-GARE基因的獲得如下所示。
首先，純化本發(fā)明的α-GARE，如按照后述的純化工序進(jìn)行純化，用埃德曼試劑等常規(guī)方法進(jìn)行氨基酸序列的測(cè)定，在此基礎(chǔ)上推測(cè)其基因序列。在此基礎(chǔ)上用常規(guī)的化學(xué)合成等方法制作DNA片段和RNA片段，作為引物和探針使用?？寺【幋a來(lái)自本發(fā)明新型菌體的α-GARE的基因，得到本發(fā)明的基因。
圖2是上述一實(shí)施例中，應(yīng)用棒狀桿菌屬菌體的培養(yǎng)液上清，分解糖化肽，用TLC分析其分解產(chǎn)物的其它色譜圖。
圖3是本發(fā)明的其它實(shí)施例中，應(yīng)用假單胞菌屬菌體的培養(yǎng)液上清，分解糖化肽，用TLC分析其分解產(chǎn)物的色譜圖。
圖4是本發(fā)明的其它實(shí)施例中，應(yīng)用棒狀桿菌屬菌體的培養(yǎng)液上清，分解糖化肽，用LC-MS分析其分解產(chǎn)物的全部離子色譜圖。
圖5是上述實(shí)施例中，應(yīng)用棒狀桿菌屬菌體的培養(yǎng)液上清，分解糖化肽，用LC-MS分析其分解產(chǎn)物的MS質(zhì)譜圖。
圖6是本發(fā)明的其它實(shí)施例中，棒狀桿菌屬菌體來(lái)源的α-GARE量與吸光度間的關(guān)系圖。
圖7是本發(fā)明的其它實(shí)施例中，假單胞菌屬菌體來(lái)源的α-GARE量與吸光度間的關(guān)系圖。
圖8表示本發(fā)明的其它實(shí)施例中，棒狀桿菌屬菌體來(lái)源的α-GARE的熱穩(wěn)定性。
圖9表示本發(fā)明的其它實(shí)施例中，假單胞菌屬菌體來(lái)源的α-GARE的熱穩(wěn)定性。


圖10表示本發(fā)明的其它實(shí)施例中，棒狀桿菌屬菌體來(lái)源的α-GARE的最適溫度。
本發(fā)明的最佳實(shí)施狀態(tài)產(chǎn)生本發(fā)明α-GARE的菌體的篩選可這樣進(jìn)行，例如，如下所示，分離培養(yǎng)土壤中的菌體，用其培養(yǎng)液進(jìn)行糖化肽的分解反應(yīng)，通過(guò)薄層層析(TLC)對(duì)所得分解產(chǎn)物進(jìn)行分析。以下的篩選方法是本發(fā)明者們?yōu)榉蛛x出α-GARE產(chǎn)生菌進(jìn)行反復(fù)詳盡的研究而發(fā)現(xiàn)的。由于建立了該篩選方法而能成功地進(jìn)行本發(fā)明α-GARE產(chǎn)生菌的分離，這麼說(shuō)一點(diǎn)也不為過(guò)。
(1)培養(yǎng)方法預(yù)先用高壓蒸氣滅菌器對(duì)如下所示的營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌，121℃滅菌20分鐘。然后，將土壤樣懸浮于滅菌水中，將之添加到已滅菌的營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)48小時(shí)(111rpm)。將所得培養(yǎng)液離心(12000G，15分鐘，4℃)，回收上清。
(營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基)麥芽提取物(商品名Malt extractDIFCO公司) 2.0gD-葡萄糖(ナカライテスク公司) 2.0g蛋白胨(商品名Becto peptoneDIFC0) 0.1g
蒸餾水100ml(2)糖化肽的分解反應(yīng)(糖化肽及糖化氨基酸的制備方法)應(yīng)用以下肽及纈氨酸、葡萄糖，常規(guī)制備其氨基酸序列與HbAlcβ鏈N末端氨基酸序列相同的α-氨基糖化了的肽及α-巖藻糖基纈氨酸(以下稱作FV)。
(肽)Val-His(肽研究所公司，以下將該糖化物稱作F2P)Val-His-Leu(肽研究所公司，以下將該糖化物稱作F3P)Val-His-Leu-Thr(バイオリンク公司，以下將該糖化物稱作F4P)Val-His-Leu-Thr-Pro(SIGMA公司，以下將該糖化物稱作F5P)Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Ser(バイオリンク公司，以下將該糖化物稱作F9P)。
(L-氨基酸)Val、Leu和His(和光純藥工業(yè))(分解方法)預(yù)先將上述各糖化肽溶解到蒸餾水中，濃度為0.01M，分別制備糖化肽溶液。然后，分別將各糖化肽溶液50μl與上述培養(yǎng)液上清100μl混合，37℃反應(yīng)一晚后，將該反應(yīng)液冷凍干燥。
(3)TLC分析用TLC對(duì)前面糖化肽的分解產(chǎn)物進(jìn)行分析，確認(rèn)其有無(wú)α-GARE活性。所使用的試劑及方法如下。
(薄層板)商品名Pre-Coated TLC plate SILICA GEL 60(メルク公司)(檢測(cè)試劑)用75％(體積)的乙醇溶解濃度為0.5％(體積)的茚三酮(フナコシ公司)。
(展開(kāi)溶劑)丁醇(ナカライテスク公司)、醋酸(ナカライテスク公司)和蒸餾水以2∶1∶1的體積比混合。
(分析方法)預(yù)先準(zhǔn)備展開(kāi)距離為8cm的上述薄層板，距離板下端1cm的位置作為樣品點(diǎn)的基線。然后在進(jìn)行TLC分析前，分別將前述冷凍干燥的各反應(yīng)液溶解到15μl分50％乙醇中，用注射器(體積25μl)將它們點(diǎn)到基線上。將前述的FV和各種氨基酸同樣點(diǎn)到板上，作為對(duì)照。然后將該板放到預(yù)先用展開(kāi)劑飽和了的展開(kāi)槽中，讓展開(kāi)劑展開(kāi)到距離基線約8cm的位置。放置薄層板時(shí)，展開(kāi)劑浸沒(méi)其下端約0.5cm。
