專利名稱：改進食品發(fā)酵程序的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與乳酸細菌有關(guān)的食品發(fā)酵程序領(lǐng)域，并且特別涉及改進乳產(chǎn)品特性如酸度、發(fā)酵后的酸化、芳香、香味、溫和性、稠度以及質(zhì)地。特別地，本發(fā)明提供一種使用耐熱的耐熱鏈球菌和嗜溫的乳酸乳球菌生產(chǎn)乳產(chǎn)品的方法，該菌表達小熱激蛋白質(zhì)使得發(fā)酵可以在高于正常發(fā)酵溫度的溫度下進行。表達所述熱激蛋白質(zhì)的該耐熱及嗜溫的乳酸細菌也表現(xiàn)出對較低pH和較高鹽濃度的耐受性以及在升高的發(fā)酵溫度下對噬菌體攻擊的減弱的易感性。
序言在食品工業(yè)中，同型發(fā)酵的耐熱乳酸細菌耐熱鏈球菌在乳產(chǎn)品發(fā)酵中通常與耐熱乳桿菌一起用作起始種。在商業(yè)上，最重要的這種發(fā)酵是酸乳生產(chǎn)。酸乳得自兩種乳酸細菌耐熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種的原共生生長。原共生表現(xiàn)了生物間的代謝相互關(guān)系，這意味著兩種乳酸細菌都通過提供優(yōu)化生長所需的營養(yǎng)物來促進相互的生長。作為結(jié)果，酸化是快速的并且導致了低至3.5的最終pH值。
盡管一般認為德氏乳桿菌保加利亞亞種是導致香味形成的最主要的酸乳起始成分，然而從用耐熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株的不同組合的發(fā)酵實驗獲得的結(jié)果顯示了耐熱鏈球菌對香味形成有重要的影響(C.Mller，W.Bockelmann，和K.J.Heller，未發(fā)表)。
喜愛具有較溫和芳香的酸乳的消費者數(shù)量近年來一直在增多。如果發(fā)酵在4.0到4.7的pH值時已停止，就可以得到這種溫和的口味。此外，發(fā)酵后的酸化是導致酸乳中苦味和/或酸味的一個主要原因。為了克服酸乳的這種不合需要的特性，通過使用顯示無或僅有少許發(fā)酵后的酸化作用的起始成分能夠阻止苦味和/或酸味的形成。
除了酸乳之外，耐熱的起始培養(yǎng)物也用于不同類型的硬干酪和半硬干酪如莫澤雷勒干酪以及酸凝乳酪的生產(chǎn)。特別是對于后一種干酪，發(fā)酵后得到的最終pH值對于產(chǎn)品的質(zhì)量具有顯著的影響。
嗜溫的乳酸細菌乳球菌被用作許多干酪品種和黃油乳的起始成分。雖然對于干酪生產(chǎn)的酸化作用通常是通過切除凝乳以及除去伴隨的可發(fā)酵乳糖而得以終止，但黃油乳發(fā)酵在pH4.6時終止，而這非常接近于該生物的最低pH。
在溫暖的國家，例如像埃及，由于制冷系統(tǒng)不能令人滿意，鮮乳的保存期非常短。為了克服快速變質(zhì)的問題，將較多量的NaCl加入乳中。而這在另一方面妨礙了隨后的乳品發(fā)酵。因此，在這樣的國家對于耐鹽的起始培養(yǎng)物有著強烈的需求。
乳品發(fā)酵通過有不同溫度需求的起始生物得以進行。包括有不同溫度需求的起始生物的發(fā)酵在某一溫度時引起這些生物中之一的亞優(yōu)化生長。例如，在酸乳的生產(chǎn)中，德氏乳桿菌保加利亞亞種在終產(chǎn)品中的細胞數(shù)量由于在亞優(yōu)化溫度下的發(fā)酵而非常低。
因而迫切需要發(fā)展可以在比其通常的發(fā)酵溫度和鹽濃度更高的溫度和鹽濃度下發(fā)酵乳的乳酸細菌以及在較低pH值下更持久地保持存活的物種。另一方面，在較高的溫度下發(fā)酵將抑制污染物的增多。由此可以降低鹽濃度以利于人類健康。
在隨附的權(quán)利要求書以及在下面的描述及附圖中對本發(fā)明的各個方面進行介紹。這些方面展示在各個部分的標題下。然而，應理解各部分下的教導并不必要限于該特定部分的標題。
發(fā)明概述令人感興趣地，本專利申請的發(fā)明人顯示表達小熱激蛋白質(zhì)的某些乳酸細菌菌種能夠在比正常乳發(fā)酵溫度和/或鹽濃度更高的溫度和/或鹽濃度下發(fā)酵乳。本專利申請的發(fā)明人進一步顯示了表達熱激蛋白質(zhì)的乳酸細菌在較低的pH下更持久地保持存活并由于高的發(fā)酵溫度而變得對噬菌體侵染更不敏感。
重要地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的乳酸細菌當與乳一起溫育時能夠生產(chǎn)出一種與通過相應的不表達熱激蛋白質(zhì)的乳酸細菌生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)品相比具有較溫和口味特性的發(fā)酵產(chǎn)品。
據(jù)此，本發(fā)明的第一個方面涉及一種基于溫和發(fā)酵的生產(chǎn)乳產(chǎn)品的方法，所述方法包括下列步驟將乳與一種能夠表達小熱激蛋白質(zhì)的乳酸細菌混合，并在比通常的發(fā)酵溫度更高的溫度和/或比通常的發(fā)酵鹽濃度更高的鹽濃度下培養(yǎng)乳/細菌混合物，其中發(fā)酵產(chǎn)品與通過相應的不表達熱激蛋白質(zhì)的乳酸細菌生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)品相比具有較溫和口味的特性。
在另一方面中，提供了用于乳發(fā)酵程序的耐熱的和/或嗜溫的乳酸細菌，其帶有編碼小熱激蛋白質(zhì)的基因并且其生產(chǎn)一種與通過相應的不表達熱激蛋白質(zhì)的耐熱的和/或嗜溫的乳酸細菌生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)品相比具有較溫和口味特性的發(fā)酵產(chǎn)品。
優(yōu)選地，產(chǎn)品的pH值高于4.0。
在另一方面中，本發(fā)明提供了一種方法，包括將乳與第一和第二乳酸細菌混合，其中至少第一和第二乳酸細菌中的一種各自都能夠表達小熱激蛋白質(zhì)，以及按照具體要求培養(yǎng)乳/細菌混合物。
在另一方面中，本發(fā)明也提供了一種方法，其中第一乳酸細菌和第二乳酸細菌中的每一個包含一種嗜溫細菌。
在另一方面，本發(fā)明也提供了一種方法，其中第一乳酸細菌和第二乳酸細菌中的每一個包含一種耐熱細菌。
在另一方面，本發(fā)明也提供了一種方法，其中在加入第二耐熱乳酸細菌之前，將乳與含有第一耐熱乳酸細菌的起始培養(yǎng)物混合。
在另一方面，本發(fā)明也提供了一種方法，其中第一乳酸細菌包含一種嗜溫乳酸細菌而第二乳酸細菌包含一種耐熱細菌。
在另一方面，本發(fā)明也提供了一種方法，其中在加入耐熱乳酸細菌之前，將乳與含有嗜溫乳酸細菌的起始培養(yǎng)物混合。
在另一方面，本發(fā)明也提供了一種方法，其中每個嗜溫細菌獨立地選自但不限于乳球菌屬(Lactococcus spp)、明串珠菌屬(Leuconostoc spp)、乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂亞種，以及乳酸乳球菌乳亞種。
在另一方面，本發(fā)明也提供了一種方法，其中每個耐熱細菌獨立地選自但不限于含有帶有編碼小熱激蛋白質(zhì)的基因的質(zhì)粒的鏈球菌屬、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium spp)、片球菌屬、乳桿菌屬(Lactobacillus spp)、耐熱鏈球菌、德氏乳桿菌或德氏乳桿菌保加利亞亞種。
在另外一方面，提供了具有增強的耐酸性的嗜溫的和耐熱的乳酸細菌。
在進一步的方面，提供了具有由升高的發(fā)酵溫度引起的對噬菌體的敏感性減小的嗜溫的和耐熱的乳酸細菌。
在進一步的方面，本發(fā)明涉及由本發(fā)明的方法獲得的乳以及由發(fā)酵這樣的乳獲得的當與通過相應的不表達本發(fā)明的小熱激蛋白質(zhì)的乳酸細菌生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)品相比時具有較溫和口味特性的發(fā)酵產(chǎn)品，如酸乳、酸凝乳酪、硬干酪、半硬干酪像莫澤雷勒干酪、鮮干酪、夸克、黃油乳以及松軟的干酪。
在另外一方面，本發(fā)明涉及由本發(fā)明的方法獲得的乳以及由發(fā)酵這樣的乳獲得的發(fā)酵產(chǎn)品，其中該發(fā)酵產(chǎn)品能夠選自酸凝乳酪、硬干酪、半硬干酪像莫澤雷勒干酪、鮮干酪、夸克、黃油乳以及松軟的干酪。
在進一步的方面，本發(fā)明涉及由本發(fā)明的方法獲得的乳以及由發(fā)酵這樣的乳獲得的當與通過相應的不表達本發(fā)明的小熱激蛋白質(zhì)的乳酸細菌生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)品相比時具有較溫和口味特性的酸乳。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵乳的方法，其中乳酸細菌包括一種重組的乳酸細菌，其已被工程化從而在與相應的未改進的細菌相比時能在更高的水平上表達小熱激蛋白質(zhì)。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵乳的方法，其中乳酸細菌包含一種重組的乳酸細菌，其已被工程化從而與相應的未改進的細菌相比超量表達小熱激蛋白質(zhì)。
在另一方面，提供了攜帶小熱激蛋白質(zhì)基因的用于乳產(chǎn)品發(fā)酵程序的耐熱的和/或嗜溫的乳酸細菌。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種能夠在比通常的發(fā)酵溫度和/或鹽濃度更高的溫度和鹽濃度下進行乳發(fā)酵的重組微生物。
已知小熱激蛋白質(zhì)(sHsp)形成了阻止不可逆聚合以及輔助變性蛋白質(zhì)重新折疊的分子伴侶家族之一。這些蛋白質(zhì)存在于各組織中并且其特征在于具有12-30kDa范圍內(nèi)的低分子量、低聚物結(jié)構(gòu)以及存在保守的結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)構(gòu)域與脊椎動物的α-嵴高度相似。優(yōu)選能夠用于本發(fā)明方法的小熱激蛋白質(zhì)具有16-18kDa的分子量。
一般來說，術(shù)語“小熱激蛋白質(zhì)或(sHsp)”是指一種能夠結(jié)合及穩(wěn)定變性蛋白質(zhì)并且阻止它們的不可逆聚合的不依賴于ATP的sHsp。
對完整的細菌基因組序列的分析揭示，大多數(shù)細菌僅含有少量的小熱激蛋白質(zhì)。在乳酸細菌中僅有少量的耐熱鏈球菌菌株攜帶sHsps基因，其位于分離自細菌基因組的小質(zhì)粒上。
盡管本發(fā)明的描述是針對小熱激蛋白質(zhì)進行的，但其應被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解為其它的熱激蛋白質(zhì)也能夠適合并用于本發(fā)明的方法中。
本發(fā)明的詳述改進的乳酸發(fā)酵本發(fā)明的一個基本目標是提供一種改進基于發(fā)酵的乳產(chǎn)品的特性的方法。對于酸乳，其可以通過提供一種在溫和香味、酸度、發(fā)酵后的酸化、口味以及外觀等方面具有非常合意品質(zhì)的酸乳的生產(chǎn)方法來實現(xiàn)，并且該酸乳另外還具有延長的保存期，如反映在乳清產(chǎn)物減少、香味的溫和性以及活體培養(yǎng)物的高密度方面，也就是相對于不用本發(fā)明的微生物制成的乳產(chǎn)品，該發(fā)酵乳產(chǎn)品的變質(zhì)被延緩了。
如這里所用的，術(shù)語“較溫和的口味特性”是指以顯著減少的苦味和/或酸味為特征的發(fā)酵乳產(chǎn)品。此外或可供選擇地，術(shù)語“較溫和的口味特性”也可以被認為是關(guān)于該產(chǎn)品的pH。據(jù)此，具有溫和的口味特性的本發(fā)明的產(chǎn)品的pH高于4.0，優(yōu)選地在4.0至5.0范圍內(nèi)，更加優(yōu)選地為4.0至4.7。因此，具有較溫和的口味特性的發(fā)酵乳產(chǎn)品是指通過本發(fā)明的方法將本發(fā)明的乳酸細菌與乳一起培養(yǎng)而獲得的發(fā)酵乳產(chǎn)品。
