專利名稱：一種快速聯(lián)檢IrrE和G2-EPSPS蛋白的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種快速聯(lián)檢IrrE和G2-EPSPS蛋白的試劑盒。
背景技術(shù)：
在轉(zhuǎn)基因植物的研制開(kāi)發(fā)或在對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行篩選或安全性評(píng)價(jià)時(shí)，往往需要 對(duì)轉(zhuǎn)入的外源性基因進(jìn)行定性或半定量測(cè)定。1. IrrE蛋白編碼基因(irrE)是具有極端輻射抗性的耐輻射球菌 Deinococcusradiodurans中的全局調(diào)控因子，irrE基因的表達(dá)能顯著增強(qiáng)大腸桿菌的輻 射抗性、氧化抗性和耐鹽能力。該基因?qū)胫参锖?，明顯提高了植物的耐鹽和抗旱能力。目 前，IrrE蛋白編碼基因已轉(zhuǎn)入玉米、棉花、煙草、油菜等作物。2.G2-EPSPS(5_烯醇丙酮莾草酸-3-磷酸合酶)蛋白編碼基因(aroA)克隆自熒光 假單胞菌G2基因組文庫(kù)，該菌株篩選自草甘膦污染土壤，具有高草甘膦耐受性。aroA基因 編碼的蛋白經(jīng)分析屬于Class I類型，酶活測(cè)定顯示該蛋白具有高底物親和能力和低草甘 膦親和力，因此能賦予宿主高草甘膦除草劑耐受力。目前，IrrE蛋白編碼基因以及G2-EPSPS蛋白編碼基因(aroA)已轉(zhuǎn)入玉米、棉花、 煙草、油菜等作物。因此，實(shí)踐中轉(zhuǎn)基因植物樣本往往都需要進(jìn)行兩種基因的檢測(cè)?，F(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)如酶免、放免等方法，受儀器(酶標(biāo)儀、放免閃爍儀、離心機(jī)等)、 場(chǎng)地等因素的限制，而且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)(酶免檢測(cè)時(shí)間需20hr、放免需30min lhr)，檢測(cè)成 本較高，很難推廣應(yīng)用。已有試紙條檢測(cè)的方法雖可部分克服以上不足，但每種試紙條只能檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作 物中單一的外源基因，實(shí)際操作中容易產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果。例如如果檢測(cè)者僅有G2-EPSPS檢 測(cè)試紙條，而檢測(cè)對(duì)象中并未轉(zhuǎn)入G2-EPSPS基因，而是轉(zhuǎn)入IrrE基因，那么很可能會(huì)得出 檢測(cè)對(duì)象不存在外源基因的錯(cuò)誤結(jié)果，造成不必要的損失。而且在操作時(shí)，需要將試紙條浸 入待檢測(cè)的液體中，操作不是很方便。因此，實(shí)踐中很需要有一種可同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中IrrE蛋白和G2-EPSPS蛋白， 且操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、快速的裝置
實(shí)用新型內(nèi)容
本實(shí)用新型的目的是建立一種操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、快速，并能同時(shí)檢測(cè)兩種 不同轉(zhuǎn)基因成分(IrrE和G2-EPSPS蛋白)的免疫檢測(cè)試劑盒。本實(shí)用新型的技術(shù)方案是這樣的它包括底板和上蓋，底板蓋入上蓋后組成試劑 盒，其特征在于底板上放置有兩條測(cè)試帶；上蓋有兩個(gè)觀測(cè)窗和兩個(gè)加樣孔。底板的上表面可以設(shè)置兩條凹槽，每條凹槽內(nèi)嵌入一條測(cè)試帶，底板的厚度不限。所述底板或上蓋可具有卡槽，以保證底板與上蓋扣緊。所述觀測(cè)窗優(yōu)選是長(zhǎng)方形。試劑盒的形狀為扁平的圓柱形盒。
