專利名稱：冬蟲(chóng)夏草菌粉與活性免疫蟲(chóng)草多糖凍干粉的生產(chǎn)方法及產(chǎn)品的制作方法
本

發(fā)明內(nèi)容
屬于生化物品制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用冬蟲(chóng)夏草菌種制備蟲(chóng)草菌粉的方法和產(chǎn)品以及一種根據(jù)以上菌粉原料提取蟲(chóng)草免疫活性多糖的方法和產(chǎn)品。
冬蟲(chóng)夏草(Cordyceps sinensis)是分布于我國(guó)四川、西藏、青海、云南、甘肅等省區(qū)高山及亞高山草甸地帶的一種名貴的食用及藥用真菌，屬子囊菌綱、麥角菌科。由于冬蟲(chóng)夏草內(nèi)所含的蟲(chóng)草酸及蟲(chóng)草素等成分具有擴(kuò)張氣管、鎮(zhèn)靜、抗菌和降血壓等功效，中醫(yī)學(xué)上以干燥的子座及蟲(chóng)體入藥，可用于治療慮勞咳嗽痰血、氣喘、腰痛、肺結(jié)核、慢性腎炎、糖尿病、腫瘤、遺精陽(yáng)痿、自汗盜汗、失眠健忘等多種病癥，此外蟲(chóng)草本身也含有多種人體必需的氨基酸及人體造血所必需的維生素B12，因而它具有極佳的醫(yī)療和滋補(bǔ)功能，近年來(lái)，社會(huì)對(duì)其的需求量很大。鑒于野生冬蟲(chóng)夏草所處的生長(zhǎng)環(huán)境為高寒特殊環(huán)境，其寄主蝙蝠蛾需三年以上才能完成一個(gè)時(shí)代，致使自然繁殖的蟲(chóng)草資源不足，產(chǎn)供矛盾本已十分突出，加之近年來(lái)人工過(guò)度采掘，又使生態(tài)環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞，一些地區(qū)的冬蟲(chóng)夏草已瀕臨枯竭，建立有效的保護(hù)措施也已是刻不容緩。因此，本領(lǐng)域亟待尋求出新型的可通過(guò)工業(yè)化生產(chǎn)的冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性型細(xì)胞體及其產(chǎn)品，使其成為天然冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體的代用品，以緩解中藥材的供需矛盾，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，同時(shí)也為我國(guó)中草藥進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)及生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品創(chuàng)一條道路。
本發(fā)明的目的之一在于針對(duì)已有技術(shù)現(xiàn)狀，提供一種可替代天然冬蟲(chóng)夏草的冬蟲(chóng)夏草菌粉及其生產(chǎn)方法；本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種以上述冬蟲(chóng)夏草菌粉產(chǎn)品為原料提取種活性免疫蟲(chóng)草多糖凍干粉的生產(chǎn)方法及產(chǎn)品。
用于實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的整體設(shè)計(jì)思路是這樣的依據(jù)冬蟲(chóng)夏草的生活史分有性型和無(wú)性型的特征，采用現(xiàn)代組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，從天然冬蟲(chóng)夏草的有性子實(shí)體上分離獲得冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性型細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行純化和訓(xùn)化后，利用自動(dòng)控制發(fā)酵法及噴霧干燥、細(xì)胞破碎等工序生產(chǎn)出冬蟲(chóng)夏草菌粉；繼而以冬蟲(chóng)夏草菌粉為原料通過(guò)復(fù)合酶提取法及吸附法等工序制備出活性免疫蟲(chóng)草多糖凍干粉。
本發(fā)明所述的生產(chǎn)方法與產(chǎn)品包括根據(jù)天然冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體純菌種制備冬蟲(chóng)夏草菌粉的生產(chǎn)方法與產(chǎn)品以及以冬蟲(chóng)夏草菌粉為原料制備活性免疫蟲(chóng)草多糖凍干粉的生產(chǎn)方法與產(chǎn)品兩種。
