專利名稱：生產(chǎn)核黃素的微生物和利用其生產(chǎn)核黃素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)核黃素的微生物和利用其生產(chǎn)核黃素的方法。更具體地，本發(fā)明涉及與親株相比具有增強(qiáng)的核黃素生產(chǎn)力的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的突變株，和利用其生產(chǎn)核黃素的方法。
背景技術(shù)：
核黃素，也已知為維生素B2，是一種水溶性維生素，其通過(guò)各種微生物和植物的生物合成來(lái)制備。然而，在脊椎動(dòng)物包括人中卻不能生物合成核黃素。核黃素是黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黃素單核苷酸(FMN)、在所有細(xì)胞體的氧化-還原反應(yīng)中涉及的輔酶的前體，因此是動(dòng)物包括人必需的養(yǎng)分。核黃素缺乏可導(dǎo)致嘴和咽粘膜發(fā)炎，皮膚炎癥和其它皮膚損傷，結(jié)膜炎，弱視，生長(zhǎng)抑制和重量減輕。因此，核黃素用作預(yù)防或治療與前述維生素缺乏有關(guān)的疾病的維生素產(chǎn)品，或作為飼養(yǎng)家畜的飼料添加劑。特別是，濃縮的核黃素本身已被用作飼料。目前核黃素的世界產(chǎn)量是每年3,000噸，其中75％用于飼料添加劑，其余的用于食品和藥品。
目前，通過(guò)化學(xué)合成或通過(guò)發(fā)酵微生物來(lái)生產(chǎn)核黃素。在化學(xué)合成中，利用一種前體如D-核糖，用多步法來(lái)生產(chǎn)高純度的核黃素。然而，由于起始物質(zhì)的成本高，所以化學(xué)合成的生產(chǎn)成本也是高的。因此，開發(fā)了利用微生物的核黃素發(fā)酵方法。適于發(fā)酵方法的微生物可以是任何存在于自然界的產(chǎn)生核黃素的微生物或通過(guò)遺傳工程、化學(xué)或物理方法轉(zhuǎn)化的過(guò)量生產(chǎn)核黃素的微生物。將這些微生物在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)，以生產(chǎn)核黃素。從培養(yǎng)物中重新獲得生產(chǎn)的核黃素。
廣為人知的適于生產(chǎn)核黃素的微生物是屬于酵母種群的釀酒酵母和假絲酵母，屬于細(xì)菌種群的梭菌，桿菌和棒桿菌，和屬于真菌種群的假囊酵母和Ashbya sp.。
美國(guó)專利No.5,231,007公開了一種利用假絲酵母生產(chǎn)核黃素的方法。它報(bào)道了過(guò)量表達(dá)在核黃素生物合成過(guò)程中涉及的酶的基因的遺傳工程修飾的枯草芽孢桿菌和產(chǎn)氨棒桿菌分別產(chǎn)生4.5g/l和17.4g/l的核黃素[Perkins等.，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，228-18，1999]。歐洲專利EP0 821 063公開了一種利用重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)核黃素的方法。美國(guó)專利No.5,837,528公開了一種過(guò)量生產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌的重組菌株，其通過(guò)利用重組技術(shù)，將rib操縱子引入到親株中而獲得。另外，還有Windholz等[The Merk Index，Merk & Co.，1183頁(yè)，1983]報(bào)道的阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)和棉病阿舒囊霉(Ashbya gossypii)子囊真菌作為生產(chǎn)核黃素的微生物。特別是，報(bào)道了在含糖蜜或植物油作為主要碳源的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，這些子囊真菌突變株的培養(yǎng)物每一升發(fā)酵溶液產(chǎn)生15g的核黃素[Bigelis，生物技術(shù)，7b卷，243頁(yè)，1989]。WO95/26406中也公開了利用棉病阿舒囊霉來(lái)生產(chǎn)核黃素。
然而，仍然需要開發(fā)具有增強(qiáng)的核黃素生產(chǎn)力的微生物來(lái)大量生產(chǎn)核黃素。
同時(shí)，有人報(bào)道了天冬氨酸激酶(蘇氨酸生物合成的一種主要酶)的反向調(diào)節(jié)可能與核黃素的生物合成緊密相關(guān)[Stahmann等.，Applied andEnvironmental Microbiology，4283-4290，1998]。
