專利名稱：一種戊糖片球菌菌株和以該菌株制成的發(fā)酵劑及該發(fā)酵劑在肉食品中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種戊糖片球菌菌株和以該菌株制成的發(fā)酵劑及該發(fā)酵劑在肉食品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
發(fā)酵香腸最初是由古羅馬人發(fā)明的一種發(fā)酵肉制品，目前已經(jīng)形成多種類型和多種風(fēng)格。發(fā)酵香腸在加工過程中經(jīng)過微生物發(fā)酵作用，將糖轉(zhuǎn)化為各種酸和醇，使香腸的pH值降低；將脂肪和蛋白降解成醛和酮，使香腸具有良好的發(fā)酵風(fēng)味；并經(jīng)干燥脫水使Aw下降。因此，發(fā)酵香腸具有獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)，并具有較長的貨架期。發(fā)酵肉制品的發(fā)酵方式主要有非接種發(fā)酵法和接種發(fā)酵法兩種。其中非接種發(fā)酵易受雜菌感染，發(fā)酵啟動(dòng)慢，發(fā)酵周期長；而接種發(fā)酵法就是通過接種優(yōu)良的肉制品發(fā)酵菌種進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。接種發(fā)酵縮短了發(fā)酵周期，提高了產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性，有利于工藝控制。雖然發(fā)酵香腸品種繁多，工藝各不相同，但接種發(fā)酵已經(jīng)成為目前生產(chǎn)使用的主要方法，因此，篩選優(yōu)良肉制品發(fā)酵微生物是接種發(fā)酵的基礎(chǔ)，而乳酸菌、微球菌和非致病性葡萄球菌是接種發(fā)酵最常使用的菌種。
目前，發(fā)達(dá)國家肉制品深加工比例高達(dá)30％以上，其中發(fā)酵肉制品占據(jù)重要地位。當(dāng)今的歐美國家，通過對微生物發(fā)酵肉制品的特性進(jìn)行了較為深入的研究，已經(jīng)完成了從傳統(tǒng)的自然發(fā)酵向微生物定向接種發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)變，發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)已具備相當(dāng)成熟的生產(chǎn)工藝。目前，國外發(fā)酵肉制品主要研究內(nèi)容之一是加強(qiáng)了優(yōu)良微生物發(fā)酵菌種的選育工作。因此，通過對傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中發(fā)酵微生物的純種分離培養(yǎng)技術(shù)和微生物育種技術(shù)，篩選和構(gòu)建具有優(yōu)良性狀的微生物發(fā)酵劑菌種是研究的中心目標(biāo)。
1940年，美國人L.B.Jenson在專利中第一次描述了乳酸菌在發(fā)酵香腸中的應(yīng)用，從而開始了使用純培養(yǎng)的微生物發(fā)酵劑生產(chǎn)發(fā)酵香腸的第一步；1961年Deibel等發(fā)現(xiàn)片球菌可用作制作半干香腸發(fā)酵劑的菌種；1974年Everson等申請了植物乳桿菌的專利，與此同時(shí)，其他菌株如微球菌、鏈球菌以及乳酸菌與其他混合菌種發(fā)酵劑的研究與應(yīng)用也有所發(fā)展。目前應(yīng)用于肉制品上的發(fā)酵劑主要包括細(xì)菌、酵母和霉菌等。
我國地域廣闊，生態(tài)條件復(fù)雜，生產(chǎn)實(shí)踐表明，在我國傳統(tǒng)肉制品主產(chǎn)區(qū)廣泛存在著優(yōu)良的自然菌株，但由于分離篩選較為困難和對優(yōu)良菌種在生產(chǎn)中重要性的認(rèn)識(shí)程度不夠，使我國發(fā)酵肉制品乳酸菌資源研究與利用至今仍很薄弱。為此，我們系統(tǒng)地對我國的發(fā)酵肉制品微生物資源進(jìn)行考查，希望從中優(yōu)選出適合生產(chǎn)要求的菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種戊糖片球菌菌株和以該菌株制成的發(fā)酵劑，該發(fā)酵劑能應(yīng)用于肉食品的發(fā)酵生產(chǎn)過程中。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種戊糖片球菌I9菌株(Pediococcus Pentosaceus I9)，其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC No.0918將所述戊糖片球菌I9放在改良MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長晚期即獲得發(fā)酵劑。
所述改良MRS培養(yǎng)基的配制過程如下首先按下述配方配制培養(yǎng)液(單位/L)蛋白胨 10g酵母粉 5g 牛肉膏 10gMgSO4·7H2O 0.58g MnSO4·4H2O 0.25gK2HPO42g檸檬酸二銨 2g 乙酸鈉 5g 葡萄糖 20gTween80 1mL 鹽酸半胱氨酸 0.5g 番茄汁 10～20％(v/v)然后將按上述比例配好的培養(yǎng)液調(diào)pH至6.2-6.4，115℃濕熱滅菌30min。
