專利名稱：一種提高人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞分化效率的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法，具體地說涉及一種調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的新方法。
背景技術(shù)：
通過組織工程技術(shù)體外分離和培養(yǎng)所需的靶細(xì)胞用于體內(nèi)相關(guān)疾病的細(xì)胞或組織替代治療已為多種臨床疾病的治療提供了新的途徑，近年來受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注和重視。但由于多種組織細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)難度極大，限制了這一技術(shù)的開展和推廣。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源較廣泛，取材較方便，并在不同誘導(dǎo)條件下，可分化為骨、軟骨、腱、肌肉、韌帶、血管內(nèi)皮、肝、神經(jīng)、皮膚和脂肪等多種組織細(xì)胞，分離培養(yǎng)較為容易，且植入反應(yīng)較弱，是一種良好的替代治療的靶細(xì)胞。在組織器官性損傷疾病、組織器官退行性疾病、遺傳缺陷疾病等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。目前通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單獨(dú)應(yīng)用可以較好地促進(jìn)骨折愈合和軟骨組織損傷修復(fù)，通過體外培養(yǎng)使其覆蓋于陶瓷支架和碳纖維網(wǎng)等再植入患處效果更明顯。國(guó)外還開展了將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于治療因I型膠原基因突變導(dǎo)致的兒童骨發(fā)育不良的臨床實(shí)驗(yàn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植還具有不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)或程度較低的優(yōu)點(diǎn)且易于控制。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不僅具有多向分化潛能，還易于外源基因的導(dǎo)入和表達(dá)，因而，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有可能成為一種新型的基因治療的靶細(xì)胞，這樣再與其多向分化潛能相結(jié)合，通過導(dǎo)入目的基因，將細(xì)胞治療和基因治療結(jié)合起來，對(duì)上述疾病的治療無疑將有更廣闊的前景。
帕金森病是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的退行性疾病，其發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病，位于第二位。本病基本上屬于中、老年人的疾患，隨著我國(guó)人口平均壽命延長(zhǎng)和社會(huì)老齡化進(jìn)程加速，其發(fā)病率呈明顯上升勢(shì)頭，已成為一嚴(yán)重的社會(huì)問題，但其發(fā)病原因和致病機(jī)制至今還不完全清楚。其主要的病理生化學(xué)改變是位于中腦黑質(zhì)致密區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元漸進(jìn)性變性壞死，致使黑質(zhì)-紋狀體通路多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)水平下降，引起錐體外系的功能失調(diào)，從而導(dǎo)致以隨意運(yùn)動(dòng)減慢、肌張力僵直、肢體震顫和正常的姿勢(shì)平衡反射喪失為主的臨床癥狀。長(zhǎng)期以來，人們一直在尋找能夠有效治療帕金森病的方法，由于本病主要是源于多巴胺能神經(jīng)元變性死亡而致，若能將合成和分泌多巴胺的細(xì)胞移植入黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)，理論上講是最為理想的治療措施，可以起到治愈該病的作用。但這種療法卻存在難以克服的困難，主要限制因素是無法同時(shí)獲得足夠用于移植的胚胎組織，所以，尋找新的細(xì)胞來源已成為細(xì)胞替代治療首要解決的問題。
研究人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的重要性主要是其潛在的治療應(yīng)用價(jià)值，目前，用于臨床治療的人間充質(zhì)干細(xì)胞主要來源于骨髓。盡管骨髓樣品易獲取，但其中間充質(zhì)干細(xì)胞含量較少，約占骨髓單個(gè)核細(xì)胞的10萬分之一；特別是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外一定誘導(dǎo)條件下定向分化為多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞的比例較低，因此，獲得充足、安全而合格的移植所需細(xì)胞是研究和應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療帕金森病的前提條件。然而，目前還沒有一種切實(shí)可行的生理方法來促進(jìn)體外人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化。
