專利名稱：二肽生產(chǎn)方法,所用的l-氨基酸酰胺水解酶,以及l(fā)-氨基酸酰胺水解酶生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及不采用復(fù)雜的合成方法，方便地和廉價(jià)地生產(chǎn)二肽的方法，更具體地講，本發(fā)明涉及由L-氨基酸酰胺(amino acid amide)和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的方法，涉及用于所述生產(chǎn)二肽的方法中的L-氨基酸酰胺水解酶，以及所述水解酶的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
二肽被用于藥品和功能食品領(lǐng)域以及各種其他領(lǐng)域。例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺可用作無(wú)血清培養(yǎng)基的成分，并且由于它具有比L-谷氨酰胺更高的穩(wěn)定性和水溶性，它可用于輸液。
盡管化學(xué)合成方法是本領(lǐng)域傳統(tǒng)公知的生產(chǎn)二肽的方法，但是這些生產(chǎn)方法不一定簡(jiǎn)單。所述方法的已知例子包括使用N-芐基氧基羰基丙氨酸(以下稱之為“Z-丙氨酸”)和受保護(hù)的L-谷氨酰胺的方法(參見Bull.Chem.Soc.Jpn.，34，739(1961)，Bull.Chem.Soc.Jpn.，35，1966(1962))，使用Z-丙氨酸和受保護(hù)的L-谷氨酸-γ-甲基酯的方法(參見Bull.Chem.Soc.Jpn.，37，200(1964))，使用Z-丙氨酸酯和未保護(hù)的谷氨酸的方法(參見特開平1-96194號(hào)公報(bào))，以及使用2-取代的丙酰鹵作為原始材料，使用N-(2-取代的)丙酰谷氨酰胺衍生物作為中間產(chǎn)物合成二肽的方法(參見特開平6-234715號(hào)公報(bào))。
不過，由于所有上述方法需要導(dǎo)入和消除保護(hù)基團(tuán)或合成一種中間產(chǎn)物，在它們的工業(yè)優(yōu)勢(shì)方面，它們不被認(rèn)為十分令人滿意的。
另外，利用微生物酶系統(tǒng)生產(chǎn)二肽的方法的已知例子，包括使用Z-天冬氨酸和丙氨酸甲酯的方法(參見特開昭53-92729號(hào)公報(bào))，以及使用天冬氨酸酰胺和丙氨酸甲酯的方法(參見特開平10-136992號(hào)公報(bào))。在EPA 0278787和WO 90/01555中披露了通過酶促方法生產(chǎn)二肽的方法的其他公知例子。
不過，在以上所有微生物酶系統(tǒng)中，由于必須使用具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸作為原始材料，因此有必要開發(fā)一種采用成本較低并且較容易獲得的材料生產(chǎn)二肽的方法，該方法具有工業(yè)優(yōu)點(diǎn)，并且采用一種簡(jiǎn)單的生產(chǎn)途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于生產(chǎn)二肽的方法，該方法使用較廉價(jià)的并且容易獲得的原始材料，該方法具有工業(yè)優(yōu)點(diǎn)，并且采用簡(jiǎn)單的生產(chǎn)途徑。
對(duì)上述目的進(jìn)行深入研究的結(jié)果是，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了某些微生物具有較廉價(jià)的并且便于獲得的L-氨基酸酰胺和L-谷氨酸生產(chǎn)二肽的能力，從而完成了本發(fā)明。
就是說，本發(fā)明如下文所描述。
一種二肽生產(chǎn)方法，包括利用具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的酶或含有酶的物質(zhì)，由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽。
如上述[1]的二肽生產(chǎn)方法，其中酶或含有酶的物質(zhì)是選自下列的一種或兩種以上類型具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的微生物培養(yǎng)物，從所述培養(yǎng)物中分離的微生物細(xì)胞，以及來自所述微生物的處理過的微生物細(xì)胞制品。
如上述[2]的二肽生產(chǎn)方法，其中微生物屬于芽孢桿菌屬，棒桿菌屬，歐文氏菌屬，紅球菌屬，黃金桿菌屬，微球菌屬，假單胞菌屬，隱球菌屬，絲孢酵母屬，紅冬孢酵母屬，擲孢酵母屬，銀耳屬，有孢圓酵母屬，梗孢酵母屬或紅酵母屬。
如上述[1]的二肽生產(chǎn)方法，其中酶是蛋白(A)或(B)(A)具有序列表中的SEQ ID No.5所示氨基酸序列的蛋白，(B)具有在序列表中的SEQ ID No.5的氨基酸序列上包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列的蛋白，并且具有L-氨基酸酰胺水解酶活性，這種活性能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)；[5]如上述[1]的二肽生產(chǎn)方法，其中酶是由(C)的DNA編碼的蛋白(C)能在嚴(yán)格條件下與由和序列表中的SEQ ID No.4所示堿基序列的57-1295號(hào)堿基互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸雜交，并且編碼具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白，它能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)。
