專利名稱：輻射誘導提高耐輻射球菌超氧化物歧化酶產(chǎn)量的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種輻射誘導提高耐輻射球菌超氧化物歧化酶產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(SOD)是生物體中一種重要的抗氧化酶，SOD的生理作用是將超氧陰離子自由基通過歧化反應生成過氧化氫和氧分子，防止超氧陰離子自由基o2-對機體中生物大分子的氧化損傷。SOD主要應用于延緩人體衰老、防止紫外線輻射引起的色素沉著，清除局部炎癥等醫(yī)藥、保健品、化妝品方面。
目前，SOD的制備主要有三種來源①動物(牛馬血液)中的超氧化物歧化酶；②植物(如茶葉、甘藍)來源的SOD；③微生物來源的SOD。目前市場上的SOD多用動物血液為制備原料，而動物性來源的SOD可能帶有病原體的危險，如歐洲流行的瘋牛病。與動植物SOD制備方法相比較，微生物SOD的制備具有原料生物體生長周期短，發(fā)酵生產(chǎn)規(guī)模較大，提取成本較低的優(yōu)點。因此，微生物發(fā)酵制備SOD具有重要的應用前景和實際意義。目前國內(nèi)外應用于SOD研究的微生物是酵母菌、乳酸菌和芽孢桿菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種輻射誘導提高耐輻射球菌超氧化物歧化酶產(chǎn)量的方法。本發(fā)明中耐輻射球菌的菌株分類為Deinococcus radiodurans，保藏號為ATCC NO.13939，菌種編號為R1。
它的步驟如下1)菌種的活化將耐輻射球菌劃線接種于TGY固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基組成為蛋白胨5g/L，酵母提取物3g/L，葡萄糖1g/L，30-32℃培養(yǎng)45-48h，挑取單菌落接種于三角瓶中搖瓶培養(yǎng)至對數(shù)生長期；2)發(fā)酵培養(yǎng)條件將液體種子按3-5％接種量，接入發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，30-32℃培養(yǎng)；3)SOD的輻射誘導條件①菌體輻射誘導時期的選擇菌體生長到38-42h，即穩(wěn)定早期，菌濃度＞108/ml，菌體形態(tài)多數(shù)呈二聯(lián)體，此時是進行輻射誘導的最佳時期；②照射條件將菌體培養(yǎng)物置于Co60輻射平臺，按劑量率1000Gy/h進行γ射線照射，菌體所接受照射處理的總劑量為200-1000Gy；4)菌體輻照后培養(yǎng)的條件經(jīng)輻射誘導后的菌體，需要在30-32℃條件下培養(yǎng)30-60min，目的是使菌體在接受外界刺激后，大量合成SOD酶蛋白；5)粗酶液的提?、倬弘x心5000-10000rpm，0-4℃，10-15min，收集菌體細胞沉淀。用50-60mM，pH7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌三次，離心收集菌體細胞。
②按每克菌體加入三倍緩沖液制成菌懸液，600-700w功率下超聲波處理破碎細胞8-10min，每處理2-3秒間隔4-6秒，菌體破碎率可達85％以上。
③10000-12000rpm，0-4℃條件下離心10-20min，收集上清液，即為SOD粗酶液。酶活性采用鄰苯三酚自氧化法測定，單位表示為每毫克菌體干重所含的酶活單位數(shù)U/mg。
本發(fā)明優(yōu)點在于1)在輻射誘導(1000Gy劑量)和恢復培養(yǎng)30min條件下，耐輻射球菌的SOD酶活性達到了149.69U/mg，比輻照處理前提高了75％以上，是產(chǎn)SOD酵母菌酶活性的3倍；2)該工藝流程比較簡單，成本低；3)耐輻射球菌屬于原核生物，菌株繁殖快，發(fā)酵培養(yǎng)周期較短，適于大規(guī)模的生產(chǎn)。


附圖是輻射誘導法提高耐輻射球菌SOD含量的工藝流程圖。
具體實施例方式