氧是生命存在的必要條件，也是細(xì)胞生理功能的一種重要調(diào)節(jié)因子。而低氧是生命發(fā)育的基本環(huán)境，如哺乳動(dòng)物的胚胎是在低氧環(huán)境中發(fā)育生長(zhǎng)的；成體哺乳動(dòng)物腦組織內(nèi)的局部氧水平也只有1％～5％，骨髓中的氧濃度為4％～7％，均是一種生理性的低氧環(huán)境。然而，目前體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)條件是在37℃下，5％二氧化碳和95％空氣的混合氣(氧含量是20％)。近年來關(guān)于低氧對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)作用研究只有零星的報(bào)道，5％氧氣可促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)低氧能促進(jìn)這些細(xì)胞向骨細(xì)胞的分化(Lennon DP.et al.Cultivation of rat marrow-derivedmesenchymal stem cell in reduced oxygen tensioneffects on in vitro and in vivoosteochondrogenesis.J Cell Physio1，2001，187345-355)。然而，迄今未見有關(guān)低氧對(duì)體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化影響的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種提高人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞分化效率的新方法。
本發(fā)明的發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)中意外的發(fā)現(xiàn)適宜的低氧濃度具有促進(jìn)體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的作用，從而提高定向誘導(dǎo)分化的效率。
本發(fā)明的方法包括以下內(nèi)容人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定抽取胎兒股骨骨髓，移入含DMEM-LG培養(yǎng)基的離心管中，離心去脂肪及上清，向細(xì)胞團(tuán)加入Percoll分離液，離心。取界面云霧狀細(xì)胞層加入DMEM-LG，吹打成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)有核細(xì)胞，將細(xì)胞接種于25ml培養(yǎng)瓶中，進(jìn)行常規(guī)原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。
用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，當(dāng)蓋玻片上的細(xì)胞融合約50％時(shí)，取出蓋玻片，用PBS沖洗，室溫自然風(fēng)干，酒精固定，蒸餾水洗；用TritonX-100和雙氧水處理；滴加正常羊血清室溫封閉；分別滴加一抗工作液和生物素化二抗；用DAB試劑盒室溫顯色；蘇木精輕度復(fù)染，脫水、透明、中性樹膠封片。
人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞將傳代的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)按一定的密度接種，分2組，即對(duì)照組和誘導(dǎo)組。誘導(dǎo)組用含1mmol/L β-巰基乙醇、20％胎牛血清的DMEM-HG培養(yǎng)基預(yù)誘導(dǎo)24h，然后更換為含5mmol/L β-巰基乙醇、無血清的DMEM-HG培養(yǎng)基誘導(dǎo)5h。對(duì)照組不加誘導(dǎo)劑。用多聚甲醛固定細(xì)胞，PBS洗滌；非免疫性動(dòng)物血清封閉，PBS洗滌；加入TH一抗，PBS洗滌；加入二抗，PBS洗滌；DAB溶液室溫下反應(yīng)顯色。鏡下觀察到一些hMSCs在誘導(dǎo)劑作用下轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元樣形態(tài)，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化；免疫組化顯示，約8.63％的細(xì)胞TH染色陽性，對(duì)照組則無陽性結(jié)果。
低氧對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞的作用將傳代的hMSCs按一定的密度接種，分三組正常誘導(dǎo)組、預(yù)誘導(dǎo)+低氧組和預(yù)誘導(dǎo)、誘導(dǎo)+低氧組。用含1mmol/L β-巰基乙醇、20％胎牛血清的DMEM-HG培養(yǎng)基預(yù)誘導(dǎo)24h，然后更換為含5mmol/L β-巰基乙醇、無血清的DMEM-HG培養(yǎng)基誘導(dǎo)5h。預(yù)誘導(dǎo)+低氧組和預(yù)誘導(dǎo)、誘導(dǎo)+低氧組分別在預(yù)誘導(dǎo)期間和誘導(dǎo)的全過程將hMSCs放在含氧量為3％的低氧環(huán)境中培養(yǎng)。誘導(dǎo)后用多聚甲醛固定細(xì)胞，PBS洗滌；非免疫性動(dòng)物血清封閉，PBS洗滌；加入TH一抗，PBS洗滌；加入二抗，PBS洗滌；DAB溶液室溫下反應(yīng)顯色。鏡下觀察預(yù)誘導(dǎo)+低氧組和預(yù)誘導(dǎo)、誘導(dǎo)+低氧組hMSCs轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元樣形態(tài)的明顯多于正常誘導(dǎo)組；免疫組化顯示，預(yù)誘導(dǎo)+低氧組(16.57％)和預(yù)誘導(dǎo)、誘導(dǎo)+低氧組(24.88％)TH染色陽性細(xì)胞數(shù)均高于正常誘導(dǎo)組，預(yù)誘導(dǎo)、誘導(dǎo)+低氧組TH染色陽性細(xì)胞數(shù)高于預(yù)誘導(dǎo)+低氧組，統(tǒng)計(jì)均有顯著性差異(P＜0.001)。