如這里所用的術(shù)語“相應的不表達本發(fā)明的小熱激蛋白質(zhì)的乳酸細菌”是指已消除了(也就是它們已失去了)攜帶本發(fā)明的小熱激蛋白質(zhì)(見實施例)的質(zhì)粒的乳酸細菌。消除細菌中的質(zhì)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的方法實現(xiàn)?；蛘?，不表達本發(fā)明的熱激蛋白質(zhì)的乳酸細菌可以依然包含質(zhì)粒但是對可以用遺傳重組和/或突變技術(shù)編碼shsp的基因進行特異性的修飾以阻止這些基因的表達。
盡管目前優(yōu)選將本發(fā)明的方法用于酸乳生產(chǎn)，但是也考慮將該方法用于任何其它類型的基于發(fā)酵的乳產(chǎn)品，如硬干酪、半硬干酪像莫澤雷勒干酪、酸凝乳酪、夸克、黃油乳、鮮干酪以及松軟干酪，其品質(zhì)能夠通過加入本發(fā)明的微生物而得以提高。
本發(fā)明涉及的乳能夠從反芻動物獲得，這些動物優(yōu)選地選自水牛、奶牛、綿羊、美洲駝、山羊或駱駝。乳也可以經(jīng)脫脂或半脫脂。乳也可以得自植物如大豆或大米或可以是合成生產(chǎn)的乳。
合成生產(chǎn)的乳是一個用于本領(lǐng)域的術(shù)語，用以描述一種類似乳的人工產(chǎn)品。合成乳的組成可以經(jīng)特別設(shè)計以排除例如某些消費者耐受不良或過敏的成分。合成乳也可以是強化乳。例如，強化乳可以包含具有或沒有營養(yǎng)價值的化合物如礦物質(zhì)、維生素、多糖、寡糖、稠化劑或吸水物質(zhì)。
通常地，一種生物的生長溫度范圍是一個具有重要分類學價值的特性。依賴于其喜愛的生長溫度，將一般的以及包括乳酸細菌的細菌寬泛地分入嗜溫細菌和耐熱細菌。已知嗜溫細菌具有20℃到44℃的最適溫度。而耐熱細菌的最適溫度則在35℃到55℃的范圍。
本發(fā)明涉及通過組合嗜溫的和/或耐熱的乳酸細菌發(fā)酵乳來生產(chǎn)不同乳品的方法。
根據(jù)本發(fā)明，嗜溫的乳酸細菌被定義為具有20℃到30℃的一般生長溫度的細菌。然而，顯示出具有30℃到44℃的一般生長溫度的嗜溫乳酸細菌也可以用于本發(fā)明的方法中。
根據(jù)本發(fā)明，耐熱的乳酸細菌被定義為具有35℃到47℃的一般生長溫度的細菌。然而，顯示出具有50℃到55℃的一般生長溫度的耐熱乳酸細菌也可以用于本發(fā)明的方法中。
下面的總結(jié)列出了一些不同的嗜溫的和耐熱的乳酸細菌，這是為了舉例說明的目的而非以任何方式將所述的細菌限于包括在下面總結(jié)中的特定乳酸細菌。
起始培養(yǎng)物的最適生長溫度
本方法包括一個必要的步驟，即在發(fā)酵條件下，有效量的本發(fā)明的乳酸細菌在比通常的發(fā)酵溫度更高的溫度對于嗜溫的乳球菌最高為43℃(特別是對于乳酸乳球菌乳脂亞種)以及對于耐熱的耐熱鏈球菌最高為55℃下發(fā)酵乳品。
酸乳的發(fā)酵溫度是42℃(或為40℃-43℃)，它是介于兩種起始生物耐熱鏈球菌(39℃)和德氏乳桿菌保加利亞亞種(45℃)的最優(yōu)值之間的折衷值。當耐熱鏈球菌攜帶shsp時，最適的發(fā)酵溫度得以改變并且該生物的最適溫度得到提高。這意味著你能夠在45℃發(fā)酵酸乳并且因此攜帶shsp的德氏乳桿菌保加利亞亞種和耐熱鏈球菌都可以在最適的溫度下生長。
據(jù)此，本發(fā)明提供了嗜溫的乳酸細菌，其作為本發(fā)明的表達小熱激蛋白質(zhì)的結(jié)果，能夠在比相應的嗜溫乳酸細菌更高的溫度下發(fā)酵乳，該相應的嗜溫細菌不表達根據(jù)本發(fā)明的小熱激蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也提供耐熱的乳酸細菌耐熱鏈球菌，該細菌在表達根據(jù)本發(fā)明的小熱激蛋白質(zhì)時能夠在42℃-55℃的范圍發(fā)酵乳，此溫度高于不表達本發(fā)明的小熱激蛋白質(zhì)的相應耐熱鏈球菌的最適溫度。
重要地，當與有效量的德氏乳桿菌保加利亞亞種一起培養(yǎng)時，有效量的表達小熱激蛋白質(zhì)的耐熱鏈球菌細菌能夠在高于正常溫度時發(fā)酵乳，這導致了具有溫和口味特性的產(chǎn)品的產(chǎn)生。
如這里所用的，術(shù)語“有效量”描述了足以發(fā)酵存在于乳中的可檢測量的糖化合物的耐熱和/或嗜溫細菌物如耐熱鏈球菌或乳球菌中的各自的量。更為具體地，本發(fā)明的微生物的存在不僅導致了乳中糖化合物的可檢測的發(fā)酵，而且它也導致了在某一水平上發(fā)酵終產(chǎn)品的形成，而這帶來了乳產(chǎn)品品質(zhì)的改良，如顯著改善的酸度、質(zhì)地、口味、外觀以及香味的溫和性，這些可以歸因于添加了本發(fā)明的微生物。
在一個方面，本發(fā)明提供了在提高的溫度下發(fā)酵乳以生產(chǎn)具有溫和香味的發(fā)酵乳產(chǎn)品的耐熱鏈球菌，這些發(fā)酵乳產(chǎn)品包括但不限于酸乳、酸凝乳酪、硬干酪、半硬干酪像莫澤雷勒干酪，或鮮干酪。
在另一方面，本發(fā)明提供了能在提高的溫度下發(fā)酵乳以生產(chǎn)具有溫和香味的發(fā)酵乳產(chǎn)品的乳酸乳球菌，這些發(fā)酵乳產(chǎn)品包括但不限于夸克、黃油乳、鮮干酪，或松軟干酪。
如這里所用的術(shù)語“提高的溫度”或“較高的溫度”可互換使用并且指嗜熱乳酸細菌和耐熱乳酸細菌在高于正常發(fā)酵溫度時發(fā)酵乳的能力。
對于嗜溫乳酸細菌，術(shù)語“提高的溫度”是指與通常的發(fā)酵溫度范圍相比，在39℃-48℃，優(yōu)選在41℃-47℃，更加優(yōu)選在43℃-46℃，尤其更加優(yōu)選在43℃-46℃并且最優(yōu)選在43℃發(fā)酵乳(見上面的總結(jié))。
對于耐熱乳酸細菌來說，術(shù)語“提高的溫度”是指與通常的發(fā)酵溫度范圍相比，在48℃-58℃，優(yōu)選在53℃-57℃，更加優(yōu)選在54℃-57℃，尤其更加優(yōu)選在54℃-56℃并且最優(yōu)選在55℃發(fā)酵乳(見上面的總結(jié))。
此外，在高于39℃的溫度生長的嗜溫起始細菌的獲得使用于生產(chǎn)新發(fā)酵產(chǎn)品的嗜熱的和/或耐熱的起始者的新組合得以產(chǎn)生。
在另外一方面，本發(fā)明提供了具有減弱的噬菌體侵染敏感性的乳酸細菌。這是由于本發(fā)明的乳酸細菌能在升高的溫度下發(fā)酵乳而導致的。
在另一方面，本發(fā)明提供了對于較高的鹽濃度例如高于1％，優(yōu)選地高于2％，更加優(yōu)選地高于2.5％的鹽濃度具有增強的耐受性的乳酸細菌。值得注意的是，正常乳的鹽濃度在0.7-0.8％的范圍。
本發(fā)明的微生物的特性對于南方國家特別重要，在這些國家中在乳中加入鹽以阻抑腐物以及致病微生物的生長。與通過不表達本發(fā)明的小熱激蛋白質(zhì)的相應的乳酸細菌生產(chǎn)的乳產(chǎn)品相比，當由發(fā)酵這樣的乳來生產(chǎn)獲得具有溫和口味特性的乳產(chǎn)品時，這種乳可以更容易地由本發(fā)明的乳酸細菌發(fā)酵。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種在4℃保藏時產(chǎn)品的保藏期增長的包含表達本發(fā)明的小熱激蛋白質(zhì)的乳酸細菌的發(fā)酵產(chǎn)品。
在另一方面，本發(fā)明提供了含有42℃以上的耐熱起始培養(yǎng)物并且在最終產(chǎn)品中具有較高的活體乳桿菌計數(shù)的酸乳產(chǎn)品。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵乳的方法，其中乳酸細菌包括一種重組的乳酸細菌，其已被工程化從而在一個比相應的未修飾的細菌更高的水平上表達小熱激蛋白質(zhì)，這種未修飾的細菌能夠在比通常的發(fā)酵溫度和/或鹽濃度更高的溫度和/或鹽濃度下進行乳發(fā)酵。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵乳的方法，其中乳酸細菌包含一種重組的乳酸細菌，其已被工程化從而與相應的未修飾的細菌相比超量表達小熱激蛋白質(zhì)，這種未修飾的細菌能夠在比通常的發(fā)酵溫度和/或鹽濃度更高的溫度和/或鹽濃度下發(fā)酵乳。
在一方面，本發(fā)明提供了源自pSt04和pER1-1的多肽。
在一方面，本發(fā)明提供了基本上由用于本發(fā)明方法的SEQ ID No1和SEQ ID No2所示氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
如這里所用的術(shù)語“氨基酸序列”是指肽、多肽或蛋白序列或它的變異體、同源物或衍生物。
如這里所用的術(shù)語“衍生物”包括能夠用于本發(fā)明方法的多肽的化學修飾。這類修飾的示例為烷基、?；虬被鶊F對氫的取代。
優(yōu)選地，能夠用于本發(fā)明方法的多肽不包括在其自然環(huán)境時的天然多肽和由也在自然環(huán)境中的它們的天然核苷酸編碼序列表達的天然多肽以及其核苷酸序列在它的也于自然環(huán)境中的在天然啟動子控制下的天然多肽。
更加優(yōu)選地，能夠用于本發(fā)明方法的多肽包括在其自然環(huán)境時的天然多肽，和由也在自然環(huán)境中的其天然核苷酸編碼序列表達的天然多肽，以及其核苷酸序列在它的也于自然環(huán)境中的天然增強子控制下的天然多肽。
在本發(fā)明的一個方面，多肽將通過與由相應的不表達本發(fā)明的多肽的乳酸細菌生產(chǎn)的酸乳相比具有較溫和的口味特性的酸乳生產(chǎn)中的乳酸細菌來提供改進的乳發(fā)酵方法。
本發(fā)明也包括基本上呈現(xiàn)為編碼能夠用于本發(fā)明方法的多肽的SEQ ID No3和SEQ ID No4的核苷酸序列。
在本發(fā)明的正文中，編碼能夠用于本發(fā)明方法的多肽的核苷酸序列可以與自然發(fā)生形式或是它的突變體、同源物、片段或衍生物相同。優(yōu)選地，編碼能夠用于本發(fā)明方法的多肽的核苷酸序列包含在一種乳酸細菌之內(nèi)。
如這里所用的術(shù)語“核苷酸序列”是指一種寡核苷酸序列或多聚核苷酸序列和它的突變體、同源物、片段及衍生物(例如它的部分)。
核苷酸序列可以是基因組的或合成的或重組源的DNA或RNA，其無論代表有義鏈或反義鏈都可以是雙鏈的或單鏈的。核苷酸序列不必是一個完整的自然發(fā)生的DNA序列。因而，該DNA序列可以是，例如，合成的DNA序列、重組的DNA序列(也就是通過使用重組技術(shù)制備的)、cDNA序列或部分的基因組DNA序列，包括它們的各種組合。該DNA序列不必是一個編碼區(qū)。如果它是一個編碼區(qū)的話，它不必是一個完整的編碼區(qū)。此外，該DNA序列可以是有義向或反義向的。優(yōu)選地，它是有義向的。然而，在一些反義DNA序列被轉(zhuǎn)錄并用作蛋白質(zhì)合成模板的實例中，優(yōu)選反義序列。優(yōu)選地，該DNA是cDNA或包含cDNA。
因而，優(yōu)選地，術(shù)語“核苷酸序列”意為DNA。更加優(yōu)選地，術(shù)語“核苷酸序列”意為通過使用重組DNA技術(shù)制備的DNA(也就是重組DNA)。因而，優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種編碼能夠用于本發(fā)明方法的多肽的DNA序列(優(yōu)選地為一個cDNA序列)。
在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了基本上由能夠用于本發(fā)明方法的多肽編碼序列構(gòu)成的核苷酸序列。
在另一個方面，本發(fā)明提供了SEQ ID No3和SEQ ID No4所示的編碼能夠用于本發(fā)明方法的多肽的核苷酸序列。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了SEQ ID No3或SEQ ID No4所示的編碼能夠用于本發(fā)明方法的多肽的核苷酸序列或它的突變體、同源物、片段及衍生物。
經(jīng)過改變的編碼能夠用于本發(fā)明方法的多肽/小熱激蛋白質(zhì)的多聚核苷酸序列可以根據(jù)本發(fā)明進行使用并可以包括導致編碼本發(fā)明的多肽或功能等同的多肽產(chǎn)生的不同核苷酸殘基，該多肽可以在其間發(fā)生刪除、插入或取代。
如這里所用的“刪除”被定義為一種核苷酸或氨基酸序列的改變，其中分別有一個或多個核苷酸或氨基酸殘基缺失了。
如這里所用的“插入”或“添加”是一種核苷酸或氨基酸序列的改變，其導致了與本發(fā)明的自然發(fā)生的多膚或編碼序列相比，分別添加了一個或多個核苷酸或氨基酸殘基。
如這里所用的“取代”起因于一個或多個核苷酸或氨基酸分別被不同的核苷酸或氨基酸替換。
