專利名稱：與人類感音神經(jīng)性耳聾相關(guān)的wfs1突變基因及其在診斷遺傳性耳聾中的應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及新的WFS1突變基因，具體地說涉及WFS1基因2766G→A雜合突變，該突變基因與人類感音神經(jīng)性耳聾特異相關(guān)。
本發(fā)明還涉及應用新的WFS1突變基因檢測人類遺傳性耳聾的檢測方法。
本發(fā)明還涉及新的WFS1突變基因在診斷遺傳性耳聾中的應用。
背景技術(shù)：
一、Wolframin蛋白的結(jié)構(gòu)與功能Wolframin基因位于人類染色體的4p16上，含33.4kb個DNA堿基，包括8個外顯子(exon)。exon1未被編碼，exon2-7為小編碼片斷，exon8為最大的外顯子，有2.6kb長。大約有10個跨膜片斷。
Wolframin蛋白質(zhì)由890個氨基酸組成，分子量約為100kDa，是一種對糖苷內(nèi)切酶敏感的膜糖蛋白，。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中間有個疏水的區(qū)域(氨基酸330-650)，由9個螺旋狀的跨膜部分構(gòu)成，N端有一個親水的部分位于細胞質(zhì)外，C端部分位于細胞質(zhì)內(nèi)。65％存在于漿膜，26％存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，還有4％存在于線粒體或細胞核中。熒光免疫染色顯示在轉(zhuǎn)染的COS-7細胞中，WFS1蛋白位于細胞質(zhì)中，呈現(xiàn)特征性的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有交迭。在鼠的腦組織中，無論在蛋白質(zhì)和mRNA水平，WFS1在海馬回、杏仁核、嗅神經(jīng)核以及不規(guī)則皮質(zhì)表層的神經(jīng)元中濃集。
二、WFS1與Wolfram綜合征WFS1基因首先是Wolfram綜合征(WSWolfram Syndrome)的致病基因。對于WFS1基因的研究開始于對Wolfram綜合征的認識。WS(WolframSyndrome)即Wolfram綜合征，由Wolfram和Wagener于1938年首次提出，是一種罕見的常染色體隱性遺傳的神經(jīng)變性疾病。因為WS患者患有尿崩癥(Diabetes Insipidus)、糖尿病(Diabetes mellitus)、視萎縮(Optic Atrophy)、耳聾(Deafness)四大典型并發(fā)病癥，取其各病英文名稱字首，又被稱為DIDMOAD。WFS1基因突變可以引起神經(jīng)的進行性退變性病變，病變?yōu)橐暂S突膨脹為特征的軸突營養(yǎng)不良，直接導致患者出現(xiàn)Wolfram綜合征的種種復雜癥狀。
三、WFS1與耳聾2001年，WFS1基因的突變被證實是導致低頻感音神經(jīng)性聽力損失(LFSNHL)的原因之一，為DFNA6/14/38基因座位的致病基因。
自2001年以后，各國科學家通過對發(fā)現(xiàn)的不同家系的WFS1基因研究，不斷發(fā)現(xiàn)了LFSNHL的突變位點。Bespalova 2001年，研究了多個家系，共報告了5個突變位點，它們是2266C＞T T699M；2146G＞AA716T；2505G＞AV779M；2656T＞C L829P，2662G＞A G831D。Komatsu 2002年通過研究日本的家系，報告了K634T。在這些突變中都未發(fā)現(xiàn)可以引起蛋白質(zhì)的早熟、合成提前終止的突變。因此，對于WFS1基因突變與LFSNHL相關(guān)性的深入研究有望發(fā)現(xiàn)WFS1基因突變的真正致病機制。WFS1基因與Walfram綜合征有關(guān)的突變有64％是失活的，因此可以說只有活化的WFS1基因突變才是導致低頻聽力損失的原因。
四、展望WFS1基因突變的發(fā)現(xiàn)開辟了一個令人驚奇的新領域，為耳聾患者打開一扇新的診斷、治療的大門。目前，通過國內(nèi)外的研究僅發(fā)現(xiàn)了6個WFS1基因突變位點，通過發(fā)現(xiàn)新的突變位點有利于進一步認識WFS1基因?qū)τ谡Ｂ犛X生理功能意義，更加深入的了解其與耳聾的關(guān)系。在以前所發(fā)現(xiàn)的6個突變位點中，都不是在中國人群中發(fā)現(xiàn)的，因此對中國人群中可能存在的WFS1基因突變進行研究將對于遺傳性耳聾的臨床診斷和治療有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一個與遺傳性耳聾相關(guān)的新的WFS1突變基因，該WFS1基因具有2766G→A雜合突變，相應地其編碼蛋白氨基酸具有866D→N突變。