綜上所述，低氧可促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化，提高這些細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化效率。利用環(huán)境中的低氧調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的定向分化，具有實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)單，重復(fù)性強(qiáng)，結(jié)果可靠，在體外易調(diào)控，對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其分化的多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞無損傷和毒副作用，實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn)。


圖1.為體外培養(yǎng)接近融合的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖(×100)。
圖2.為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定圖(×400)。
圖3.為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞圖(TH染色，×200)。其中A對(duì)照組；B誘導(dǎo)組圖4.為低氧對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的作用圖。(*P＜0.001)圖5.為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞圖(TH染色，×200)。其中A正常誘導(dǎo)組；B預(yù)誘導(dǎo)+低氧組；C預(yù)誘導(dǎo)、誘導(dǎo)+低氧組具體實(shí)施方式
實(shí)施例一人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定1.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)無菌抽取胎兒(6個(gè)月水囊引產(chǎn)胎兒，經(jīng)產(chǎn)婦知情同意提供)股骨骨髓約1ml，移入含3ml DMEM-LG培養(yǎng)基(Hyclone公司產(chǎn)品)的無菌離心管中，900g離心5min。去脂肪及上清，向細(xì)胞團(tuán)加入70％Percoll分離液(Pharmacia公司產(chǎn)品)，900g離心30min。取界面云霧狀細(xì)胞層加入含20％胎牛血清的DMEM-LG，吹打成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)有核細(xì)胞，將細(xì)胞以105個(gè)/ml的密度接種于25ml培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后更換新鮮培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞，以后每3～4d換液一次。當(dāng)細(xì)胞相互融合達(dá)到約90％的生長(zhǎng)表面(見圖1.)時(shí)，用0.25％胰蛋白酶消化分散細(xì)胞，以1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
2.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定當(dāng)培養(yǎng)瓶中蓋玻片上的細(xì)胞融合約50％時(shí)，取出蓋玻片，0.01M PBS沖洗，室溫自然風(fēng)干，95％酒精固定30min，蒸餾水洗；0.2％TritonX-100處理10min，0.5％雙氧水10min；滴加正常羊血清，室溫封閉20min，甩去多余液體；滴加一抗工作液(小鼠抗人Vimentin，購(gòu)自北京中山生物公司)，4℃過夜，0.01M PBS洗；滴加生物素化二抗，37℃ 20min，0.01M PBS洗；滴加SABC，370℃ 20min，0.01M PBS洗；用DAB試劑盒室溫顯色；蘇木精輕度復(fù)染，脫水、透明、中性樹膠封片。在顯微鏡下計(jì)數(shù)結(jié)果顯示98％細(xì)胞Vimentin陽性(見圖2.)。
實(shí)施例二人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞1.實(shí)驗(yàn)分組將第5代的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)按1×105/ml密度接種于35mm培養(yǎng)皿中，隨機(jī)分成2組，分別為對(duì)照組和誘導(dǎo)組，每組10皿。
2.誘導(dǎo)方法用含1mmol/L β-疏基乙醇、20％胎牛血清的DMEM-HG培養(yǎng)基預(yù)誘導(dǎo)24h，然后用解剖液洗滌2遍，更換為含5mmol/L β-巰基乙醇、無血清的DMEM-HG培養(yǎng)基誘導(dǎo)5h。對(duì)照組不加誘導(dǎo)劑。