展開(kāi)劑展開(kāi)后，在通風(fēng)廚內(nèi)風(fēng)干，然后將檢測(cè)試劑(茚三酮溶液)噴霧到薄層板上，用預(yù)熱的熱攪拌器(100℃)加熱，進(jìn)行顯色試驗(yàn)。結(jié)果，與對(duì)照FV的移動(dòng)度一樣的樣品α-GARE活性陽(yáng)性，其培養(yǎng)液的菌體是α-GARE生產(chǎn)菌。
TLC分析中并不限定于前述的茚三酮法檢測(cè)，也可應(yīng)用其它方法，例如應(yīng)用熒光胺、乙二胺硫酸鹽等試劑的熒光檢測(cè)方法。
另外，作為對(duì)照，優(yōu)選使用，如糖化蛋白質(zhì)或糖化肽底物的α-GA。
應(yīng)用這種篩選方法，本發(fā)明者們分離出的新菌體有，如上述解脲棒狀桿菌KDK1002(Corynebacterium ureolyticum KDK 1002)(FERMP-17135)和產(chǎn)堿假單胞菌KDK1001(Pseudomonas alcaligenesKDK1001)(FERM P-17133)等。
本發(fā)明α-GARE的檢測(cè)和活性測(cè)定中使用的底物并不限定于上述糖化肽，也包括，如N末端α-氨基糖化了的糖化蛋白質(zhì)及糖化肽。應(yīng)用這樣的底物時(shí)，通過(guò)應(yīng)用后述的FAOD進(jìn)行氧化還原反應(yīng)(例如顯色反應(yīng))，釋放出α-GA，而進(jìn)行α-GARE的檢測(cè)、測(cè)定。
前述的糖化蛋白質(zhì)包括，如HbAlc，糖化珠蛋白等。這樣的糖化蛋白質(zhì)可以是天然產(chǎn)物，也可是通過(guò)糖與蛋白質(zhì)進(jìn)行阿馬多爾轉(zhuǎn)位反應(yīng)而合成的。前述糖化珠蛋白的制備是，如用Teale的方法(Teale，F(xiàn)W，J.Biochem.Biophys.Acta.，35，543，1959)，對(duì)用HPLC純化的HbAlc進(jìn)行珠蛋白化。對(duì)合成的各種蛋白質(zhì)進(jìn)行糖化的時(shí)候，所使用的糖沒(méi)有特別限制，可應(yīng)用，如葡萄糖等醛糖和酮糖等。
前述的糖化肽的制備可如前所述，通過(guò)蛋白酶水解糖化蛋白質(zhì)而得到，也可通過(guò)糖與合成肽的阿馬多爾轉(zhuǎn)位反應(yīng)而合成。糖化肽的長(zhǎng)度無(wú)特殊限制，但氨基酸殘基可為2-20的范圍，優(yōu)選為2-8。
與糖進(jìn)行阿馬多爾轉(zhuǎn)位反應(yīng)的肽可以是天然產(chǎn)物，也可是合成的。其氨基酸組成無(wú)特殊限制，但優(yōu)選不包含精氨酸和賴氨酸的肽。因?yàn)閷?duì)這樣的肽進(jìn)行糖化時(shí)，可制備出只有肽的α-氨基被糖化了的糖化肽，用該糖化肽可僅檢測(cè)出α-GARE活性。
具體而言，利用α-GARE進(jìn)行HbAlc測(cè)定時(shí)，糖化肽優(yōu)選，如與HbAlcβ鏈N末端氨基酸序列相同的糖化肽，例如前面的“糖化肽的分解反應(yīng)”中講到的N末端Val的α-氨基被糖化了的糖化肽。另外，用胰蛋白酶消化HbAlc時(shí)，可得到N末端Val的α-氨基被糖化了的氨基酸殘基數(shù)為8的糖化肽。
用N末端的α-氨基被糖化了的糖化肽作為α-GARE的底物時(shí)，可檢測(cè)釋放出的α-GA，也可通過(guò)檢測(cè)α-GA釋放后的殘存肽而檢測(cè)、測(cè)定α-GARE。
這樣的糖化肽無(wú)特殊限制，包括有，如FV-Leu(以下計(jì)作FVL)，F(xiàn)V-Gln(以下計(jì)作FVQ)、FV-Ala(以下計(jì)作FVA)、FV-Asn(以下計(jì)作FVN)等二肽。通過(guò)α-GARE的作用，F(xiàn)V游離，同時(shí)分別生成Leu、Gln、Ala、Asn。讓生成的Leu與亮氨酸脫氫酶、Gln與谷氨酰胺脫氫酶、Ala與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和α-酮戊二酸和乳酸脫氫酶、Asn與門(mén)冬酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶和α-酮戊二酸和馬來(lái)酸脫氫酶等反應(yīng)，通過(guò)進(jìn)行NADH生成或NAD生成的吸光度測(cè)定(波長(zhǎng)340nm)而進(jìn)行檢測(cè)。
另外糖化包括，例如FV-Leu-Ser(以下計(jì)作FVLS)等。通過(guò)α-GARE可釋放出FV，同時(shí)生成Leu-Ser。用氨基肽酶、糜蛋白酶、蛋白酶K等水解酶進(jìn)行水解，可如前那樣測(cè)定生成的亮氨酸。前述肽的長(zhǎng)度無(wú)特殊限制。
α-GARE的底物可以是這樣的底物，它包含氨基酸和檢測(cè)基團(tuán)，該氨基酸的α-氨基被糖化，且該檢測(cè)基團(tuán)與該氨基酸的α-羧基鍵合成酰胺或酯，該檢測(cè)基團(tuán)在鍵合狀態(tài)下檢測(cè)不到，游離后可檢測(cè)得到。
α-GARE若與上述底物反應(yīng)，可切斷α-GA與上述檢測(cè)基團(tuán)形成的酰胺鍵或酯鍵，游離α-GA和檢測(cè)基團(tuán)。由于通過(guò)切斷而釋放出的檢測(cè)基團(tuán)能生色、發(fā)光，所以由此可檢測(cè)、測(cè)定α-GARE。
上述檢測(cè)基團(tuán)沒(méi)有特殊限制，但優(yōu)選如前所述能通過(guò)生色和熒光進(jìn)行檢測(cè)的。通過(guò)生色而能進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)基團(tuán)有，對(duì)硝基苯胺(以下計(jì)作p-NA)、對(duì)硝基酚、吲哚、β-萘胺、4-甲氧-β-萘胺(4MNA)等。通過(guò)熒光而能進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)基團(tuán)有，如4-甲基-香豆素-7-酰胺等。具體而言，p-NA和對(duì)硝基酚用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)405nm-410nm的吸光度為宜，4-甲基-香豆素-7-酰胺用380nm的激發(fā)波長(zhǎng)，在波長(zhǎng)460nm處進(jìn)行測(cè)定。
