專利名稱：提高寵物的葡萄糖代謝、飽腹感及營養(yǎng)物吸收的方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及包括利用含有可發(fā)酵纖維的寵物食品組合物來提高寵物(例如，狗和貓)的葡萄糖代謝、飽腹感及營養(yǎng)物吸收的方法。
最近的研究表明，食物纖維因其在狗和貓的大腸中的發(fā)酵性質(zhì)而很重要。例如，Reinhart，美國專利5,616,569描述了在寵物食品組合物中添加可發(fā)酵食物纖維以保持動物的正常腸胃功能，并改善慢性腹瀉。Howard等，F(xiàn)ASEB J.(1996)10A257，提到狗的這種可發(fā)酵纖維的消耗可以使廢氮的分配由尿轉(zhuǎn)至糞便，增加了動物通過糞便的氮排泄。Sunvold等，動物科學(xué)雜志，(1995)731099-1109，指出適當(dāng)?shù)匚菇o狗可發(fā)酵纖維，可通過在動物的腸道內(nèi)優(yōu)化短鏈脂肪酸(SCFA)的產(chǎn)生而提高胃腸道的健康狀況。
某些動物(如狗及人)有時患有糖尿病或具有削弱的調(diào)節(jié)血糖水平的能力。引起糖尿病有很多原因。當(dāng)診斷出糖尿病或削弱的血糖調(diào)節(jié)能力時，應(yīng)密切控制動物的藥物療法和飲食。目前，利用具有高濃度的不可發(fā)酵纖維的食物治療糖尿病。然而，這些含不可發(fā)酵纖維的食物經(jīng)常會削弱動物的營養(yǎng)物吸收情況，導(dǎo)致對動物健康狀況的副作用。
某些動物也具有過量熱量攝入的趨向，這增加了動物發(fā)展糖尿病或其它慢性病的風(fēng)險。優(yōu)選能夠通過食物手段控制熱量的攝入，這樣動物在進食后變飽，但無過量的熱量攝入。
另一些動物具有消化及從食物中吸收營養(yǎng)物的困難。例如，具有外分泌胰腺(EPI)不足的動物(即其胰腺分泌的酶不足)，很難正常地消化他們食物中的營養(yǎng)物，尤其是脂肪。這就需要能夠改善這些動物的營養(yǎng)物吸收能力。這樣，仍然需要另外的食物療法，其能改善寵物的葡萄糖代謝、飽腹感及營養(yǎng)物吸收情況，而無含有非可發(fā)酵纖維的食物的副作用。
發(fā)明概要本發(fā)明通過提供一種以對動物的健康狀況有利的方式用改變胃腸道(GIT)(一個大淋巴樣器官)功能與形態(tài)的食物對動物進行飼養(yǎng)的方法而滿足這種需求。該方法包括喂給寵物(如，狗或貓)含有可發(fā)酵纖維的寵物食品組合物(當(dāng)可發(fā)酵纖維被糞便細菌發(fā)酵24小時時，其有機物質(zhì)消失比(OMD)為15-60％)，纖維的量占補充的總食物纖維重量的約1-11％。用這些食物飼養(yǎng)動物至足夠的時間，以使可發(fā)酵纖維在動物的GIT中發(fā)酵。發(fā)酵導(dǎo)致GLP-1(其在動物體內(nèi)改善葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)并促進飽腹感)的分泌的正調(diào)節(jié)。這些食物還通過增加D-葡萄糖和月桂酸(其分別是糖和脂肪吸收的指示劑)的轉(zhuǎn)運從而改善動物的營養(yǎng)物吸收情況。
優(yōu)選地，寵物食品組合物含有可發(fā)酵纖維的量為補充的總食物纖維重量的2-10％。更優(yōu)選地，寵物食品組合物含有可發(fā)酵纖維的量為補充的總食物纖維重量的3-9％。最優(yōu)選地，寵物食品組合物含有可發(fā)酵纖維的量為補充的總食物纖維重量的4-7％。
優(yōu)選地，可發(fā)酵纖維的有機物質(zhì)消失比為20-50％。更優(yōu)選地，可發(fā)酵纖維的有機物質(zhì)消失比為30-40％。
此外，可發(fā)酵纖維優(yōu)選選自下組物質(zhì)甜菜漿，阿拉伯膠，talha膠(阿拉伯膠的一種形式)，車前草，米糠，角豆膠，桔漿，果膠，果糖寡糖或菊粉，甘露糖寡糖(mannanoligosaccharides)及其混合物。更優(yōu)選地，可發(fā)酵纖維選自該組物質(zhì)甜菜漿，阿拉伯膠和果糖寡糖。最優(yōu)選地，可發(fā)酵纖維是甜菜漿、talha膠和果糖寡糖的混合物?？砂l(fā)酵纖維混合物中甜菜漿與果糖寡糖的重量比優(yōu)選的是約3∶1至6∶1，最優(yōu)選的是4∶1。甜菜漿與talha膠及果糖寡糖的重量比優(yōu)選的是6∶2∶1.5。
因此，本發(fā)明的特征是提供了用于改變胃腸道(GIT)的功能與形態(tài)的寵物食品組合物與方法，以在動物體內(nèi)提高葡萄糖代謝和葡萄糖穩(wěn)態(tài)，改善飽腹感，并促進營養(yǎng)物吸收。這點及本發(fā)明的其它特性和優(yōu)點將由下列詳細描述、附圖及所附的權(quán)利要求要求得以體現(xiàn)。
附圖簡述

圖1A-1C描述了施用口腔葡萄糖耐受性檢驗(OGTT)后，可發(fā)酵纖維對血漿GLP-1(A)、胰島素(B)及葡萄糖濃度(C)的效應(yīng)，用“*”表示顯著差異的時間點(p＜0.05)。
圖2A-2C描述了施用口腔葡萄糖耐受性檢驗(OGTT)后，血漿GLP-1(A)，胰島素(B)及葡萄糖(C)在曲線下增加的面積。
圖3是顯示可發(fā)酵纖維對腸前胰高血糖素mRNA的效應(yīng)的圖表；圖4A-4B是顯示可發(fā)酵纖維在犬的腸段中對絨毛高度(A)和隱窩深度(B)的效應(yīng)的圖表；圖5A-5B說明可發(fā)酵纖維對D-葡萄糖體外攝取進入至狗的空腸(A)和回腸(B)中的效應(yīng)；圖6是可發(fā)酵纖維對腸SGLT-1轉(zhuǎn)運蛋白mRNA的效應(yīng)的圖表；圖7A-7B說明可發(fā)酵纖維對狗的空腸(A)和回腸(B)SGLT-1轉(zhuǎn)運蛋白豐度的效應(yīng)；圖8A-8B說明可發(fā)酵纖維對狗的空腸(A)和回腸(B)GLUT2轉(zhuǎn)運蛋白豐度的效應(yīng)；圖9是葡萄糖(GLC)和脯氨酸(PRO)在近側(cè)(P)、中間(M)及遠側(cè)(D)腸內(nèi)的攝取速率的圖表；圖10說明腸近側(cè)的攝取作為葡萄糖濃度的函數(shù)；圖11說明腸近側(cè)的攝取作為脯氨酸濃度的函數(shù)；以及圖12是說明狗的腸在腸近側(cè)(P)、中間(M)及遠側(cè)(D)對葡萄糖(GLC)和脯氨酸(PRO)的吸收能力。
優(yōu)選實施方案的詳細描述本發(fā)明利用包含可發(fā)酵纖維的寵物食品組合物來改變動物胃腸道的功能與形態(tài)。這給動物帶來了一些好處。首先，動物中的葡萄糖代謝得到改善，并且葡萄糖穩(wěn)態(tài)得到提高。希望不被任何特定理論束縛，人們認為動物內(nèi)葡萄糖調(diào)節(jié)的改善至少部分是由促胰島素的腸激素(如胃腸道分泌的GLP-1)的水平增加而引起的。GLP-1是一種強效的促胰島素且是潛在的抗糖尿病發(fā)生的試劑。人們認為GLP-1的正調(diào)節(jié)可增加動物的腸的葡萄糖轉(zhuǎn)運能力，并改善葡萄糖穩(wěn)態(tài)。動物GIT中GLP-1水平增加也可改善動物的飽腹感，并減少動物過分進食的趨勢。這些結(jié)果在原有技術(shù)實踐的觀點(原來在動物食物中利用十分高的纖維濃度，但利用低可發(fā)酵纖維(如纖維素)來試圖得到該結(jié)果)方面讓人感到驚訝。