0016]所述底板內(nèi)的兩條測(cè)試帶，一條用于檢測(cè)IrrE，另一條用于檢測(cè)G2-EPSPS蛋白。所述測(cè)試帶是一種具有檢測(cè)系統(tǒng)主體膜反應(yīng)體系功能的檢測(cè)材料，由高分子纖維膜、塑料 等多層材料制成。兩種蛋白的測(cè)試帶均可分為質(zhì)控區(qū)和檢測(cè)區(qū)，質(zhì)控區(qū)可包被羊抗鼠IgG 或兔抗鼠IgG多克隆抗體；IrrE蛋白測(cè)試帶的樣品檢測(cè)區(qū)包被特異功能性IrrE，G2-EPSPS 蛋白測(cè)試帶的樣品檢測(cè)區(qū)包被G2-EPSPS的單克隆抗體或多克隆抗體。當(dāng)外源基因轉(zhuǎn)入植物，并在植物中表達(dá)，將產(chǎn)生目的蛋白(IrrE和G2-EPSPS)，因 此通過(guò)檢測(cè)樣品中是否含有上述兩種蛋白來(lái)確定該基因是否存在。如果外源基因轉(zhuǎn)入植 物，發(fā)生基因沉默，無(wú)目的蛋白產(chǎn)生，將不能達(dá)到預(yù)期目的(耐鹽或抗除草劑)。本實(shí)用新型的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的當(dāng)?shù)装迳w入上蓋后，每個(gè)觀測(cè)窗和加樣孔各分 別對(duì)應(yīng)一條測(cè)試帶，通過(guò)盒蓋上的加樣孔和觀測(cè)窗可進(jìn)行加樣和觀察檢測(cè)結(jié)果，每個(gè)觀測(cè) 窗可分別檢查一種基因。每個(gè)觀測(cè)窗分為測(cè)試區(qū)(T)和質(zhì)控區(qū)(C)兩部分，可在上蓋上用字母C、T標(biāo)示出；檢測(cè)時(shí)，將送檢物品的同一種提取液分別滴加在試劑盒的兩個(gè)加樣孔中，5-10分 鐘后，通過(guò)肉眼就可以通過(guò)上蓋的觀測(cè)窗直接觀察到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。對(duì)于每個(gè)觀測(cè)窗來(lái)說(shuō)，用以下方式判斷檢測(cè)結(jié)果1、陰性(-)反應(yīng)狀況觀測(cè)窗質(zhì)控區(qū)(C)出現(xiàn)一條紫紅色條帶。檢測(cè)結(jié)果待檢樣品中不含待檢基因或其含量在其閾值以下。2、陽(yáng)性(+)反應(yīng)狀況觀測(cè)窗質(zhì)控區(qū)(C)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在測(cè)試區(qū)(T)內(nèi)同時(shí)出現(xiàn)紫紅 色條帶。檢測(cè)結(jié)果待檢基因含量在閾值以上。3、無(wú)效反應(yīng)狀況質(zhì)控區(qū)(C)未出現(xiàn)紫紅色條帶，檢測(cè)結(jié)果表明不正確的操作過(guò)程或試劑盒已變質(zhì)損壞。本實(shí)用新型所述試劑盒的優(yōu)點(diǎn)在于經(jīng)濟(jì)高效一個(gè)檢測(cè)盒可同時(shí)檢測(cè)2種不同的轉(zhuǎn)基因成份，大大降低了使用成本；簡(jiǎn)便快速2種不同的轉(zhuǎn)基因成份一步法操作，同時(shí)檢測(cè)，不需其它任何附加儀器 設(shè)備。直接將待測(cè)樣品液滴加在加樣孔中，5-10分鐘可出結(jié)果；檢測(cè)結(jié)果直觀不借助任何儀器，用肉眼可觀察到結(jié)果；應(yīng)用廣泛可檢測(cè)棉花、小麥、玉米、油菜、煙草等多種農(nóng)作物的葉片、種子及加工產(chǎn)品。由于本實(shí)用新型提供的聯(lián)檢試劑盒同時(shí)可對(duì)植物樣品進(jìn)行IrrE和G2-EPSPS分 析，檢測(cè)快速、特異、敏感、方便，特別適用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的研制開(kāi)發(fā)和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的快速篩 選，可用于實(shí)驗(yàn)室、田間、邊防、海關(guān)植物檢驗(yàn)、檢驗(yàn)檢疫局、食品安全檢測(cè)及種子經(jīng)營(yíng)銷售 等部門對(duì)可疑樣本現(xiàn)場(chǎng)、快速篩查。