上述的檢測(cè)基團(tuán)與α-羧基鍵合無(wú)論形成酰胺還是酯，α-GARE均能釋放α-GA，所以推測(cè)α-GARE能識(shí)別α-氨基的糖化部分，釋放出α-GA。
這樣的檢測(cè)基團(tuán)與α-羧基鍵合的α-GARE的底物可進(jìn)行制備，如應(yīng)用市售檢測(cè)基團(tuán)鍵合的氨基酸和糖通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。
本發(fā)明的α-GARE可通過(guò)按照前述的培養(yǎng)方法培養(yǎng)本發(fā)明的α-GARE生產(chǎn)菌體而制備。應(yīng)用解脲棒狀桿菌KDK1002(FERM P-17135)時(shí)，其培養(yǎng)條件為，如培養(yǎng)溫度為20-37℃，培養(yǎng)時(shí)間為18-72小時(shí)，培養(yǎng)基的pH為7.0-8.0。使用產(chǎn)堿假單胞菌KDK1001(FERM P-17133)時(shí)，其培養(yǎng)條件為，如培養(yǎng)溫度為20-40℃，培養(yǎng)時(shí)間為18-72小時(shí)，培養(yǎng)基的pH為5.0-10.0。
上述培養(yǎng)液中包含的α-GARE可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行分離純化，得到α-GARE的酶標(biāo)準(zhǔn)品。α-GARE的純化方法有，例如用硫酸銨鹽等進(jìn)行鹽析方法、等電點(diǎn)沉淀法、乙醇沉淀法、離子交換色譜、凝膠色譜、親和色譜、疏水性色譜等已知方法，它們可聯(lián)合應(yīng)用。以下是純化來(lái)自解脲棒狀桿菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE的一個(gè)例子。
首先，將上述培養(yǎng)液離心(12000G，15分鐘，4℃)，除去菌體，得到上清。向上清中添加冷乙醇，使之體積達(dá)50％，攪拌，4℃放置20分鐘，然后離心(12000G，15分鐘，4℃)。再向所得上清中添加冷乙醇，使之體積達(dá)85％，攪拌后，與前面同樣，放置、離心，回收沉淀。然后將沉淀溶解到純水中。
將該溶液過(guò)柱，柱的商品名為ポロスHQ/M(ピ一イ一バイオシステムズ公司)，用10mM Tris-Hcl(pH7.5)緩沖液洗脫非吸附部分，回收。然后，將非吸附部分過(guò)商品名為バイオスケ一ルCHT-1(BioRad)的柱子，用1mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)洗脫非吸附部分，回收，得到部分純化的本發(fā)明α-GARE酶溶液。本發(fā)明的其它菌體來(lái)源的α-GARE的純化相同。
另外，培養(yǎng)本發(fā)明的新型菌體所使用的培養(yǎng)基并不限定于前面所講的營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基，也可應(yīng)用其它的培養(yǎng)基，如以下所示的血紅蛋白(Hb)培養(yǎng)基。Hb溶液可按以下所示的方法進(jìn)行制備。
(Hb培養(yǎng)基，pH6.0)Hb溶液 0.2％(重量)K2HPO40.2％(重量)MgSO4·7H2O 0.02％(重量)微量金屬鹽溶液 1.0％(重量)微量維生素類溶液0.2％(重量)(Hb溶液)將新鮮血液離心(2000G，10分鐘，室溫)，回收紅細(xì)胞，向其中加入等體積的蒸餾水，溶血。將溶血了的溶液離心(2000G，10分鐘，室溫)，去除紅細(xì)胞膜等，將該溶液作為Hb溶液。
(微量金屬鹽溶液)CaCl2·2H2O 200mgH3BO350mgCuSO4·5H2O 20mgKI 50mgFeSO4·7H2O 100mgMnSO4·5H2O 200mgZnSO4·7H2O 200mgNa2MoO4·2H2O 50mg其余水(總量500ml)(微量維生素類溶液)Ca-泛酸 40mg肌醇20mg煙酸40mgρ-氨基安息香酸 20mg吡多辛鹽酸鹽40mg硫胺煙酸鹽 40mg生物素 0.2mg
維生素B12 O.05mg其余 水(總量100ml)用血細(xì)胞作樣品，用α-GARE和FAOD測(cè)定血細(xì)胞中的糖化蛋白質(zhì)(例如，HbAlc)，以此為例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的糖化蛋白質(zhì)或糖化肽的測(cè)定方法。
首先，用離心等常規(guī)方法從全血中分離出血細(xì)胞，將之溶血。溶血方法無(wú)特別限制，例如可以用表面活性劑的方法、超聲波的方法、利用滲透壓差的方法等。其中，考慮到操作簡(jiǎn)便性，優(yōu)選應(yīng)用表面活性劑。
上述表面活性劑可使用，例如商品名為T(mén)ritonX-100等的聚氧乙烯-p-t-辛烷基苯醚類，商品名為T(mén)ween-20等的聚氧乙烯山梨聚糖烷基酯類，商品名為Brij35等的聚氧乙烯烷基醚類等。表面活性劑的處理?xiàng)l件為，例如當(dāng)處理溶液中的血細(xì)胞濃度為1-10％體積的時(shí)候，向該處理溶液中添加濃度達(dá)O.1-1％重量的表面活性劑，室溫，攪拌5秒-1分鐘。
然后用本發(fā)明的α-GARE對(duì)上述溶血樣品進(jìn)行酶處理。這樣，能從溶血樣品中的糖化蛋白質(zhì)中釋放出α-GA。用α-GARE進(jìn)行酶處理的條件是，例如在緩沖液中進(jìn)行時(shí)，其處理?xiàng)l件要根據(jù)所使用的α-GARE種類(例如來(lái)源不同)和糖化蛋白質(zhì)及糖化肽的種類及其濃度進(jìn)行適當(dāng)選擇。