將戊糖片球菌I9在改良MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，改良MRS培養(yǎng)基為28～32℃靜止?fàn)顟B(tài)。
本發(fā)酵劑可以應(yīng)用于肉食品發(fā)酵生產(chǎn)中，即可以在發(fā)酵肉食品生產(chǎn)過程中接種本發(fā)酵劑。
所述肉食品為發(fā)酵香腸，在灌腸前接種重量比為0.5～1％的發(fā)酵劑，在溫度20℃、相對濕度95％發(fā)酵至pH5.0；在溫度15℃、相對濕度90％繼續(xù)發(fā)酵pH4.6。
采用上述技術(shù)方案后，由于發(fā)酵劑為單菌株，避免了復(fù)合發(fā)酵劑制備的復(fù)雜性；本發(fā)酵劑在發(fā)酵適應(yīng)性方面具有優(yōu)良特性(1)耐鹽性氯化鈉在發(fā)酵香腸中的添加量通常為2.5～3.0％，而在某些類型發(fā)酵香腸，如意大利Salami中的添加量會(huì)更高一些，故篩選菌株必須有良好的食鹽耐受性，要求能夠在至少3.0％的食鹽濃度下能正常生長。經(jīng)試驗(yàn)本發(fā)酵劑菌種能耐受6.0％的食鹽溶液。
(2)耐NaNO2或NaNO3發(fā)酵香腸(干發(fā)酵香腸除外)一般添加亞硝酸鹽，添加濃度可達(dá)到150mg/Kg；而于發(fā)酵香腸通常加入硝酸鹽，添加量200～600mg/Kg，甚至更高一些。但在加工過程中，起發(fā)色和抑菌作用的主要是亞硝酸鈉，一般要求菌種至少在50mg/Kg的亞硝酸鹽濃度下能良好的生長。經(jīng)試驗(yàn)本發(fā)酵劑菌種在80～100mg/Kg濃度條件下的亞硝酸鹽溶液中仍能生長。
同時(shí)，本發(fā)酵劑發(fā)酵風(fēng)味濃郁，不產(chǎn)生異味，產(chǎn)生生物胺的量很小，發(fā)色效果良好，提高了產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)。最適溫度為28℃，在57～60℃范圍內(nèi)滅活。


圖1為細(xì)菌的分離流程圖；圖2為細(xì)菌在MRS-瓊脂培養(yǎng)基(+5％CaCO3)上產(chǎn)酸情況觀察圖；圖3為菌體形態(tài)特征觀察圖；圖4為不同菌株發(fā)酵香腸中組胺生成量對比圖；圖5為不同菌株發(fā)酵香腸中腐胺和尸胺生成量對比圖。
本發(fā)明的戊糖片球菌I9菌株(Pediococcus Pentosaceus I9)已于2003年4月8日提交中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC)予以保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No.0918。
具體實(shí)施例方式
一、發(fā)酵香腸細(xì)菌菌種篩選標(biāo)準(zhǔn)1、安全性作為發(fā)酵香腸細(xì)菌菌種，必須對人體無害，具體內(nèi)容包括①必須是革蘭氏陽性菌，無致病性，不得產(chǎn)生細(xì)菌毒素(尤其在葡萄球菌的篩選中)；②不產(chǎn)生生物胺。某些細(xì)菌有降解蛋白質(zhì)和氨基酸的能力，降解過程中的某些代謝產(chǎn)物對人體有一定的危害。其中，有些細(xì)菌具有氨基酸脫羧能力，能夠代謝氨基酸生成生物胺，生物胺(尤其是組胺)在發(fā)酵食品中含量過高時(shí)，人食用后可能會(huì)引起過敏性反應(yīng)；③不產(chǎn)生氨基甲酸乙酯(EC)。EC是自然發(fā)酵食品中一種常見的致癌物質(zhì)，它主要是由某些LAB代謝精氨酸產(chǎn)生的，通過優(yōu)良菌株的篩選能夠克服這一問題。
2、發(fā)酵適應(yīng)性(1)耐鹽性氯化鈉在發(fā)酵香腸中的添加量通常為2.5～3.0％，而在某些類型發(fā)酵香腸，如意大利Salami，中的添加量會(huì)更高一些，故篩選菌株必須有良好的食鹽耐受性，要求能夠在至少3.0％的食鹽濃度下能正常生長。
(2)耐NaNO2或NaNO3發(fā)酵香腸(干發(fā)酵香腸除外)一般添加亞硝酸鹽，添加濃度可達(dá)到150mg/Kg；而干發(fā)酵香腸通常加入硝酸鹽，添加量200～600mg/Kg，甚至更高一些。但在加工過程中，起發(fā)色和抑菌作用的主要是亞硝酸鈉，一般要求菌種至少在50mg/Kg的亞硝酸鹽濃度下能良好的生長。
(3)產(chǎn)酸特性發(fā)酵香腸在常溫下之所以有一個(gè)較長的貨架期，是因?yàn)樗陨砉逃械摹岸鸵桓摺保蚿H值、低水分及高的含鹽量。這就要求LAB能快速發(fā)酵葡萄糖或蔗糖產(chǎn)酸，這是決定發(fā)酵成功與否及發(fā)酵食品安全性的一個(gè)重要工藝條件。這項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)主要針對LAB中的桿菌和部分球菌。對于產(chǎn)酸速度比較緩慢的菌種，要求在3d內(nèi)能使發(fā)酵香腸的pH值降至5.1±0.1；而對于產(chǎn)酸速度快的菌株，能在40h左右把發(fā)酵香腸的pH值降至5.0以下。