然而，直至目前，尚沒(méi)有關(guān)于核黃素生物合成途徑和蘇氨酸生物合成途徑之間相關(guān)性的詳細(xì)報(bào)道。也沒(méi)有將蘇氨酸抗性引入到生產(chǎn)核黃素的菌株中以增強(qiáng)核黃素生產(chǎn)力的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了抗蘇氨酸類似物的生產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌。
本發(fā)明還提供了一種利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)核黃素的方法。
依照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了抗蘇氨酸類似物的生產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌。優(yōu)選使用枯草芽孢桿菌CJKB0002(保藏號(hào)KCCM-10446)。
在尋找具有增強(qiáng)的核黃素生產(chǎn)力的微生物的過(guò)程中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在枯草芽孢桿菌上誘導(dǎo)突變并對(duì)其引入蘇氨酸類似物抗性，導(dǎo)致核黃素生產(chǎn)力的增強(qiáng)。在這些菌株中，本發(fā)明人選擇了過(guò)量生產(chǎn)核黃素并且高產(chǎn)率的菌株，并利用所選擇的菌株大規(guī)模生產(chǎn)核黃素。
依照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種生產(chǎn)核黃素的方法，其包含培養(yǎng)枯草芽孢桿菌和從培養(yǎng)物中回收核黃素。
以下，將詳細(xì)描述本發(fā)明。
本發(fā)明的枯草芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌AS5(BIONOM-S，Ltd.，俄羅斯)的突變株。它抗蘇氨酸類似物，并且以高產(chǎn)率產(chǎn)生高濃度的核黃素。
此處使用的親株是枯草芽孢桿菌AS5(BIONOM-S，莫斯科，俄羅斯)。
常規(guī)的物理或化學(xué)方法可在親株上誘導(dǎo)突變。例如，可將親株曝露于X-射線或紫外光，或化學(xué)試劑如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)，硫酸二乙酯和乙胺中。
本發(fā)明人在包含各種濃度的、作為蘇氨酸類似物的β-羥基正纈氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)被誘導(dǎo)突變的菌株。篩選能在存在高濃度β-羥基正纈氨酸的條件下生長(zhǎng)的突變株。在它們中間，篩選到具有最高核黃素生產(chǎn)力的一個(gè)突變株。將篩選到的突變株命名為枯草芽孢桿菌CJKB0002，并于2002年11月18日保藏于韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心(保藏號(hào)KCCM-10446)。
本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CJKB0002(KCCM-10446)可在包含甚至高達(dá)250mg/lβ-羥基正纈氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。另一方面，作為親株的枯草芽孢桿菌AS5在存在多于50mg/l的β-羥基正纈氨酸的條件下不能生長(zhǎng)。
另外，在瓶培養(yǎng)中，本發(fā)明枯草芽孢桿菌CJKB0002(KCCM-10446)的核黃素的生產(chǎn)力比枯草芽孢桿菌AS5的核黃素生產(chǎn)力高13％。在5升發(fā)酵培養(yǎng)中，當(dāng)與枯草芽孢桿菌AS5相比較時(shí)，枯草芽孢桿菌CJKB0002(KCCM-10446)生產(chǎn)增加了18.4％水平的核黃素。
因此，當(dāng)與枯草芽孢桿菌AS5相比時(shí)，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CJKB0002(KCCM-10446)對(duì)蘇氨酸類似物具有增強(qiáng)了5倍的抗性，并且相當(dāng)大地增強(qiáng)了核黃素生產(chǎn)力。
為了生產(chǎn)核黃素，在合適的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CJKB0002(KCCM-10446)。