例如，測(cè)定對(duì)象物為HbAlc，使用來(lái)源于解脲棒狀桿菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE時(shí)，其處理?xiàng)l件為，反應(yīng)液中α-GARE濃度為0.01U-1KU/L，溫度為15-60℃，反應(yīng)時(shí)間為3分-6小時(shí)，pH5.0-10.0。優(yōu)選的是溫度為30-37℃，反應(yīng)時(shí)間為5-60分，pH6-8。此時(shí)，緩沖液可使用Tris-鹽酸緩沖液，硫酸緩沖液，Good緩沖液(EPPS緩沖液，PIPES緩沖液等)等。本發(fā)明的其它菌體來(lái)源的α-GARE也同樣適用。
然后，用FAOD處理上面經(jīng)α-GARE處理而得到的分解物(α-GA)。FAOD催化的α-GA分解反應(yīng)如下式(1)所示。
(式1)
如式1所示，用FAOD處理上面經(jīng)α-GARE處理而得到的分解物(α-GAR1-CO-CH2-NH-R2)生成糖(R1-CO-CHO)、氨基酸(NH2-R2)和過(guò)氧化氫(H2O2)。
上面式1中，R1是指糖化反應(yīng)前產(chǎn)生糖的殘基(糖殘基)。反應(yīng)前糖為醛糖時(shí)，糖殘基(R1)為醛糖殘基，反應(yīng)前的糖為酮糖時(shí)，它為酮糖殘基。例如，當(dāng)反應(yīng)前的糖為葡萄糖時(shí)，經(jīng)阿馬多爾轉(zhuǎn)位反應(yīng)后的結(jié)構(gòu)為果糖結(jié)構(gòu)，此時(shí)，糖殘基(R1)為葡萄糖殘基(醛糖殘基)。該糖殘基(R1)可用-CH(OH)]n-CH2OH表示，n是0-6的整數(shù)。
上面式1中，R2是α-氨基發(fā)生糖化了的氨基酸殘基，可用下面式(2)表示。下面式(2)中，R3表示氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)。
(式2)-CHR3-CO-OH前面所講的FAOD沒(méi)有特別限制，只要能催化上述反應(yīng)即可，例如它還可有其它催化功能。FAOD處理，優(yōu)選與上述α-GARE進(jìn)行酶處理時(shí)同樣的緩沖液。上述緩沖液無(wú)特殊限制，例如可用Tris鹽酸緩沖液，EPPS緩沖液，PIPES緩沖液等。
FAOD的處理?xiàng)l件為，如反應(yīng)液中FAOD濃度為0.1-10KU/L，溫度15-50℃，反應(yīng)時(shí)間1-60分鐘，pH6-9，優(yōu)選FAOD濃度為0.5-2KU/L，溫度30-37℃，反應(yīng)時(shí)間5-20分鐘，pH7-8。
然后，應(yīng)用POD和經(jīng)氧化生色的底物，利用氧化還原反應(yīng)測(cè)定經(jīng)FAOD處理而產(chǎn)生的過(guò)氧化氫。
上述氧化還原反應(yīng)通常在緩沖液中進(jìn)行，其條件要根據(jù)反應(yīng)液中過(guò)氧化氫的濃度等適當(dāng)選擇。例如，反應(yīng)液中POD濃度為10U-400KU/L，反應(yīng)溫度15-40℃，反應(yīng)時(shí)間0.1-5分鐘，pH5-10，更優(yōu)選POD濃度為50U-20KU/L，反應(yīng)溫度30-37℃，反應(yīng)時(shí)間0.1-1分鐘，pH5-8。緩沖液沒(méi)有特殊限制，可使用與FAOD處理時(shí)同樣的緩沖液。
應(yīng)用生色底物作為底物時(shí)，通過(guò)用分光光度計(jì)測(cè)定其顯色(反應(yīng)液的吸光度)，可測(cè)定過(guò)氧化氫的濃度，由此可知道樣品中糖化蛋白質(zhì)的濃度。
該測(cè)定過(guò)程中，各處理工序可如前所述分別進(jìn)行，也可幾個(gè)工序同時(shí)進(jìn)行，或全部同時(shí)進(jìn)行。例如，通過(guò)向樣品中同時(shí)添加α-GARE和FAOD使之進(jìn)行反應(yīng)，可同時(shí)進(jìn)行α-GARE處理過(guò)程和FAOD處理過(guò)程。另外，通過(guò)向α-GARE分解物中同時(shí)添加FAOD、POD和生色底物，可同時(shí)進(jìn)行FAOD處理過(guò)程和POD生色過(guò)程。此外，還可同時(shí)進(jìn)行用表面活性劑進(jìn)行溶血處理過(guò)程和α-GARE處理過(guò)程。(實(shí)施例)(實(shí)施例1)該實(shí)施例是讓生產(chǎn)本發(fā)明α-GARE的新菌體培養(yǎng)液上清與具有α-GA的糖化肽進(jìn)行反應(yīng)，從該糖化肽中釋放出α-GA的例子。若無(wú)特殊說(shuō)明，與前述的篩選方法進(jìn)行同樣的菌體培養(yǎng)、糖化肽分解及TLC分析。
首先，將解脲棒狀桿菌KDK1002(FERM P-17135)接種到200ml前述營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。將所得培養(yǎng)液離心，去除菌體，其上清作為酶的粗提液。
將上述酶的粗提液100μl分別與0.01M糖化肽(F2P、F3P、F5P)溶液50μl混合，37℃反應(yīng)一晚，然后，用TLC對(duì)該反應(yīng)液進(jìn)行分析。TLC分析結(jié)果如
圖1和圖2所示。
圖1中，泳道1是對(duì)照(FV)，泳道2為對(duì)照(Leu，Val，His)，泳道3為F2P分解物，泳道4為F3P分解物；圖2中泳道1為F2P分解物，泳道2為F5P分解物。圖中用箭頭表示的點(diǎn)的移動(dòng)度如下面表1所示。