此外，食物中存在可發(fā)酵纖維增加了D-葡萄糖和月桂酸在小腸的空腸(中間部分)內(nèi)的轉(zhuǎn)運。D-葡萄糖和月桂酸分別是動物體內(nèi)糖和脂肪的吸收指示劑。這樣，健康的動物將受益于本發(fā)明的改善營養(yǎng)物吸收的方法。然而，患有一定疾病(如外分泌胰腺功能不全(EPI))的動物將受益更多。EPI是由于胰腺所分泌酶的分泌不足而引起的，這些酶是動物正常營養(yǎng)物消化所需要的。患有EPI的動物很難消化食物中的營養(yǎng)物，尤其是脂肪。給患有EPI的動物喂以本發(fā)明的寵物食品組合物將通過改善其食物營養(yǎng)物的吸收能力而獲益。
本發(fā)明利用包含可發(fā)酵纖維(其具有一定的有機物質(zhì)消失百分比)的寵物食品組合物。用于本發(fā)明的可發(fā)酵纖維當(dāng)在體外被糞便細菌發(fā)酵24小時時，其有機物質(zhì)消失比(OMD)為大約15-60％。也就是說，糞便細菌發(fā)酵和轉(zhuǎn)化了原來存在的所有有機物的約15-60％。纖維的有機物消失比優(yōu)選的是20-50％，最優(yōu)選地是30-40％。
這樣，體外OMD百分比的計算如下{1-[(OM剩余-OM空白對照)/OM初值]}×100，其中OM剩余是在發(fā)酵24小時后回收的有機物，OM空白對照是在相應(yīng)的空白對照管(即含有基質(zhì)和稀釋的糞便但無底物的試管)中回收的有機物，OM初值是在發(fā)酵前放置到試管中的有機物質(zhì)。該方法的其它細節(jié)見Sunvold等，動物科學(xué)雜志1995，731099-1109期。
寵物食品組合物可以是可給動物提供適當(dāng)營養(yǎng)物的任何合適寵物食品制劑。例如，一種用于本發(fā)明的典型犬類食物可以含有約30％的粗蛋白，約20％脂肪及約10％的總食物纖維。但是，不要求這些或其它營養(yǎng)物的特定比值或百分比。
在本發(fā)明中有用的可發(fā)酵纖維產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFA)，其產(chǎn)率范圍為每1000卡路里(kcal)代謝能量(ME)產(chǎn)生約28至約85mmol的SCFA，更優(yōu)選的是每1000ME千卡產(chǎn)生約42至約71mmol的SCFA。這相當(dāng)于含有可產(chǎn)生約100至約350mmol SCFA/kg食物的總可發(fā)酵纖維的組合物。
每1000千卡代謝能量的SCFA毫摩爾數(shù)可通過先計算給定食物組合物中每千克組合物的代謝能量(ME)的總卡路里而得到。每1000千卡ME的克數(shù)可由第一個計算得到。然后，可以計算組合物中可發(fā)酵纖維組分的克數(shù)及毫摩爾數(shù)。
本發(fā)明的可發(fā)酵纖維可以是任何纖維來源，只要其能被動物體內(nèi)存在的腸道細菌發(fā)酵以產(chǎn)生有效數(shù)量的SCFA。對于本發(fā)明，SCFA的″有效量″是在24個小時內(nèi)每克底物的總SCFA超過0.5mmol。優(yōu)選的纖維包括甜菜漿，阿拉伯膠(包括talha膠)，車前草，米糠，角豆膠，桔漿，果膠，果糖寡糖或菊粉，甘露糖寡糖及其混合物)。更優(yōu)選地，可發(fā)酵纖維選自下組物質(zhì)甜菜漿，阿拉伯膠和果糖寡糖。最優(yōu)選地，可發(fā)酵纖維是甜菜漿、talha膠和果糖寡糖的混合物。可發(fā)酵纖維中甜菜漿與果糖寡糖的重量比優(yōu)選的是約3∶1至6∶1，最優(yōu)選的是4∶1。甜菜漿與talha膠及果糖寡糖的重量比優(yōu)選的是6∶2∶1.5。
用于寵物食品組合物的可發(fā)酵纖維的量占補充的總食物纖維重量的1-11％，優(yōu)選的是重量的2-10％，最優(yōu)選的是重量的3-7％。
″補充的總食物纖維″的定義首先要求解釋″總食物纖維″?！蹇偸澄锢w維″是指植物食品的殘渣，它們對動物消化酶的水解具有抵抗力?？偸澄锢w維的主要組分是纖維素，半纖維素，果膠，木質(zhì)素以及樹膠(不同于″粗纖維″，其僅僅含有某些形式的纖維素和木質(zhì)素)。″補充的總食物纖維″是添加到上述食品產(chǎn)品中的食物纖維，不包括該食品產(chǎn)物其它組分中天然存在的任何食物纖維。同時，認為″纖維來源″也是這樣(當(dāng)它主要由纖維組成時)。
為了更容易了解本發(fā)明，可參考下列實施例，這些實施例旨在說明本發(fā)明，但不限制其范圍。實施例1參見表1，食物被制成含相等氮和相等能量，并提供約19.5MJ/kg食物，其中能量的35％來自糖，30％來自脂肪且35％來自蛋白質(zhì)。低可發(fā)酵纖維(LFF)食物包含木纖維素作為纖維來源，高可發(fā)酵纖維(HFF)食物包含多種可發(fā)酵植物纖維(甜菜漿，MichganSugar，Saginaw，M1；阿拉伯膠，TIC Gums，Belcamp，MD；果糖寡糖(FOS)，Golden技術(shù)公司，Golden，CO)的混合物。甜菜漿比阿拉伯膠比FOS的比值為約6∶2∶1.5。甜菜漿對FOS的比值為約4∶1。
利用成年雜種狗(n＝16)。當(dāng)剛到達時，讓動物適應(yīng)7天并喂以完全營養(yǎng)的食物(Can-Pro，Beaumont，AB)。每日稱量所有狗的體重，并且利用式能量吸收(MJ)＝0.553×kg(體重)0.67分別喂養(yǎng)每只狗以滿足能量需求。每日在0900-1000小時間提供食物一次，水隨意提供。利用交叉實驗設(shè)計，其中隨機安排狗接收HFF或LFF食物14天，接著交換食物繼續(xù)喂養(yǎng)14天。由于在同一時間內(nèi)未能提供16只狗，所以狗在整個實驗中均是成對的。
口腔葡萄糖耐受性檢驗。在第13和27天1600小時撤走食物。在第14和28天的0845-0900小時，將狗寬松地套上薄套環(huán)，利用70％(w/w)葡萄糖進行口腔葡萄糖耐受性檢驗(OGTT)，其中每千克體重為2g葡萄糖。在0，15，30，45，60，90和120分鐘時通過將Insyte-W 20GA 2″導(dǎo)管(Becton-Dickinson Vascular Access，Sandy，UT)放置在隱靜脈中取外周血液樣。
外周血液樣品。將用于一般化學(xué)篩選和完全血液計數(shù)的血液樣品(2ml)放置到3ml肝素化的Vacutainer試管中(商標(biāo)，Becton-Dickinson，Sunnyvale，CA)，并且存放在冰中直至分析。利用Coulter STKS儀器(Courter Electronics公司，Hialeah，F(xiàn)L)進行血液學(xué)分析，并進行手工差異計數(shù)。將進行胰島素和GLP-1分析的血液樣品收集在10ml EDTA肝素化的并含抑蛋白酶肽的Vacutainer試管中(500KIU/ml血液，Sigma Chemicals，St.Louis MO)，并且存儲在-70℃(GLP-1)或-35℃(胰島素)。將進行血清葡萄糖檢測的血液樣品放置在250μl微離心管中，并在室溫下于2900×g離心10分鐘。用吸管取出血清，并且存儲在-35℃下。
腸樣品。在第28天，在OGTT之后用茄醇(MTC藥物，劍橋，ON)靜脈內(nèi)注射法通過隱導(dǎo)管用1ml/2.27kg體重的量對狗進行麻醉。取出腸樣品進行Northern印跡分析，并且立即放置在液氮中。將進行營養(yǎng)物攝取分析的空腸和回腸樣品放置在冰鹽水中，并在取樣30分鐘之內(nèi)進行分析。刮削空腸和回腸片段以便獲得粘膜樣品進行Western印跡分析。將組織學(xué)樣品直接放置到福爾馬林中，并且制備切片。
葡萄糖。利用西格瑪診斷葡萄糖(Trinder)試劑進行血清葡萄糖檢測，以在505nm下進行葡萄糖的酶促檢測(Cat#315-100，SigmaChemical，St.Louis MO).