3、發(fā)酵特性優(yōu)良發(fā)酵香腸橫切面組織結(jié)構(gòu)致密細(xì)膩，色澤呈可人的玫瑰紅色，中間脂肪乳白色或淡黃色，這些表觀現(xiàn)象均與微生物的發(fā)酵特性有關(guān)。
(1)有NO2-和NO3-還原能力肉制品的發(fā)色機(jī)理是硝酸鹽在還原細(xì)菌的作用下，還原成亞硝酸鹽，隨后與肉中乳酸發(fā)生反應(yīng)形成亞硝酸，后者分解產(chǎn)生氧化氮(NO)，NO與肌紅蛋白或血紅蛋白結(jié)合生成亞硝基肌(血)紅蛋白，使肉具有鮮艷的玫瑰紅色。由此發(fā)色機(jī)理來看，所選菌株必須具有良好的硝酸鹽還原能力。但從現(xiàn)代發(fā)酵香腸加工工藝來講，非干燥發(fā)酵香腸(最終aw在0.94～0.96之間)和半干發(fā)酵香腸(最終aw在0.90～0.95之間)的發(fā)酵成熟期短，主要添加亞硝酸鹽及發(fā)色助劑抗壞血酸鈉，對添加菌種硝酸鹽還原能力的要求不太嚴(yán)格；而干發(fā)酵香腸，兼顧發(fā)色和風(fēng)味兩方面因素，主要添加硝酸鹽，這就要求所選菌株具有良好的硝酸鹽還原能力。經(jīng)試驗(yàn)本發(fā)明發(fā)酵劑菌株在80～100mg/Kg濃度條件下的亞硝酸鹽溶液中仍能生長。
(2)接觸酶試驗(yàn)陽性亞硝基肌紅蛋白或亞硝基血紅蛋白的生成是香腸發(fā)色的主要原因，但發(fā)酵成熟過程中微生物可能形成的H2O2會(huì)導(dǎo)致香腸顏色變灰發(fā)暗。H2O2酶陽性菌株能產(chǎn)生H2O2還原酶，把生成的H2O2分解成H2O和O2。因此，如果使用單菌種發(fā)酵，此菌必須為接觸酶陽性菌株；若為復(fù)配菌種發(fā)酵，那么其中必須有接觸酶陽性菌株存在。
(3)發(fā)酵過程中不得有大量氣體產(chǎn)生，不得有粘液生成在發(fā)酵過程中，如乳酸菌異型發(fā)酵菌株，產(chǎn)生大量CO2，會(huì)影響到香腸的結(jié)構(gòu)致密性；而且某些菌類的代謝產(chǎn)物中有粘液狀物質(zhì)，同樣也會(huì)損壞香腸的內(nèi)部組織狀態(tài)。在菌株的篩選中，這些標(biāo)準(zhǔn)必須考慮。
(4)所選菌種在其生長代謝過程中能使香腸產(chǎn)生良好的發(fā)酵風(fēng)味發(fā)酵香腸的風(fēng)味組成非常復(fù)雜，它包括揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分。從目前的研究來看，發(fā)酵香腸的風(fēng)味形成涉及到脂肪、蛋白質(zhì)的降解和氨基酸的異化等。微球菌和葡萄球菌是風(fēng)味物質(zhì)形成的主要菌系，但有些LAB如片球菌屬細(xì)菌也有類似特性。微球菌或葡萄球菌分泌脂肪酶，切裂大分子脂肪為短鏈或支鏈的脂肪酸；分泌蛋白酶，降解蛋白質(zhì)成各種肽和氨基酸，氨基酸又進(jìn)一步被其對應(yīng)的酶類異化為各種醛或酮類風(fēng)味物質(zhì)。此外，在微生物代謝過程中還可能會(huì)產(chǎn)生具有不良?xì)馕兜拇x產(chǎn)物，如H2S。鑒于以上分析，篩選的微球菌或葡萄球菌的應(yīng)具有以下特征①能降解脂肪；②能分解蛋白質(zhì)；③能異化氨基酸；④不產(chǎn)生影響風(fēng)味的不良物質(zhì)。
4、具有抗冷凍干燥特性肉制品發(fā)酵劑生產(chǎn)一般采用真空冷凍干燥法，因此要求優(yōu)選菌株必須有較強(qiáng)地抗冷凍干燥能力。主要表現(xiàn)在①在最佳培養(yǎng)條件下具有較大生物量(菌密度＞109cfu/ml)；②凍干后具有較高的存活率。雖然影響存活率的因素很多(保護(hù)劑、凍干工藝等)，但不同菌株間抗冷凍干燥的能力還是存在很大的差異；③凍干菌種的活力能夠保持較長時(shí)間。一般要求凍干菌粉在存放一年后活菌數(shù)不低于109cfu/g。
二、菌株分離本菌株分離培養(yǎng)基分離采用MRS-瓊脂、改良MRS-瓊脂、MSA-瓊脂等固體培養(yǎng)基；活化采用MRS液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配方如下(1L)(1)MRS培養(yǎng)基酵母浸出物4g，牛肉膏8g，細(xì)菌蛋白胨10g，葡萄糖20g，檸檬酸鈉2g，醋酸鈉5g/L，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O0.05g，Tween80 1mL，用400mL蒸餾水溶解。另外，用500mL蒸餾水溶解20g瓊脂，在沸水浴中完全溶解后，加入上述溶液，定容至1000mL，用1M的NaOH或1M HCl調(diào)整pH至5.0。121℃滅菌15min。
(2)改良MRS培養(yǎng)基配方蛋白胨10g；酵母粉5g；MgSO4·7H2O 0.58g；MnSO4·4H2O 0.25g；牛肉膏10g；K2HPO42g；檸檬酸二銨2g；乙酸鈉5g；葡萄糖20g；Tween80 1mL；番茄汁10％(v/v)；鹽酸半胱氨酸0.5g/L；調(diào)pH至6.2-6.4，115℃濕熱滅菌30min。
(3)MSA培養(yǎng)基牛肉膏1g，細(xì)菌蛋白胨10g，D-甘露醇10g，NaCI75g，酚紅0.025g，用400mL蒸餾水溶解(酚紅除外)，用1M HCl或NaOH調(diào)pH至7.4±0.2；加1％的酚紅溶液2.5ml，混勻；另外，用500mL蒸餾水溶解20g瓊脂，在沸水浴中完全溶解后，加入上述溶液，定容至1000mL。121℃滅菌15min。
