專利名稱：快速檢測非典型性肺炎病毒的單堿基多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類醫(yī)學(xué)衛(wèi)生領(lǐng)域，尤其涉及一種快速檢測非典型性肺炎病毒的單堿基多態(tài)性的方法。
背景技術(shù)：
非典型性肺炎病毒，即SARS病毒是一種引起嚴(yán)重急性呼吸道疾病綜合癥(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，又稱非典型性肺炎的病毒，屬冠狀病毒(coronavirus)類病毒，基因組共含29，737個核苷酸。該病首先于2002年11月在中國廣東省發(fā)現(xiàn)，隨后迅速擴散到東南亞和世界上25個國家，造成多人感染，嚴(yán)重時可致人于死。我們根據(jù)該病毒的基因組序列分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了多個單堿基多態(tài)性位點(single-nucleotide polymorphism，SNP)，這些位點在不同來源的菌株中具有不同的基因序列，即具有多態(tài)性。這對于病毒菌株的鑒定，確定不同菌株間的遺傳從屬關(guān)系，判斷病原體的來源，以及指導(dǎo)臨床治療都具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是一種快速檢測非典型性肺炎病毒的單堿基多態(tài)性的方法。
區(qū)別非典型性肺炎病毒類別的方法的步驟如下1)分離并純化樣品1，樣品2的非典型性肺炎病毒顆粒，并提取RNA；2)逆轉(zhuǎn)錄RNA，采用PCR技術(shù)，設(shè)計相應(yīng)的引物，擴增單堿基多態(tài)性(single-nucleotide polymorphism，SNP)位點周圍150-1000核苷酸長度的片斷；3)測定樣品的單堿基多態(tài)的基因型，進一步測定樣品的單體型(Haplotype)類型；4)比較兩個樣品的單體型類型，判斷菌株的差異情況。
判定不同非典型性肺炎病毒菌株間遺傳進化從屬關(guān)系方法的步驟如下1)分離并純化不同類群的非典型性肺炎病毒顆粒，并提取RNA。
2)逆轉(zhuǎn)錄RNA，采用PCR技術(shù)擴增單堿基多態(tài)性(single-nucleotidepolymorphism，SNP)位點周圍200-800核苷酸長度的片斷。
3)測定樣品的單堿基多態(tài)的基因型，進一步測定樣品的單體型(Haplotype)類型，統(tǒng)計樣品的單體型(Haplotype)類型的頻率，計算判別函數(shù)系數(shù)(discriminant function coefficient)。
4)推算各病毒菌株間的遺傳從屬關(guān)系。
本發(fā)明的有益效果是解決了臨床對非典型性肺炎病毒類別的區(qū)別問題，為臨床檢測本病提供判斷病毒類型和分析傳染源的方法和試劑盒。


附圖是非典型性肺炎病毒基因組單堿基多態(tài)性位點測序結(jié)果示意圖，圖中垂直黑線處指示單堿基多肽位點。
具體實施例方式
本發(fā)明選取非典型性肺炎病毒基因組中具有單堿基多態(tài)性的核酸序列區(qū)，提供一種可用于臨床快速鑒定非典型性肺炎病毒類型，分析不同病毒菌株間遺傳從屬關(guān)系的方法。
1、分離并純化不同類群的非典型性肺炎病毒顆粒，方法采用一般實驗室的常規(guī)方法，并提取RNA，RNA提取方法可采用普通分子生物學(xué)實驗手冊，如《Molecular clongingA Laboratory manual，2nd edition》(Sambrook，1989)介紹的方法，也可以采用商業(yè)試劑盒，如TrizolR，按說明書進行。
本發(fā)明采用如下試驗步驟1)、取可疑病人的血清、分泌物或組織，加入PBS緩沖液50μl、溶液D160μl、酚160μl、氯仿32μl和4.0M(PH＝3.8)醋酸鈉9μl。
溶液D含2.5克異硫氰酸胍、1.76毫升0.75M的檸檬酸鈉(PH7.0)、2.46毫升10％的十二烷基肌酸鈉，加水29.3毫升，使用前加入7.2μl/ml的巰基乙醇。
2)、振搖混合液15秒，冰上放置15分鐘。
3)、14000rpm，4℃離心20分鐘。
4)、取上清，加入等體積的異丙醇，冰上放置25分鐘。
5)、4℃，14000rpm離心20-30分鐘。
6)、沉淀用-20℃預(yù)冷的乙醇洗兩次，真空抽干，溶于DEPC水中。