圖1和圖2是本實(shí)用新型一種試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖，其中圖1是底板的俯視圖，圖 2是試劑盒上蓋的俯視圖；圖1中有兩條測(cè)試帶，圖2中1是加樣孔，2是觀測(cè)窗，T是測(cè)試區(qū)，C是質(zhì)控區(qū)。
具體實(shí)施方式
本實(shí)用新型試劑盒中的測(cè)試帶的制備用制備檢測(cè)G2-EPSPS的測(cè)試帶來(lái)舉例說(shuō) 明實(shí)施例1制備測(cè)試帶1.G2-EPSPS單抗腹水的制備小鼠腹腔注射液體石蠟0. 5mL。1周后，將G2-EPSPS單抗雜交瘤細(xì)胞注射于以上 預(yù)先處理過(guò)的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射雜交瘤細(xì)胞1 3X 106。10天后收獲腹水， 以上過(guò)程皆在無(wú)菌條件下完成。2. G2-EPSPS單克隆抗體的純化1)以DEAE離子交換層析及S印hacryl S 300分子篩對(duì)單抗進(jìn)行純化；SDS-PAGE 平板電泳檢測(cè)純化單抗的純度；ELISA法測(cè)定單抗活性；2)純化過(guò)程取小鼠單抗腹水一3，000 X g離心15分鐘一上清液加50 %硫酸銨沉 淀，過(guò)夜一3，000 X g離心20分鐘一沉淀溶于0. 01M磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2) — S-300凝膠 柱一DEAE Blue層析柱一0-800mM NaCl梯度洗脫一超濾離心，濃縮單抗；3)單抗純度測(cè)定常規(guī)SDS-PAGE電泳，上述方法所純化的單抗的純度皆在95%以 上；4)蛋白濃度測(cè)定紫外分光光度計(jì)測(cè)定279nm處的0. D.值，按以下公式計(jì)算蛋白 含量0D279/1.4 = mg/ml (純化單抗)。將單抗?jié)舛日{(diào)節(jié)為約lmg/mL ；5)單抗活性測(cè)定選用G2-EPSPS抗原包被ELISA板(1 y g/孔)，及羊抗鼠 IgG-HRP復(fù)合物，測(cè)定各單抗效價(jià)(大于1 5000)。3.羊抗D0At高效價(jià)免疫抗血清的制備和純化1)純化好的上述單抗+完全佐劑一免疫山羊一加強(qiáng)免疫二次，每次間隔一月一第 二次加強(qiáng)后10天左右取血一離心取血清一硫酸銨沉淀一DEAE離子交換層析純化；2)效價(jià)測(cè)定ELISA夾心法，抗體效價(jià)稀釋度應(yīng)大于1 256;3)蛋白濃度測(cè)定紫外分光法測(cè)定0D279，計(jì)算蛋白濃度。4.膠體金及金標(biāo)抗體制備1)膠體金的制備以檸檬酸鹽還原法制備40-60nm的膠體金。將0. 01 % HauCl4 加熱至沸，加入一定量的檸檬酸三鈉(Na3C6H507 *2H20)，繼續(xù)加熱煮沸5分鐘，待膠體金 溶液顏色由蘭一紫一紅，穩(wěn)定后，冷卻即可。膠體金溶液應(yīng)清亮透明，如需長(zhǎng)期保存，可加入 0. 02% NaN3。2)將膠體金液500mL用0. 1M NaOH調(diào)pH8. 4，磁力攪拌下緩慢加入單抗2mL，攪拌 20分鐘。5，500Xg離心30Min，除去上清液中未結(jié)合的蛋白質(zhì)。離心后吸取膠體金標(biāo)記抗 體沉淀，沉淀溶于10mL保存液中，用0. 45 y m微孔濾膜過(guò)濾。取樣進(jìn)行檢定，其余置4°C保存。5.膜反應(yīng)體系Ml的制備1)將G2-EPSPS抗體及純化的羊抗鼠IgG以0. 1M磷酸鹽緩沖液稀釋，終濃度為約 0. 2-2mg/mL。