胰島素。利用Coat-A-CountI125診斷性放射免疫測定法(Cat#TKIN1，診斷產(chǎn)品公司，洛杉磯CA)進行血清胰島素濃度檢驗。
提取血漿GLP-1(7-36)NH2。按照Reimer和McBurney，Endocrinol.1373948-3956(1996)所描述的方法，從2.5ml血漿中提取GLP-1免疫活性肽。利用SEP-COLUMN，其含有200mgC18(Cat#RIK-SEPCOL Peninsula-Laboratories，Belmont，CA)，并以緩沖液A(0.1％三氟乙酸(Cat#RIK-BA-1))和緩沖液B(60％乙腈(Cat#RIK-BB 1)作為洗脫劑。利用Speed-Vac(商標(biāo)，SevantInc.，Midland，MI)凍干樣品過夜，并且存儲在-70℃下。
腸的GLP-1(7-36)NH2的提取。從腸片段中提取GLP-1(7-36)NH2的方法見Xioyan，PhD論文，英國哥倫比亞，Vancouver大學(xué)(1996)，稍作改動后進行提取。將每個節(jié)段(空腸，回腸和結(jié)腸)的400-500mg添加至含有0.5ml 2M乙酸的12×75mm Simport聚丙烯試管(Fischer Scientific，Edmonton，AB)內(nèi)，并煮沸1小時。在4500×g離心試管10分鐘，收集上清液，并移至新試管中，用1N NaOH中和。出于RIA目的，用RIA緩沖液(100mM Tris，50mM NaCl，200mMNa2-EDTA，0.2g/L疊氮化鈉，pH8.5)按1∶10稀釋上清液樣品，直至樣品終體積為100μL。
GLP-1(7-36)NH2的放射免疫分析。利用Xiaoyan(1996)所描述的競爭性結(jié)合放射免疫分析法稍作改動后測量GLP-1(7-36)NH2的濃度。在250μL RIA分析緩沖液(100mM Tris，50mM NaCl，20mM Na2-EDTA，0.2g/L疊氮化鈉，pH8.5)中重建凍干的血漿樣品。聚丙烯試管(12mm×75mm)用于對照、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，整個方法均在冰上進行。GLP-1(7-36NH2)標(biāo)準(zhǔn)品(Peninsula Laboratories，Belmont，CA)由連續(xù)的稀釋液組成，范圍從4000pg/ml至15pg/ml。4℃下振蕩試管，并溫育24小時。溫育后，添加50Bq125I-GLP-1(736)NH2示蹤物至試管中，4℃下渦旋混合試管并溫育48小時。在除TC試管外的所有試管(100μL)中加入葡聚糖-炭懸浮物(分析緩沖液中含有4g/L葡聚糖T70，80g/L炭)。通過渦旋混合試管，并置于冰上15分鐘，2200×g離心30分鐘，將600μl上清液轉(zhuǎn)換到新試管中，并利用CobraTMAuto-Gamma計數(shù)器(Packard儀器公司，Downers Grove，IL)對其進行計數(shù)。
GLP-1(7-36)NH2的碘化作用。利用Xiaoyan(1996)所描述的氯胺-T方法使GLP-1(7-36NH2)發(fā)生碘化作用。先讓10ml含有0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈流過，接著讓10ml含有0.1％TFA的雙蒸水流過，從而準(zhǔn)備好柱體。用注射器推入l0ml空氣穿過柱體以干燥柱體。碘化作用的實施首先是將30-40μg的GLP-1溶解在30-40μL的雙蒸水中，接著將10μL轉(zhuǎn)移到一個新的eppendorf試管內(nèi)。往該管中先加入10μL 0.5MPO4(pH7.0)，接著加入0.5mCi125I。加入氯胺-T(10μl)，并且輕敲試管整30秒。加入偏亞硫酸氫鈉(5mg/ml)，接著加入1ml 0.1％TFA，然后將其轉(zhuǎn)換到已預(yù)先制好的柱內(nèi)。利用10cc的注射器對柱施加輕壓。含有0.1％TFA的乙腈用作洗脫劑來獲取5個組分。乙腈(5ml，10％+0.1％TFA)和乙腈(5ml，20％+0.1％TFA)是按這一順序所利用的頭兩份洗脫劑，將組分收集在14mL的圓底試管中。然后，30％乙腈(1ml+0.1％TFA，4次)，38％乙腈(lml+0.1％TFA，1次)和40％乙腈(1ml+0.1％TFA，5次)按照該順序作為下面的洗脫劑，其組分收集在小的聚丙烯管中。將每個洗脫組分充分混勻，并利用CobraTMAuto-Gamma計數(shù)器對每個組分的10μL進行計數(shù)。標(biāo)記物通常洗脫在40％乙腈的組分1，2和/或3中。集中含有標(biāo)記GLP-1(7-36)NH2的組分并存儲在-35℃下。125I GLP-1(7-36)NH2大約有2周的存儲期。
總RNA的分離。按照制造廠商提供的方案，利用TrizolTM(GibcoBRL，Burlincton，ON)分離每個腸節(jié)段的總RNA。將400-500mg的組織在預(yù)冷的無菌研缽中用杵研碎。稱量研碎的組織(200mg兩份)，并雙份轉(zhuǎn)移到兩個聚丙烯試管(12mm×75mm)中，添加2ml TrizolTM溶液，并用Polytron勻漿器在第十檔勻漿樣品30秒。將勻漿過的樣品轉(zhuǎn)移至14ml無菌聚丙烯FalconTM試管中，并在室溫下溫育5分鐘。在每個樣品中加入400μl三氯甲烷，用手用力振蕩試管15秒，并在室溫下再溫育2-5分鐘。接著，4℃下于12,000×g離心樣品15分鐘。將水相轉(zhuǎn)移到一根新eppendorf試管內(nèi)，并添加1ml異丙醇至試管內(nèi)。然后渦旋試管，并在-20℃下沉淀RNA過夜。4℃下于10,000-12,000×g離心樣品10分鐘，除去上清液，并以75％乙醇(至少1ml)洗滌沉淀兩次。通過渦旋混合樣品，并在4℃下于7,500×g離心10分鐘以沉淀。讓RNA沉淀在空氣中暫時干燥(不超過10分鐘)。通過輕渦旋，使RNA沉淀溶解在無RNA酶的水中(每100mg組織50-100μl)，并在55-60℃下溫育5-10分鐘，70℃下保存。在260，280和230nm處用紫外分光光度法檢測RNA的量和純度。
Northern印跡分析。按照Zhao等，Intern.J.Bioch.251897-1903(1993)所描述的Northern印跡分析測定信使RNA。將15μg總RNA的等分試樣分別溶解在10μl凝膠上樣緩沖液中(50％去離子甲酰胺(vol/vol)，2M甲醛，1.3％甘油(vol/vol)，0.02M嗎啉代丙磺酸(MOPS)，5mM乙酸鈉，1mM EDTA及0.1％溴酚藍(wt/vol))。將溶解的RNA等分試樣煮沸2分鐘以使RNA變性，然后上樣在含有(0.66M)甲醛的1％瓊脂糖(wt/vol)凝膠上，在循環(huán)電泳緩沖液(其含有0.02MMOPS，5mM乙酸鈉和1mM EDTA)的情況下通過電泳(100V 5小時)而將RNA按大小分離出來。電泳后，將凝膠浸在10×標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液(SSC)(1.5M NaCl，0.15M檸檬酸三鈉，pH7.0)中(換液兩次)，并印跡到ζ-探針GT Genomi測試印跡膜(BioRad，Mississauga，ON)上。真空80℃下烘烤2小時使RNA固定在膜上。