本發(fā)明中所用的微生物是耐輻射球菌(Deinococcus radiodurans R1)，該菌的生物學特征是，與其他物種比較，它具有超強的耐輻射能力和DNA修復能力。耐輻射球菌比大腸桿菌的抗輻射能力高出200多倍。這種菌超強耐輻射能力的主要原因之一為高含量的抗氧化酶SOD和Catalase。輻射引起的細胞內(nèi)水輻解產(chǎn)生的活性氧自由基能夠攻擊生物大分子，導致機體氧化損傷。因此耐輻射球菌的超強耐輻射能力與它的SOD含量有著密切的聯(lián)系。我們的研究發(fā)現(xiàn)耐輻射球菌中的SOD活性是大腸桿菌(E.colli)的4.8倍，是酵母菌(Saccharomycescerevisiae)的2.3倍。
實施例1以1000Gy劑量輻射誘導1L菌體培養(yǎng)物，恢復培養(yǎng)30min為例。
1將耐輻射球菌Dradiodurans R1劃線接種于TGY固體培養(yǎng)基上，32℃培養(yǎng)45h，挑取單一菌落接種于100ml培養(yǎng)液，搖瓶培養(yǎng)30h，菌體生長達到對數(shù)期(OD600＞1.0)。將液體種子按5％接種量，接入1L發(fā)酵培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)200rpm。培養(yǎng)42h至菌落計數(shù)＞108/ml。
2將1L菌體培養(yǎng)物分裝于聚乙烯管(γ射線可穿透)中，置于Co60輻射照射下，按劑量率1000Gy/h照射1小時，菌體接受照射處理的總劑量為1000Gy。
3經(jīng)輻射誘導后的菌體，置于32℃條件下恢復培養(yǎng)30min，條件同上。
4將菌液離心(5000rpm，4℃)10min，收集菌體細胞沉淀。用50mM磷酸緩沖液(pH7.0)洗滌三次，離心收集菌體細胞。按菌體與緩沖液1∶3比例加入50mM，pH7.0的磷酸緩沖液制成菌懸液，在低溫(0-4℃)條件下，600w功率下超聲波處理破碎細胞(處理時間8min)，每處理2秒間隔4秒，菌體破碎率達85％以上。然后將菌液在4℃，12000rpm下離心20min，收集上清液，即為SOD粗酶液。SOD酶活達到149.69U/mg，比對照(未經(jīng)輻照誘導組)提高了75％以上，是酵母菌酶活性的3倍。
實施例2以200Gy劑量輻射誘導1L菌體培養(yǎng)物，恢復培養(yǎng)30min為例。
1將耐輻射球菌D.radiodurans R1劃線接種于TGY固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48h，挑取單一菌落接種于裝有100ml培養(yǎng)液的三角瓶內(nèi)，搖瓶培養(yǎng)30h，菌體生長達到對數(shù)期(OD600＞1.0)。將液體種子按5％接種量，接入1L發(fā)酵培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)200rpm。培養(yǎng)40h至菌落計數(shù)＞108/ml。
2將1L菌體培養(yǎng)物分裝于聚乙烯管(γ射線可穿透)中，置于Co60輻射照射下，按劑量率1000Gy/h照射12分鐘，菌體接受照射處理的總劑量為200Gy。
3經(jīng)輻射誘導后的菌體，置于32℃條件下恢復培養(yǎng)30min，條件同上。
4將菌液離心(10000rpm，0-4℃)10min，收集菌體細胞沉淀。用60mM磷酸緩沖液(pH7.0)洗滌三次，離心收集菌體細胞。按菌體與緩沖液1∶3比例加入60mM，pH7.0的磷酸緩沖液制成菌懸液，在低溫(0-4℃)條件下，600w功率下超聲波處理破碎細胞(處理時間8min)，每處理2秒間隔4秒，菌體破碎率達85％以上。然后將菌液在4℃，12000rpm下離心20min，收集上清液，即為SOD粗酶液。SOD酶活達到122.41U/mg，比對照(未經(jīng)輻照誘導組)提高了43.59％。
實施例3以500Gy劑量輻射誘導1L菌體培養(yǎng)物，恢復培養(yǎng)60min為例。
1將耐輻射球菌D.radiodurans R1劃線接種于TGY固體培養(yǎng)基上，32℃培養(yǎng)48h，挑取單一菌落接種于含100ml培養(yǎng)液的三角瓶，搖瓶培養(yǎng)30h，菌體生長達到對數(shù)期(OD600＞1.0)。將液體種子按3％接種量，接入1L發(fā)酵培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)220rpm。培養(yǎng)38h至菌落計數(shù)＞108/ml。