本發(fā)明的另一個目的在于提供診斷人類遺傳性耳聾的方法，通過檢測來自于一個體的待測樣本中是否存在WFS1基因2766G→A(866D→N)突變而判斷該個體的耳聾發(fā)生原因，進而為臨床診斷和治療提供參考。
本發(fā)明的再一目的在于提供WFS1基因2766G→A突變基因在診斷或治療人類遺傳性耳聾中的應用。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，通過在82名各種感音神經(jīng)性耳聾患者和83名正常聽力對照組中進行篩查，發(fā)現(xiàn)一個與感音神經(jīng)性耳聾有關(guān)的WFS1基因新的突變位點(2766G→A 866D→N)。這一突變位點在83名對照組中均沒有發(fā)現(xiàn)這一突變，說明這一突變位點與耳聾特異相關(guān)，這一突變位點位于Wolramin的細胞膜內(nèi)區(qū)域。通過對不同物種的Wolframin蛋白氨基酸序列的進化研究證明，該突變位于Wolframin蛋白的高度保守區(qū)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，診斷人類遺傳性耳聾的方法是通過檢測來自于患者的待測樣本中是否存在WFS1基因2766G→A突變而判斷該患者的耳聾發(fā)生原因及類型。在本發(fā)明的一個實施方案中，采用PCR擴增-直接測序法來檢測樣本，具體包括下述步驟1)采集待測個體的樣本，例如血樣、體液或組織，提取DNA；2)以該DNA為模板，以針對WSF1基因或WSF1基因2766堿基附近編碼區(qū)設計的PCR引物進行PCR反應得到PCR反應產(chǎn)物；3)將得到的PCR反應產(chǎn)物進行直接測序分析，將所得的序列與WSF1正?；虻臉藴市蛄羞M行比較，確定是否存在2766G→A突變位點；4)按照正常閱讀框進行翻譯以確定是否存在866D→N氨基酸突變位點；5)根據(jù)以上結(jié)果判斷待測個體是否為WSF12766G→A基因突變導致的感音神經(jīng)性耳聾。
在上述方法中使用的PCR引物可以依據(jù)已知的WFS1核苷酸序列設計，通常為15-30個堿基，GC含量為45-50％左右，在適當?shù)臏囟认屡c模板特異性結(jié)合，其可以利用專門的計算機程序設計。在本發(fā)明的一個具體實施例中，應用引物設計軟件設計了一對PCR引物，包含WSF1整個編碼區(qū)，其序列為WFS1-F5’-TTC GAC CGC TAC AAG TTT GA-3’WFS1-R5’-GGG AGG AGA GGG AAT CTC AT-3’WSF1正常基因的標準序列可以參考例如Genbank NT 034692。
本發(fā)明進一步提供用于檢測WFS1基因2766G→A突變的試劑盒，試劑盒中可以包括以下幾種試劑的一種或幾種的組合從待測樣本中提取DNA的試劑；
用于擴增樣本DNA中WSF1基因的PCR引物及相應的PCR反應試劑；以及對PCR擴增產(chǎn)物進行測序的試劑。
例如，本發(fā)明的一個實施方案中提供一個檢測WFS1基因2766G→A突變的試劑盒，其內(nèi)裝有一個或多個容器，容器內(nèi)裝有用以檢測WFS1基因2766G→A突變的一種或多種成分，與之同時提供的可以是經(jīng)政府藥物管理機構(gòu)審核的、有關(guān)藥品或生物制品制造、使用及銷售的信息。例如，采用PCR擴增后，直接檢測樣品中WFS1基因2766G→A突變位點的試劑盒?？珊袛U增引物，dNTP，用于PCR反應的DNA聚合酶及其緩沖液等的一種或多種。本領域技術(shù)人員已知，以上組分僅是示意性的，例如，所述的引物可以采用上述的一對WFS1-F和WFS1-R引物，所述的用于PCR反應的DNA聚合酶是能夠用于PCR擴增的酶。并說明使用方法如下1)PCR擴增用軟件Primer 3對WFS1基因的編碼區(qū)設計PCR引物反應條件為94℃預變性5分鐘，94℃變性30秒，退火溫度62℃30秒，72℃延伸40秒，35個循環(huán)，反應結(jié)束后再72℃延伸7分鐘，4℃保存。
2)PCR產(chǎn)物純化將含有PCR產(chǎn)物的MultiScreen-PCR板抽真空，加入去離子水，靜置，隨后將MultiScreen-PCR板置于混合器上震蕩，純化后的PCR產(chǎn)物重新溶解后至另一潔凈的96孔板中。