(實(shí)施例2)將產(chǎn)堿假單胞菌KDK1001(FERMP-17133)接種到前述營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，與實(shí)施例1同樣進(jìn)行菌體培養(yǎng)，糖化肽的分解及TLC分析。其TLC分析結(jié)果如圖3所示。圖中泳道1是對(duì)照(FV)，泳道2為對(duì)照(Leu，Val，His)，泳道3為F2P分解物，泳道4為F3P分解物。另外，圖中用箭頭表示的點(diǎn)的移動(dòng)度如下面表1所示。
(表1)圖序號(hào)樣品名 移動(dòng)度
圖1 對(duì)照FV 0.43F2P分解物0.43F3P分解物0.43圖2 F2P分解物0.44F5P分解物0.44圖3 對(duì)照FV 0.46F2P分解物0.46F3P分解物0.46如
圖1、圖2、圖3及表1所示，經(jīng)前述各種粗酶液處理的糖化肽分解物中，可確認(rèn)與對(duì)照FV移動(dòng)度相同的點(diǎn)(用箭頭表示的點(diǎn))。另外，實(shí)施例2中也可確認(rèn)F5P分解物與FV的移動(dòng)度相同(移動(dòng)度0.46圖中未顯示)。由以上可知，應(yīng)用本發(fā)明的α-GARE可從糖化肽中釋放出α-GA。并且，由于上述分解物的點(diǎn)與Val的移動(dòng)度不同，所以可知糖未游離通過(guò)α-GARE釋放出的FV。如
圖1、圖2和圖3所示，F(xiàn)2P分解物可看到FV和His的點(diǎn)。F3P分解物和F5P分解物中，除FV以外未看到分解物(二肽和四肽)的點(diǎn)，由此可以推測(cè)，用TLC方法很難檢測(cè)得到的緣故。
(實(shí)施例3)該實(shí)施例是用來(lái)源于本發(fā)明新型菌體的粗酶液處理糖化肽，確認(rèn)α-GA(FV)釋放的例子。
用上述Hb培養(yǎng)基(pH6.0)培養(yǎng)解脲棒狀桿菌KDK1002(FERM P-17135)，28℃培養(yǎng)5天。然后，將培養(yǎng)液離心(12000G，15分，4℃)，得到的上清作為粗酶液。
將該粗酶液與0.01M F4P溶液50μl混合，37℃反應(yīng)一晚。用濾膜過(guò)濾該反應(yīng)液，除去高分子量物質(zhì)，將所得溶液冷凍干燥。
將上面的各冷凍干燥品溶解到下述溶液A中，在下述條件下，將該溶液進(jìn)行逆相色譜，從分析開(kāi)始每15秒為一級(jí)分〔250μl/級(jí)分)。相同條件下洗脫對(duì)照FV，確認(rèn)其洗脫時(shí)間。
(逆相色譜)柱商品名Hypercarb(ジ一エルサイエニス公司，p26)大小100mm×4.6mm環(huán)1000μl溶液A三氟醋酸∶蒸餾水＝0.1∶100(體積比)溶液B∶丙酮∶蒸餾水∶三氟醋酸＝80∶20∶0.1(體積比)梯度條件0-25分，0-20％溶液B；25分以后，20％溶液B流速1ml/min柱溫度37℃檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，230nm通過(guò)逆相色譜而得到的各分離級(jí)分，用以下方法進(jìn)行FV的檢測(cè)。
(FV的檢測(cè)方法)向各分離級(jí)分溶液20μl中添加過(guò)氧化氫溶液20μl，然后添加下述氧化還原反應(yīng)液A60μl，37℃進(jìn)行反應(yīng)。然后，用生化學(xué)自動(dòng)分析裝置-商品名JCA-BM8(日本電子公司，下同)，在主波長(zhǎng)694nm及副波長(zhǎng)884nm處測(cè)定該反應(yīng)液的吸光度。
(氧化還原反應(yīng)液A的組成)商品名DA6420umol/1(和光純藥工業(yè)公司，下同)POD(東洋紡織公司，下同)20KU/1FAOD(旭化成公司)0.5KU/l磷酸鉀緩沖液(pH8.0)0.1mol/l結(jié)果，逆相色譜中洗脫時(shí)間為5-6分的級(jí)分中見(jiàn)到顯色。該洗脫時(shí)間與對(duì)照FV的洗脫時(shí)間相同，這提示F4P分解物中存在FV。
接著對(duì)顯色的級(jí)分進(jìn)行如下條件的液相色譜(LC)/質(zhì)譜(MS)分析。結(jié)果如圖4和圖5所示。圖4為總的離子色譜圖，圖5是洗脫時(shí)間為1.84時(shí)流穿物的MS圖譜。
(LC條件)柱商品名イナ一トシル0DS3(ジ一エルサイエン ンス公司)P28大小長(zhǎng)150mm，內(nèi)徑2.1mm，ODS載體的粒徑5μm
流洗液∶乙氰∶01％體積的蟻酸水溶液＝10∶90(體積比〕流速0.2ml/min柱溫40℃(MS條件)型號(hào)商品名LC1100MSD(アジレントテクノロジ一公司)質(zhì)量范圍100-500am電離化噴霧器N2Drying gasN2(10L/min，350℃)電壓60V結(jié)果如圖4和圖5所示，檢測(cè)出3個(gè)峰。詳細(xì)地講，洗脫時(shí)間1.84分時(shí)檢測(cè)出表示FV的質(zhì)量數(shù)280峰和質(zhì)量數(shù)261的FV類似分子峰。大部分為質(zhì)量數(shù)280的峰，因?yàn)樵摲灞硎綟V，所以可以確認(rèn)F4P分解物生成了FV。
(實(shí)施例4)該實(shí)施例是變化α-GARE的濃度，確認(rèn)各濃度的α-GARE活性的
(1)制備部分純化的酶與實(shí)施例3同樣分別培養(yǎng)解脲棒狀桿菌KDK1002(FERM P-17135)和產(chǎn)堿假單胞菌KDK1001(FERMP-17133)。然后，回收各培養(yǎng)液上清，作為粗酶液。用截流分子量為5kDa的濾膜(商品名Ultrafree-MC filterミリポア公司〕分別對(duì)這些粗酶液進(jìn)行濃縮，然后按以下所示的條件進(jìn)行凝膠色譜，進(jìn)行部分純化。