根據(jù)本發(fā)明，編碼能夠用于所述方法的多肽、多肽片段、融合蛋白或它的功能等同物的核苷酸序列，其可以用于產(chǎn)生在合適的宿主細胞中指導表達的重組DNA分子。在本發(fā)明的一個實施方案中，將一個編碼能夠用于本發(fā)明方法的多肽的核苷酸序列有效地連接至一個能夠指導在合適的宿主細胞中編碼多肽的核苷酸序列的表達的啟動子序列上。當導入宿主細胞時，可以在合適的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主/重組微生物直到獲得足夠水平的本發(fā)明的多肽，其后細胞可以被用于在本發(fā)明方法下的乳發(fā)酵。
肽序列與能夠用于本發(fā)明方法的多肽序列相關(guān)的術(shù)語“突變體”、“同源物”、“衍生物”或“片段”，包括將提供所得的核苷酸序列的表達產(chǎn)物的序列中的任何一個(或多個)核酸取代、修飾、替換、刪除或向所述的序列中添加一個(或多個)核酸，將會使得乳酸細菌在高于正常溫度和/或鹽濃度下發(fā)酵乳，優(yōu)選以至少與被SEQ ID No1和SEQ IDNo2覆蓋的一個序列的表達產(chǎn)物相同的容量在高于正常的溫度和/或鹽濃度下使得乳酸細菌發(fā)酵乳。
蛋白質(zhì)也可以發(fā)生氨基酸殘基的刪除、插入或取代，其產(chǎn)生沉默的變化或?qū)е鹿δ艿韧亩嚯?。只要本發(fā)明多肽的生物學活性得以保持，可以在殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性，和/或兩親性相似的基礎(chǔ)上有目的地進行氨基酸的取代。例如，包括天冬氨酸和谷氨酸在內(nèi)的負電荷氨基酸；包括賴氨酸和精氨酸在內(nèi)的正電荷氨基酸；以及具有相似親水性值的帶有無電荷的極性頭端基的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
保守的取代例如可以根據(jù)下表進行。
第二欄中以及優(yōu)選第三欄中同一行的氨酸酸可以互相替換。
本發(fā)明也包括可以發(fā)生同源的取代(取代和替換都可以用于此處以表示一個已存在的氨基酸殘基與一個備選的殘基的互換)，即相似對相似的取代如堿性的對堿性的、酸性的對酸性的、極性的對極性的等?？梢园l(fā)生非同源的取代，即可以從一類殘基替換為另一類或者備選地，涉及將非天然氨基酸如鳥氨酸(此后用Z代表)、二氨基丁酸鳥氨酸(此后用B代表)、正亮氨酸鳥氨酸(此后用O代表)、吡啶基丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸包括在內(nèi)。
替代也可以通過非天然氨基酸完成包括α*和α-二取代的*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的鹵化衍生物如三氟酪氨酸*、對-Cl-苯丙氨酸*、對-Br-苯丙氨酸*、對-I-苯丙氨酸*、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基異丁酸*、L-ε-氨基已酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-戊氨酸*、L-正亮氨酸*、L-正纈氨酸*、對-硝基-L-苯丙氨酸*、L-羥基脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe(4-氨基)#、L-酪氨酸(甲基)*、L-Phe(4-異丙基)*、L-Tic(1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-芐基)*。符號*用于上面討論的目的(與同源的或非同源的取代相關(guān))，以顯示衍生物的疏水本性，而#用來顯示衍生物的親水本性，#*顯示兩性分子的特性。
變異的氨基酸序列可以包括可插至該序列的任何兩個氨基酸殘基之間的合適的間隔子基團，包括除了氨基酸間隔子如甘氨酸或β-丙氨酸殘基之外的烷基如甲基、乙基或丙基。
修飾包括乙?；Ⅴ；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價結(jié)合、血紅素蛋白的共價結(jié)合、核苷酸或核苷酸衍生物的共價結(jié)合、脂質(zhì)體或脂質(zhì)體衍生物的共價結(jié)合、磷脂酰肌醇的共價結(jié)合、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、去甲基化、共價交聯(lián)的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲?；ⅵ敏然?、羥基化、甲基化、氧化、蛋白分解處理、硒化、硫酸化。
能夠用于本發(fā)明方法的多肽也可以作為添加了一個或多個多肽結(jié)構(gòu)域的重組蛋白質(zhì)來表達以方便蛋白質(zhì)的純化。這種方便純化的結(jié)構(gòu)域包括但不限于，使得純化在固定的金屬上進行的金屬螯合肽如組氨酸-色氨酸模塊(Porath J(1992)Protein Expr Purif 3-263281)、使得純化在固定的免疫球蛋白上進行的蛋白質(zhì)A結(jié)構(gòu)域，以及在FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)(Immunex Corp，Seattle，WA)中使用的結(jié)構(gòu)域。將可剪切的連接子序列如介于純化結(jié)構(gòu)域和能夠用于本發(fā)明方法中的多肽之間的因子XA或腸激酶(Invitrogen，San Diego，CA)包含在內(nèi)，這對于方便純化是有用的。
核苷酸序列與能夠用于本發(fā)明方法的多膚序列相關(guān)的術(shù)語“突變體”、“同源物”、“衍生物”或“片段”包括將提供所得的核苷酸序列的表達產(chǎn)物的序列中任何一個(或多個)核酸取代、修飾、替換、刪除或向所述的序列中添加一個(或多個)核酸，這將會使乳酸細菌在高于正常的溫度和/或鹽濃度下具有發(fā)酵乳的能力，優(yōu)選以至少與被SEQ ID No3和SEQ ID No4覆蓋的一個序列的表達產(chǎn)物相同的容量在高于正常溫度和/或鹽濃度下使得乳酸細菌發(fā)酵乳的能力。
特別地，術(shù)語“同源物”包含了結(jié)構(gòu)上和/或功能上的等同物，其提供的所得的核酸序列具有使得乳酸細菌在高于正常的溫度和/或鹽濃度下發(fā)酵乳的能力。關(guān)于序列的等同性(也就是相似性)，優(yōu)選地至少有75％，更加優(yōu)選地至少有85％，更加優(yōu)選地至少有90％的序列等同性。更加優(yōu)選地至少有95％，更加優(yōu)選地至少有98％的序列等同性。這些術(shù)語也包括序列的等位基因變異。
關(guān)于SEQ ID No3和SEQ ID No4的序列等同性能夠通過以任何一個或多個序列與另一個序列進行一種簡單的“眼球(eyeball)”比較(也就是一種嚴格的比較)來進行確定，來看另一個序列是否具有例如與所述序列至少75％的序列等同性。
相關(guān)序列的等同性也能夠通過商業(yè)上現(xiàn)有的計算機程序進行確定，這些程序能夠運用任何合適的用于確定等同性的算法，使用例如默認的參數(shù)來計算兩個或更多個序列之間的等同性百分比。這樣的計算機程序的一個典型例子是CLUSTAL。有利地，應用帶有設(shè)定為默認值的參數(shù)的BLAST算法。BLAST算法在http//www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html進行了詳細描述，此處引用作為參考。將搜索參數(shù)定義如下，可以將參數(shù)有利地設(shè)定為默認參數(shù)。
有利地，由BLAST分析時，“基本等同性”等同于與至少約為7，優(yōu)選地至少約為9，并且更加優(yōu)選地為10或更多的EXPECT值匹配的序列。在BLAST搜索中，EXPECT的默認閥值通常為10。
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)是由程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx運用的啟發(fā)式檢索算法；這些程序利用具有一些改進的Karlin和Altschul(見http//www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html)將意義歸于它們的發(fā)現(xiàn)。BLAST程序是專為序列相似性檢索，例如鑒別與查詢序列的同源性而設(shè)計的。對于在序列數(shù)據(jù)庫的相似性檢索中的基本問題的討論，參見Altschul等，1994，Nature Genetics 6119-129。
在http//www.ncbi.nih.gov上可利用的5種BLAST程序執(zhí)行下列任務(wù)blastp-將一種氨基酸查詢序列與一個蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進行比較。
blastn-將一種核苷酸查詢序列與一個核苷酸序列數(shù)據(jù)庫進行比較。
blastx-將一種核苷酸查詢序列(兩條鏈)的六框概念的翻譯產(chǎn)物與一個蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進行比較。
tblastn-將一種蛋白質(zhì)查詢序列與一個在所有六個框(兩條鏈)上動態(tài)翻澤的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫進行比較。
tblastx-將一種核苷酸查詢序列的六框翻譯與一個核苷酸序列的六框翻譯進行比較。
BLAST使用下列檢索參數(shù)HISTOGRAM-顯示每次檢索得分的柱狀分布圖；默認是yes。(見BLAST手冊中的參數(shù)H)。
DESCRIPTIONS-將報告的匹配序列的簡單描述的數(shù)限制到一個特定的數(shù)目；默認的限定值為100次描述。(見手冊頁中的參數(shù)V)。
EXPECT-報告相對于數(shù)據(jù)庫序列的匹配的統(tǒng)計顯著性閥值，默認值為10，所以根據(jù)Karlin和Altschul(1990)的隨機模型，10次匹配僅僅有望偶然發(fā)現(xiàn)。假如歸于一種匹配的統(tǒng)計顯著性大于EXPECT的閥值，則該匹配該不予報告。較低的EXPECT閥值更為嚴格，導致匹配以更少的機會得到報告。小數(shù)值是可接受的。(見BLAST手冊中的參數(shù)E)。
CUTOFF-報告高分片段對的截止分。默認值由EXPECT值計算而得(見上面)。僅僅在歸于其的統(tǒng)計顯著性至少和具有與CUTOFF相等分值的單獨的HSP一樣高時HSPs才予以報告。較高的CUTOFF值更加嚴格，導致匹配以更少的機會得到報告。(見BLAST手冊中的參數(shù)S)。一般地，使用EXPECT能夠更加直觀地掌握顯著性閥值。
ALIGNMENTS-將數(shù)據(jù)庫序列限制到一個高分片段對被報告的特定數(shù)目；默認的限定值為50。假如大于此數(shù)的數(shù)據(jù)庫序列碰巧滿足了報告的統(tǒng)計顯著性閥值(見下面的EXPECT和CUTOFF)，則僅僅報告那些歸于最大的統(tǒng)計顯著性的匹配。(見手冊頁中的參數(shù)B)。
MATRIX-指定一種交替的Blastp、Blastn、Blastx、Tblastn和Tblastx分值矩陣。默認矩陣是BLOSUM62(Henikoff&Henikoff，1992Proc Natl Acad Sci U S A.89(22)，10915-9)。有效的可替代的選擇包括PAM40、PAM120、PAM250和IDENTITY。對于BLASTN沒有交替的分值矩陣可利用；在BLASTN請求中指定MATRIX指示回答一個錯誤的應答。
STRAND-將TBLASTN檢索限定到僅為數(shù)據(jù)庫序列的頂部或底部鏈；或?qū)LASTN、BLASTX或TBLASTX檢索限定到僅為查詢序列的頂部或底部鏈的閱讀框。