如[2]的二肽生產(chǎn)方法，其中微生物是已轉(zhuǎn)化過的微生物，以便能夠表達(dá)蛋白(A)、(B)或(C)(A)具有序列表中的SEQ ID No.5所示氨基酸序列的蛋白，(B)具有在序列表中的SEQ ID No.5所示氨基酸序列上包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列的蛋白，并且具有L-氨基酸酰胺水解酶活性，這種活性能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)。
(C)由一種DNA編碼的蛋白，該DNA能在嚴(yán)格條件下與由和序列表中的SEQ ID No.4所示堿基序列的57-1295號(hào)堿基互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸雜交，并且編碼具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白，它能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)。
如上述[1]-[6]中任意一項(xiàng)的二肽生產(chǎn)方法，其中L-氨基酸酰胺是選自L-丙氨酸酰胺，甘氨酸酰胺和L-谷氨酸-α-酰胺的一種或兩種以上的類型。
如上述[1]-[7]中任意一項(xiàng)的二肽生產(chǎn)方法，其中L-氨基酸選自下列的一種或兩種以上類型L-谷氨酰胺，L-天冬酰胺，甘氨酸，L-丙氨酸，L-纈氨酸，L-亮氨酸，L-異亮氨酸，L-甲硫氨酸，L-脯氨酸，L-苯丙氨酸，L-色氨酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸，L-酪氨酸，L-賴氨酸，L-精氨酸，L-組氨酸和L-谷氨酰胺。
一種從屬于以下屬的微生物中獲得的L-氨基酸酰胺水解酶歐文氏菌屬，紅球菌屬，黃金桿菌屬，微球菌屬，隱球菌屬，絲孢酵母屬，紅冬孢酵母屬，擲孢酵母屬，銀耳屬，有孢圓酵母屬，梗孢酵母屬或紅酵母屬，所述酶能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)。
L-氨基酸酰胺水解酶的生產(chǎn)方法，包括在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于以下屬的微生物歐文氏菌屬，紅球菌屬，黃金桿菌屬，微球菌屬，隱球菌屬，絲孢酵母屬，紅冬孢酵母屬，擲孢酵母屬，銀耳屬，有孢圓酵母屬，梗孢酵母屬或紅酵母屬，并且在所述培養(yǎng)基和/或細(xì)胞中積累能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)的L-氨基酸酰胺水解酶。
L-氨基酸酰胺水解酶生產(chǎn)方法，包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化過的微生物，以便能夠表達(dá)蛋白(A)，(B)或(C)(A)具有序列表中的SEQ ID No.5所示氨基酸序列的蛋白，(B)具有在序列表中的SEQ ID No.5的氨基酸序列上包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列的蛋白，并且具有L-氨基酸酰胺水解酶活性，這種活性能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)。
(C)由一種DNA編碼的蛋白，該DNA能在嚴(yán)格條件下與由和序列表中的SEQ ID No.4所示堿基序列的57-1295號(hào)堿基互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸雜交，并且編碼具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白，它能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)，并且在所述培養(yǎng)基和/或細(xì)胞中積累能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)的L-氨基酸酰胺水解酶。