在與[32P]CTP標(biāo)記的核酸探針雜交前，將每張膜于50℃下在20ml預(yù)雜交緩沖液中預(yù)雜交2小時，其中所說的預(yù)雜交緩沖液組成為去離子化甲酰胺(60％vol/vol)，2×SSPE(5％vol/vol)，10％blotto(5％vol/vol)，20％SDS(5％vol/vol)及10mg/ml剪切的鮭魚DNA(通過熱水浴中煮10分鐘使其變性，5％vol/vol)。50℃下在相同體積的新鮮雜交溶液[去離子化甲酰胺(55％vol/vol)，20×SSPE(5％vol/vol)，10％blotto(5％vol/vol)，20％SDS(5％vol/vol)及10mg/ml剪切的鮭魚DNA(與等量去離子化甲酰胺相混合，2.5％vol/vol)]中雜交12-16小時。在添加預(yù)熱的雜交溶液之前，先添加16.7KBq(1×106cpm)的標(biāo)記核酸探針，并在70℃水浴中預(yù)熱5分鐘。室溫下用2×SSC洗滌膜5分鐘，然后用2×SSC/0.1％SDS洗滌10分鐘(GLUT2)或15分鐘(前胰高血糖素，SGLT-1)。如下將膜轉(zhuǎn)移到0.2×SSC/1％SDS的水浴中前胰高血糖素(70℃10分鐘)，SGLT-1(70℃20分鐘)，GLUT2(60℃2-3分鐘)。最后，在室溫下用0.2×SSC洗滌膜2-3分鐘。將膜熱密封在塑料袋中，并在-70℃下利用增感屏(Dupont Canada，Mississauga，ON)使其對柯達XRA5膠片(Eastman柯達，Rochester，NY)曝光。為了進行統(tǒng)計分析，利用激光光密度分析法(型號GS-670圖象光密度儀，BioRad實驗室(加拿大)有限公司，Mississauga，ON)定量測定信號。通過膜照片的底片來量化28S和18S核糖體帶。這些帶用來確認RNA的完整性，并用來彌補較小的上樣偏差值。
核酸探針。由Xba I線性化的質(zhì)粒DNA[pGEM4Z-HTL-3]和T7聚合酶制備3.8kb放射性標(biāo)記的GLUT2反義核酸探針。由Rsa I線性化的質(zhì)粒DNA[pGEM4Z-HTL-3]和Sp6聚合酶制備350kb前胰高血糖素有義核酸探針。最后，由小羊腸SGLT-1克隆的1.4Kb片段(aa 207-664)(Wood等，Bioch.Sec.Trans.22266s 1994)制備2.1kb SGLT-1反義核酸探針。
BBM和BLM的分離、制備和富集。利用上述方法(Maenz和Cheeseman，生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報860(2)277-285(1986))在冰上進行所有操作。添加約5gm粘膜碎片至15ml膜懸浮溶液中(MSS緩沖液，125mM/1蔗糖，1mM/1 Tris-HCL，0.05mM/L PMSF，pH7.4)，用Polytron勻漿器在第八檔勻漿30秒。然后對勻漿物的等份樣品進行富集分析。將樣品分放在兩根30ml eppendorf試管內(nèi)，并往每支試管內(nèi)添加20ml MSS緩沖液。將每支試管在第8檔勻漿30秒(兩次以上)。然后于2400×g離心樣品15分鐘，收集上清液，并于43,700×g離心20分鐘。余下的沉淀由兩種組分組成。外部的白絨毛狀層包括基底外側(cè)膜(BLM)，內(nèi)部深褐色沉淀包括刷狀緣膜(BBM)。將BLM輕輕地再次懸浮在少量MSS緩沖液中，并轉(zhuǎn)移到14ml eppendorf試管內(nèi)。將BBM再次懸浮在MSS緩沖液中，并將來自相同動物的樣品集中到1支試管中，并補充MSS緩沖液至20ml。然后于43,700×g離心BBM 20分鐘。再次將絨毛狀白沉淀輕輕懸浮在MSS緩沖液中，并轉(zhuǎn)移到14mleppendorf試管內(nèi)，將黑色沉淀懸浮在正好30ml的MSS緩沖液中。在第8檔勻漿分離的BLM 15秒。將每種樣品上樣到25ml 20％Percoll上，并于46,000×g離心30分鐘。收集Percoll中所形成的絨毛狀帶，并轉(zhuǎn)移到25mm×89mm聚碳酸酯超速離心試管中(Beekman儀器公司，Palo Alto，CA)，然后用MSS緩沖液調(diào)整體積(大約38ml)，于115,000×g離心30分鐘。取出膜層，用20ml MSS緩沖液稀釋，并用Polytron在第8檔勻漿15秒。加入CaCl2(1M，100μl)，在冰上輕輕振蕩10分鐘。于7700×g離心樣品10分鐘，將沉淀重懸浮在20mlMSS緩沖液中，并在第8檔勻漿15秒。于46,000×g再離心樣品20分鐘，沉淀重懸浮在1ml MSS緩沖液中。然后取等份樣品進行標(biāo)記富集檢驗。用Polytron在第8檔勻漿BBM樣品15秒，接著于1,900×g離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新試管中，并于14,600×g再離心15分鐘。再次將上清液轉(zhuǎn)移到含有300μl 1M CaCl的新試管中，并在冰上緩慢振蕩20分鐘。于3,000×g離心樣品30分鐘，收集上清液，于46,000×g再次離心30分鐘。將沉淀重懸浮在1ml雙蒸水中，取出等份樣品進行富集檢驗。將Esmann，酶學(xué)方法15672-79(1988)所描述的富集分析用于BLM酶Na+K+-ATP酶。總ATP酶活性的分析是通過在ATP和Mg2+的存在下溫育粘膜勻漿物和膜制備物，并利用標(biāo)準(zhǔn)鉬反應(yīng)測量游離無機磷酸而進行的。烏本箭毒苷非敏感性的ATP酶活性在烏本箭毒苷存在下如同上述進行分析。Na+K+-ATP酶活性對烏本箭毒苷敏感，因此總ATP酶活性和烏本箭毒苷非敏感性ATP酶活性之間的差值區(qū)別是Na+K+-ATP酶活性。按照百分比倍富集法表述結(jié)果。利用來自Sigma的堿性磷酸酶試劑盒(Cat#245-10，Sigm Diagnostics，St.Louis，MO)對BBM酶堿性磷酸酶進行富集分析。該方法是基于堿性磷酸酶使對硝基苯基磷酸水解為對硝基苯酚和無機磷酸。所形成的對硝基苯酚呈黃色，并在405nm處顯示最大吸收值。
Western印跡分析。通過Tappenden，PhD論文，Alberta大學(xué)，Edmonton，加拿大(1997)所描述的Western印跡分析方案對BBM和BLM葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白進行量化。按1∶4的比例將BLM(60μg分離蛋白質(zhì))樣品稀釋在1×樣品緩沖液
中。按3∶1的比例將BBM(60μg分離蛋白質(zhì))樣品稀釋在4×樣品緩沖液(0.24M Tris-HCL，40％甘油，8％vol/vol的10％w/vol SDS，0.5mL溴酚藍)中。煮沸BBM樣品10分鐘，但是BLM樣品無此操作。將濃縮膠(4.1M丙烯酰胺/21mM N′N-雙甲叉丙烯(10.7％vol/vol)，0.5MTris-HCL，pH6.8(0.24％vol/vol)，10％(w/vol)SDS(0.97％vol/vol)，10％APS w/v(4.86％vol/vol)和0.4％TEMED(vol/vol))放置在分離膠[4.1M丙烯酰胺/21mM N′N-雙甲叉丙烯(32.1％vol/vol)，1.5MTris-HCL，pH8.8(32.1％vol/vol)，10％(w/vol)SDS(1.3％vol/vol)，10％(w/vol)APS(0.66％vol/vol)和0.16％(vol/vol)TEMED]的頂部。在100-200V下于電泳緩沖液