詳細(xì)地，將枯草芽孢桿菌CJKB0002(KCCM-10446)接種到含合適碳源、氮源和無(wú)機(jī)化合物的常規(guī)培養(yǎng)基中，并在有氧條件下，在預(yù)定的溫度和pH下培養(yǎng)。碳源的實(shí)例包括葡萄糖，糖蜜，乳糖，蔗糖，麥芽糖，糊精，淀粉，甘露糖醇，山梨醇和甘油。優(yōu)選葡萄糖和糖蜜。氮源的實(shí)例包括無(wú)機(jī)來(lái)源如氨，氯化銨，和硫酸銨，和有機(jī)來(lái)源如胨，NZ-胺，牛肉膏，酵母提取物，玉米漿，酪蛋白水解物，魚或魚粉，和脫脂豆餅或豆粉。優(yōu)選酵母提取物和玉米漿。無(wú)機(jī)化合物的實(shí)例包括磷酸一氫鉀，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，硫酸亞鐵，硫酸錳和碳酸鈣。當(dāng)需要時(shí)，可使用維生素和營(yíng)養(yǎng)缺陷型基質(zhì)(auxotrophic bases)。對(duì)于培養(yǎng)，可使用通過(guò)通氣進(jìn)行的振蕩培養(yǎng)或攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為30-45℃，優(yōu)選37-40℃。在培養(yǎng)過(guò)程中，優(yōu)選將pH調(diào)至相當(dāng)中性的水平。培養(yǎng)期為5-6天。
依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，將枯草芽孢桿菌CJKB0002(KCCM-10446)接種到接種培養(yǎng)基中，并在1vvm的通氣流速、37℃和8,000rpm的條件下培養(yǎng)20小時(shí)。將接種培養(yǎng)物接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在1vvm的通氣流速、40℃，800rpm和pH7.0的條件下，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)60-70小時(shí)。在振蕩培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)物補(bǔ)充以葡萄糖補(bǔ)充培養(yǎng)基，以維持培養(yǎng)物中殘余葡萄糖水平為0.5-1％，直至發(fā)酵培養(yǎng)物中葡萄糖總含量達(dá)到20％為止。當(dāng)與親株相比較時(shí)，核黃素的產(chǎn)生水平提高了約18.4％。
以下，通過(guò)實(shí)施例將更具體地描述本發(fā)明。然而，提供下述實(shí)施例僅是為了解釋本發(fā)明，因此本發(fā)明不被它們所限制。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1篩選本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CJKB0002為了獲得本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CJKB0002，將作為親株的枯草芽孢桿菌AS5進(jìn)行突變。然后，在含β-羥基正纈氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌AS5的突變株，以獲得集落。在這些集落中，篩選出了具有最高核黃素生產(chǎn)力的突變株，表示為枯草芽孢桿菌CJKB0002。
作為親株的枯草芽孢桿菌AS5獲自BIONOM-S，Ltd.(Obolensk，莫斯科，俄羅斯)。將枯草芽孢桿菌AS5懸浮于pH7.0的磷酸鹽緩沖液或pH5.5的檸檬酸鹽緩沖液中，使得細(xì)胞密度為107-108細(xì)胞/ml。向混懸液中加入突變誘導(dǎo)劑N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍，直至它的濃度為10-50μg/ml。在室溫或30℃下孵育得到的混合物30-60分鐘，以誘導(dǎo)突變。然后，用0.85％鹽溶液洗滌混合物三次，并以適當(dāng)?shù)姆绞较♂?。將稀釋的溶液接種到具有各種濃度β-羥基正纈氨酸的含1.8％瓊脂的基本培養(yǎng)基中，并在37℃培養(yǎng)24小時(shí)以獲得集落。在這種情況下，β-羥基正纈氨酸的濃度為0mg/l-350mg/l。將形成的集落接種到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，并在37℃培養(yǎng)24小時(shí)。然后，將得到的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)物接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在37℃培養(yǎng)4-5天。篩選生產(chǎn)核黃素最高的菌株。每種培養(yǎng)基組分示于表1。
表1篩選本發(fā)明枯草芽孢桿菌CJKB0002的培養(yǎng)基組分

通過(guò)HPLC測(cè)量核黃素的生產(chǎn)力。利用與kromasil C18(5μm)柱(內(nèi)徑4.6mm，長(zhǎng)250mm)偶聯(lián)的waters 510來(lái)進(jìn)行HPLC。5mM六磺酸鈉和20mM H3PO4的混合溶劑和乙腈(89∶11，體積/體積)用作流動(dòng)相。流動(dòng)相的流速為1ml/min。樣品的注射量為15μl，并使用樣品稀釋的蒸餾水。另外，使用UV監(jiān)測(cè)儀(TSP UV2000，UV260nm)作為監(jiān)測(cè)儀。