2、逆轉(zhuǎn)錄RNA，采用PCR技術(shù)，設(shè)計相應(yīng)的引物，擴增單堿基多態(tài)性位點周圍200-800核苷酸長度的片斷。可采用普通分子生物學(xué)實驗手冊，如《Molecular clongingA Laboratory manual，2nd edition》(Sambrook，1989)介紹的方法，也可以采用商業(yè)試劑盒，如Invitrogen公司的SuperScriptt試劑盒，按說明書進行逆轉(zhuǎn)錄RNA，采用Perkin-Elmer公司的Amplitaq試劑盒進行PCR擴增，PCR反應(yīng)的參數(shù)為94℃。變性15秒；58℃。退火15秒；72℃延伸20秒，循環(huán)35次；循環(huán)擴增反應(yīng)以94℃。熱啟動1分鐘和以72℃延伸2分鐘結(jié)束。反應(yīng)在Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 9600 thermal cycler.上進行。
3、并測序相應(yīng)的擴增片斷使用本領(lǐng)域周知的實驗技術(shù)克隆PCR擴增的片斷，包括純化PCR產(chǎn)物，連接到載體上，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，提取模板，自動化測序儀測序。以上步驟均可在相關(guān)的實驗手冊中查到，如《Molecular clongingA Laboratory manual，2nd edition》(Sambrook，1989)。以pUC18為載體，采用MegaBase1000(Amersham Pharmacia Biotech)毛細(xì)管測序儀測序。
4、析測序結(jié)果，確定被測菌株的基因型和單體型，比較不同菌株間的基因型和單體型的差異，計算判別函數(shù)系數(shù)，推算各病毒菌株間的遺傳從屬關(guān)系。
本發(fā)明分離的DNA片斷位于附表1所示的非典型性肺炎病毒基因組多態(tài)區(qū)域。非典型性肺炎病毒基因組數(shù)據(jù)可從以下網(wǎng)址獲得http//www.cdc.gov/ncidod/sars/sequence.htm，分離的DNA片斷具有至少0.5％的多態(tài)性。
區(qū)別非典型性肺炎病毒類別和判定不同非典型性肺炎病毒菌株間遺傳進化從屬關(guān)系的檢測試劑盒；包括所述方法中涉及的有關(guān)試劑和使用說明書。
附表1非典型性肺炎病毒基因組單堿基多態(tài)性位點及堿基多態(tài)類型和氨基酸多態(tài)類型


權(quán)利要求
1.一種快速檢測非典型性肺炎病毒的單堿基多態(tài)性的方法，其特征在于區(qū)別非典型性肺炎病毒類別方法的步驟如下1)分離并純化樣品1，樣品2的非典型性肺炎病毒顆粒，并提取RNA；2)逆轉(zhuǎn)錄RNA，采用PCR技術(shù)，設(shè)計相應(yīng)的引物，擴增單堿基多態(tài)性位點周圍150-1000核苷酸長度的片斷；3)測定樣品的單堿基多態(tài)的基因型，進一步測定樣品的單體型類型；4)比較兩個樣品的單體型類型，判斷菌株的差異情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測非典型性肺炎病毒的單堿基多態(tài)性的方法，其特征在于分離的DNA片斷具有至少0.5％的多態(tài)性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測非典型性肺炎病毒的單堿基多態(tài)性的方法，其特征在于分離的DNA片斷位于附表1所示的非典型性肺炎病毒基因組多態(tài)區(qū)域。
4.一種快速檢測非典型性肺炎病毒的單堿基多態(tài)性的方法，其特征在于判定不同非典型性肺炎病毒菌株間遺傳進化從屬關(guān)系的方法的步驟如下1)分離并純化不同類群的非典型性肺炎病毒顆粒，并提取RNA；2)逆轉(zhuǎn)錄RNA，采用PCR技術(shù)擴增單堿基多態(tài)性位點周圍200-800核苷酸長度的片斷；3)測定樣品的單堿基多態(tài)的基因型，進一步測定樣品的單體型類型，統(tǒng)計樣品的單體型類型的頻率，計算判別函數(shù)系數(shù)；4)計算各病毒菌株間的遺傳從屬關(guān)系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測非典型性肺炎病毒的單堿基多態(tài)性的方法。根據(jù)非典型性肺炎病毒基因組單堿基多態(tài)性的的特征分析，選取病毒基因組多態(tài)性的區(qū)域，又根據(jù)該病毒是核糖核酸病毒的特點，利用特定的引物序列、采用RT－PCR和PCR相關(guān)的試劑與技術(shù)，建立了一套快速檢測非典型性肺炎病毒的單堿基多態(tài)性，區(qū)別非典型性肺炎病毒類別的方法。本發(fā)明的有益效果是解決了臨床對非典型性肺炎病毒類別的區(qū)別問題，為臨床檢測本病提供判斷病毒類型和分析傳染源的方法和試劑盒。
文檔編號C12Q1/04GK1528915SQ03116660
公開日2004年9月15日 申請日期2003年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月26日
發(fā)明者汪建, 王俊, 李蔚, 胡詠武, 吳清發(fā), 呂宏, 鐘蘭, 于軍, 楊煥明, 汪 建 申請人:杭州華大基因研發(fā)中心