FILTER-屏蔽掉具有低組分復雜性的查詢序列片段，像由Wootton&Federhen 1993 Computers and Chemistry 17149-163的SEG程序所決定的，或由短周期性的內(nèi)部重復單元組成的片段，像Claverie&States 1993 Computers and Chemistry 17191-201的XNU程序所決定的，或?qū)τ贐LASTN，由Tatusov和Lipman(見http//www.ncbi.nlm.nih.gov)的DUST程序所決定的。過濾能夠從blast輸出中消除統(tǒng)計學上顯著的但生物學上不令人感興趣的報告(例如，針對普通的酸性-、堿性-或脯氨酸富集區(qū)的命中數(shù)據(jù))，留下相對于數(shù)據(jù)庫序列的特異匹配的可利用的在生物學上更加令人感興趣的區(qū)域。
由過濾器程序發(fā)現(xiàn)的低復雜性序列在核苷酸序列中用字母“N”代替(例如，“NNNNNNNNNNNNN”)并在蛋白質(zhì)序列(例如“XXXXXXXXX”)中用字母“X”代替。
過濾僅僅應用于查詢序列(或其翻譯產(chǎn)物)，并不應用于數(shù)據(jù)庫序列。默認的過濾是對于BLASTN為DUST，對于其它程序為SEG。
當應用于SWISS-PROT中的序列時，沒有任何東西被SEG、XNU或二者屏蔽是正常的，因而不應期望過濾總能產(chǎn)生效果。另外，在一些情況下，序列全部被屏蔽，意味著相對于未過濾的查詢序列，被報告的任何匹配的統(tǒng)計顯著性都應是不可信的。
NCBI-gi-使得NCBI gi標識符除了被顯示在登記號和/或位點名稱中之外還顯示在出口中。
最優(yōu)選地，序列比較利用在http//www.ncbi.nih.gov/BLAST上提供的簡單的BLAST檢索算法進行。
如果在進行序列相同性測定時使用Gap Penalties，那么優(yōu)選使用下列參數(shù)
測定兩個序列間等同性和相似性的其它計算機程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux等，1984 Nucleic Acids Research 12387)和FASTA(Atschul等，1990 J Molec Biol 215403-410)。
本發(fā)明也包括與能夠用于本發(fā)明方法的序列互補的序列或能夠與本發(fā)明SEQ ID No3和SEQ ID No4的序列或與其互補的序列雜交的序列。
如這里所用的術(shù)語“雜交”將包括“一個核苷酸鏈通過堿基配對與互補鏈結(jié)合的過程”以及如在聚合酶鏈式反應(PCR)技術(shù)中所進行的擴增過程。
本發(fā)明也包括核苷酸序列的用途，這些核苷酸序列能夠與跟這里介紹的序列互補的序列、或任何衍生物、片段或其衍生物雜交。
術(shù)語“突變體”也包括與能夠和這里介紹的核苷酸序列雜交的序列互補的序列。
優(yōu)選地，術(shù)語“突變體”包括與能夠和這里介紹的核苷酸序列在嚴格條件下(例如50℃和0.2×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉pH7.0})雜交的序列互補的序列。
更加優(yōu)選地，術(shù)語“突變體”包括與能夠和這里介紹的核苷酸序列在嚴格條件下(例如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉pH7.0})雜交的序列互補的序列。
本發(fā)明也涉及可以與能夠用于本發(fā)明方法的核苷酸序列雜交的核苷酸序列(包括這里介紹的那些互補序列)。
本發(fā)明也涉及與能夠用于本發(fā)明方法的核苷酸序列互補的核苷酸序列(包括這里介紹的那些互補序列)。
能夠在中等至最高嚴格條件下與這里介紹的核苷酸序列雜交的多聚核苷酸序列也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
術(shù)語“可選擇性地雜交的”意為核苷酸序列，當其用作探針時，在被發(fā)現(xiàn)可用于本發(fā)明方法的靶核苷酸序列能夠在顯著高于背景的水平上與探針雜交的條件下進行使用。由于存在其它核苷酸序列，因此背景雜交可能會發(fā)生，例如，在篩選的cDNA或細菌基因組DNA文庫中。在這種情況下，背景意指由探針和文庫中的非特異性DNA成員間相互作用產(chǎn)生的信號水平，該背景強度比觀察到的與靶DNA的特異性相互作用小10倍，優(yōu)選小100倍。相互作用的強度例如可以通過放射性標記探針，例如用32P來測量。
如Berger和Kimmel(1987，分子克隆技術(shù)指南，酶學方法，152，學術(shù)出版社，圣地亞哥)所教導的，雜交條件基于核苷酸結(jié)合復合物的變性溫度(Tm)，并如下面所闡釋的，賦予了經(jīng)定義的“嚴格”。
最高度的嚴格一般發(fā)生于約Tm-5℃(比探針的Tm低5℃)；高度嚴格發(fā)生在比Tm低大約5℃到10℃的溫度下；中等嚴格發(fā)生在比Tm低大約10℃到20℃的溫度下；低度嚴格發(fā)生在比Tm低大約20℃到25℃的溫度下。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，最高度嚴格的雜交能夠用于鑒別或檢測相同的核苷酸序列而中等(或低度)嚴格的雜交能夠用于鑒別或檢測相似的或相關(guān)的多核苷酸序列。
在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明包括可以在嚴格條件下與能夠用于本發(fā)明方法的核苷酸序列雜交的核苷酸序列(例如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉pH7.0})。在能夠用于本發(fā)明方法的核苷酸序列為雙鏈時，雙鏈的兩條鏈，或是單個地或是一起被本發(fā)明所包括。在該核苷酸序列為單鏈時，應當理解該核苷酸序列的互補序列也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
與能夠用于本發(fā)明方法的序列并非100％同源但落入本發(fā)明范圍的核苷酸序列能夠以許多方法獲得。這里所描述的序列的其它突變體例如可以通過用探針檢測由一系列來源制得的DNA文庫而獲得。此外，可以獲得其它病毒/細菌、或細胞同源物尤其是在哺乳動物細胞中(例如大鼠、小鼠、?；蜢`長類細胞)發(fā)現(xiàn)的細胞同源物，并且其同源物或片段通常能夠與這里的序列表所示的序列雜交。這些序列可以通過用探針檢測由其它動物物種制得的cDNA文庫或基因組DNA文庫，并且用包含全部或部分的在本發(fā)明的序列表中SEQ ID No3和SEQ IDNo4所示的核苷酸序列的探針在中等至高度嚴格的條件檢測這些文庫而獲得。
突變體以及菌株/物種同源物也可用簡并PCR來獲得，簡并PCR將使用針對編碼能夠用于本發(fā)明方法的序列之中的保守氨基酸序列的突變體或同源物之中的靶序列而設(shè)計的引物。保守序列能夠，例如，通過對幾種突變體/同源物的氨基酸序列進行比對而預測。序列比對能夠利用本領(lǐng)域已知的計算機軟件進行。例如GCG Wiconsin PileUP程序被廣泛使用。在簡并的PCR中使用的引物將包含一個或多個簡并位置并將在嚴格條件下進行，該嚴格條件比使用單一的序列引物針對已知序列來克隆序列的嚴格性低。
或者，這樣的核苷酸序列可以通過經(jīng)過表征的序列的定點突變來獲得，比如在本發(fā)明的序列表中SEQ ID No3和SEQ ID No4所示的核苷酸序列。這在例如當需要對沉默的密碼子的改變進行測序以優(yōu)化偏好特定的宿主細胞的密碼子時是有用的，其中在該宿主細胞中所述的核苷酸序列得以表達。
能夠用于本發(fā)明方法的核苷酸序列可以用于制備引物，例如PCR引物、交替擴增反應的引物以及例如通過使用放射性或非放射性標識的傳統(tǒng)方法以指示性標識標記的探針或可以克隆到載體中的核苷酸序列。這樣的引物、針和其它片段的長度將至少為15，優(yōu)選至少為20，例如至少為25、30或40個核苷酸，并且也被包括在可用于本發(fā)明方法的這里所用的術(shù)語核苷酸序列中。
根據(jù)本發(fā)明的核苷酸如DNA多聚核苷酸和探針的可以以重組方式、合成方式或通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的任何方法制備。也可以通過標準技術(shù)對它們進行克隆。
通常，引物是通過合成的方法進行生產(chǎn)的，包括一次一個核苷酸地逐步地制造所要的核酸序列。使用自動化的技術(shù)完成這一生產(chǎn)的技術(shù)可以容易地從本領(lǐng)域獲得。
更長的核苷酸序列通常是利用重組技術(shù)進行制備的，例如，使用PCR(聚合酶鏈反應)克隆技術(shù)。這包括制備一對位于待克隆的靶序列的一個區(qū)域的兩側(cè)的引物(例如大約15到30個核苷酸的)，使引物與得自一個細菌細胞的mRNA或cDNA接觸，在引發(fā)目標區(qū)擴增的條件下進行聚合酶鏈反應(PCR)，分離擴增的片段(例如通過在瓊脂糖凝膠上純化反應混合物)以及回收擴增的片段?？梢詫⒁镌O(shè)計成包含合適的限制性酶識別位點使得擴增的DNA能夠被克隆到一個合適的克隆載體中。
由于遺傳密碼固有的簡并性，基本上編碼相同的或功能等同的氨基酸序列的DNA序列，可以用于克隆并表達本發(fā)明的多肽。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解的，對于一定的表達系統(tǒng)，生產(chǎn)由具有非天然發(fā)生的密碼子的核苷酸序列編碼的能夠用于本發(fā)明方法的多肽是有利的。例如，可以選擇受特定的原核細胞偏愛的密碼子(Murray E等，1989，Nuc Acids Res 17477-508)，以提高通道表達的比率或生產(chǎn)具有所要特性(如與天然發(fā)生序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相比更長的半衰期)的重組RNA轉(zhuǎn)錄物。
在一個實施方案中，能夠用于本發(fā)明方法的多肽是一種重組多肽。
優(yōu)選地使用一種遺傳載體來制備可用于本發(fā)明方法的重組多肽。
構(gòu)建體術(shù)語“構(gòu)建體”包括這里所述的核苷酸序列，其直接附著于一個啟動子上。對于與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語“融合的”也是如此，包括直接附著。在每一種情況中，這些術(shù)語并不包括為與野生型基因啟動子以普通方式聯(lián)系的蛋白編碼的核苷酸序列的天然組合以及當它們都處于其自然環(huán)境中時。
構(gòu)建體甚至可以包含或表達一個允許在例如細菌中進行遺傳構(gòu)建體選擇的標記，這樣的細菌優(yōu)選為埃希氏菌屬，如大腸桿菌，或鏈球菌屬，如耐熱鏈球菌，或乳球菌屬(Lactococcus)如乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳亞種，明串珠菌屬，片球菌屬或雙歧桿菌屬。可以使用各種存在的標記，比如提供抗生素耐性的標記-例如耐卡那霉素、慶大霉素和氨芐青霉素、青霉素的標記。
優(yōu)選地，本發(fā)明的構(gòu)建體至少包含與啟動子可操作地連接的能夠用于本發(fā)明方法的核苷酸序列。
載體術(shù)語“載體”包括表達載體、轉(zhuǎn)化載體和附加體。
術(shù)語“表達載體”意指能夠在體內(nèi)或在體外表達的構(gòu)建體。
優(yōu)選地，本發(fā)明的載體是質(zhì)粒。
按照如下所述，在控制的條件下，可以把本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化至一個合適的宿主細胞中，為能夠用于本發(fā)明方法的多肽的表達提供合適環(huán)境。因此，在本發(fā)明的一個進一步的方面，提供了一種表達本發(fā)明多肽的方法，其包括在為編碼能夠用于本發(fā)明方法的多肽的編碼序列的載體表達提供的條件下培養(yǎng)如上所述的用一種表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
可操作地連接至編碼能夠用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)的序列上的控制序列包括啟動子/增強子以及其它的表達調(diào)節(jié)序列?？梢赃x擇這些控制序列使其與宿主細胞兼容，其中所述的表達載體被設(shè)計成用于該宿主細胞。術(shù)語啟動子在本領(lǐng)域是公知的，例如作為一個RNA聚合酶結(jié)合位點并且包含了在大小及復雜性范圍方面從最小的啟動子到包括上游調(diào)節(jié)序列和增強子的啟動子的核酸區(qū)。