依照試驗(yàn)結(jié)果，在含250mg/lβ-羥基正纈氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的突變株顯示杰出的核黃素生產(chǎn)力。在它們中間，篩選一個(gè)具有最高核黃素生產(chǎn)力的突變株，并表示為枯草芽孢桿菌CJKB0002。將枯草芽孢桿菌CJKB0002于2002年11月18日保藏于韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心，保藏號(hào)KCCM-10446。
實(shí)施例2評(píng)估枯草芽孢桿菌CJKB0002和枯草芽孢桿菌AS5對(duì)β-羥基正纈氨酸的抗性在本實(shí)施例中，為了評(píng)估對(duì)β-羥基正纈氨酸的抗性，將實(shí)施例1的枯草芽孢桿菌CJKB0002(KCCM-10446)和作為親株枯草芽孢桿菌AS5在含各種濃度β-羥基正纈氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。詳細(xì)地，將各個(gè)菌株接種到如表1所示的含β-羥基正纈氨酸的培養(yǎng)基中，并在30℃培養(yǎng)5天。在這種情況下，β-羥基正纈氨酸的濃度為1-350mg/l。
依照如表2所示的試驗(yàn)結(jié)果，在含多于50mg/lβ-羥基正纈氨酸的培養(yǎng)基中AS5不能生長(zhǎng)。另一方面，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CJKB0002(KCCM-10446)甚至可在含250mg/lβ-羥基正纈氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
表2評(píng)估枯草芽孢桿菌CJKB0002和枯草芽孢桿菌AS5對(duì)β-羥基正纈氨酸的抗性菌株 β-羥基正纈氨酸的濃度(mg/l)0 50100 200250 300 350枯草芽孢桿菌AS5+++ + - - - - -枯草芽孢桿菌 +++ +++ +++ ++ + - -CJKB0002(KCCM-10446)+生長(zhǎng)，-不生長(zhǎng)實(shí)施例3
在瓶中本發(fā)明枯草芽孢桿菌CJKB0002的發(fā)酵潛能評(píng)估在瓶中枯草芽孢桿菌CJKB0002和枯草芽孢桿菌AS5的發(fā)酵潛能。將每個(gè)菌株接種到基本培養(yǎng)基中并培養(yǎng)。然后，將每個(gè)接種培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到在瓶中的發(fā)酵培養(yǎng)基中。接種培養(yǎng)基如下制備在具有18mm直徑的試驗(yàn)管中分配5ml的接種培養(yǎng)基，然后在121℃下壓力滅菌試驗(yàn)管15分鐘。將每個(gè)枯草芽孢桿菌CJKB0002和枯草芽孢桿菌AS5接種到接種培養(yǎng)基中，并在200rpm和37℃下振蕩培養(yǎng)20小時(shí)。當(dāng)完成接種培養(yǎng)時(shí)，將1ml每個(gè)接種培養(yǎng)物接種到瓶中的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在200rpm和37℃下振蕩培養(yǎng)90小時(shí)。通過(guò)以與制備接種培養(yǎng)基相同的方式在壓力滅菌培養(yǎng)基FA和培養(yǎng)基FS，并將15ml培養(yǎng)基FA和5ml培養(yǎng)基FS分配到250ml振蕩培養(yǎng)瓶中來(lái)制備發(fā)酵培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)瓶在壓力下預(yù)先滅菌。當(dāng)發(fā)酵完成時(shí)，以與實(shí)施例1相同的方式測(cè)量積累到發(fā)酵培養(yǎng)物中的核黃素的濃度。本實(shí)施例中使用的接種培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的每個(gè)組分示于表3。
表3適于瓶中發(fā)酵的培養(yǎng)基的組分

依照試驗(yàn)結(jié)果，作為親株的枯草芽孢桿菌AS5生產(chǎn)7.0g/l核黃素。另一方面，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CJKB0002(KCCM-10446)生產(chǎn)7.9g/l核黃素，其比枯草芽孢桿菌AS5高13％。