3.免疫細(xì)胞組化鑒定和細(xì)胞分化的定量分析誘導(dǎo)后用4％多聚甲醛固定細(xì)胞30min(室溫)，0.1M PBS洗滌3遍；用非免疫性羊血清封閉，室溫處理30min，0.1M PBS洗3遍；加入兔TH抗體，濃度1∶1000，4℃過夜；PBS洗3遍，加入抗兔IgG，4℃過夜；PBS洗3遍，用AB復(fù)合物1∶1000室溫處理1h，PBS洗3遍；DAB溶液室溫下反應(yīng)顯色。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，每皿從上下左右中5個(gè)方位分別選取2個(gè)視野計(jì)數(shù)TH陽性細(xì)胞，并計(jì)算其百分比例的平均數(shù)。最后計(jì)算出每組TH陽性細(xì)胞百分比例的平均值。鏡下可見誘導(dǎo)組一些hMSCs在誘導(dǎo)劑作用下發(fā)生形態(tài)改變，原來的梭形細(xì)胞向核回縮，出現(xiàn)突起樣變化，轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元樣形態(tài)，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化；免疫組化顯示，誘導(dǎo)組約8.63％的細(xì)胞TH染色陽性，呈黑色。對(duì)照組則無陽性結(jié)果(見圖3.和圖4.)。
實(shí)施例三低氧對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞的作用1.實(shí)驗(yàn)分組將第5代的hMSCs按1×105/ml密度接種于35mm培養(yǎng)皿中，隨機(jī)分成3組，分別為正常誘導(dǎo)組、預(yù)誘導(dǎo)+低氧組和預(yù)誘導(dǎo)、誘導(dǎo)+低氧組，每組10皿。
2.低氧條件的確定向自制細(xì)胞低氧培養(yǎng)箱內(nèi)的密閉容器通入含3％O2、5％CO2和氮?dú)馄胶獾幕旌蠚怏w，開始通氣量為1L/min，持續(xù)通氣30min后，調(diào)整至維持量0.1L/min繼續(xù)通氣，保持密閉容器內(nèi)的氧含量為3％O2。
3.免疫細(xì)胞組化鑒定和細(xì)胞分化的定量分析誘導(dǎo)后免疫細(xì)胞組化鑒定和細(xì)胞分化的定量分析方法同上。組間比較用非配對(duì)Student’s T-test作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
4.低氧對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞的促進(jìn)作用鏡下可見預(yù)誘導(dǎo)+低氧組和預(yù)誘導(dǎo)、誘導(dǎo)+低氧組hMSCs轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元祥形態(tài)的明顯多于正常誘導(dǎo)組；免疫組化結(jié)果顯示，預(yù)誘導(dǎo)+低氧組和預(yù)誘導(dǎo)、誘導(dǎo)+低氧組TH染色陽性細(xì)胞數(shù)平均值分別為16.57％和24.88％，均高于正常誘導(dǎo)組，預(yù)誘導(dǎo)、誘導(dǎo)+低氧組TH染色陽性細(xì)胞數(shù)高于預(yù)誘導(dǎo)+低氧組，統(tǒng)計(jì)均有顯著性差異(P＜0.001)(見圖4.和圖5.)。
權(quán)利要求
1.一種提高人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞分化效率的新方法，其特征在于采用低氧環(huán)境，促進(jìn)體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所說的低氧環(huán)境為氧濃度低于20％的環(huán)境。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于低氧環(huán)境中氧的濃度為3％至10％。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于低氧環(huán)境中的氧濃度為3％。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞分化效率的新方法。本發(fā)明通過適宜的低氧濃度對(duì)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化進(jìn)行調(diào)節(jié)，使這些細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的效率得到提高。通過本發(fā)明的方法，采用一種可調(diào)控的無損傷的物理手段，體外調(diào)節(jié)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化，實(shí)現(xiàn)少量取樣、體外擴(kuò)增和誘導(dǎo)分化、大量獲取所需細(xì)胞，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)應(yīng)用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療帕金森病，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1752208SQ20041000959
公開日2006年3月29日 申請(qǐng)日期2004年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月21日
發(fā)明者李海生, 趙彤, 朱玲玲, 張翠萍, 丁愛石, 范明 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所