Tris堿(0.189％w/vol)，甘氨酸(0.9％w/vol)，甲醇(20％vol/vol)，SDS(0.02％w/vol)〗，在200V下將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(MSI實驗室，休斯敦，TX)上1.5-2小時。轉(zhuǎn)移后，將膜立即放置在TBST(1M Tris pH7.5(2％vol/vol)，NaCI(0.88％w/vol)，0.05％Tween-20(0.05％vol/vol))內(nèi)。輕微振蕩下，使膜在TBSTM(混有5％(w/vol)奶粉的TBST)中封閉至少1小時，然后使其與SGLT-1(Cat#AB1352，Chernicon國際公司，Temecula，CA)的初級抗體的1∶1000稀釋液一起或者與GLUT2(Cat# AB1342)的初級抗體的1∶500稀釋液一起于4℃下溫育過夜。用TBST輕微振蕩洗滌膜3×10分鐘，然后與次級抗體(抗兔IgG HRP綴合物，SignalTransduction，PDI生物科學(xué)公司，Aurora，ON)的1∶4000稀釋液輕微振蕩下溫育至少2小時。在印跡對KODAK XRA5膠片曝光之前，用Supersignal CL-HRPTM(Cat#34080，Pierce，Rockford，IL)工作溶液完全覆蓋印跡，并溫育5分鐘。以麗春紅S(0.1％w/vol麗春紅S(BDH)，5％乙酸)對印跡進行染色，以確認上樣一致性和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移程度。對帶的相對強度進行統(tǒng)計分析。為了進行統(tǒng)計分析，信號通過激光光密度分析法進行量化。
轉(zhuǎn)運動力學(xué)分析。按照Thomson和Rajotte，Am.J..Clin.Nutr.38394-403(1983)所描述的方法進行轉(zhuǎn)運的動力學(xué)分析。從每個動物體內(nèi)取出12cm的腸節(jié)段，沿著腸系膜的邊緣打開，并用冰冷的生理鹽水細心地洗去可見的粘液和碎片。將腸切成塊狀(1cm2)，并將組織展平在37℃的含有充氧Kreb碳酸氫鹽緩沖液(pH7.4)的溫育槽中。將組織塊在該緩沖液中預(yù)溫育15分鐘，以平衡于該溫度下。在預(yù)溫育后，將溫育槽轉(zhuǎn)移到37℃的含有于充氧Kreb碳酸氫鹽緩沖液(pH7.4)中的[3H]胰島素和各種[14C]-探針分子的燒杯中。D-葡萄糖和D-果糖的溶質(zhì)濃度是4、8、16、32和64mM，L-葡萄糖是16m，月桂酸是0.1mM。利用環(huán)狀磁棒(其用頻閃燈光調(diào)整至攪拌速率為600rpm，并對腸未攪拌水層具低的有效抗性)混合預(yù)先溫育的溶液與溫育溶液。取出槽，迅速將組織放入冷的鹽水中浸洗約5秒，并用環(huán)狀鋼打孔機從溫育槽中切割下暴露的粘膜組織，從而終止實驗。在烘箱中55℃過夜干燥組織以便確定組織的干重，然后用0.75N NaOH使其皂化。將閃爍液(Beekman Ready Solv HP，多倫多，ON)添加至樣品中，利用外部標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)來校正兩種同位素的可變猝滅以檢測放射性(Beekman Beta LS-5801，Beekman儀器公司，MountainVies，CA)。營養(yǎng)物的攝取以nmol/100mg干燥組織/分鐘來表述。
絨毛高度和隱窩深度測量方法。將腸片段切割成若干部分。在光學(xué)顯微鏡下，利用Northern Exposure Image Analysis軟件(EmpixImaging公司，Mississauga，ON)測量腸絨毛高度和隱窩深度。對每只動物和每節(jié)段總共記錄10次，其平均值用于統(tǒng)計分析。
統(tǒng)計分析。利用Statistical Analysis System(SAS)統(tǒng)計包(6.10版本，SAS研究所，Cary，Nc)完成所有統(tǒng)計分析。至于前胰高血糖素和SGLT-1 mRNA的豐度、以及SGLT-1和GLUT2轉(zhuǎn)運蛋白的豐度，數(shù)據(jù)由普通線型模擬方法(proc GLM)來分析，顯著性差異由單向ANOVA來確定。該模型包括食物、凝膠、時期、成對的和喂食時期。發(fā)現(xiàn)時期和喂食時期均無顯著差異，其后將它們排除出去。利用proc GLM和單向ANOVA(其包括食物和成對)分析絨毛高度、隱窩深度及腸GLP-1濃度。再次發(fā)現(xiàn)時期和喂食時期均無顯著差異，從模型中將它們排除掉。在proc GLM內(nèi)利用成對T-檢驗分析GLP-1、胰島素及葡萄糖的血漿AUC。利用重復(fù)測量法ANOVA來分析動物重量之間的差異。檢驗了進食時間的影響，但不顯著(P＞0.05)。在proc GLM內(nèi)利用成對T-檢驗分析了D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-果糖及脂肪酸12的腸轉(zhuǎn)運速率。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。當(dāng)P＜0.05時，確定為有顯著性差異。
食物對體重的效應(yīng)。分別計算所需的能量，相應(yīng)地調(diào)整食物結(jié)構(gòu)，這樣狗體重沒有因為實驗食物(實驗前、HFF和LFF時分別為23.4±1.8kg，22.9±1.8kg，23.5±1.8kg)或時期(實驗前[第7天]、時期1[第21天]及時期3[第35天]分別為23.4±1.8kg，23.4±1.8kg，23.4±1.8kg)而不同。
OGTT對血漿GLP-1、胰島素和葡萄糖的效應(yīng)。當(dāng)狗進食HFF食物時，相對于LFF食物時，其在30和90分鐘時血漿GLP-1濃度增加(參見圖1A)。當(dāng)狗進食HFF食物時，相對于LFF食物，其在90分鐘時胰島素濃度增加(參見圖1B)。在OGTT期間，食物纖維類型沒有影響任何時間點的血液葡萄糖濃度(參見圖1C)。當(dāng)狗進食HFF食物時，相對于LFF食物，對于GLP-1(參見圖2A，988±92對648±92pmol/L*h，P≤0.05)和胰島素(參見圖2B，15781±1371對11209±1371pmol/L*hr，P＜0.05)來說，曲線下的增長面積明顯更高一些。當(dāng)狗進食HFF食物時，相對于LFF食物，曲線下的增長面積對于葡萄糖來說明顯低一些((219±22mmol/L*hr對291±22mmol/L*hr，P≤0.05，參見圖2C)。這說明了可發(fā)酵纖維食物增加了檢驗的動物中GLP-1的量，并且改善了葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)。
食物對腸前胰高血糖素和GLP-1濃度的效應(yīng)。HFF食物相對于LFF食物的消化，在回腸中(1.13±0.04對0.83±0.04光密度單位)和結(jié)腸中(1.45±0.05對0.78±0.05光密度單位)引起了更高的前胰高血糖素mRNA豐度(參見圖3)。在十二指腸中沒有檢測到前胰高血糖素mRNA的表達。當(dāng)狗進食HFF食物時，相對于進食LFF食物，其粘膜碎片中的GLP-1濃度顯著高一些(41±4pmol GLP-1/mg蛋白質(zhì)對25±4pmol GLP-1/mg蛋白質(zhì))。這再次說明了檢驗動物中可發(fā)酵纖維食物可增加GLP-1的濃度。