采用平板劃線法對自然發(fā)酵肉制品(火腿和臘腸)中的乳酸細(xì)菌進(jìn)行分離。取25g樣品與225ml生理鹽水于無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器Bagmixer均質(zhì)120sec(臘腸)或210sec(火腿)。吸取0.1ml的酒樣在分離培養(yǎng)基上劃線，30℃條件下培養(yǎng)2d后觀測菌落形成情況，經(jīng)多次劃線分離，直到獲得純菌落。分離流程如圖1所示。
菌密度的測定采用平板計(jì)數(shù)法，計(jì)數(shù)結(jié)果并換算成菌落形成單位(cfu/mL)，每個(gè)培養(yǎng)試驗(yàn)均重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。乳酸測定采用氣相色譜法。pH值及總酸的測定按GB方法進(jìn)行。生活力測定按最大菌密度法。具有硝酸鹽或亞硝酸鹽還原能力按《工業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(杜連祥編著)進(jìn)行。H2O2酶活性測定按《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》(范秀蓉編著)進(jìn)行操作。食鹽耐受性測試是把測試菌接種于pH4.5的MRS液體培養(yǎng)基，觀察其生長狀況；食鹽耐受性的測定同乳酸耐受性的測定。氣體及黏液產(chǎn)生狀況研究是否有氣體產(chǎn)生采用半固體軟瓊脂柱法；是否有黏液產(chǎn)生可直接從挑起菌落的狀態(tài)進(jìn)行觀察。
采用PCR方法對分離株I9的16SrRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR采用原核生物通用引物27f(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1541R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)。PCR反應(yīng)條件反應(yīng)混合物總體積為50μl，內(nèi)含2.5mM Mg2+，20mM Tris-HCl(pH9.0)，0.1％Triton-100(v/v)，100μM的dNTP，2.5UTaqDNA聚合酶，300ng的模板DNA，40pmol的引物，用25μl礦物油覆蓋并加蓋。PCR反應(yīng)進(jìn)行前，DNA模板94℃變性5min，隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性1min，52℃復(fù)性2min，72℃延伸3min，最后一個(gè)循環(huán)在72℃延伸2-3h。PCR反應(yīng)在Thermolyne AmplitronI(Barnstead Thermolyne Corporation)中進(jìn)行。
三、菌株16SrRNA測序及以該菌株為菌種制成的發(fā)酵劑PCR產(chǎn)物電泳純化后，聯(lián)結(jié)在質(zhì)粒pSK-T中，攜帶有16SrRNA的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH5α中，然后在含氨卞青霉素Ap/IPTG/X-gal的平板上篩選白斑，用堿解法提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切后用聚乙二醇純化產(chǎn)物。16SrRNA的測序由中國科學(xué)院微生物研究所完成，用BLAST軟件將測定序列與GenBank中的16SrRNA序列進(jìn)行同源性分析比較。
1、主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備手提式高壓滅菌鍋，101C型電熱鼓風(fēng)干燥箱，JA3003電子天平，DMB5-5數(shù)碼顯微鏡，Ph/ORH酸度離子計(jì)，厭氧操作培養(yǎng)箱，YJ超凈工作臺(tái)，微量移液器(上海求精)，BS-2F振蕩培養(yǎng)箱，pHB5型酸度計(jì)，超低溫冰箱，Lyostar真空冷凍干燥機(jī)，GM-21低溫高速離心機(jī)，BS-2F恒溫培養(yǎng)箱，自動(dòng)發(fā)酵室。
2、菌種鑒定個(gè)體形態(tài)特征、菌落形態(tài)特征、Gram染色、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、對不同脅迫環(huán)境的耐受性以及其他生理生化特征的測定按凌代文主編的“乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法”和Holt J G，Krieg N R and Snath P H A，et al.Bergey’smanual of determinative bacteriology(9thedition).BatimoreWilliams & Wilkins，1993兩部參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行；菌種鑒定按Holt J G，Krieg N R and Snath P HA，et al.Bergey’s manual of determinative bacteriology(9thedition).BatimoreWilliams & Wilkins，1993進(jìn)行。