本發(fā)明所述生產(chǎn)冬蟲(chóng)夏草菌粉的方法由以下的生產(chǎn)工序構(gòu)成(一)、優(yōu)良純菌株菌種的獲得選天然冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體的新鮮個(gè)體，用常規(guī)的初篩和復(fù)篩法從菌株中篩選出相對(duì)穩(wěn)定且性能較好的菌株，然后依次通過(guò)分離、紫外線誘變、復(fù)壯及對(duì)照等常規(guī)微生物系統(tǒng)分離的方法獲得相對(duì)優(yōu)良的蝙蝠蛾擬青霉(paecilomyces hepiali Chen & Dai)菌種；(二)、用發(fā)酵法生產(chǎn)冬蟲(chóng)夏草菌體包括固體發(fā)酵法和液體發(fā)酵法兩種，其中a、固體發(fā)酵生產(chǎn)法——使經(jīng)過(guò)工序(一)獲得的菌種在PH值為6.8～7.2的綜合PDA培養(yǎng)基(該綜合PDA培養(yǎng)基的每單位份物質(zhì)配方為土豆粉20個(gè)重量單位，蔗糖20個(gè)重量單位，磷酸二氫鉀1.5個(gè)重量單位，硫酸鎂1個(gè)重量單位，維生素B10.02個(gè)重量單位，天然蛋白1.5個(gè)重量單位，麥麩30個(gè)重量單位，玉米粉10個(gè)重量單位。)上接種，并使之與培養(yǎng)基作固體發(fā)酵培養(yǎng)15～20天，培養(yǎng)溫度為16～25℃，濕度70％；其后對(duì)菌體進(jìn)行低溫干燥，溫度60℃以下，獲得干燥菌體；b、液體發(fā)酵生產(chǎn)法——將經(jīng)工序(一)獲得的菌種置入PH值為6.8～7.2的綜合PDA培養(yǎng)基液(該綜合PDA培養(yǎng)基液的配方為土豆粉20g，蔗糖20g，磷酸二氫鉀g，硫酸鎂1g，維生素B120mg，天然蛋白0.5g，麥麩30g，玉米粉10g，水1000ml。)發(fā)酵缸中接種，并使之在培養(yǎng)基液中做深層發(fā)酵培養(yǎng)5～7天，培養(yǎng)溫度為16～25℃；其后通過(guò)蒸發(fā)濃縮及板框過(guò)濾的方法使培養(yǎng)基液與生長(zhǎng)后的菌體分離，對(duì)分離出的菌體進(jìn)行噴霧干燥，獲得干燥菌體；③、粉碎制取超細(xì)粉用細(xì)胞粉碎機(jī)將經(jīng)工序(二)獲得的干燥菌體制成粒度為-300目(粒徑為4～10微米)的冬蟲(chóng)夏草菌粉的超細(xì)粉，粉碎過(guò)程中，環(huán)境溫度不超過(guò)60℃；(四)、成品性能檢測(cè)、包裝、入庫(kù)。
本發(fā)明所述的冬蟲(chóng)夏草菌粉的產(chǎn)品為經(jīng)上述工序(一)～(四)制得的菌粉細(xì)胞破壁率＞95％。由于細(xì)胞及微粉是醫(yī)藥品提高藥效的基礎(chǔ)，中、西藥的主要藥效成分通常都分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間質(zhì)中，且以細(xì)胞內(nèi)為主，當(dāng)細(xì)胞破壁后，其細(xì)胞內(nèi)有效成分暴露出來(lái)，細(xì)胞破壁率越高，產(chǎn)品的藥效就越高，而且起效速度也越快。經(jīng)陜西省產(chǎn)品檢驗(yàn)所、陜西省衛(wèi)生防疫站、陜西省中醫(yī)研究院、西安交大附屬醫(yī)學(xué)院等單位對(duì)菌粉成品所做的測(cè)定分析結(jié)果表明該產(chǎn)品內(nèi)核苷酸類物質(zhì)、甘露醇、活性免疫蟲(chóng)草多糖等的含量均高于或等于天然冬蟲(chóng)夏草的含量，此外它還含有各種氨基酸、微量元素和有機(jī)硒等，其衛(wèi)生指標(biāo)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，抗癌作用明顯。這種通過(guò)人工制得的冬蟲(chóng)夏草菌粉不僅從化學(xué)組成、營(yíng)養(yǎng)成份、藥理作用上達(dá)到可以替代天然冬蟲(chóng)夏草的性能，而且其產(chǎn)品的組織形態(tài)也達(dá)到了國(guó)際制藥行業(yè)對(duì)中藥的最高要求，使產(chǎn)品可一次到位直接與國(guó)際市場(chǎng)接軌。