術(shù)語“啟動子”在本領(lǐng)域通常的意義上使用，例如一個RNA聚合酶結(jié)合位點。啟動子可以任選地包含一個增強子元件。
術(shù)語“增強子”包括一個DNA序列，其結(jié)合至轉(zhuǎn)錄起始復合物的其它蛋白質(zhì)組分上并且因此促進由與其相關(guān)聯(lián)的啟動子指導的轉(zhuǎn)錄的起始。
啟動子可以包括確?；蛱岣咴诤线m的宿主細胞中表達水平的特征。例如，這些特征可以是保守區(qū)如Pribnow盒、Kozak序列或TATA盒。啟動子還可以包含其它序列以影響(如保持、增強、降低)核苷酸序列的表達水平。例如，合適的其它序列包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的靶序列、延伸的-10個基序、RNA引導序列、增量元件及其它。其它序列包括可誘導的元件-如溫度、化學品、光或應激誘導元件。并且，提高轉(zhuǎn)錄或翻譯，可以存在合適的元件。
在另一個實施方案中，可以選擇一種組成性啟動子來指導能夠用于本發(fā)明方法的所要多膚的表達。由于其避免了在含誘導底物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)表達宿主的需要，因此這樣的表達構(gòu)建體可以帶來額外的益處。
啟動子一般選自在細菌或真菌中具有功能的啟動子，被稱為原核啟動子或真核啟動子。
更加優(yōu)選地，啟動子選自在乳酸細菌中具有活性的啟動子。
啟動子的可誘導性也可能是有益的，從而能夠在細胞的生命周期內(nèi)對異源基因的表達水平進行調(diào)節(jié)?？烧T導性意指利用啟動子所得的表達水平能夠被調(diào)節(jié)。
此外，任何這些啟動子都可以通過添加額外的調(diào)節(jié)序列，例如增強子序列來進行修飾。也可以使用包含來自兩個或更多個上述的不同啟動子的序列元件的嵌合啟動子。
本發(fā)明的載體可以包含一個或多個可選擇的標記基因，例如氨芐青霉素或青霉素耐性基因。
對于工業(yè)微生物，優(yōu)選的選擇系統(tǒng)是由在宿主生物中不需要突變的選擇標記組形成的那些。真菌選擇標記的實例是乙酰胺酶的基因(amdS)、ATP合成酶的基因、亞基9的基因(oliC)、乳清酸核苷-5’-磷酸-脫羧酶的基因(pvrA)、腐草霉素和苯菌靈耐性基因(benA)。非真菌選擇標記的實例為細菌的G418耐性基因(這也可以用于酵母中，但不用于絲狀真菌中)、氨芐青霉素或卡那霉素耐性基因(大腸桿菌)、新霉素耐性基因(Bacillus)以及編碼β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的大腸桿菌uidA基因。
載體可以用于體外，例如用于生產(chǎn)RNA或用于轉(zhuǎn)染宿主細胞。
本發(fā)明的載體也包含附加體。
如在這里所用的術(shù)語，“附加體”意指由一系列任選地含有一個啟動子的基因組成的遺傳物質(zhì)的單位，其有時作為染色體外的單位，在宿主細胞中具有獨立的存在形式，而在另外一些時侯則被整合至細胞的染色體中，與染色體一起進行自身復制。已在細菌中研究了附加體。一組附加體事實上是侵染細菌的病毒。被稱為性別因子的附加體決定了染色體物質(zhì)是否會從一個細菌轉(zhuǎn)移至另一個細菌。其它的附加體攜帶令細菌耐抗生素抑制作用的基因。另外，附加體攜帶使細菌能夠在高于通常溫度、酸度、鹽等的情況下存活的基因。
因此，能夠用于本發(fā)明方法的多肽可以被整合至一個重組載體中(一般是一個可復制的載體)，例如一個克隆或表達載體中。該載體可以用于在一個兼容的細胞中復制核苷酸。因此，在一個進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了一種通過將多聚核苷酸導入可復制的載體，將載體導入兼容的宿主細胞，以及在引起載體復制的條件下培養(yǎng)宿主細胞來生產(chǎn)能夠用于本發(fā)明方法的多肽的方法?？梢詮乃拗骷毎谢厥赵撦d體。合適的宿主細胞在下面結(jié)合表達載體一起進行描述。
細胞本發(fā)明在它的范圍內(nèi)包括含有本發(fā)明的核苷酸分子、構(gòu)建體或載體的細胞。如這里所述，這些細胞例如可以用于表達。
用編碼能夠用于本發(fā)明方法的多膚的核苷酸序列進行轉(zhuǎn)化的宿主細胞可以在適合于從細胞培養(yǎng)物中表達和回收多肽的條件下進行培養(yǎng)。根據(jù)所用的序列和/或載體的不同，重組細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以被分泌或包含在細胞內(nèi)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解的，含有編碼能夠用于本發(fā)明方法的多肽的核苷酸序列的表達載體可以被設(shè)計成含有信號序列，該信號序列指導多肽通過一種特定的原核細胞膜而被分泌。其它的重組構(gòu)建體可以將編碼能夠用于本發(fā)明方法的多肽的核苷酸序列連接至一個編碼可促進可溶性蛋白的純化的多肽結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列上(Kroll DJ等，1993，DNA Cell Biol 12441-53，也參見上面對含融合蛋白的載體的討論)。
能夠用于本發(fā)明方法的細胞可以以任何適當?shù)男问教峁＠?，它們可以以分離的形式、培養(yǎng)物的形式、以保藏的形式等提供。保藏例如可以涉及冷凍保存、緩沖、無菌條件等。能夠用于本發(fā)明方法的細胞可以通過基因克隆技術(shù)或通過任何其它手段提供。
優(yōu)選地，將能夠用于本發(fā)明方法的核苷酸序列可操作地連接至一個轉(zhuǎn)錄單位上。
如這里所述的術(shù)語“轉(zhuǎn)錄單位”是含有編碼序列以及信號的核酸區(qū)域，信號用于使獨立于任何其它編碼序列的那些編碼序列得到表達。因此，每一個轉(zhuǎn)錄單位通常至少包含一個啟動子、一個任選的增強子以及一個多聚腺苷酸信號。
雜交啟動子也可以用于增強表達構(gòu)建體的可誘導調(diào)節(jié)。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化的細胞”意指具有經(jīng)修飾的基因結(jié)構(gòu)的細胞。對于本發(fā)明，當根據(jù)本發(fā)明的載體導入細胞時細胞具有經(jīng)修飾的基因結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明也提供一種方法，包括用能夠用于本發(fā)明方法的核苷酸序列轉(zhuǎn)化宿主細胞。
本發(fā)明也提供一種方法，包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞，該細胞已在適于由這里所述的核苷酸序列編碼的能夠用于本發(fā)明方法的多肽表達的條件下，用本發(fā)明的核苷酸序列進行了轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明也提供一種方法，包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞，該細胞已在適于由這里所述的核苷酸序列編碼的能夠用于本發(fā)明方法的多肽表達的條件下，用根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列或衍生物、同源物、突變體或其片段進行了轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明也包括與這里所述的序列互補的核苷酸序列或任何片段或其衍生物。假如序列與其片段互補，那么該序列能夠用作識別其它生物中的相似的啟動子序列的探針。
能夠用于本發(fā)明方法的多肽及其片段可以在重組的大腸桿菌或真菌中生產(chǎn)。優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法的多肽及其片段是在重組乳酸細菌中進行生產(chǎn)的。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化載體”意指能夠從一個實體轉(zhuǎn)移到另一個實體的構(gòu)建物，其可以來源于該物種或可以出自不同的物種。如果構(gòu)建體能夠從一個物種轉(zhuǎn)移至另一個物種，如從一個大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到一個細菌中，如鏈球菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬、雙歧桿菌屬或片球菌屬中，則該轉(zhuǎn)化載體有時被稱為“穿梭載體”。
與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語“宿主細胞”包括任何可以包含編碼本發(fā)明的重組蛋白和/或從中所得的產(chǎn)物的核苷酸序列的細胞，其中一個啟動子使得本發(fā)明的核苷酸序列當其出現(xiàn)在宿主細胞中時可以表達。另外，本發(fā)明的載體和多聚核苷酸(上述的報道基因構(gòu)建體)也可以被導入宿主細胞中以復制載體/多聚核苷酸。
在一個優(yōu)選的實施方案中，宿主細胞為一個乳酸細菌。例如，該乳酸細菌可以是一種細菌，其選自但不限于鏈球菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬、雙歧桿菌屬或片球菌屬。
宿主細胞/宿主生物的轉(zhuǎn)化如前所示，宿主生物可以是原核的或真核的生物。合適的原核宿主的實例包括大腸桿菌。更加優(yōu)選地為乳酸細菌如鏈球菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬或雙歧桿菌屬。對于原核宿主轉(zhuǎn)化的教導在本領(lǐng)域中得到大量記載，例如見Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，第2版，1989，冷泉港實驗室出版社)以及Ausubel等，分子生物學中的最新方法(1995)，John Wiley&Sons，Inc。
如果使用原核宿主，則需要在轉(zhuǎn)化前對核苷酸序列進行適當?shù)母倪M，如通過去除內(nèi)含子來改進。
盡管標記基因表達的存在/缺失提示也存在能夠用于本發(fā)明方法的核苷酸序列和/或多膚，然而應當確認其存在以及表達。例如，如果編碼能夠用于本發(fā)明方法的多肽的核苷酸序列被插入至一個標記基因序列中，則可以通過標記基因功能的缺失而識別包含該多肽編碼區(qū)的細胞?；蛘撸梢栽谝粋€單獨啟動子的控制下隨機地標記基因?qū)⑴c編碼能夠用于本發(fā)明方法的多肽的核苷酸序列置于一起。對于誘導以及選擇作出應答的標記基因的表達通常也指示多肽的表達。
測定特定分子表達量的另外的方法包括放射性標記(Melby PC等，1993，J Immunol Methods 159235-44)或生物素標記(Duplaa C等，1993，Anal Biochem 229-36)核苷酸、對照核酸的共擴增，以及將實驗結(jié)果插入其中的標準曲線。多重樣品的量化可以通過進行ELISA形式的分析而得以加速，其中以各種稀釋度制備能夠用于本發(fā)明方法的多肽并且分光光度計測量或量熱反應提供了快速的量化。
為了在體內(nèi)或體外生產(chǎn)該多肽，著眼于通過發(fā)酵乳來生產(chǎn)本發(fā)明的不同乳產(chǎn)品，本發(fā)明也涉及包含編碼能夠用于本發(fā)明方法的多肽或突變體、同源物、片段或其衍生物的核苷酸序列的表達載體和轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
實施例現(xiàn)在通過實施例對本發(fā)明進行闡明，其中參考下列圖和表。


圖1.A.顯示一個SDS-PAGE圖1.B顯示一個蛋白質(zhì)印跡圖2.A和B.顯示一個曲線2-1.顯logOD620的曲線圖像圖2-2.顯示一個曲線3.顯示一個示意4.顯示存活的細胞百分比的曲線圖像圖5.顯示log集落形成單位(％)的曲線圖像圖6.A顯示一個曲線6.B顯示一個曲線6.C顯示一個曲線7.顯示log集落形成單位/ml的曲線圖像圖8.顯示一個曲線9.顯示序列表表1.細菌菌株和噬菌體表2.用耐熱鏈球菌S4和保加利亞乳桿菌92063在42℃和50℃生產(chǎn)的酸乳在4℃保存期間pH值的變化。
更加詳細解釋的附1.A.