(凝膠色譜)柱商品名HiLoad 26/60 Superdex 200pg(BioRad)柱大小內(nèi)徑260mm，長(zhǎng)度600mm流速5.2ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)280nm、230nm流洗液20磷酸鉀緩沖液(pH7.5)1級(jí)分7ml(2)α-GARE活性測(cè)定應(yīng)用下述HbAlc消化物溶液作為解脲棒狀桿菌KDK1002(FERM P-17135)來(lái)源的α-GARE的底物，應(yīng)用10mM F3P(50mM/L磷酸鉀緩沖液pH8.0)作為產(chǎn)堿假單胞菌KDK1001(FERM P-17133)來(lái)源的α-GARE的底物。向上述各底物50μl中添加一定量(25、50、75、100、125、140μl)的各部分純化α-GARE，37℃反應(yīng)一晚。取該反應(yīng)液20μl，與實(shí)施例3同樣，用FAOD進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，測(cè)定吸光度。以未添加α-GARE的作空白，求出每5分鐘吸光度的增加量，作為α-GARE的活性。其結(jié)果如圖6和圖7所示。圖6表示解脲棒狀桿菌KDK1002(FERMP-17135)來(lái)源的α-GARE酶量與顯色量(吸光度)的關(guān)系。圖7表示產(chǎn)堿假單胞菌KDK1001(FERM P-17133)來(lái)源的α-GARE酶量與顯色量(吸光度)的關(guān)系。
(HbAlc消化物溶液)用生理鹽水(0.85％NaCl)洗滌人的全血，回收血細(xì)胞。向該血細(xì)胞中加入10倍體積的純水，使之完全溶血，然后離心(10000G，30分)，分離血細(xì)胞膜，得到溶血液。用大小為0.94cm×20cm、商品名為PolyCAT的柱(polyLC)，根據(jù)Bisse和Wieland的方法(J.Chromatogr，(1988)，Vol434，p95-110，Bisse and Wieland)從溶血液中分離出各7.5mg的Hb，回收HbAlc。將回收的HbAlc(血紅蛋白濃度17g/l)20ml與0.2M醋酸鈉緩沖液(pH3.0)5ml混合，用醋酸調(diào)整pH為3.0后，添加胃蛋白酶(Sigma公司)0.35ml。將該溶液在28℃孵育一晚后，用超濾膜(商品名Ultrafree-MCfilterミリポア公司)去除胃蛋白酶等高分子量物質(zhì)，所得溶液作為HbAlc消化物溶液。
如圖6所示，來(lái)源于解脲棒狀桿菌KDK1002(FERMP-17135)的α-GARE，在酶量大約50-100μl的范圍內(nèi)其活性以酶量依賴的方式增加。如圖7所示，來(lái)源于產(chǎn)堿假單胞菌KDK1001(FERMP-17133)的α-GARE，在酶量添加到大約70μl以上時(shí)，其活性保持直線性增加。
(實(shí)施例5)該實(shí)施例是驗(yàn)證本發(fā)明的α-GARE熱穩(wěn)定性的例子。
與實(shí)施例4同樣制備部分純化的來(lái)源于解脲棒狀桿菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE酶，和來(lái)源于產(chǎn)堿假單胞菌KDK1001(FERM P-17133)的α-GARE酶。預(yù)先，將兩種部分純化的酶在各溫度(30、37、50、60、70、80℃)孵育15分鐘，熱處理后，取100μl部分純化的酶，與50μl底物混合，37℃反應(yīng)一晚。各α-GARE對(duì)應(yīng)的底物與實(shí)施例4的相同。與實(shí)施例3同樣，用FAOD對(duì)該反應(yīng)液20μl進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，測(cè)定吸光度。然后，以每5分鐘吸光度的增加量作為α-GARE活性，以未處理的α-GARE活性作為100％，求出殘存的活性。其結(jié)果如圖8和圖9所示。圖8表示來(lái)源于解脲棒狀桿菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE的熱穩(wěn)定性。圖9表示來(lái)源于產(chǎn)堿假單胞菌KDK1001(FERM P-17133)的α-GARE的熱穩(wěn)定性。
如圖8所示，來(lái)源于解脲棒狀桿菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE即使經(jīng)過(guò)30-60℃的熱處理仍顯示100％的殘存活性，但是經(jīng)過(guò)80℃的熱處理殘存活性減到50％。如圖9所示，來(lái)源于產(chǎn)堿假單胞菌KDK1001(FERM P-17133)的α-GARE即使經(jīng)過(guò)30-60℃的熱處理仍顯示100％的殘存活性，但是經(jīng)過(guò)70℃的熱處理殘存活性減到60％。
(實(shí)施例6)該實(shí)施例是確認(rèn)本發(fā)明的α-GARE最適溫度的例子。
與實(shí)施例4同樣制備部分純化的來(lái)源于解脲棒狀桿菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE酶。將該部分純化的酶100μl添加到與實(shí)施例5同樣的HbAlc消化物溶液90μl與磷酸鉀緩沖液(pH8.0)10μl的混合液中，各溫度(10、30、37、50、60、70℃)反應(yīng)一晚。與實(shí)施例3同樣，用FAOD對(duì)該反應(yīng)液20μl進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，測(cè)定吸光度。然后，以每5分鐘吸光度的增加量作為α-GARE活性。其結(jié)果如
圖10所示。
圖10表示來(lái)源于解脲棒狀桿菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE的最適溫度。
如