3、結(jié)果與分析3.1、發(fā)酵微生物的分離結(jié)果篩選優(yōu)良肉制品發(fā)酵菌株，應(yīng)根據(jù)菌種的發(fā)酵特性，結(jié)合產(chǎn)品特點(diǎn)對菌株進(jìn)行篩選。優(yōu)選菌株發(fā)酵特性研究的主要內(nèi)容包括①食鹽耐受性(＞3％的食鹽溶液)；②亞硝酸鹽耐受性(在80-100mg/Kg濃度條件下仍能生長)；③能在27-43℃范圍內(nèi)生長，最適溫度為30～32℃；④發(fā)酵副產(chǎn)物不產(chǎn)生異味；⑤無致病性；⑥產(chǎn)組胺量要小。
3.2、菌種分離本實(shí)驗(yàn)從金華火腿、國外發(fā)酵火腿、國外肉制品發(fā)酵劑、從DSM C型和Yogurt type II型牛奶發(fā)酵劑等生境中共分離得到120余株乳酸菌，分離結(jié)果如下
(1)從金華火腿中分離29株以無菌操作取金華火腿適量，加滅菌生理鹽水，均質(zhì)，吸取上清液作梯度稀釋，傾注平板培養(yǎng)。依據(jù)菌落特征，逐一挑取單菌落，以平板劃線兩次純化，之后轉(zhuǎn)接斜面，4℃保藏，備用。
(2)從國外發(fā)酵火腿中分離29株以無菌操作取金華火腿適量，加滅菌生理鹽水，均質(zhì)，吸取上清液作梯度稀釋，傾注平板培養(yǎng)。依據(jù)菌落特征，逐一挑取單菌落，以平板劃線兩次純化，之后轉(zhuǎn)接斜面，4℃保藏，備用。
(3)從國外肉制品發(fā)酵劑中分離12株以無菌操作取發(fā)酵劑適量，加滅菌生理鹽水梯度稀釋，傾注平板培養(yǎng)。依據(jù)菌落特征，逐一挑取單菌落，以平板劃線兩次純化，之后轉(zhuǎn)接斜面，4℃保藏，備用。
(4)從DSM C型和Yogurt type II型牛奶發(fā)酵劑中分離共11株以無菌操作取發(fā)酵劑適量，加滅菌生理鹽水梯度稀釋，傾注平板培養(yǎng)。依據(jù)菌落特征，逐一挑取單菌落，以平板劃線二次純化，之后轉(zhuǎn)接斜面，4℃保藏，備用。
另外，從其他發(fā)酵肉制品樣品中分離得到42株分離物。
3.3、菌株鑒定3.3.1、I9的鑒定(1)形態(tài)學(xué)特征固體培養(yǎng)特征在30℃條件下培養(yǎng)2d后，I9在MRS+5％CaCO3固體培養(yǎng)基上形成明顯的透明圈，表面光滑濕潤，如圖2所示。
細(xì)胞形態(tài)特征I9菌株革蘭氏染色陽性，經(jīng)亞甲藍(lán)單染色后與光學(xué)顯微鏡(1600×)下觀察，細(xì)胞球狀，四聯(lián)或成片狀排列，細(xì)胞直徑約1μm，如圖3所示。
液體培養(yǎng)特征 在無菌條件下，用接種針挑取1個(gè)菌落于澄清的MRS液體培養(yǎng)基中30℃靜止培養(yǎng)，細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長緩慢而均勻，達(dá)到最大渾濁度后，菌體逐漸沉淀到培養(yǎng)基的底部，菌體呈白色。
(2)生理生化特征表1分離菌株I9的表型特征

根據(jù)I9細(xì)菌表型特征和生理生化特點(diǎn)(表1)，按照Bergey’s細(xì)菌鑒定手冊有關(guān)乳酸菌的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，初步可以將I9歸類為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。
(3)I9的16SrRNA測序分析通過對分離菌株的16SrRNA序列(長度1477bp)與GenBank基因庫中所有已知序列進(jìn)行了同源性比較，結(jié)果顯示分離株I9與戊糖片球菌(P.pentosaceus)具有高度的同源性(99％)。這從分子系統(tǒng)學(xué)角度證實(shí)分離株I9為戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，結(jié)果如下CATGCAAGTCGAACGAACTTCCGTTAATTGATTATGACGTACTTGTACTGATTGAGATTTTAACACGAAGTGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAGAAGTAGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGTATAACAGAGAAAACCGCATGGTTTTCTTTTAAAAGATGGCTCTGCTATCACTTCTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCAGTGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGGTTAAGAAGAACGTGGGTAAGAGAACTGGTTACCCAGTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTAATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATTGGAAACTGGGA
GACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGATTACTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAAGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGACAGTCTAAGAGATTAGAGGTTCCCTTCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAGACCGCGAGGTTAAGCTAATCTCTTAAACCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAGCTAGCCGTCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTC將上述戊糖片球菌I9放在改良MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長晚期即獲得發(fā)酵劑。
所述改良MRS培養(yǎng)基可按如下比例配制首先按下述配方配制培養(yǎng)液(單位/L)蛋白胨 10g酵母粉 5g 牛肉膏 10gMgSO4·7H2O 0.58g MnSO4·4H2O 0.25gK2HPO42g檸檬酸二銨 2g 乙酸鈉 5g 葡萄糖 20gTween80 1mL 鹽酸半胱氨酸 0.5g 番茄汁 10％(v/v)然后將按上述比例配好的培養(yǎng)液調(diào)pH至6.4，115℃濕熱滅菌30min。戊糖片球菌I9在改良MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，改良MRS培養(yǎng)基為30℃靜止?fàn)顟B(tài)。
在配制上述改良MRS培養(yǎng)基時(shí)，番茄汁也可按15％(v/v)的比例配制，并將按此比例配制的培養(yǎng)液調(diào)PH至6.3，115℃濕熱滅菌30min。戊糖片球菌I9在改良MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，改良MRS培養(yǎng)基為28℃靜止?fàn)顟B(tài)。
在配制上述改良MRS培養(yǎng)基時(shí)，番茄汁還可按20％(v/v)的比例配制，并將按此比例配制的培養(yǎng)液調(diào)PH至6.2，115℃濕熱滅菌30min。戊糖片球菌I9在改良MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，改良MRS培養(yǎng)基為32℃靜止?fàn)顟B(tài)。
四、該菌株制成的發(fā)酵劑在肉食品中的應(yīng)用在發(fā)酵肉食品生產(chǎn)過程中可接種本發(fā)明的發(fā)酵劑。如在發(fā)酵香腸的生產(chǎn)過程中，在灌腸前接種重量比為0.5％的發(fā)酵劑，在溫度20℃、相對濕度95％發(fā)酵至pH5.0；在溫度15℃、相對濕度90％繼續(xù)發(fā)酵至pH4.6，發(fā)酵后在溫度14℃，相對濕度70％～80％下進(jìn)行熟化。本發(fā)明的發(fā)酵劑發(fā)酵力適中，發(fā)酵進(jìn)程平緩，酸味柔和，產(chǎn)品成熟后發(fā)酵香氣濃郁，發(fā)色好，產(chǎn)品切片性良好。
在發(fā)酵香腸的生產(chǎn)過程中，也可按0.8％、1％或0.5％～1％之間的任意比例接種發(fā)酵劑。
發(fā)酵劑使用戊糖片球菌I9(Pediococcus pentosaceus I9)單菌種發(fā)酵劑。發(fā)酵香腸工藝流程第一步切肉、預(yù)凍(-18℃，24h)；第二步斬拌混合；第三步接種發(fā)酵劑(107個(gè)/g)；第四步灌腸；第五步發(fā)酵(溫度20℃、相對濕度95％發(fā)酵至pH5.0；溫度15℃、相對濕度90％繼續(xù)發(fā)酵至pH4.6)；第六步成熟(溫度14℃，相對濕度為70％-80％)。不添加香辛料。
在發(fā)酵食品如發(fā)酵香腸、酸奶、泡菜及葡萄酒中，大都含有生物胺。胺在生活細(xì)胞中具有重要的生理功能，但當(dāng)人體吸收過量時(shí)，可能會(huì)引起頭痛、呼吸紊亂、心悸、血壓變化等過敏性反應(yīng)。此外，生物胺還是亞硝胺的前體，后者具有致癌效應(yīng)。Vandekerckhove(1977)曾報(bào)道在老化的和霉菌成熟型的發(fā)酵香腸中，生物胺的含量可達(dá)100mg/Kg，有時(shí)甚至高達(dá)1000mg/Kg，因此，近年來，發(fā)酵食品中的生物胺含量問題已引起了人們的重視。
發(fā)酵香腸中生物胺是由氨基酸脫羧而產(chǎn)生的。其生成量取決于原料肉組織酶和微生物酶活力以及生物胺前體物(氨基酸、寡肽)的豐度。通過采用優(yōu)質(zhì)的新鮮生肉、適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵劑和合理的發(fā)酵工藝，可以降低產(chǎn)品中的生物胺產(chǎn)量。其中，發(fā)酵劑菌種的相關(guān)氨基酸脫羧酶活性直接影響著產(chǎn)品中生物胺的含量，因?yàn)樯a(chǎn)發(fā)酵香腸所使用的乳酸菌如乳桿菌、片球菌和微球菌等的大多數(shù)菌株具有對相關(guān)氨基酸脫羧能力，因而能夠在發(fā)酵過程中產(chǎn)生生物胺。通過篩選氨基酸脫羧酶活性低或無脫羧酶活性的突變株對于降低發(fā)酵香腸中的生物胺含量具有重要的意義。通過對本發(fā)明優(yōu)選菌株的生物胺產(chǎn)生特性分析，以考查其在生產(chǎn)上的利用價(jià)值。