耐熱鏈球菌S4-1(泳道2)和S4w/o的可溶性蛋白及其在40℃(泳道3和4)、45℃(泳道5和6)和55℃(泳道7和8)溫育60分鐘后進行熱激的SDS-PAGE。泳道1包含6.5、14.2、18.4、29、48.5和60kDa分子量的蛋白大小標記。泳道9包含從超量表達的大腸桿菌菌株中分離的部分純化的sHsp。于溫育前在指示的時間在52℃進行熱激30分鐘。
圖1.B.在耐熱鏈球菌S4中sHsp表達的誘導。收集在LTM17培養(yǎng)基中生長至對數(shù)生長晚期(OD620～1.0)的耐熱鏈球菌S4和S4-1的細胞，以無糖培養(yǎng)基洗滌，并在含0.05％葡萄糖的TM17中進行重懸。將5ml的等份在37、46和52℃溫育30分鐘(A)或在52℃溫育5-60分鐘(B)。制備細胞提取物并進行蛋白質(zhì)斑點分析。A從大腸桿菌中部分純化的sHsp，泳道1；在52、46和37℃溫育的耐熱鏈球菌S4，泳道2-4；在52℃溫育的S4-1(陰性對照)，泳道5。B陽性對照，泳道1；5分鐘，泳道2；15分鐘，泳道3；30分鐘，泳道4；60分鐘，泳道5。
圖2.A.顯示在42℃溫育的耐熱鏈球菌S4(實心圓圈，(●S4))、其消除質(zhì)粒后的衍生物S4-1(空心圓圈，(○S4-1))、用重組質(zhì)粒p99-17-2(shsp+)轉(zhuǎn)化的S4-1(實心三角形，(S4-1))和p00-8-1(shsp)(空心三角形，(S4-1))的生長曲線。
圖2.B.顯示在52℃溫育的耐熱鏈球菌S4(實心圓圈，(●S4))、其消除質(zhì)粒的衍生物S4-1(空心圓圈，(○S4-1))、用重組質(zhì)粒p99-17-2(shsp+)轉(zhuǎn)化的S4-1(實心三角形，(S4-1))和p00-8-1(shsp)(空心三角形，(S4-1))的生長曲線。
圖2-1耐熱鏈球菌S8(圓圈，(○S8))、其不含質(zhì)粒的衍生物S8-1(三角形，(S8-1))和以重組質(zhì)粒p99-17-2轉(zhuǎn)化的菌株S8和S8-1(菱形，正方形，(◇含有p99-17-2轉(zhuǎn)化的S8，□含有p99-17-2的S8-1))。
圖2-2乳酸乳球菌菌株Bu2-60、IL1403和MG1363及其用重組質(zhì)粒p99-17-2轉(zhuǎn)化的衍生物的生長。在37℃或41/42℃下的Bu2-60、IL1403、MG1363(1-三角形和4-正方形，(37℃和□41/42℃))；在37或41/42℃下的轉(zhuǎn)化的菌株(2-圓圈和3-菱形，(○37℃和◇41/42℃))。
從圖中看出所有的乳酸乳球菌菌株在37℃生長良好(1)而在42℃生長得不好(4)。在42℃用質(zhì)粒p00-17-2轉(zhuǎn)化的菌株增強了生長(3)而在37℃的生長則沒有改變。
圖3.質(zhì)粒pSt04、p99-17-2和p00-8-1的物理圖譜。
圖4.耐熱鏈球菌S4(圓圈，(○)S4，在52℃預溫育和(●)S4，在42℃預溫育)及其無質(zhì)粒的衍生物S4-1(三角形，()S4-1，在52℃預溫育和()S4-1，在42℃預溫育)在60℃于TM17培養(yǎng)基中的熱存活曲線。在暴露于60℃之前，將細胞在42℃(實心符號，(●)S4和()S4-1)或52℃(空心符號，(○)S4和()S4-1)進行預溫育30分鐘。
從圖4看出，S4顯示了比無質(zhì)粒菌株S4-1更好的存活力。
圖5.耐熱鏈球菌S4及其無質(zhì)粒的衍生物S1在不同的pH值下于4℃保存期間的存活。將細胞重懸在通過加入乳酸預調(diào)至適合pH的生長培養(yǎng)基中并于4℃保存至多15天。每隔三天通過將適合的稀釋物鋪平在LTM17瓊脂培養(yǎng)基上來測定細胞計數(shù)。(●)S4，pH5.5；(○)S4，pH4.5；()S4，pH3.5；()S4-1，pH5.5；(■)S4-1，pH4.5；(□)S4-1，pH3.5。
從該圖能夠看出在所有提及的pH值下S4表現(xiàn)了較好的存活。在1-2天的保存后S4-1的存活急劇減少，并且在4-6天后幾乎沒有細菌存活。
圖6.在不同溫度下用耐熱鏈球菌S4和S4-1以及保加利亞乳桿菌92063進行的單一或混合菌株發(fā)酵中的脫脂乳酸化。接種混合菌株中的每一種菌株以5×106CFU/ml的量給脫脂乳，而對于單一的菌株發(fā)酵則接種107CFU/ml。根據(jù)多頻道pH計自動跟蹤pH的降低。
圖6.A在50℃下的Lb92063(1)；在50℃下的S4(2)；在42℃時的S4(3)；在50℃時S4和Lb(4)；在42℃時的Lb(5)；在42℃時的S4和Lb(6)。然后是圖6.B在50℃時的Lb92063(1)；在50℃時的S4-1(2)；在42℃時的S4-1(3)；在50℃時的S4-1和Lb(4)；在42℃時的Lb(5)；在42℃時的S4-1和Lb(6)。
圖6.C在50℃時的Lb HM(1)；在50℃時的S4-1(2)；在50℃時的S4(3)；在50℃時的S4和Lb HM(4)；在42℃時的S4(5)；在42℃時的S4-1(6)；在42℃時的Lb HM(7)；在42℃時的S4和Lb HM(8)。
從圖6A和B看出，在兩圖中的6號曲線都對應于一種正常的酸乳發(fā)酵曲線。在15-20小時的發(fā)酵后達到pH3.6左右。圖6A和6C中的曲線4顯示在50℃進行的發(fā)酵，其中耐熱鏈球菌攜帶shsp。這些發(fā)酵達到pH5.2左右的水平。圖6B中的曲線3顯示用S4-1和Lb92063進行的發(fā)酵終止于pH5.2左右。
圖7.耐熱鏈球菌S4以及保加利亞乳桿菌于50℃在單一或混合菌株培養(yǎng)液中生長以及隨后的保存后的存活。將脫脂乳接種至107CFU/ml的細胞終密度并在50℃溫育24小時。隨后在4℃將發(fā)酵后的乳保藏15天。每隔3天測量每一種菌種的全部細胞計數(shù)以及總的細胞計數(shù)(乳桿菌與S4加在一起的計數(shù))。全部計數(shù)(空心正方形，(□))；混合培養(yǎng)基中的S4和Lb(空心三角形，()S4)和實心方形(■Lb)；S4(實心圓圈，(●)S4)；Lb(實心三角形，()Lb)。
圖8.耐熱鏈球菌S8及其經(jīng)過轉(zhuǎn)化的衍生物S8(pSt04-shsp+)在42℃和48℃的酸化。以107CFU/ml給脫脂乳接種并在存在或不存在噬菌體s8和感染復數(shù)(m.o.i)為10的情況下于所示溫度下進行溫育。使用多頻道pH計自動地跟蹤酸化。S8(pSt04)+噬菌體s8，42℃(1)；S8(pSt04)+噬菌體s8，48℃(2)；S8(pSt04)w/o噬菌體，48℃(3)；S8(pSt04)w/o噬菌體，42℃(4)。
圖9.序列表SEQ ID No1SEQ ID No2SEQ ID No3SEQ ID No4具體實施例攜帶小熱激蛋白質(zhì)的基因的質(zhì)粒pSt04和pER1-1的一般特性對質(zhì)粒pSt04和pER1-1的核苷酸序列進行了測定(登錄號分別為AJ242477和AJ242476)，該質(zhì)粒屬于來自耐熱鏈球菌的DNA同源組I(Janzan等，1992)。這些質(zhì)粒在大約1200bp的DNA區(qū)域上具有超過90％的同源性，該區(qū)域?qū)τ谫|(zhì)粒復制是必需的。
除repA基因外，質(zhì)粒pSt04和pER1-1各自還具有一個第二開放閱讀框，該閱讀框分別編碼具有155和142個氨基酸殘基的多肽(SEQID No1和SEQ ID No2)，對應于18，042和16，422Da的分子量。這些開放閱讀框相對于repA基因按逆時針方向排列。起始密碼子的上游8bp處的推定的核糖體結(jié)合位點(GAa/gGAAAG)的前面是5’-TTGAAA...(16bp)...TATAAT啟動子區(qū)。預期的基因產(chǎn)物與在其它耐熱鏈球菌菌株(O’Sullivan等，1999，Somkuti等，1998)中觀察到的小熱激蛋白質(zhì)(sHsp)高度相似(＞90％)。這些sHsp屬于普遍存在于原核和真核生物中的休克反應蛋白質(zhì)家族。sHsp合成從一個在pH值低于pH4.5或溫度高于45℃時的低的基礎(chǔ)水平開始顯著地提高了并且可以通過在pH4.0或者在52℃時的一個短的30分鐘的休克而得到進一步提高(圖1)。
小熱激蛋白質(zhì)的功能i)在升高的溫度下的生長和耐熱性將攜帶有質(zhì)粒pSt04和pER1-1的耐熱鏈球菌菌株S4和ER1在不同溫度下的生長行為分別與它們的消除了質(zhì)粒的衍生菌株S4-1和ER1-1的生長行為進行了比較。在42℃時所有的菌株都以相同的速率生長到大約2×109CFU/ml的細胞終密度。在45℃時不含質(zhì)粒的菌株生長得稍顯緩慢，但也達到了幾乎相同的細胞終密度。在52℃時只有帶有質(zhì)粒(shsp)的菌株能夠以減小的生長速率生長至大約1×109的細胞終密度(圖2)。
為了證實shsp基因是負責在高溫下的生長能力的，用重組質(zhì)粒p99-17-2和p00-8-1轉(zhuǎn)化不含質(zhì)粒的菌株S4-1。質(zhì)粒p99-17-2含有克隆入大腸桿菌載體pBluescript(SK+)中的整個pSt04序列并且攜有來自金黃色葡萄球菌質(zhì)粒pE194的紅霉素抗性基因作為革蘭氏陽性細菌的選擇標記。質(zhì)粒p00-8-1是失去了整個shsp序列的p99-17-2的刪除衍生物(圖3)。菌株S4-1(p99-17-2)和S4-1(p00-8-1)分別顯示了與S4和S4-1相同的生長行為，證明shsp基因的存在是負責在最高達52℃的溫度下的生長能力的(圖2)。
隨后通過電穿孔將重組的質(zhì)粒p99-17-2轉(zhuǎn)移入耐熱鏈球菌菌株S8和S11以及嗜溫的乳酸乳球菌乳亞種菌株LL1403和Bu2-60和乳酸乳球菌乳脂亞種菌株MG1363中。S8和S11的最大生長溫度分別從45℃提高到了最高達48℃(圖2-1)和52℃(圖2)，并且乳球菌菌株的最大生長溫度由37℃提高到了最高達42℃(圖2-2)。
與不含質(zhì)粒的衍生菌相比，耐熱鏈球菌菌株S4和ER1顯示了更高的耐熱性。大約50％帶有質(zhì)粒的細胞在60℃培養(yǎng)時存活了2小時，而不含質(zhì)粒的細胞則沒有一個存活。通過短暫的熱休克(在52℃30分鐘)，耐熱性可以得到進一步的提高(圖4)。