3)測序反應及驗證以PCR引物作為測序引物進行測序反應，在ABI9700熱循環(huán)儀上進行測序反應。反應結(jié)束后，延伸產(chǎn)物上樣與ABI PRISM 3730DNA序列分析儀。將所得到的圖譜進行分析。與Genbank中的標準序列比較可以發(fā)現(xiàn)突變位點。該試劑盒可簡便快捷地檢測WFS1——866D→N突變位點，從而應用于耳聾相關(guān)基因的檢測和耳聾治療方法中。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供WSF12766G→A突變基因在診斷人類遺傳性耳聾疾病中的應用，通過檢測待測個體中是否存在WSF 1基因2766G→A突變，而判斷該個體的耳聾發(fā)生原因及類型。
本發(fā)明首次提供了在中國人群中存在的WFS1基因新的2766G→A突變基因，并證明了該突變基因與感音神經(jīng)性耳聾特異相關(guān)，而且這個突變位點可能是在中國人群中特有的突變，并且有可能存在著突變熱點，這對于耳聾患者的診斷有重要的意義。本發(fā)明同時提出了通過檢測患者中是否存在WFS1基因新的2766G→A突變而診斷耳聾發(fā)生的原因和類型的檢測方法。這將有利于在臨床上開展聾病患者的WFS1突變篩查工作，為耳聾患者診斷和治療提供服務。
下面結(jié)合附圖，通過對本發(fā)明較佳實施方式的說明，詳細描述但不限制本發(fā)明。


圖1為WFS1編碼區(qū)氨基酸與核酸堿基的對照，圖中顯示突變位于WFS1的細胞膜內(nèi)區(qū)；圖2為WFS1基因測序結(jié)果圖；其中左圖為正常序列測序結(jié)果，右圖為突變序列測序結(jié)果，左圖與右圖序列順序關(guān)系為全反互補圖3為Wolframin蛋白結(jié)構(gòu)示意圖，標示出866D→N氨基酸突變位點；圖4為來源于不同物種的Wolframin蛋白氨基酸序列比對，箭頭所指為866D位點，圖中顯示來源于不同物種的所有Wolframin蛋白該位點均為天冬氨酸(D)，提示了WSF 1突變基因的866D→N突變位于高度保守區(qū)。
發(fā)明的
具體實施例方式
選取WFS1基因作為研究對象，通過在90名各種感音神經(jīng)性耳聾患者和83名正常聽力對照組中進行篩查，發(fā)現(xiàn)一個與耳聾有關(guān)的WFS1基因新的突變位點(2766G→A 866D→N)。這一突變位點在83名對照組中均沒有發(fā)現(xiàn)這一突變，說明這一突變位點與耳聾有關(guān)，這一突變位點位于Wolramin的細胞膜內(nèi)區(qū)域。發(fā)生突變的具體結(jié)果總結(jié)于下表1，并對結(jié)果進行了卡方檢驗，p值＜0.01，說明突變發(fā)生人數(shù)在2組中有差異，差異有統(tǒng)計學意義。
表1、90例耳聾患者和83例正常聽力對照組WFS1基因新的2766G→A突變統(tǒng)計
卡方檢驗，P＝0.00實施例1一、WFS1基因編碼區(qū)的PCR擴增1.對象聾病門診收集的非綜癥型低頻性感音神經(jīng)性耳聾90例，正常對照83例。對所有參加者詳細調(diào)查其病史以及家族史，并對其進行體格檢查，耳科檢查包括耳鏡檢查、聽力學評估。在簽署知情同意書以后每人采集血樣5-10ml。
2.基因組DNA提取采用酚氯仿抽提法。
第一天1.抗凝血用PBS作1倍稀釋。
2.在離心管中加入2倍體積的淋巴分離液(18℃-28℃)，上面鋪一層1倍體積已稀釋的血液，室溫離心1000×g 20分。
3.吸棄上清，小心吸出中間有核細胞層，轉(zhuǎn)入5mlEp管中，5000×g，10分鐘，然后用PBS洗一次。5000×g 10分。
4.將細胞懸于2mlTE緩沖液中，加10％的SDS至終濃度0.5％(100μl)，蛋白激酶k100-200μg/ml(10mg/ml)，50℃水浴3-5小時。
5.用酚氯仿提取。用等體積的飽和酚，加入混勻，離心5000×g 10分鐘。
6.吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入等體積酚氯仿混合物，混勻，5000×g 10分鐘。
7.吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入等體積氯仿異戊醇混合物，混勻，5000×g 10分鐘。
8.吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入1/10體積的乙酸鈉，混勻。
9.加入2.5倍體積的無水乙醇。