0057]2)純化的羊抗鼠IgG溶于0. 1M磷酸鹽緩沖液中，濃度為2. Omg/mL ；[0058]3)硝酸纖維素膜大小10cmX 27cm，每張膜可噴長(zhǎng)25cm的檢測(cè)及控制帶各4條；4)將以上兩種溶液分別加入Biodot XYZ3000噴涂機(jī)的二個(gè)噴頭儲(chǔ)存瓶中；5)設(shè)置噴速為2 u L/cm, NC膜的移行速度為50mm/s。以單抗G2-EPSPSAD2 (2mg/ mL)在NC膜上包被反應(yīng)檢測(cè)線，以1. Omg/mL兔抗鼠IgG包被反應(yīng)對(duì)照線，對(duì)照線與檢測(cè)線 的距離為4-4. 5mm ；6)完成包被后，置37°C干燥箱24小時(shí)，用BB封閉液封閉處理半小時(shí)，用WB洗液 抽洗一次；7) 37 °C干燥箱干燥備用；8)切制備好的硝酸纖維素膜1. 8cmX27cm/條，放入鋁薄袋中密封干燥保存。置
室溫保存?zhèn)溆谩?.膜反應(yīng)體系M2a、M2b及M3的制備將吸水纖維膜分別浸泡于M2a、M2b、M3溶液中，浸透后，取出晾干，裝入塑料袋中，
室溫保存。l)M2a制備將制好的玻璃纖維切27cmX 1. 2cm/條；2)M2b制備將制好的玻璃纖維切27emX 1. 8cm/條；3)M3制備將制好的玻璃纖維切27emX 1. 2cm/條。7.膜反應(yīng)體系M4的制備1)取膠體金_單抗復(fù)合物加稀釋液，混勻配成工作濃度；2)將溶液加入噴涂機(jī)Biodot的Air jet噴頭儲(chǔ)存瓶中；3)設(shè)定壓力為15PSI，玻璃纖維膜的移動(dòng)速度為50mm/s ；4)噴制規(guī)格為0. 5-1. 5cmX 25cm/條，每條噴2遍；5)于37°C烘干12小時(shí)，放入鋁薄袋中，加入干燥劑，熱合封口，室溫保存。8.反應(yīng)體組裝1)在M6塑料基板上貼雙面膠帶M7 二條；2)在M7中間貼反應(yīng)膜Ml (18mm)，離M6上緣約22mm ；3)在M7上貼M5 (22mm)，與M6上緣對(duì)齊并與Ml上緣交；4)在M7上貼M2a (12mm)，與Ml下緣相接；5)在 M2 上貼 M4 (10mm)，壓住 Ml 下緣 0. 5mm ；6)在 M7 上貼 M3 (12mm),上緣壓住 M4 約 2/3 ；7)在M7上貼M2b (18mm)，上緣壓住M4約2/3，下緣與M7的下緣對(duì)齊；8)在M4和M7上貼透明保護(hù)膠帶M8，上緣完全壓住M4，并壓住Ml約1. 5mm ；9)在M5上貼彩色標(biāo)記膠帶M9，與Ml上緣交1mm，另一端翻過(guò)M6上緣，貼于M6被10)將組裝成型的反應(yīng)體用全自動(dòng)切條機(jī)切成3. 5mm規(guī)格。實(shí)施例2試劑盒裝配將制備好的檢測(cè)IrrE和檢測(cè)G2-EPSPS蛋白的兩種測(cè)試帶分別嵌入底板的兩個(gè)凹 槽中，然后將上蓋與底板扣緊，即成試劑盒。將試劑盒、滴管和使用說(shuō)明書(shū)裝塑料袋封裝后，即可。
0089]實(shí)施例3試劑盒使用過(guò)程[0090]1.檢測(cè)樣本處理及準(zhǔn)備植物種子、葉子、籽苗等樣本在檢測(cè)前需經(jīng)研磨，并以蒸餾水抽提和稀釋。為獲得 最佳檢測(cè)效果，各不同樣品應(yīng)根據(jù)下表中的比例稀釋，在完成研磨和稀釋后，將樣本混勻， 靜置，取上清液作為檢測(cè)樣品。 2.檢測(cè)及結(jié)果將檢測(cè)盒平放，用所配塑料吸管吸取樣品液，滴加4-5滴于檢測(cè)盒的加樣孔1中， 吸水材料使待檢樣品緩慢移動(dòng)，膜反應(yīng)體系被啟動(dòng)。無(wú)論待測(cè)基因是否存在于植物樣品中， 一條紫紅色條帶都會(huì)出現(xiàn)在質(zhì)控區(qū)內(nèi)(C)。質(zhì)控區(qū)內(nèi)(C)所顯現(xiàn)的紫紅色條帶是判定是否 有足夠的植物樣品液，層析過(guò)程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也作為試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。