ii)耐酸性除了提高最大生長溫度和改善耐熱性外，sHsp的存在還提高了耐酸性。表達sHsp的細胞表現(xiàn)出在低pH保藏時生存能力的顯著提高。甚至在pH3.5時，該pH值低于大多數(shù)發(fā)酵乳產(chǎn)物中的pH值，超過40％的細胞可以在4℃保藏時存活15天，而在相同條件下在7天后沒有檢測到sHsp陰性突變子的細胞。
iii)耐鹽性將耐熱鏈球菌菌株S4及其不含質(zhì)粒的衍生菌S4-1在0-3％濃度的NaCl下進行生長。在最高到1％的NaCl濃度下，在生長速率或細胞終濃度上都沒有觀察到明顯的差別。在1.5到2.5％的鹽濃度上野生型菌株比消除了質(zhì)粒的菌株生長得更快。而在3％的NaCl鹽濃度上則沒有生長發(fā)生。
將耐熱的耐熱鏈球菌菌株應用到含有保加利亞乳桿菌的混合培養(yǎng)液上進行乳發(fā)酵攜帶有質(zhì)粒編碼的shsp基因的耐熱鏈球菌菌株顯示了耐熱性和耐酸性的明顯提高。為了證明兩個現(xiàn)有的shsp陽性耐熱鏈球菌菌株S4和ER1是否適合于酸乳生產(chǎn)，將這些菌株中的每個菌株與德氏乳桿菌保加利亞亞種(保加利亞乳桿菌)92063和HM組合進行脫脂乳的發(fā)酵。保加利亞乳桿菌與消除了包含shsp基因的質(zhì)粒的S4和ER1的等基因衍生物混合培養(yǎng)物作為對照。
在乳發(fā)酵期間的酸化作用菌株組合S4/Lb92063在42℃以及50℃的發(fā)酵中顯示了顯著的原共生效應。在42℃時在7小時后，pH值降到4.0以下，并且在24小時后減少到pH3.6。在50℃時在8-10小時后，pH值是4.3，在24小時后pH值為4.1(圖6A)。S4-1和LB 92063的菌株組合在42℃顯示了顯著的原共生效果，但是在50℃時沒有觀察到酸化作用(圖6B)。
對于耐熱鏈球菌菌株ER1和Lb92063的組合，得到了相似的結(jié)果。但是酸化作用稍微低一些。在42℃時的對照發(fā)酵(耐熱鏈球菌ER1-2和Lb 92063)與在這個溫度下的測試發(fā)酵非常相似；在50℃時的酸化作用是不充分的。
耐熱鏈球菌菌株S4與保加利亞乳桿菌HM的組合也給出了與S4/Lb92063組合相似的結(jié)果(圖6C)。
在乳發(fā)酵和隨后的保藏期間的細胞計數(shù)對于每種菌株以2×106cfu/ml的細胞數(shù)開始，在50℃時在含有S4/Lb92063混合培養(yǎng)物的發(fā)酵中細胞數(shù)增加到109(S4)和6×108(Lb)cfu/ml。在單一的菌株發(fā)酵中，菌株S4生長到大約5×108cfu/ml的細胞數(shù)量，而消除了質(zhì)粒的shsp陰性的菌株S4-1和Lb92063僅僅緩慢生長到大約8×106的細胞終密度。在發(fā)酵24h后，將發(fā)酵后的乳于4℃下貯藏15天。每隔三天對單個菌株的細胞數(shù)量和總的細胞數(shù)進行一次測定。在貯藏期結(jié)束的時候，觀察到耐熱鏈球菌S4和Lb92063的細胞數(shù)量只有輕微的減少。Lb92063的高存活尤其令人感到驚奇，因為該菌株在50℃進行單一的菌株培養(yǎng)生長時，在貯藏12天后就不再能被檢測到了(圖7)。對于這種保加利亞乳桿菌在50℃在與耐熱的耐熱鏈球菌一起混合培養(yǎng)時的存活的積極效果的原因尚不知道。使用耐熱鏈球菌S4和保加利亞乳桿菌92063的混合菌株培養(yǎng)物在42和50℃時進行酸乳的生產(chǎn)將S4和Lb92063的混合培養(yǎng)物接種到巴氏滅菌乳中并且在42℃和50℃培養(yǎng)12小時。在發(fā)酵結(jié)束的時候，對酸乳產(chǎn)物的質(zhì)地、pH、細胞數(shù)量、口味和香味進行測試。隨后將酸乳產(chǎn)物在4℃貯藏2個星期，并且每隔三天進行如上測試。在42℃生產(chǎn)的酸乳質(zhì)地堅實，有輕微的乳清分離，pH值為3.6到3.5，每個菌株的細胞數(shù)量都達到了大約109cfu/ml。其口味非常酸并且具有發(fā)酸的香味。在50℃時生產(chǎn)的酸乳也具有堅實的質(zhì)地，并且沒有乳清分離，發(fā)酵結(jié)束后pH值約為4.3，而在貯藏期結(jié)束的時候pH值為4.0(表2)。細胞數(shù)量與42℃時的發(fā)酵相當。在貯藏期間只有輕微的減少。酸乳口味溫和，與良好發(fā)酵的“溫和的酸乳”相當，并且具有豐富的香味。用耐熱的耐熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的適當組合在50℃進行發(fā)酵得到了一種酸乳，其具有“溫和的酸乳”的特性，但是在至少經(jīng)過了產(chǎn)品的保藏期的貯藏后還具傳統(tǒng)酸乳的原始微生物區(qū)系并且具有高的細胞密度。
發(fā)酵溫度對噬菌體敏感性的影響為了測試發(fā)酵溫度對噬菌體敏感性的影響，在42和48℃時在感染復數(shù)約為10時的情況下在烈性噬菌體S8不存在或存在時對用shps-質(zhì)粒pSt04轉(zhuǎn)化的耐熱鏈球菌S8的酸化作用的活性進行了測定。在42℃下沒有觀察到酸化作用，而在48℃時得到的最終pH值為5.0(圖8)。這表明，甚至在這種不切實際的高噬菌體負載下較高的發(fā)酵溫度對噬菌體的攻擊也具有保護作用。
材料與方法細菌菌株、噬菌體和培養(yǎng)基在本研究中使用的菌株列在表1中。耐熱鏈球菌和乳球菌在添加了1％乳糖的TM17培養(yǎng)基上生長(Krusch等.1987)，保加利亞乳桿菌在MRS上生長(Merck，Darmstadt，德國)。大腸桿菌在LB培養(yǎng)物中在37℃生長(Sambrook等，1989)。在適當時，按如下方式加入抗生素分別對于耐熱鏈球菌和乳球菌加入3或5μg/ml的紅霉素，并且對于大腸桿菌加入每毫升100μg的紅霉素。象Sambrook等(1989)所描述的那樣進行藍白選擇。在9％的脫脂乳培養(yǎng)基中測定酸化作用，使用8-頻道的pH計對pH進行監(jiān)測(Ingenieurbüro Messelektronik，Chemnitz，德國)。象Sambrook等1989描述的那樣對噬菌體s8進行增殖并且以大約為10的感染復數(shù)將其加入到發(fā)酵分析物中。
DNA分離和操作用NucleoSpin試劑盒將質(zhì)粒DNA從大腸桿菌中分離出來，并通過對該方法作相應的調(diào)整從耐熱鏈球菌和乳酸乳球菌中分離出質(zhì)粒DNA(Macherey-Nagel，Düren，德國)。酶購自New England Biolabs，Beverley，Mass，并且按照生產(chǎn)商說明使用。
轉(zhuǎn)化通過Bio-Rad實驗室，Richmond，Calif推薦的程序?qū)Υ竽c桿菌進行電轉(zhuǎn)化，乳酸乳球菌如Holo和Nes(1989)所描述的，耐熱鏈球菌根據(jù)Mohamed(博士論文，Univ.Koel，德國，2002)所述。
質(zhì)粒p99-17-2和p00-8-1的構(gòu)建通過用HinP1I消化使質(zhì)粒pSt04線性化并將其克隆到pBluescrips II SK+(Cla I)中。隨后通過將紅霉素抗性基因盒插入pBluescript的BamHI位點來對重組的質(zhì)粒p99-16-5進行遺傳標記。一個小的EcoRI片段，產(chǎn)生了缺少整個shsp基因的p00-8-1。該重組的質(zhì)粒在大腸桿菌XL-blue中增殖并且通過電穿孔而轉(zhuǎn)化到耐熱鏈球菌中。
質(zhì)粒的消除基本上按照Gasson(1983)所描述的方法，通過原生質(zhì)體誘導的消除來消除耐熱鏈球菌菌株中的質(zhì)粒。
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此處通過參考文獻將上述說明書中提到的所有出版物引入。同樣通過參考文獻將通過登錄號或gi號所示的所有數(shù)據(jù)庫序列引入。
在不背離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，對本發(fā)明所述的各種方法和系統(tǒng)進行各種改進和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。盡管結(jié)合特定的優(yōu)選的實施方案對本發(fā)明進行的描述，然而應當理解，所要求保護的本發(fā)明不應被不適當?shù)叵拗频竭@些特定的實施例。事實上，對于食品發(fā)酵或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說顯而易見的是對所述的實施本發(fā)明的方式進行的多種改進被認為是在下面的權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
表1細菌菌株和噬菌體細菌菌株或噬菌體相關(guān)的特征 參考文獻的來源嗜熱鏈球菌S4 pSt04，耐熱的 BAFMa)S4-1不含質(zhì)粒的S4 本研究S4-1(p99-17-2) 耐熱的 本研究ER1 pER1-2(shsp)，pER1-BAFMER1-2 2 本研究S8 除去了pER1-1的 BAFMS8(pSt04) pSt08 本研究S8(p99-17-2)耐熱的 本研究S11 耐熱的 Nestle，Vevey，瑞士S11(p99-17-2) 不含質(zhì)粒的 本研究保加利亞乳桿菌 耐熱的92063 BAFMHM 工業(yè)菌株 BAFM乳酸乳球菌 工業(yè)菌株Gasson，1983MG1363不含質(zhì)粒的乳酸乳球菌 本研究MG1363(P99-17-2)712Chopin等.，1984IL1403耐熱的 本研究IL1403(P99-17-2)不含質(zhì)粒的 BAFMBu2-60耐熱的 本研究Bu2-60(P99-17-2)不含質(zhì)粒的 BAFM噬菌體s8耐熱的有同組異序頭的a)strain collection of the Institute of Microbiology，Bundesanstalt für Milchforschung，Kiel，德國表2.使用耐熱鏈球菌S4和保加利亞乳桿菌92063在42℃和50℃生產(chǎn)的酸乳在4℃貯藏期間的pH值的變化
權(quán)利要求