組織學(xué)。食物對腸絨毛高度和隱窩深度的效應(yīng)見圖4。進食HFF食物的狗與進食LFF食物的狗相比，前者的十二指腸絨毛高度更高一些(1505±83對1294±83μm，P＝0.1)，但十二指腸隱窩深度無差異(289±28對262±28μm)。進食HFF食物的狗，相對于進食LFF食物的狗，前者的空腸絨毛高度明顯高一些(分別是1517±43對1343±43μm)，但隱窩深度無顯著差異(277±19對234±19μm)。進食HFF的狗對進食LFF食物的狗，兩者的回腸絨毛高度和隱窩深度無顯著差異(分別為1035±45對993±45μm和251±46對357±46μm)。進食HFF食物的狗，相對于進食LFF食物的狗，兩者的結(jié)腸隱窩深度無顯著差異(724±33對727±33μm)。
營養(yǎng)物攝取。食物纖維可發(fā)酵性對營養(yǎng)物攝取的效應(yīng)見表2。HFF的消耗導(dǎo)致空腸對D-葡萄糖的最大葡萄糖攝取能力(Vmax)明顯更高(參見圖5)。在空腸中還注意到食物對脂肪酸-12攝取的重要影響，這種攝取是未攪拌水層抗性的一個度量。Michaelis親和常數(shù)(Km)不受到食物的影響。D-葡萄糖的細胞旁攝取或者由16mM時L-葡萄糖的攝取外推至原點并標(biāo)準(zhǔn)化為1mM時確定的D-葡萄糖kd估計值，不受食物的明顯影響。D-果糖的Kd不受食物的影響。
葡萄糖輸送蛋白。食物對任何檢測腸段中的SGLT-1 mRNA無影響(參見圖6)。相對于LFF食物，HFF食物的消耗與空腸內(nèi)SGLT-1轉(zhuǎn)運蛋白的蛋白質(zhì)豐度更高相關(guān)(22.2±3.7對6.6±3.7光密度單位)。當(dāng)消耗HFF食物時，回腸中SGLT-1轉(zhuǎn)運蛋白的蛋白質(zhì)豐度更高(13.4±0.7對10.4±0.7光密度單位，P＝0.09，參見圖7)?？漳c和回腸GLUT2轉(zhuǎn)運蛋白的蛋白質(zhì)豐度由于食物而引起顯著性差異(參見圖8)，這顯示相對LFF食物，隨著HFF食物的消耗而豐度增加(分別為1.9±0.2對0.9±0.1光密度單位和4.2±0.2對1.5±0.2光密度單位)。
表1實驗食物的組成低可發(fā)酵纖維 高可發(fā)酵纖維成分 (LFF)(HFF)(g/kg進食食物)家禽副產(chǎn)品粉460 460家禽脂肪164 164魚粉122 121預(yù)先膠化的玉米淀粉 80 110鯡魚油 3 3干燥的整蛋 40 40小雞消化物 25 25維生素混合物3.2 3.2礦物混合物 2.4 2.4纖維素 70 ---甜菜漿 --- 60阿拉伯膠--- 20果糖寡糖--- 15氯化鉀 2.2 2.1氯化鈣 1.9 1.1膽堿氯化物 1.1 ---氯化物鈉0.3 0.3
表2進食14天高可發(fā)酵纖維(HFF)的狗對進食14天低可發(fā)酵纖維(LFF)食物的狗的腸轉(zhuǎn)運速率空腸 回腸HFFLFFHFF LFFD-葡萄糖1Vmax 182±15a133±13b132±11 146±15(nmol/mg組織/分鐘)Km(mM) 10.0±1.9 8.0±2.05.5±1.2 12.7±2.2L-葡萄糖(nmol/mg組織/分鐘)16mM 21.7±1.2 21.5±3.3 33.7±5.3 27.8±3.51mM 1.4±0.1 1.4±0.22.1±0.3 1.4±0.2D-果糖(nmol/mg組織/分鐘)Kd21.96 1.612.43 2.28脂肪酸12攝取3(nmol/mg組織/分鐘)2.4±0.2a1.7±0.2b3.6±0.54.2±0.21各值是平均值±SEM，每種食物n＝8。上角標(biāo)的不同字母表明在同一腸位點內(nèi)兩種食物之間的顯著性差異(P＜0.05)。2KD是描述被動攝取L-葡萄糖的線條的斜率，這也反映了D-葡萄糖被動攝取的組分。Kd等于將16mM L-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)化為1mM時的攝取。3脂肪酸12(月桂酸)的攝取是未攪拌水層耐受性的度量。實施例2喂給兩組五只成年小獵犬(兩種性別均包括)兩種食物，這兩種食物僅有纖維來源方面的不同(參見表3)。將纖維素(其通過犬類胃腸道(GIT)只被輕度降解)以3.6％的水平添加至對照食物(A)內(nèi)。第二種食物(B)中包含甜菜漿(4.2％)和果糖寡糖(FOS)(1％)，它們可被狗GIT細菌發(fā)酵?；瘜W(xué)分析顯示這兩種食物均含有25.9％蛋白質(zhì)，11.8％脂肪，6.2％水分，5.7％灰分，1.23％鈣，以及0.79％磷。食物B采用甜菜漿和FOS的混合物，因為狗的腸道細菌對它們的纖維發(fā)酵速率有區(qū)別。FOS的細菌代謝產(chǎn)物(如SCFA)與甜菜漿(其發(fā)酵緩慢)的細菌代謝產(chǎn)物相比應(yīng)能在GIT的更近端獲得。此外，可發(fā)酵纖維的兩個來源設(shè)計為能產(chǎn)生不同濃度和比率的SCFA。從Fiber and SalesDevelepment公司(St.Loui s，MO)獲得纖維素(Solka Floc)，從Michigan Sugar(Saginaw，MI)獲得甜菜漿，從GoldenTechnologies(Golden，CO)獲得FOS。
表3成分 食物組分比例，重量百分比玉米粉 到100小雞和小雞副產(chǎn)品粉 23.4啤酒制造稻米 15.9小雞脂肪 4.2纖維來源 a魚粉 3.3維生素和礦物混合物3.2小雞消化物2.0干燥的蛋產(chǎn)品 1.4魚油 0.75干燥的啤酒酵母0.47亞麻 0.28DL-甲硫氨酸 0.19a食物A含有3.6％纖維素，食物B含有4.2％甜菜漿和1.0％FOS。
將狗分成兩組分別在單獨的開闊狗舍中飼養(yǎng)。在進行外科操作之前，進食至少六周。外科手術(shù)后，立即取出小腸，并切斷相聯(lián)的腸系膜，以將腸展平在水平表面上，并在靜置狀態(tài)下測量長度。取出三個長25-30cm的腸段并立即放置在冷(2-4℃)的Ringers(其已充入O2及CO2的混合物(95％和5％))中。第一個節(jié)段起源于距幽門30cm遠處，視作近側(cè)腸。第二段取自小腸的中部，作為中間的腸。第三節(jié)段，從距回腸結(jié)腸連接點30cm處開始到近側(cè)，作為遠側(cè)腸的代表。
從三段小腸中的每一段取l0cm長用來確定每cm的濕重、周長及基于干燥物質(zhì)的粘膜百分比。區(qū)域濕重和名義表面積(不計算由絨毛和微絨毛所擴增的面積)的估算通過用每cm的區(qū)域重量值和周長乘以區(qū)域長度而得到的。區(qū)域粘膜的量通過用粘膜百分比乘以區(qū)域濕重來估計。整個腸的值通過加和這三個區(qū)而得到。
利用外翻套管方法(Karasov等，J.Comp.Physiol.B 152105-116(1983))的改進方法來測量營養(yǎng)物攝取的速率。因為成年小獵犬具有大直徑的小腸(＞1cm)，故它不適于利用完整套管來測量營養(yǎng)物吸收。而將組織約0.5cm2的塊用絲帶系在5mm棒的旁邊鄰近末端處，并使得粘膜暴露出來。初步證實研究顯示，攝取速率與利用腸的完整套管所測量的值相當(dāng)(安裝技術(shù)之間的差異＜10％)。在安裝在棒上之前、期間及之后，將組織保持在冷的充氣Ringers中。