本發(fā)明的最終產(chǎn)品是利用冬蟲(chóng)夏草菌粉提取免疫活性多糖及其它產(chǎn)品。近幾年來(lái)，本領(lǐng)域中關(guān)于真菌免疫活性多糖的研究報(bào)道很多，但產(chǎn)品卻很少，其主要原因就是目前提取多糖生產(chǎn)工藝(如熱水提取法、有機(jī)溶劑提取法、常規(guī)酶提取法等)的產(chǎn)量低、成本高、活性低。本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，采用復(fù)合酶法作為蟲(chóng)草多糖的提取方法，該方法克服了現(xiàn)有技術(shù)在提取過(guò)程中破壞生物活性分子的立體結(jié)構(gòu)及降低生物活性能力等缺點(diǎn)，提高了提取率，獲得了免疫活性高的蟲(chóng)草多糖，同時(shí)也降低了生產(chǎn)成本。由冬蟲(chóng)夏草菌粉生產(chǎn)免疫活性蟲(chóng)草多糖的工藝路線是在低于40℃條件下將1份蛋白水解酶、1～2份淀粉水解酶和1份纖維素水解酶分別加入10份冬蟲(chóng)夏草菌粉中，在含水量為75％的條件下將之?dāng)嚢杈鶆?，繼而在溫度為25～40℃及PH值為6.0～8.0條件下作用45～90分鐘后，采用常規(guī)的有機(jī)溶劑沉淀法提取上述物料中的多糖成分；再通過(guò)低溫冷凍干燥法獲得含量為75～85％的多糖粗制品；繼而再利用蛋白水解酶、淀粉水解酶和纖維素水解酶分別與粗制品作用進(jìn)行再提取，并利用吸附法對(duì)再提取物進(jìn)行脫色處理后獲得含量在95％以上的多糖精制品，最后再將多糖精制品凍干后，獲得活性免疫蟲(chóng)草多糖凍干粉。
與傳統(tǒng)的提取多糖法相比，利用復(fù)合酶法提取多糖的反應(yīng)條件溫和、酶反應(yīng)性質(zhì)專一，在一般條件下，不會(huì)破壞或影響多糖的立體結(jié)構(gòu)和大分子主鏈結(jié)構(gòu)的1，3-糖苷鍵骨架上的對(duì)抗腫瘤活性起重要作用的多羥基基團(tuán)，從而達(dá)到保護(hù)活性基團(tuán)生理活性作用不受影響的目的；此外，復(fù)合酶提取法的反應(yīng)時(shí)間短、酶源可以利用糖化酶生產(chǎn)，其工藝簡(jiǎn)單易行、成本低，可根據(jù)需要隨時(shí)生產(chǎn)，克服了一般酶源較難提取及酶源價(jià)值高的問(wèn)題。根據(jù)上述方法獲得的蟲(chóng)草多糖具有廣泛的藥理作用特別是免疫抗腫瘤作用，它的抗瘤活性主要依賴寄主的反應(yīng)，也就是說(shuō)它通過(guò)活化吞噬細(xì)胞和刺激產(chǎn)生抗體而達(dá)到提高人體免疫能力的生理功能，當(dāng)抗體產(chǎn)生后，就表現(xiàn)為強(qiáng)烈的抗腫瘤活性和對(duì)癌細(xì)胞很強(qiáng)的抑制力，再加上蟲(chóng)草素和有機(jī)硒的作用，其藥效相對(duì)廣泛并實(shí)用，因而可以說(shuō)它是預(yù)防和治療一切疾病的功能性基質(zhì)。
本發(fā)明所述產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝完全實(shí)行生物技術(shù)生產(chǎn)，不采用任何化學(xué)物質(zhì)，應(yīng)用的原材料也全部來(lái)源于農(nóng)副產(chǎn)品，并不產(chǎn)生任何污染源，所獲產(chǎn)品屬具有高附加值的珍稀中藥原料和國(guó)內(nèi)外先進(jìn)稀少的生化特效藥品原料，技術(shù)含量高、競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)、市場(chǎng)前景好，其技術(shù)方案的實(shí)施應(yīng)用可有效緩解保護(hù)環(huán)境和人類需求的矛盾，并為我國(guó)實(shí)現(xiàn)珍稀、野生藥材人工訓(xùn)化及工廠化生產(chǎn)代用品創(chuàng)立了先例。
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)冬蟲(chóng)夏草菌粉的方法，其特征在于包括以下的生產(chǎn)工序1.1、優(yōu)良純菌株菌種的獲得選天然冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體的新鮮個(gè)體，用常規(guī)的初篩和復(fù)篩法從菌株中篩選出相對(duì)穩(wěn)定且性能較好的菌株，然后依次通過(guò)分離、紫外線誘變、復(fù)壯及對(duì)照等常規(guī)微生物系統(tǒng)分離的方法獲得蝙蝠蛾擬青霉菌種；1.2、用蝙蝠蛾擬青霉菌種發(fā)酵法生產(chǎn)冬蟲(chóng)夏草菌體包括固體發(fā)酵法和液體發(fā)酵法兩種1.2a、固體發(fā)酵生產(chǎn)法——使經(jīng)過(guò)1.1工序獲得的菌種在PH值為6.8～7.2的綜合PDA培養(yǎng)基上接種，并使之與培養(yǎng)基作固體發(fā)酵培養(yǎng)15～20天，培養(yǎng)溫度為16～25℃；其后使培養(yǎng)基與生長(zhǎng)菌體分離，并對(duì)菌體進(jìn)行低溫干燥，溫度60℃以下，獲得干燥菌體；1.