3.結(jié)果判定每一個(gè)觀測(cè)窗(2)檢測(cè)一種待檢基因是否存在。以下以檢測(cè)G2-EPSPS為例說(shuō)明1)如樣本中不含特定G2-EPSPS蛋白，或其濃度低于檢測(cè)靈敏度，膠體金抗體在層 析過(guò)程中不會(huì)被固定在膜上檢測(cè)帶內(nèi)的單抗免疫，因而測(cè)試區(qū)內(nèi)(T)不會(huì)出現(xiàn)一條紫紅色 檢測(cè)帶，顯示陰性(_)結(jié)果，即僅在質(zhì)控區(qū)(C)內(nèi)出現(xiàn)一條紫紅色條帶。2)如果待植物樣品中G2-EPSPS蛋白濃度高于其檢測(cè)閾值時(shí)，抗原免疫金與檢測(cè) 帶上的另一單抗結(jié)合，在測(cè)試區(qū)內(nèi)(T)將還出現(xiàn)另一紫紅色檢測(cè)帶，顯示陽(yáng)性(+)結(jié)果，即 在質(zhì)控區(qū)(C)和檢測(cè)區(qū)內(nèi)各出現(xiàn)一條紫紅色條帶。注意測(cè)試區(qū)(T)內(nèi)的紫紅色條帶可顯 現(xiàn)出顏色深淺的現(xiàn)象。但是，在規(guī)定的觀察時(shí)間內(nèi)，不論該色帶顏色深淺，都應(yīng)判定為陽(yáng)性 結(jié)果。3)如質(zhì)控區(qū)(C)未出現(xiàn)紫紅色條帶，則檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，表明不正確的操作過(guò)程或 試劑盒已變質(zhì)損壞。
權(quán)利要求一種快速聯(lián)檢IrrE和G2-EPSPS蛋白的試劑盒，包括底板和上蓋，底板蓋入上蓋后組成試劑盒，其特征在于底板上放置有兩條測(cè)試帶；上蓋有兩個(gè)觀測(cè)窗和兩個(gè)加樣孔。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速聯(lián)檢IrrE和G2-EPSPS蛋白的試劑盒，其特征在于 所述底板的上表面設(shè)置有兩條可嵌入測(cè)試帶凹槽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種快速聯(lián)檢IrrE和G2-EPSPS蛋白的試劑盒，其特征 在于所述底板或上蓋具有卡槽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種快速聯(lián)檢IrrE和G2-EPSPS蛋白的試劑盒，其特征 在于所述觀測(cè)窗是長(zhǎng)方形。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種快速聯(lián)檢IrrE和G2-EPSPS蛋白的試劑盒。本試劑盒由底板、上蓋組成；底板內(nèi)有兩條測(cè)試帶；上蓋有兩個(gè)觀測(cè)窗和兩個(gè)加樣孔。本試劑盒可一步同時(shí)檢測(cè)2種不同的轉(zhuǎn)基因成份，不需其它任何附加儀器設(shè)備。本試劑盒操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)結(jié)果形象、準(zhǔn)確、快速只要將送檢物品的提取液分別滴加在試劑盒的兩個(gè)加樣孔中，5-10分鐘后，通過(guò)肉眼就可以通過(guò)觀測(cè)窗直接觀察到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。
文檔編號(hào)G01N33/68GK201600372SQ201020114178
公開(kāi)日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2010年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日
發(fā)明者劉奇, 張維, 林敏 , 鄭建, 陸偉, 陳明 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所