圖10所示，來(lái)源于解脲棒狀桿菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE的最適溫度為大約40-50℃。
(實(shí)施例7)該實(shí)施例是確認(rèn)本發(fā)明的α-GARE分子量的例子。
與實(shí)施例3同樣培養(yǎng)解脲棒狀桿菌KDK1002(FERMP-17135)，和產(chǎn)堿假單胞菌KDK1001(FERM P-17133)，回收其上清，作為粗酶液。然后將這些粗酶液，以與實(shí)施例4相同的條件進(jìn)行凝膠色譜，進(jìn)行分離。將各級(jí)分150μl添加到50μl底物與50mM磷酸鉀緩沖液(pH8.O)的混合液中，37℃反應(yīng)一晚。各α-GARE對(duì)應(yīng)的底物與實(shí)施例4的相同。與實(shí)施例3同樣，用FAOD對(duì)該反應(yīng)液20μl進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，測(cè)定吸光度。然后，以每5分鐘吸光度的增加量作為α-GARE活性。分子量標(biāo)記物使用商品名MW標(biāo)記物(HPLC)(オリエンタル酵母公司)。
結(jié)果，兩種粗酶液均在相當(dāng)于分子量約40000-50000的級(jí)分中發(fā)現(xiàn)α-GARE活性，由此推測(cè)來(lái)源于解脲棒狀桿菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE，和來(lái)源于產(chǎn)堿假單胞菌KDK1001(FERM P-17133)的α-GARE的分子量分別在40000-50000左右。
(實(shí)施例8及比較例1)該實(shí)施例是用與實(shí)施例1和實(shí)施例2相同的α-GARE粗酶液處理糖化肽，通過(guò)用FAOD對(duì)其處理物進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，測(cè)定粗酶液α-GARE活性的例子。所使用的時(shí)間、組分及方法如下。
(50mM糖化肽溶液)將前述的F2P溶解到蒸餾水中，使其濃度達(dá)50mM。
(緩沖液A)80mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)(氧化還原反應(yīng)液B的組成〕商品名DA640.1mmol/LPOD50KU/LFAOD(キツコ一マン公司)10KU/L緩沖液A80mmol/L將與實(shí)施例1和實(shí)施例2相同制備的粗酶液490μl與前述的糖化肽溶液10μl混合，30℃反應(yīng)一晚，分解糖化肽。將該分解液25μl添加到上述緩沖液A55μl中，然后與前述的氧化還原反應(yīng)液B20μl混合，開(kāi)始反應(yīng)，用生化學(xué)自動(dòng)分析裝置-商品名JCA-BM8(日本電子社)測(cè)定該反應(yīng)液在主波長(zhǎng)694nm、副波長(zhǎng)884nm的吸光度。預(yù)先用標(biāo)準(zhǔn)物FV進(jìn)行FAOD反應(yīng)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從吸光度求出α-GARE活性。結(jié)果如表2所示。另外，將胰蛋白酶(Sigma公司)、木瓜蛋白酶(Sigma公司)和氨基肽酶(Sigma公司)溶解到純水中，使其濃度達(dá)1g/L，除應(yīng)用各自的酶液以外，與前述同樣測(cè)定α-GARE活性，作為比較例1。
(表2)

如表2所示，應(yīng)用來(lái)源于前面所講兩種新菌體的粗酶液時(shí)，可見(jiàn)到α-GARE活性，但在分別應(yīng)用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和氨基肽酶的比較例1中，未檢測(cè)到α-GARE活性。
(實(shí)施例9)該實(shí)施例是用來(lái)源于解脲棒狀桿菌KDK1002(FERMP-17135)的α-GARE酶溶液處理糖化珠蛋白，通過(guò)用FAOD對(duì)其處理物進(jìn)行氧化還原反應(yīng)而測(cè)定α-GARE活性的例子。所使用的試劑、其組成和方法如下。
(α-GARE酶溶液的制備方法〕將解脲棒狀桿菌KDK1002(FERM P-17135)種植到200ml前述的營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，將所得培養(yǎng)液離心，去除菌體，回收上清。然后將上清過(guò)與前面同樣的柱子，柱子的商品名為ポロスH0/M(ピ一イ一バイオシステムズ公司)和バイオスケ一ルCHT-1(BioRad)，進(jìn)行α-GARE的部分純化，所得活性級(jí)分作為α-GARE酶溶液。
(糖化珠蛋白的制備方法)按照前面所講的テ一ル方法，從人血細(xì)胞中純化出珠蛋白。然后向該珠蛋白中添加葡萄糖，使其重量比達(dá)10％，40℃放置一周，由此制備出糖化珠蛋白。
預(yù)先將上述糖化珠蛋白溶解到蒸餾水中，使?jié)舛冗_(dá)2g/L，制備出糖化珠蛋白溶液。將前述的α-GARE酶溶液100μl與糖化珠蛋白溶液50μl和100mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)350μl混合，37℃反應(yīng)3小時(shí)，分解糖化珠蛋白。用該分解液與實(shí)施例8同樣求出α-GARE活性。由于FAOD(キッコ一マン公司)對(duì)α-GA具有特異作用，來(lái)源于解脲棒狀桿菌KDK1002(FERM P-17135)的α-GARE，除α-GA以外，也可釋放ε-氨基發(fā)生糖化的氨基酸殘基，可只測(cè)定α-GARE活性。結(jié)果，α-GARE活性為2.1U/L。
(實(shí)施例10)該實(shí)施例是用FV-pNA作底物測(cè)定α-GARE活性的例子。