2b、液體發(fā)酵生產(chǎn)法——將經(jīng)1.1工序獲得的菌種置入PH值為6.8～7.2的綜合PDA培養(yǎng)基液發(fā)酵缸中接種，并使之在培養(yǎng)基液中做深層發(fā)酵培養(yǎng)5～7天，培養(yǎng)溫度為16～25℃；其后通過(guò)蒸發(fā)濃縮及板框過(guò)濾的方法使培養(yǎng)基液與生長(zhǎng)后的菌體分離，對(duì)分離出的菌體進(jìn)行噴霧干燥，獲得干燥菌體；1.3、粉碎制取超細(xì)粉用細(xì)胞粉碎機(jī)將經(jīng)1.2工序獲得的干燥菌體制成粒度為-300目的超細(xì)粉，粉碎過(guò)程中環(huán)境溫度不超過(guò)60℃。
2.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)冬蟲(chóng)夏草菌粉的方法，其特征是在1.2a過(guò)程中所用的每份固態(tài)綜合PDA培養(yǎng)基的配方為土豆粉20個(gè)重量單位，蔗糖20個(gè)重量單位，磷酸二氫鉀1.5個(gè)重量單位，硫酸鎂1個(gè)重量單位，維生素B10.02個(gè)重量單位，天然蛋白1.5個(gè)重量單位，麥麩30個(gè)重量單位，玉米粉10個(gè)重量單位。
3.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)冬蟲(chóng)夏草菌粉的方法，其特征是在1.2b過(guò)程中所用的每單位份綜合PDA培養(yǎng)基液的配方為土豆粉20g，蔗糖20g，磷酸二氫鉀g，硫酸鎂1g，維生素B20mg，天然蛋白1.5g，麥麩30g，玉米粉10g，水1000ml。
4.一種冬蟲(chóng)夏草菌粉，其特征在于所說(shuō)的菌粉為根據(jù)權(quán)利要求1所述生產(chǎn)方法制得的細(xì)胞破壁率＞95％的產(chǎn)品。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求4所述冬蟲(chóng)夏草菌粉提取活性免疫蟲(chóng)草多糖凍干粉的方法，其特征是在低于40℃條件下將1份蛋白水解酶、1～2份淀粉水解酶和1份纖維素水解酶分別加入10份冬蟲(chóng)夏草菌粉中，在含水量為75％的條件下將之?dāng)嚢杈鶆颍^而在溫度為25～40℃及PH值為6.0～8.0條件下作用45～90分鐘后，采用常規(guī)的有機(jī)溶劑沉淀法提取上述物料中的多糖成分；再通過(guò)低溫冷凍干燥法獲得含量為75～85％的多糖粗制品；繼而再利用蛋白水解酶、淀粉水解酶和纖維素水解酶分別與粗制品作用進(jìn)行再提取，并利用吸附法對(duì)再提取物進(jìn)行脫色處理后獲得含量在95％以上的多糖精制品，最后再將多糖精制品凍干后，獲得活性免疫蟲(chóng)草多糖凍干粉。
6.一種活性免疫蟲(chóng)草多糖凍干粉，其特征在于所說(shuō)的凍干粉為根據(jù)權(quán)利要求1和5所述生產(chǎn)方法制得的產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明依據(jù)冬蟲(chóng)夏草的生活史特征，采用現(xiàn)代組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，從天然冬蟲(chóng)夏草的有性子實(shí)體上分離獲得冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性型細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行純化和訓(xùn)化后，利用自動(dòng)控制發(fā)酵法及噴霧干燥、細(xì)胞破碎等工序生產(chǎn)出冬蟲(chóng)夏草菌粉；繼而以冬蟲(chóng)夏草菌粉為原料通過(guò)復(fù)合酶提取法及吸附法等工序制備出活性免疫蟲(chóng)草多糖凍干粉。其技術(shù)方案的實(shí)施應(yīng)用對(duì)緩解中藥材的供需矛盾，保護(hù)生態(tài)環(huán)境、實(shí)現(xiàn)珍稀、野生藥材人工訓(xùn)化及生產(chǎn)高附加值中草藥產(chǎn)品等方面均具有積極的意義。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1546644SQ200310118988
公開(kāi)日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2003年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月11日
發(fā)明者孫悅迎, 陳瑞真, 張?chǎng)?申請(qǐng)人:孫悅迎