10.-20℃沉淀DNA過夜。
第二天11.高速離心，10000×g，10分鐘，4℃。
12.棄上清，加入75％乙醇2ml，高速離心10000×g，5分鐘。
13.棄上清，吹干。
14.用TE緩沖液溶解，(400μl TE/5ml全血，600-800TE/10ml全血)15.分裝。1％瓊脂糖電泳和分光光度計定量。
二、WFS1基因擴增——PCR反應條件引物序列WFS1-F5’-TTC GAC CGC TAC AAG TTT GA-3’WFS1-R5’-GGG AGG AGA GGG AAT CTC AT-3’反應體系25ul

其中緩沖液、dNTP、引物、Tag多聚酶為上海生工公司生產(chǎn)。
反應條件反應在ABI公司9700熱循環(huán)儀上進行。

實施例2PCR產(chǎn)物直接測序
PCR產(chǎn)物純化1.向裝有PCR產(chǎn)物的96孔板中加入50微升無菌水，混勻。
2.將其轉(zhuǎn)移到Millipore純化板中，放到真空泵上抽濾約3分鐘，看到純化板中沒有水即可。
3.向純化扳中再次加入50微升的去離子水，繼續(xù)抽濾，直到純化板中沒有水為止。
4.將純化板從真空泵上取下，向板中加入20微升的去離子水，靜置15分鐘，再震蕩15分鐘，然后吸到一新96孔板內(nèi)。
5.保存在-20度冰箱中。
電泳定量1、樣品準備DNA(2ul)+上樣緩沖液(6ul)共8ul×96取一96孔點樣板，每孔先加上樣緩沖液6ul，在從裝有PCR產(chǎn)物的腔板中，每孔用排槍移出PCR產(chǎn)物(2ul)，轉(zhuǎn)移到點樣板上、混勻、用離心機甩一下(腔板孔號要與96孔點樣板一一對應)。
2、流程配膠(0.8％瓊脂糖)稱取2.4g瓊脂糖，懸浮于300ml 0.5×TBE中(500ml錐形瓶)。
溶膠微波爐中高火加熱至沸，持續(xù)沸騰數(shù)分鐘，注意不要沸出，其間取出混勻。
涼膠待膠完全溶解，從微波爐中取出，涼至60℃左右，加入1滴EB(約10ul，10mg/ml)，搖勻。
鋪膠平板兩端用膠布封嚴，把250ml膠液全部倒入平板，插入梳尺。
上膠將平板放入已盛有電泳液(0.5×TBE，液面距膠面1至2mm)的電泳槽中，拔下梳尺。
加樣用排槍按規(guī)定格式加樣，最后用單槍加入待測的PCR樣品。
走膠蓋上電泳槽蓋，檢查正負級，開啟電泳儀，調(diào)節(jié)電泳電壓。
定量當溴酚藍走離加樣孔1.5至2cm處，關(guān)閉電泳儀，小心取膠，放入攝相儀照相，定量。
所用做標記的MARKER為DL2000經(jīng)過電泳后，有6條帶可見，片段長度分別是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp而構(gòu)成，DL2000的總濃度是300ng/5ul。一般取3ul+5ul(溴酚藍)電泳。每條帶的DNA量約為30ng。
實施例3測序反應BigDye 3.1測序反應采用美國應用生物系統(tǒng)公司(ABI公司)BigDyeTM Terminaors試劑盒，可在一個反應管中完成循環(huán)測序反應，并通過一個電泳道電泳即可完成測序任務。
1.測序反應所需試劑應為新鮮配制，需要經(jīng)高壓滅菌的試劑必須滅菌后方可使用。測序反應所需的器材(如384孔板、tip頭等)同樣應為潔凈無菌的。
2.為了保證測序樣本及反應試劑的新鮮，加樣時應在冰上操作。
3.目前的反應體系為5ul，各種試劑加入量如下

4.樣品(實施例2中的PCR產(chǎn)物)放于PCR儀上做如下反應

反應完的樣品要及時從PCR儀上取下，短時間會純化的樣品放置于4℃冰箱中，超過一天以上才能純化的樣品放置于-20℃冰箱冷凍。
測序純化-BigDye3.1測序純化1.使用機械手程序15在384孔板的每個孔中加入20ul 80％乙醇，4,000rpm離心30min；將樣品板放在折好的紙巾上，在離心機中倒甩，倒甩時速率不能超過1000rpm；2.在每孔中加入30ul 70％乙醇，4,000rpm離心10min，倒甩；3.重復第2步的操作；4.重復第2步的操作；5.將樣品板放于干凈的抽屜中，避光干燥30min；6.加入5ul甲酰胺，封膜，離心后置于-20℃冰箱中；7.上機器前95℃變性5分鐘，放置冰上2分鐘，離心后上樣。
實施例4突變位點進化研究1.突變分析應用DNAStar(Lasergene inc.)軟件包中的SeqmanTM軟件進行序列對比分析。將測序得到的序列與NCBI檢索到的標準序列進行比對，找出突變序列。