1.一種制備乳產(chǎn)品的方法，該方法包括下列步驟將乳與一種能夠表達小熱激蛋白質(zhì)的乳酸細菌混合，并在比通常的發(fā)酵溫度更高的溫度下和/或在比通常的發(fā)酵鹽濃度更高的鹽濃度下培養(yǎng)該乳/細菌混合物，其中當與用相應的不表達熱激蛋白質(zhì)的乳酸細菌生產(chǎn)的乳產(chǎn)品相比時，該乳產(chǎn)品具有較溫和口味的特性。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1的制備乳產(chǎn)品的方法，其中當與用相應的不表達熱激蛋白質(zhì)的細菌生產(chǎn)的乳產(chǎn)品的pH值相比時，所述的具有較溫和口味的特性的產(chǎn)品具有較高的pH值。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述的產(chǎn)品的pH高于4.0。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述的細菌包含一種嗜溫乳酸細菌和/或一種耐熱乳酸細菌。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的方法包括將乳與第一和第二乳酸細菌混合，其中所述的第一和/或第二乳酸細菌中的每一種都能夠表達一種小熱激蛋白質(zhì)，并且如具體指出的那樣培養(yǎng)乳/細菌混合物。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的第一乳酸細菌和所述的第二乳酸細菌中的每一種都包含一種嗜溫細菌。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中在加入第二嗜溫乳酸細菌前將乳與含有第一嗜溫乳酸細菌的起始培養(yǎng)物混合。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的第一乳酸細菌和所述的第二乳酸細菌中的每一種都包含一種耐熱細菌。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中在加入第二耐熱乳酸細菌前將乳與含有第一耐熱乳酸細菌的起始培養(yǎng)物混合。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的第一乳酸細菌包含一種嗜溫乳酸細菌，而所述的第二乳酸細菌包含一種耐熱乳酸細菌。
11.一種根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中在加入耐熱乳酸細菌前將乳與含有嗜溫乳酸細菌的起始培養(yǎng)物混合。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中在加入嗜溫乳酸細菌前將乳與含有耐熱乳酸細菌的起始培養(yǎng)物混合。
13.一種根據(jù)權(quán)利要求7或9中任意一項的方法，其中將含有所述的第一乳酸細菌的起始培養(yǎng)物和所述的第二乳酸細菌同時加入乳中。
14.一種根據(jù)權(quán)利要求10-12中任意一項的方法，其中同時加入所述的起始培養(yǎng)物和所述的第二培養(yǎng)物。
15.一種根據(jù)前述的任意一項權(quán)利要求的方法，其中所述的嗜溫細菌獨立地選自乳球菌屬、明串珠菌屬、乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂亞種，以及乳酸乳球菌乳亞種。
16.一種根據(jù)前述的任意一項權(quán)利要求的方法，其中所述的耐熱細菌獨立地選自鏈球菌屬、雙歧桿菌屬、片球菌屬、乳桿菌屬、耐熱鏈球菌、德氏乳桿菌或德氏乳桿菌保加利亞亞種。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求8-14中任意一項的方法，其中所述的第一耐熱細菌為德氏乳桿菌或德氏乳桿菌保加利亞亞種，并且所述的第二耐熱細菌為耐熱鏈球菌。
18.一種根據(jù)前述的任意一項權(quán)利要求的方法，其中所述的嗜溫乳酸細菌能夠在最高為43℃時發(fā)酵乳。
19.一種根據(jù)前述的任意一項權(quán)利要求的方法，其中所述的耐熱乳酸細菌能夠在最高為55℃時發(fā)酵乳。
20.一種根據(jù)前述的任意一項權(quán)利要求的方法，其中所述的方法包括在比用相應的不表達小熱激蛋白質(zhì)的細菌培養(yǎng)乳的pH范圍更低的pH范圍下培養(yǎng)所述的乳/細菌混合物。
21.一種根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述的乳酸細菌在3.9至4.5范圍的pH值下保持存活。
22.一種根據(jù)權(quán)利要求20或21的方法，其中當在pH3.9，在4℃保存15天時，在培養(yǎng)物中至少有106個乳酸細菌保持存活。
23.一種根據(jù)前述的任意一項權(quán)利要求的方法，其中所述的乳酸細菌包括重組的乳酸細菌，其已被工程化從而在與相應的未改進的細菌相比時在更高的水平上表達小熱激蛋白質(zhì)。
24.一種重組的乳酸細菌，其已被工程化從而在與相應的不表達所述的小熱激蛋白質(zhì)的細菌相比時在更高的水平上表達小熱激蛋白質(zhì)。
25.一種根據(jù)權(quán)利要求24的重組的乳酸細菌，其中所述的細菌能夠在比通常的發(fā)酵溫度和/或鹽濃度更高的溫度和鹽濃度下進行乳的發(fā)酵。
26.一種根據(jù)權(quán)利要求1-23中任意一項的方法，其中所述的乳酸細菌是根據(jù)權(quán)利要求24或25中任意一項的重組細菌。
27.一種根據(jù)權(quán)利要求1-23或26中任意一項的方法，或根據(jù)權(quán)利要求24或25的重組細菌，其中所述的乳酸細菌或重組的乳酸細菌包含一種編碼與組成型或可誘導的啟動子可操作地相連的小熱激蛋白質(zhì)的核酸序列。
28.根據(jù)前述的任意一項權(quán)利要求的方法或重組的乳酸細菌，其中所述的小熱激蛋白質(zhì)包含一個shsp序列或它的部分，優(yōu)選源自耐熱鏈球菌。
29.根據(jù)前述的任意一項權(quán)利要求的方法或重組的乳酸細菌，其中所述的小熱激蛋白質(zhì)源自具有在18到16kDa范圍內(nèi)的分子量的pSt04或pER1-1。
30.根據(jù)前述的任意一項權(quán)利要求的方法或重組的乳酸細菌，其中所述的小熱激蛋白質(zhì)包含如SEQ ID No1或SEQ ID No2所示的氨基酸序列或其變異體、同源物、片段或其衍生物。
31.根據(jù)前述的任意一項權(quán)利要求的方法或重組的乳酸細菌，其中所述的核酸序列包含如SEQ ID No3或SEQ ID No4所示的序列或其變異體、同源物、片段或其衍生物。
32.根據(jù)前述的任意一項權(quán)利要求的方法或重組的乳酸細菌，它包含一種編碼小熱激蛋白質(zhì)的染色體外的核酸、優(yōu)選附加型核酸。
33.根據(jù)前述的任意一項權(quán)利要求的方法或重組的乳酸細菌，它包含一種在載體中，優(yōu)選在質(zhì)粒載體中編碼小熱激蛋白質(zhì)的核酸。
34.根據(jù)前述的任意一項權(quán)利要求的方法或重組的乳酸細菌，其中所述的乳包括半脫脂乳，或脫脂乳或源自大豆或大米的乳，或合成的乳。
35.根據(jù)前述的任意一項權(quán)利要求的方法或重組的乳酸細菌，其中所述的乳從反芻動物，優(yōu)選從選自水牛、奶牛、綿羊、美洲駝、山羊或駱駝的反芻動物獲得。
36.根據(jù)前述的任意一項權(quán)利要求的方法或重組的乳酸細菌，其中所述的乳包含高濃度的NaCl。
37.根據(jù)前述的任意一項權(quán)利要求的方法或重組的乳酸細菌，其中所述的乳酸細菌或重組的乳酸細菌在升高的發(fā)酵溫度時顯示減弱的對噬菌體侵染的敏感性。
38.根據(jù)前述的任意一項權(quán)利要求的方法或重組的乳酸細菌，其中所述的乳產(chǎn)品是與通過所述方法或相應的不表達小熱激蛋白質(zhì)的重組的乳酸細菌生產(chǎn)的酸乳相比時具有較溫和口味特性的酸乳。
39.一種制備乳產(chǎn)品的方法，該方法包括下列步驟將乳與一種能夠表達小熱激蛋白質(zhì)的乳酸細菌混合，并且在比通常的發(fā)酵溫度更高的溫度和/或在比通常的發(fā)酵鹽濃度更高的鹽濃度下培養(yǎng)該乳/細菌混合物，其中所述的乳產(chǎn)品選自酸凝乳酪、硬干酪、半硬干酪如莫澤雷勒干酪、鮮干酪、夸克、黃油乳或松軟的干酪。
40.一種通過權(quán)利要求1至23或26至39中任意一項的方法制備的乳產(chǎn)品。
41.一種包含權(quán)利要求26至39中任意一項的重組的乳酸細菌以及乳或乳產(chǎn)品的組合物。
42.一種編碼權(quán)利要求31的小熱激蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
43.一種包含權(quán)利要求42的核苷酸序列的構(gòu)建體。
44.一種包含權(quán)利要求43的核苷酸序列的載體。
45.一種宿主細胞，其中在該細胞中摻入了權(quán)利要求42-44任意一項的核苷酸序列。
46.一種根據(jù)權(quán)利要求45的宿主細胞，其中所述的核苷酸序列能夠得到表達。
47.一種基本上如這里所述的通過表達小熱激蛋白質(zhì)的乳酸細菌發(fā)酵乳的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及與乳酸細菌有關(guān)的食品發(fā)酵程序領(lǐng)域，并且特別涉及改進乳產(chǎn)品特性如酸度、發(fā)酵后的酸化、芳香、香味、溫和性、稠度以及質(zhì)地。特別地，本發(fā)明提供一種使用耐熱的耐熱鏈球菌和嗜溫的乳酸乳球菌生產(chǎn)乳產(chǎn)品的方法，該細菌帶有編碼表達小熱激蛋白質(zhì)的質(zhì)粒使得發(fā)酵可以在高于正常發(fā)酵溫度的溫度下進行。表達所述熱激蛋白質(zhì)的該耐熱及嗜溫的乳酸細菌也表現(xiàn)出對較低pH和較高鹽濃度的耐受性以及在升高的發(fā)酵溫度下對噬菌體攻擊的減弱的易感性。
文檔編號C12N1/19GK1642432SQ03805909
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月11日
發(fā)明者A·布德－尼基爾, A·蓋斯, K·赫勒, M·E·－D·哈桑 申請人:丹尼斯科有限公司