在腸取出后45分鐘于37℃下開始進行攝取的測量。按照Puchal和Buddington(Am.J.Physiol.，262G895-902(1992))的方案，溫育溶液由含有葡萄糖或脯氨酸的Ringers組成。組織積累營養(yǎng)物的量化通過添加標(biāo)記的L-脯氨酸(3H)或D-葡萄糖(14C)來完成。選擇脯氨酸作為代表性氨基酸是因為它有″私自的″載體(亞氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白)，而其它氨基酸載體可以轉(zhuǎn)運幾種不同類的氨基酸(親和力有所不同)。往脯氨酸溶液中添加聚乙二醇(14C)以便校正與粘附流體相關(guān)的但實際上并未吸收的脯氨酸。對于葡萄糖溶液，加入被動吸收的異構(gòu)體L-葡萄糖(3H)，以同時校正粘附流體內(nèi)存在的、不依賴于載體而被動吸收的D-葡萄糖。在組織暴露于營養(yǎng)物溶液中后，將它們從棒上取下(將暴露于葡萄糖的組織首先在冷的Ringers中沖洗20秒)，并且放置在確定了空重的瓶中。記錄濕重之后，溶解組織，加入閃爍劑，通過液體閃爍計數(shù)法測量結(jié)合的放射性。計算葡萄糖和脯氨酸的攝取速率，并表示為組織重量的函數(shù)。
攝取的區(qū)域分布通過在包含50mmol/L葡萄糖或脯氨酸溶液的溶液中溫育每個節(jié)段的組織來確定。初步研究顯示該濃度足夠高，能夠飽和載體并且使吸收速率最大。通過將所有攝取區(qū)域速率的值乘以區(qū)域的濕重來估算全長小腸吸收葡萄糖和脯氨酸的最大能力。
確定腸近側(cè)對葡萄糖和腸中部對脯氨酸攝取的動力學(xué)。將組織置于含有0.04，0.2，1，5，25，以及50mmol/L未標(biāo)記的葡萄糖和脯氨酸的Ringers中來完成上述目的。所得的攝取值由非線性回歸分析來檢測，以計算最大攝取速率(Vmax)和表觀親和常數(shù)(Km)。為了分析脯氨酸數(shù)據(jù)，引入了被動滲透系數(shù)，以便表示被動吸收而不依賴于載體的脯氨酸。
表和圖中所示值是平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差值。ANOVA被用來檢查食物和區(qū)域?qū)ζ咸烟呛透彼嵛盏娜萘亢退俾实男?yīng)。若發(fā)現(xiàn)了顯著的區(qū)域影響，即利用Duncan檢驗來確定具體差異。利用StatisticalAnalysis System(SAS，6.11版本，Cary，NC)對數(shù)據(jù)進行分析，以P＜0.05作為可接受的顯著性臨界水平。
在進食兩種食物的狗之間，體重沒有不同。然而，喂以含甜菜漿和FOS的混合物作為可發(fā)酵纖維來源的食物(食物B)的狗，與那些喂以含非可發(fā)酵纖維的食物(食物A)的狗相比，前者的腸長22％(P＝0.09；見表4)。從遠側(cè)到近側(cè)周長下降(p＜0.05)。雖然在任何區(qū)域內(nèi)的兩種處理之間數(shù)值沒有顯著差異，但當(dāng)綜合三個區(qū)域時，進食食物B(其含有可發(fā)酵纖維)的狗，其可供吸收使用的所有腸表面積多28％。
在兩組動物中，每cm的濕重從近側(cè)到遠側(cè)下降，而且所有區(qū)域間均有顯著性差異(P＜0.05)。進食可發(fā)酵纖維的狗，其腸每cm的平均濕重更高(1.17對1.04；P＜0.05)，這主要是因為近側(cè)腸的量更高(p＜0.05)。中間和遠側(cè)區(qū)域的每cm濕重在兩個處理之間沒有明顯差異。因此進食可發(fā)酵纖維的狗的總腸濕重更高是由于其腸更長及近側(cè)腸的每cm重量更高的綜合結(jié)果。每cm的干重也從近側(cè)到遠側(cè)下降(P＜0.05)，但是任何區(qū)域在不同處理之間均沒有差異，這表明進食可發(fā)酵纖維的狗其每cm近側(cè)腸更重部分是因為其具有更高的含水量。即使這樣，進食可發(fā)酵纖維的狗具有更高的總腸干重。
粘膜的百分比在不同區(qū)域之間(P＞0.50)或在任何區(qū)域的不同處理之間(P＞0.70)沒有差異。進食可發(fā)酵纖維和沒有進食可發(fā)酵纖維的狗，它們在三個區(qū)域的平均值分別是39％±0.02和39％±0.03。喂以可發(fā)酵纖維食物的狗由于其有更高的全腸重量，因此總腸粘膜量更大。
表4參數(shù) 食物A食物B體重(kg)10.18±1.05 10.18±0.47腸長度(cm)306±26* 372±23腸表面積(cm2)1240±95* 1582±96腸的濕重(g) 318±23* 430±17腸干重(g) 60.9±3.1* 77.9±5.7％粘膜 39±3 39±2*星號表明基于食物的效應(yīng)顯著。
葡萄糖的攝取值代表了載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運。在50mmol/L的飽和濃度時，攝取速率在近側(cè)腸最高(圖9，區(qū)域效應(yīng)P＜0.05)，但是在進食含有可發(fā)酵纖維的食物的狗內(nèi)沒有顯著變高(處理效應(yīng)p＞0.20)。中間和遠側(cè)腸的值之間、它們在兩種處理之間均沒有顯著差異。
近側(cè)腸的以葡萄糖濃度函數(shù)而描述的攝取動力學(xué)分析(圖10)說明了兩種處理的狗的可飽和攝取。雖然50mmol/L時的攝取值在兩種處理之間沒有顯著差異，但動力學(xué)分析顯示，進食可發(fā)酵纖維食物的狗具有更高的最大攝取速率(1.21±0.11nmol/mg-min對0.60±0.13，P＜0.05)。在兩種不同處理之間，表觀親和常數(shù)無差異(6.2±2.1對3.9±3.3)，這表明僅僅存在一種轉(zhuǎn)運蛋白類型。
脯氨酸攝取的速率值闡述載體介導(dǎo)的攝取和被動的不依賴于載體的吸收的總量。50mmol/L時的值在兩種處理之間或區(qū)域之間沒有差異(圖9)。
進食纖維素食物(食物A)的狗，其脯氨酸攝取隨著脯氨酸濃度中單一性地增加(圖11)，沒有顯示載體所介導(dǎo)過程典型性的飽和動力學(xué)的任何證據(jù)，并且非常符合線性關(guān)系。作為另一個指示劑，相對于50mmol/L，計算0.04mmol/L時示蹤物脯氨酸的積累比率。如果載體存在的數(shù)量有限，標(biāo)記的和未標(biāo)記脯氨酸將競爭載體位點。因為示蹤物的積累和營養(yǎng)物濃度之間的相互關(guān)系，這將導(dǎo)致比率超過1.0。進食纖維素食物的狗的比率平均值為0.96±0.11，這表明無競爭。這些研究結(jié)果并結(jié)合動力學(xué)分析的那些結(jié)果表明，被動流入占了總脯氨酸吸收的幾乎100％，并且只有極少量的輸送蛋白存在或起作用。
相反，當(dāng)狗進食可發(fā)酵纖維食物(食物B)時，脯氨酸的攝取速率和濃度之間的關(guān)系偏離線性關(guān)系，并且非常符合包括了可飽和過程與被動流入的一個平衡。這點得到了示蹤物積累比的證實，其平均為1.21±0.15。該值與1.0無顯著差異，并且明顯低于葡萄糖的比率(進食有和無可發(fā)酵纖維的食物的狗，分別是9.13±1.36和4.58±0.80，兩處理間及與1.0相比p＜0.05)。然而，這有可能表明當(dāng)狗進食可發(fā)酵纖維食物時在中間腸位置存在更多脯氨酸載體。即使這樣，在50mmol/L脯氨酸時，被動流入仍然占總流入的90％以上。
其它脊椎動物的完整組織對脯氨酸攝取的親和常數(shù)的范圍為約1至5mmol/L。如果狗的亞氨基轉(zhuǎn)運蛋白與其它已知哺乳動物相似，那么所有載體應(yīng)在25mmol/L濃度時被飽和。因此，在25和50mmol/L之間脯氨酸吸收的任何增加都應(yīng)該反映了被動的、不依賴于載體的流入。比較25和50mmol/L時的線條斜率，在進食食物A(0.074±0.022nmol/mg-min-mmol/l)和食物B(0.054±0.011，P＞0.20)的狗之間沒有發(fā)現(xiàn)差異。