1、生物胺的測定生物胺(組胺、尸胺、腐胺、酪胺、亞精胺、精胺和色胺)的測定采用反相離子對柱后衍生法。
高效液相色譜儀日本島津LC10A型；色譜柱C18反相柱(DISCOVERY)；離子對試劑辛烷磺酸鈉；流動(dòng)相10mmol/L辛烷磺酸鈉、0.1mol/L乙酸鈉溶液和乙腈；衍生液0.1鄰苯二甲醛溶液；激發(fā)波長340nm；發(fā)射波長440nm；流動(dòng)相流速1.0ml/min；衍生液流速0.5ml/min。
取適量樣品用0.6mol/L的高氯酸提取后上機(jī)分析。
2、結(jié)果與分析2.1、不同菌株的組胺生成量組胺是發(fā)酵香腸中最重要的生物胺成分之一，由組氨酸脫羧而成。在生物胺中，組胺的生理毒性最強(qiáng)。生物胺在人體細(xì)胞內(nèi)會(huì)被一些酶促代謝反應(yīng)降解，但是酒精和有些藥物能抑制這些酶的活性，從而降低了脫毒效率。長期以來，研究者們認(rèn)為只有Pediococcus屬細(xì)菌能夠產(chǎn)生組胺，但研究表明，乳桿菌屬(Lactobacillus)和葡萄酒菌屬(Staphylococcus)的一些菌株也有組氨酸脫羧酶(histidine decarboxylase，HDC)活性，因此也能產(chǎn)生組胺。
從圖4能夠看出，所有的供試菌株均能在發(fā)酵過程中產(chǎn)生組胺，但含量隨著菌株的不同而異，即存在著菌株效應(yīng)。L.sake 54的組胺產(chǎn)生量最高，達(dá)1.98mg/Kg，而L.pentosus R1的生成量最低，為0.831.98mg/Kg，P.pentosaceusI9和P.parvus M7的組胺產(chǎn)量也高于對照。
2.2不同菌株的腐胺和尸胺生成量賴氨酸脫羧基作用生成尸胺，精胺酸脫羧基作用生成腐胺。與組胺的生理作用相似，尸胺和腐胺也有升血壓的作用，同時(shí)具有較強(qiáng)的生理毒性，二者更是水產(chǎn)品和肉制品腐敗變質(zhì)的特征產(chǎn)物。圖5表明，供試的4株菌株都能在發(fā)酵過程中產(chǎn)生不等量的尸胺和腐胺，所有的菌株產(chǎn)生的尸胺量都比腐胺量高，而且存在著菌株效應(yīng)。與對照(BactofermTMF-1)相比，乳桿菌(L.sake 54和L.pentosus R1)產(chǎn)生的腐胺比片球菌(P.pentosaceus I9和P.parvus M7)的相對要低。
本實(shí)驗(yàn)還對發(fā)酵香腸中的酪胺、亞精胺、精胺和色胺的含量進(jìn)行了測定，研究表明(表2)，所有菌株都能產(chǎn)生酪胺、亞精胺和精胺，但都不產(chǎn)生色胺。這表明，供試菌株都沒有色氨酸脫羧酶活性。
表2不同菌株發(fā)酵香腸中其他種類生物胺含量Table1 Other Biogenic amines in fermented sausage with different strains生物胺含量(mg/Kg)菌株酪胺亞精胺 精胺色胺P.pentosaceus I9 8.412.604.03未檢出L.sake 54 9.282.513.89未檢出L.pentosus R1 5.922.293.29未檢出P.parvus M76.182.023.88未檢出BactofermTMF-1 5.243.273.50未檢出2.3菌株復(fù)配對生物胺生成量的影響發(fā)酵香腸生產(chǎn)中通常使用的發(fā)酵劑大多為2種或兩種以上的菌株復(fù)配復(fù)配而成的發(fā)酵劑。發(fā)酵劑中各單個(gè)菌株間實(shí)際上可以看作是一種特殊的互生關(guān)系。一般而言，發(fā)酵劑中的乳酸菌如乳桿菌(Lactobacillus)、片球菌(Pediococcus)的作用主要是在較短的時(shí)間內(nèi)將香腸的pH降至5.0以下，以抑制其他有害微生物的生長。而與之互生的葡萄球菌(Staphylococcus)、微球菌(Micrococcus)主要與香腸的風(fēng)味形成有密切關(guān)系。在香腸發(fā)酵基質(zhì)中，各組分菌株可以單獨(dú)生活，但當(dāng)它們在同一基質(zhì)中生長時(shí)，又能夠通過各自的代謝活動(dòng)而影響對方的代謝行為。表3表明，戊糖片球菌I9和木糖葡萄球菌I2復(fù)配后，能夠顯著降低發(fā)酵香腸中生物胺含量。其中，組胺的含量從1.42mg/Kg降到不能檢出，腐胺和酪胺的含量也有明顯的降低。此外，I9和I2復(fù)配發(fā)酵劑發(fā)酵產(chǎn)生的生物胺總量也低于I9單菌種發(fā)酵和商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵產(chǎn)生的生物胺總量。