2.進化研究在數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)只有鼠類和人類有WFS1的同源基因，而在人類，此基因主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，少量在肌肉組織中，找出家鼠、肌肉、倉鼠及人類神經(jīng)組織中的4種Wolframin蛋白氨基酸序列，應用ClustalX軟件進行比對分析。通過研究發(fā)現(xiàn)D866N位點在Wolramin蛋白家族中高度保守。
實施例5檢測耳聾相關(guān)基因WFS1-2766G→A突變位點試劑盒及其應用1.試劑盒含有擴增用引物WFS1-F5’-TTC GAC CGC TAC AAG TTT GA-3’WFS1-R5’-GGG AGG AGA GGG AAT CTC AT-3’PCR擴增用Taq酶5u/ul10×緩沖液(含15ml MgCl2)dNTP2mMBig-Dye mix
2.使用方法主要包括如下步驟A提取DNA，利用上述引物，進行PCR反應；BPCR反應產(chǎn)物純化后直接測序，將所得的序列與Genbank中的標準序列比較確定突變位點的存在。
C按正常閱讀框進行翻譯以確定Wolframin氨基酸突變位點。
具體方法參見實施例1、2、3。
以上對本發(fā)明的詳細描述并不限制本發(fā)明，本領域技術(shù)人員應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容以后，本領域技術(shù)人員可以對本發(fā)明做各種改動或修改，但改動或修改的等價形式同樣落在本申請權(quán)利書所限定的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.WFS1突變基因，其特征在于其具有2766G→A雜合突變，所述突變基因與人類感音神經(jīng)性耳聾相關(guān)。
2.權(quán)利要求1所述的WFS1突變基因，其特征在于所述突變基因編碼的氨基酸具有866D→N突變位點。
3.一種檢測方法，其特征在于通過檢測來源于待測個體的樣本中是否存在權(quán)利要求1所述的WFS1基因突變位點，而診斷待測個體遺傳性耳聾的發(fā)生和類型。
4.權(quán)利要求3所述的檢測方法，包括下述步驟1)采集待測個體的血液、體液或組織樣本，提取DNA；2)以所述DNA為模板，以針對WSF1基因或WSF1基因2766堿基附近編碼區(qū)設計的PCR引物進行PCR反應得到PCR反應產(chǎn)物；3)將得到的PCR反應產(chǎn)物進行直接測序分析，將所得的序列與WSF1正常基因的標準序列進行比較，確定是否存在2766G→A突變位點。4)根據(jù)以上結(jié)果判斷待測個體是否為WSF12766G→A基因突變導致的感音神經(jīng)性耳聾。
5.權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于所述進一步包括下述步驟5)按照正常閱讀框進行翻譯以確定是否存在866D→N氨基酸突變位點。
6.權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述PCR引物序列為WFS1-F5’-TTC GAC CGC TAC AAG TTT GA-3’WFS1-R5’-GGG AGG AGA GGG AAT CTC AT-3’
7.一種檢測試劑盒，用于診斷人類遺傳性耳聾，包括下述一種或幾種試劑的組合從待測樣本中提取DNA的試劑；用于擴增樣本DNA中WSF1基因或WSF1基因2766堿基附近編碼區(qū)的PCR引物及相應的PCR反應試劑；以及對PCR擴增產(chǎn)物進行測序的試劑。
8.權(quán)利要求1所述WSF1突變基因在診斷人類遺傳性耳聾疾病中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有2766G→A雜合突變的WFS1突變基因突變，該基因與人類感音神經(jīng)性耳聾相關(guān)，本發(fā)明還提供了通過檢測患者中是否存在該突變基因而診斷耳聾發(fā)生的原因和類型的檢測方法。該突變基因和檢測方法將有利于在臨床上開展聾病患者的WFS1突變篩查工作，為耳聾患者診斷和治療提供服務。
文檔編號C12Q1/68GK1733917SQ200410009578
公開日2006年2月15日 申請日期2004年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月17日
發(fā)明者王秋菊, 沈巖, 劉穹, 李慶忠 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院, 北京諾賽基因組研究中心有限公司