與實(shí)施例1同樣制備來(lái)源于解脲棒狀桿菌KDK1002(FERM P-17135)的粗酶液。取400μl粗酶液與下面的反應(yīng)試劑C100μl混合，37℃進(jìn)行反應(yīng)，將通過(guò)α-GARE而釋放出的pNA的生色作為在波長(zhǎng)410nm處的吸光度變化而進(jìn)行測(cè)定。以每1分鐘吸光度的變化作為α-GARE活性。其結(jié)果如下面表3所示。
(FV-pNA的制備)用常規(guī)方法，從Val-pNA(Sigma)和葡萄糖制備FV-pNA。
(反應(yīng)試劑C)FV-pNA1ml50mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)20ml(表3)

如表3所示，本發(fā)明的α-GARE活性可糖化氨基酸的α位氨基，而且可通過(guò)與α位羧基酰胺鍵合的檢測(cè)基團(tuán)鍵合的氨基酸底物進(jìn)行測(cè)定。
如上所述，因?yàn)楸景l(fā)明的α-GARE可釋放α-GA，使FAOD的作用變得容易，所以它能精確測(cè)定糖化蛋白質(zhì)和糖化肽。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的新型酶α-GARE可從糖化蛋白質(zhì)釋放出α-氨基發(fā)生糖化了的氨基酸殘基。若用FAOD進(jìn)行糖化蛋白質(zhì)測(cè)定的方法中使用該α-GARE，可準(zhǔn)確且簡(jiǎn)便地測(cè)定糖尿病診斷的指標(biāo)—HbAle，因此，它可使HbAlc測(cè)定的臨床檢查實(shí)用化。
權(quán)利要求
1.一種新型酶，它可從糖化蛋白質(zhì)或糖化肽中釋放出α-氨基糖化了的氨基酸。
2.權(quán)利要求1的酶，它來(lái)源于棒狀桿菌屬(Corynebacterium)。
3.權(quán)利要求2的酶，其中棒狀桿菌屬的菌體為解脲棒狀桿菌KDK1002(Corynebacterium ureolyticum KDK1002)(FERM P-17135)。
4.權(quán)利要求1的酶，它來(lái)源于假單胞菌屬(Pseudomonas)。
5.權(quán)利要求1的酶，其中假單胞菌屬的菌體為產(chǎn)堿假單胞菌KDK1001(Pseudomonas alcaligenes KDK1001)(FERM P-17133)。
6.權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)的酶，其釋放出的糖化氨基酸為α-氨基糖化了的纈氨酸。
7.一種測(cè)定方法，它是用酶分解糖化蛋白質(zhì)或糖化肽，然后讓該分解產(chǎn)物與果糖基氨基酸氧化酶反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定氧化還原反應(yīng)而測(cè)定糖化蛋白質(zhì)或糖化肽的量的測(cè)定方法，其中的酶使用了 1～5任一項(xiàng)中的酶。
8.權(quán)利要求7的測(cè)定方法，其中作為測(cè)定對(duì)象物的糖化蛋白質(zhì)是糖化的血紅蛋白。
9.一種測(cè)定試劑盒，它是糖化蛋白質(zhì)或糖化肽的測(cè)定試劑盒，備有蛋白酶、果糖基氨基酸氧化酶、過(guò)氧化物酶以及與它們反應(yīng)而被氧化的底物，其中的蛋白酶包含權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)中的酶。
10.一種菌體，它是棒狀桿菌屬(Corynebacterium)菌體，它產(chǎn)生的酶能從糖化蛋白質(zhì)或糖化肽中釋放出α-氨基糖化了的氨基酸。
11.權(quán)利要求10中的菌體，其中棒狀桿菌屬的菌體為解脲棒狀桿菌KDK1002(Corynebacterium ureo1yticum KDK1002)(FERMP-17135)。
12.一種菌體，它是假單胞菌屬(Pseudomonas)菌體，它產(chǎn)生的酶能從糖化蛋白質(zhì)或糖化肽中釋放出α-氨基糖化了的氨基酸。
13.權(quán)利要求12中的菌體，其中假單胞菌屬的菌體為產(chǎn)堿假單胞菌KDK1001(Pseudomonas alcaligenes KDK1001)(FERM P-17133)。
14.一種用于檢測(cè)權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)中的酶或測(cè)定其活性的底物，它包含氨基酸和檢測(cè)基團(tuán)，該氨基酸的α-氨基發(fā)生糖化，且該檢測(cè)基團(tuán)與氨基酸的α-羧基形成酰胺鍵或酯鍵，該檢測(cè)基團(tuán)在鍵合狀態(tài)檢測(cè)不到，游離狀態(tài)時(shí)可檢測(cè)得到。
15.權(quán)利要求14的底物，其檢測(cè)基團(tuán)選自對(duì)硝基苯胺，對(duì)硝基酚，β-萘胺，4-甲氧基-β-萘胺及4-甲基-香豆素-7酰胺中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型的酶(α－GARE)及生產(chǎn)該酶的新菌體,該酶能從糖蛋白中釋放出α－氨基糖化了的氨基酸殘基(α－GA)。該酶的生產(chǎn)菌包括解脲棒桿菌KDK1002(FERMP－17135)和產(chǎn)堿假單胞菌KDK1001(FERM P－17133)。該菌的培養(yǎng)液上清中包含α－GARE,應(yīng)用它可象附圖中所示的那樣從糖化的肽中釋放出α－GA。
文檔編號(hào)C12N9/48GK1340099SQ00803944
公開(kāi)日2002年3月13日 申請(qǐng)日期2000年2月21日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月22日
發(fā)明者石丸香, 八木雅之, 米原聰 申請(qǐng)人:阿克雷株式會(huì)社