表3菌株復(fù)配對發(fā)酵香腸中生物胺含量的影響Table1 Effecf of coculture Starter on Biogenic amine content in fermented sausage生物胺含量(mg/Kg)生物胺總量菌株組胺 腐胺 尸胺酪胺 亞精胺 精胺色胺 (mg/Kg)P.pentosaceus I9 1.42 3.85 7.908.41 2.60 4.03未檢出 28.21P.pentosaceus I9+S.xylosus I2 未檢出1.53 7.203.14 2.61 3.45未檢出 17.93BactofermTMF-1 0.89 2.72 8.255.24 3.27 3.50未檢出 23.87注P.pentosaceus I9和S.xylosus I2的復(fù)配比例為1∶13.結(jié)論與討論由于酶和細(xì)菌的作用，肉中蛋白質(zhì)、脂肪及糖類發(fā)生分解變化而腐敗變質(zhì)。在肉品腐敗過程中，蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生氨(NH3)和胺類(R-NH2)等堿性含氮的有毒物質(zhì)如酪胺、組胺、尸胺、腐胺和色胺等，它們統(tǒng)稱為有毒胺。有毒胺具有一定的毒性，可引起食物中毒。如酪胺能引起血管收縮，組胺能使血管擴(kuò)張，尸胺、腐胺等也能引起明顯的中毒反應(yīng)，因此，在發(fā)酵香腸產(chǎn)生中要通過篩選優(yōu)良的發(fā)酵劑和工藝措施來降低產(chǎn)品中生物胺的含量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在香腸發(fā)酵過程中，所有供試菌株與商業(yè)發(fā)酵劑都能產(chǎn)生組胺、腐胺、尸胺、酪胺、亞精胺和精胺，但都不產(chǎn)生色胺，各供試菌株生物胺的生成量存在著菌株效應(yīng)。將片球菌與葡萄球菌復(fù)配制得的復(fù)合型發(fā)酵劑接種發(fā)酵，能夠顯著降低產(chǎn)品中生物胺總量尤其是組胺、腐胺和酪胺的含量。本研究結(jié)果也為篩選優(yōu)良生產(chǎn)性能而且生物胺生產(chǎn)量低的自然菌株提供了參考依據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種戊糖片球菌I9菌株(Pediococcus Pentosaceus I9)，其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCCNo.0918。
2.一種以權(quán)利要求1所述戊糖片球菌菌株制成的發(fā)酵劑，其特征在于將所述戊糖片球菌I9放在改良MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長晚期即獲得發(fā)酵劑。
3.如權(quán)利要求2所述的發(fā)酵劑，其特征在于所述改良MRS培養(yǎng)基的配制過程如下首先按下述配方配制培養(yǎng)液(單位/L)蛋白胨10g 酵母粉5g 牛肉膏10gMgSO4·7H2O 0.58g MnSO4·4H2O 0.25g K2HPO42g檸檬酸二銨2g 乙酸鈉5g 葡萄糖20gTween80 1mL 鹽酸半胱氨酸0.5g 番茄汁10～20％(v/v)然后將按上述比例配好的培養(yǎng)液調(diào)pH至6.2-6.4，115℃濕熱滅菌30min。
4.如權(quán)利要求2或3所述的發(fā)酵劑，其特征在于將戊糖片球菌I9在改良MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，改良MRS培養(yǎng)基為28～32℃靜止?fàn)顟B(tài)。
5.權(quán)利要求2所述的發(fā)酵劑在肉食品中的應(yīng)用，其特征在于在發(fā)酵肉食品生產(chǎn)過程中接種本發(fā)酵劑。
6.如權(quán)利要求5所述的發(fā)酵劑在肉食品中的應(yīng)用，其特征在于所述肉食品為發(fā)酵香腸，在灌腸前接種重量比為0.5～1％的發(fā)酵劑，在溫度20℃、相對濕度95％發(fā)酵至pH5.0；在溫度15℃、相對濕度90％繼續(xù)發(fā)酵至pH4.6。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種戊糖片球菌菌株和以該菌株制成的發(fā)酵劑，本發(fā)明的戊糖片球菌I9菌株(Pediococcus Pentosaceus I9)在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC No.0918。本發(fā)明戊糖片球菌I9菌株能耐受6.0％的食鹽溶液和80～100mg/Kg濃度條件下的亞硝酸鹽溶液，以其為菌種制成的發(fā)酵劑可以應(yīng)用于肉食品的發(fā)酵生產(chǎn)中，制作出的發(fā)酵香腸發(fā)酵風(fēng)味濃郁，不產(chǎn)生異味，產(chǎn)生生物胺的量很小，發(fā)色效果良好，提高了產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)。最適溫度為28℃，在57～60℃范圍內(nèi)滅活。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1566324SQ0312622
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月26日
發(fā)明者李紅偉, 張春暉, 王玉芬 申請人:河南雙匯投資發(fā)展股份有限公司