當(dāng)攝取速率對區(qū)域濕重積分時，進食可發(fā)酵纖維食物的狗具有對葡萄糖更高的總腸吸收能力(271±42μmol/min對139±37；P＜0.05)。這主要是由腸近側(cè)的值更高造成的；中間和遠側(cè)腸的值在兩處理之間確實有差異(圖12)。未檢測到兩種處理對任何區(qū)域的脯氨酸攝取能力(圖12)或?qū)π∧c總長度(食物A＝1246±155，食物B＝1031±124；P＞0.40)有任何效果。
實驗顯示食物中存在的纖維類型能改變狗的腸結(jié)構(gòu)與功能。這些結(jié)果顯示，當(dāng)狗進食具有易被GIT細菌發(fā)酵的纖維的食物時，可導(dǎo)致腸具有更多表面積和粘膜，并且更長和更重。根據(jù)進食兩種食物的狗之間在近側(cè)腸重量和粘膜量方面的差異，說明這種反應(yīng)在近側(cè)腸更為明顯。在腸的近側(cè)或腸的任何其它區(qū)域均無粘膜百分比的差異(p＞0.9)，這表明其在所有組織層均得以增加。然而，由于近側(cè)區(qū)域更大量，因此進食可發(fā)酵纖維食物的狗在近側(cè)區(qū)域及小腸的全長內(nèi)具有更多粘膜。這表明進食可發(fā)酵纖維食物的狗具有更多的腸用于水解和吸收吞食的食物。該結(jié)果也表明，在犬類食物中添加可發(fā)酵纖維，對健康的狗來說，除了能增加有益的GIT細菌之外，還有助于其健康。
為了說明本發(fā)明闡述了一些代表性的實施方案和細節(jié)，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯然在本文所揭示的方法與裝置方面可作各種變化，而仍不超出附屬權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明范圍。
權(quán)利要求
1.一種改變動物胃腸道(GIT)的功能與組成以改善葡萄糖代謝的方法，該方法包括以下步驟喂給動物主要由含有可發(fā)酵纖維的組合物組成的食物，其中所述可發(fā)酵纖維當(dāng)被糞便細菌發(fā)酵24小時時，其有機物質(zhì)消失比為15-60％，所述纖維的存在量占補充的總食物纖維重量的約1-11％，以及用該食物飼養(yǎng)動物至足夠的時間，以使該可發(fā)酵纖維在該動物的GIT中發(fā)酵。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物含有所述可發(fā)酵纖維的量占補充的總食物纖維重量的2-10％。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物含有所述可發(fā)酵纖維的量占補充的總食物纖維重量的3-9％。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物含有所述可發(fā)酵纖維的量占補充的總食物纖維重量的4-7％。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述可發(fā)酵纖維的有機物質(zhì)消失比為20-50％。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述可發(fā)酵纖維的有機物質(zhì)消失比為30-40％。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述可發(fā)酵纖維選自甜菜漿，阿拉伯膠，talha膠，車前草，米糠，角豆膠，桔漿，果膠，果糖寡糖，甘露糖寡糖及其混合物。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述可發(fā)酵纖維選自甜菜漿，阿拉伯膠和果糖寡糖。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述可發(fā)酵纖維包含甜菜漿、talha膠和果糖寡糖的混合物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中在所述混合物中甜菜漿與果糖寡糖的比例在約3∶1至6∶1之間。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述混合物中甜菜漿與果糖寡糖的比例約為4∶1。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述甜菜漿與talha膠及果糖寡糖的比例約為6∶2∶1.5。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述動物是狗。
14.一種促進動物胃腸道(GIT)分泌胰高血糖素樣肽1(GLP-1)以改善所述動物內(nèi)葡萄糖代謝和飽腹感的方法，該方法包括以下步驟喂給動物主要由含有可發(fā)酵纖維的組合物組成的食物，其中所述可發(fā)酵纖維當(dāng)被糞便細菌發(fā)酵24小時時，其有機物質(zhì)消失比為15-60％，該纖維的存在量占補充的總食物纖維重量的約1-11％，以及用該食物飼養(yǎng)動物至足夠的時間，以使該可發(fā)酵纖維在動物的GIT中發(fā)酵從而促進動物胃腸道中GLP-1的分泌。
15.一種改善動物胃腸道(GIT)的營養(yǎng)物吸收的方法，該方法包括以下步驟喂給動物主要由含有可發(fā)酵纖維的組合物組成的食物，其中所述可發(fā)酵纖維當(dāng)被糞便細菌發(fā)酵24小時時，其有機物質(zhì)消失比為15-60％，該纖維的存在量占補充的總食物纖維重量的約1-11％，以及用該食物飼養(yǎng)動物至足夠的時間，以使該可發(fā)酵纖維在動物的GIT中發(fā)酵，從而增加動物胃腸道內(nèi)D-葡萄糖和月桂酸的轉(zhuǎn)運。
16.一種治療患外分泌胰腺功能不全(EPI)的動物的方法，該方法包括以下步驟喂給動物主要由含有可發(fā)酵纖維的組合物組成的食物，其中所述可發(fā)酵纖維當(dāng)被糞便細菌發(fā)酵24小時時，其有機物質(zhì)消失比為15-60％，該纖維的存在量占補充的總食物纖維重量的約1-11％，以及用該食物飼養(yǎng)動物至足夠的時間，以使該可發(fā)酵纖維在動物的GIT中發(fā)酵，從而增加動物胃腸道內(nèi)的營養(yǎng)吸收及D-葡萄糖和月桂酸的轉(zhuǎn)運。
全文摘要
一種用可改變動物內(nèi)一個大淋巴樣器官:胃腸道(GIT)的功能與形態(tài),并提高葡萄糖代謝、飽腹感和營養(yǎng)物吸收的食物對動物進行飼養(yǎng)的方法。該方法包括喂給動物(如,狗或貓)含有可發(fā)酵纖維的寵物食品組合物,該可發(fā)酵纖維被糞便細菌發(fā)酵24小時時,其有機物質(zhì)消失比為15－60%,纖維的量占補充的總食物纖維量的約1－11%。用這些食物飼養(yǎng)動物至足夠的時間,以使可發(fā)酵纖維在動物的GIT中發(fā)酵。
文檔編號A61K36/68GK1251995SQ98803936
公開日2000年5月3日 申請日期1998年4月6日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月7日
發(fā)明者G·D·蘇沃德, M·G·哈耶克 申請人:Iams公司