實(shí)施例4在5升發(fā)酵罐中評(píng)估本發(fā)明枯草芽孢桿菌CJKB0002的發(fā)酵潛能以比較的方式評(píng)估枯草芽孢桿菌CJKB0002(KCCM-10446)和枯草芽孢桿菌AS5在5升發(fā)酵罐中的發(fā)酵潛能。將每個(gè)接種培養(yǎng)物接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，并補(bǔ)料分批培養(yǎng)。為了這樣，首先，將1升每種接種培養(yǎng)基分發(fā)到2.5升的實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐中，并在121℃下壓力滅菌10分鐘，以制備接種培養(yǎng)基。在接種培養(yǎng)基冷卻后，將10ml的每種枯草芽孢桿菌CJKB0002和枯草芽孢桿菌AS5在鹽溶液中的混懸液接種到接種培養(yǎng)物中。然后，將每種含菌株的接種培養(yǎng)物在1vvm速率的無(wú)菌通風(fēng)、37℃和8000rpm的條件下孵育20小時(shí)。在接種培養(yǎng)過(guò)程中，不調(diào)整pH。在接種培養(yǎng)完成后，將每種接種培養(yǎng)物接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，并進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)。通過(guò)將1.4升發(fā)酵培養(yǎng)基分發(fā)到5升實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐中，然后在121℃下壓力滅菌20分鐘來(lái)制備發(fā)酵培養(yǎng)基。在發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻后，將200ml每種接種培養(yǎng)物接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在1vvm速率的通風(fēng)、8,000rpm和40℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在發(fā)酵過(guò)程中，向每種發(fā)酵培養(yǎng)物補(bǔ)充以葡萄糖補(bǔ)充培養(yǎng)基，以維持培養(yǎng)物中殘余葡萄糖的水平為0.5-1％，直至發(fā)酵培養(yǎng)物中葡萄糖的總濃度達(dá)到20％為止。在發(fā)酵過(guò)程中，使用含水氨將pH維持在7.0。發(fā)酵進(jìn)行60-70小時(shí)。
在本實(shí)施例中，為了減少生產(chǎn)成本，在接種培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中，用糖蜜代替葡萄糖作為碳源，玉米漿代替酵母提取物和胰蛋白胨作為氮源。另外，用于補(bǔ)料分批培養(yǎng)的補(bǔ)充培養(yǎng)基包含葡萄糖作為碳源，將干酵母和玉米漿作為氮源。在本實(shí)施例中使用的培養(yǎng)基的每個(gè)組分示于表4。以與實(shí)施例1中相同的方式來(lái)測(cè)量發(fā)酵培養(yǎng)物中核黃素的生產(chǎn)力。
表4適于在5升發(fā)酵罐中培養(yǎng)的培養(yǎng)基的組分

依照試驗(yàn)結(jié)果，作為親株的枯草芽孢桿菌AS5生產(chǎn)22.4g/l核黃素。在另一方面，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CJKB0002(KCCM-10446)生產(chǎn)26.5g/l核黃素，其比枯草芽孢桿菌AS5生產(chǎn)的核黃素高約18.4％。
從上述描述中顯而易見，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌對(duì)蘇氨酸類似物具有高的抗性，并且以高產(chǎn)率生產(chǎn)高濃度的核黃素。因此，可大量生產(chǎn)核黃素。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌，其抗蘇氨酸類似物。
2.依照權(quán)利要求1的枯草芽孢桿菌，其是枯草芽孢桿菌CJKB0002(KCCM-10446)。
3.一種生產(chǎn)核黃素的方法，其包含培養(yǎng)依照權(quán)利要求1或2的枯草芽孢桿菌，并從培養(yǎng)物中回收核黃素。
全文摘要
抗蘇氨酸類似物的生產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌，和一種利用提供的枯草芽孢桿菌生產(chǎn)核黃素的方法。
文檔編號(hào)C12P25/00GK1504565SQ0314307
公開日2004年6月16日 申請(qǐng)日期2003年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月5日
發(fā)明者李光鎬, 樸英薰, 韓鍾權(quán), 樸長(zhǎng)熙, 李庚翰 申請(qǐng)人:Gj株式會(huì)社