2將1L菌體培養(yǎng)物分裝于聚乙烯管(γ射線可穿透)中，置于Co60輻射照射下，按劑量率1000Gy/h照射30分鐘，菌體接受照射處理的總劑量為500Gy。
3經(jīng)輻射誘導后的菌體，置于32℃條件下恢復培養(yǎng)60min，條件同上。
4將菌液離心(5000rpm，0-4℃)10min，收集菌體細胞沉淀。用50mM磷酸緩沖液(pH7.0)洗滌三次，離心收集菌體細胞。按菌體與緩沖液1∶3比例加入50mM，pH7.0的磷酸緩沖液制成菌懸液，在低溫(0-4℃)條件下，700w功率下超聲波處理破碎細胞(處理時間10min)，每處理3秒間隔6秒，菌體破碎率達85％以上。然后將菌液在4℃，12000rpm下離心20min，收集上清液，即為SOD粗酶液。SOD酶活達到121.82U/mg，比對照(未經(jīng)輻照誘導組)提高了42.89％。
權(quán)利要求
1.一種輻射誘導提高耐輻射球菌超氧化物歧化酶產(chǎn)量的方法，其特征在于它的步驟如下1)菌種的活化將耐輻射球菌劃線接種于TGY固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基組成為蛋白胨5g/L，酵母提取物3g/L，葡萄糖1g/L，30-32℃培養(yǎng)45-48h，挑取單菌落接種于三角瓶中搖瓶培養(yǎng)至對數(shù)生長期；2)發(fā)酵培養(yǎng)條件將上述種子液按3-5％體積的接種量接入發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，30-32℃培養(yǎng)38-42h；3)SOD的輻射誘導條件①菌體輻射誘導時期的選擇菌體生長到38-42h，即穩(wěn)定早期，菌濃度＞108/ml，菌體形態(tài)多數(shù)呈二聯(lián)體，此時是進行輻射誘導的最佳時期；②照射條件將菌體培養(yǎng)物置于Co60輻射平臺，按劑量率1000Gy/h照射，菌體所接受照射處理的總劑量為200-1000Gy；4)菌體輻照后培養(yǎng)的條件經(jīng)輻射誘導后的菌體，需要在30-32℃條件下培養(yǎng)30-60min，目的是使菌體在接受外界刺激后，大量合成SOD酶；5)粗酶液的提取①菌液離心5000-10000rpm，0-4℃，10-15min，收集菌體細胞沉淀。用50-60mM，pH7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌三次，離心收集菌體細胞。②按每克菌體加入三倍緩沖液制成菌懸液，600-700w功率下超聲波處理菌細胞8-10min，每處理2-3秒間隔4-6秒，菌體破碎率可達85％以上。③10000-12000rpm，0-4℃條件下離心10-20min，收集上清液，即為SOD粗酶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種輻射誘導提高耐輻射球菌超氧化物歧化酶產(chǎn)量的方法，其特征在于所說的微生物為耐輻射球菌種及其變種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用輻射誘導提高耐輻射球菌超氧化物歧化酶產(chǎn)量的方法，將發(fā)酵培養(yǎng)到穩(wěn)定早期的耐輻射球菌經(jīng)γ射線輻照和后培養(yǎng)，誘導菌體超氧化物歧化酶SOD合成，提高菌體酶產(chǎn)量。本發(fā)明的菌體細胞經(jīng)過分離，超聲波處理和提取，得到的SOD酶活性比輻照處理前提高了75％以上，是產(chǎn)SOD酵母菌酶活性的3倍，同時具有工藝流程簡單，成本較低的優(yōu)點。
文檔編號C12N13/00GK1445362SQ0311636
公開日2003年10月1日 申請日期2003年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月9日
發(fā)明者華躍進, 田兵 申請人:浙江大學