附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1是本發(fā)明二肽生產(chǎn)方法的流程圖；圖2是源于谷氨酸棒桿菌ATCC13286的L-氨基酸酰胺水解酶的最佳pH曲線的曲線圖；圖3是源于谷氨酸棒桿菌ATCC13286的L-氨基酸酰胺水解酶的最佳溫度曲線的曲線圖；實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明二肽生產(chǎn)方法的特征是，使用具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的能力的酶或含有酶的物質(zhì)，更具體地講，其特征是使用具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的能力的微生物培養(yǎng)物，從所述培養(yǎng)物中分離的微生物細(xì)胞，或來自所述微生物的處理過的微生物細(xì)胞制品。本發(fā)明二肽生產(chǎn)方法中的反應(yīng)可以通過以下反應(yīng)式表示。正如以下化學(xué)結(jié)構(gòu)式所表明的，本說明書中所使用的術(shù)語(yǔ)“二肽”表示具有一個(gè)肽鍵的肽聚合物。
(在以上化學(xué)式中R1表示氨基酸酰胺的氨基酸側(cè)鏈，而R2表示L-氨基酸的氨基酸側(cè)鏈)。
氨基酸酰胺是能夠以商業(yè)化制品形式較廉價(jià)的獲得的化合物。本發(fā)明的方法使用氨基酸酰胺和未保護(hù)的氨基酸作為原始材料，它能夠廉價(jià)地提供可用作藥物材料和功能性食品的二肽。
下面所提供的是按以下順序結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的二肽生產(chǎn)方法進(jìn)行的說明[I]具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的能力的微生物；[II]L-氨基酸酰胺水解酶的特性；[III]分離編碼具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白的DNA；和[IV]二肽生產(chǎn)方法。
具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的能力的微生物具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的能力的微生物，可以不受限制地用作在本發(fā)明中使用的微生物。具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的能力的微生物的例子包括屬于以下屬的微生物芽孢桿菌屬，棒桿菌屬，歐文氏菌屬，紅球菌屬，黃金桿菌屬，微球菌屬，假單胞菌屬，隱球菌屬，絲孢酵母屬，紅冬孢酵母屬，擲孢酵母屬，銀耳屬，有孢圓酵母屬，梗孢酵母屬或紅酵母屬。所述微生物的具體例子如下文所示。
巨大芽孢桿菌AJ3284 FERM BP-8090谷氨酸棒桿菌ATCC 13286胡蘿卜軟腐歐文氏菌AJ2719FERM BP-8089紫紅紅球菌 ATCC 19149
腦膜膿毒性黃金桿菌 ATCC 13253藤黃微球菌 ATCC 9341嗜糖假單胞菌ATCC 15946淺白隱球酵母IFO 0378細(xì)長(zhǎng)絲孢酵母菌 ATCC 24660雙倒卵形紅冬孢酵母 ATCC 22264赭色擲孢酵母IFO 1038茶銀耳 IFO 9297戴耳有孢圓酵母 IFO 1083Sterigmatomyces elviae IFO 1843Rhodotorula ingeniosa ATCC 22993上述微生物的保藏機(jī)構(gòu)如下文所述。
獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許微生物保藏中心(International Patent Organism Depositary National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology，日本茨城縣Tsukuba市東1丁目1番地1中央第6)。
財(cái)團(tuán)法人發(fā)酵研究所(Institute For Fermentation Osaka(IFO)，日本大阪市淀川區(qū)十三本町2丁目17番85號(hào))。
美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(P.O.Box 1549，Manassas，Virginia，USA)。
另外，巨大芽孢桿菌菌株AJ3284保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許微生物保藏中心，保藏日期為2001年7月13日，確定的保藏號(hào)為FERM P-18421。根據(jù)布達(dá)佩斯條約規(guī)定，隨后將該生物的對(duì)照交由獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許保藏中心(日本茨城縣Tsukuba市東1丁目1番地1中央第6)，保藏日期為2002年6月25日，確定的保藏號(hào)為FERM BP-8090。另外，將胡蘿卜軟腐歐文氏菌菌株巨大芽孢桿菌菌株AJ2719保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許微生物保藏中心，保藏日期為2001年7月13日，確定的保藏號(hào)為FERM P-18420。隨后根據(jù)布達(dá)佩斯條約規(guī)定，將該生物的對(duì)照交由獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許保藏中心(日本茨城縣Tsukuba市東1丁目1番地1中央第6)，保藏日期為2002年6月25日，確定的保藏號(hào)為FERM BP-8089。
可以將野生菌株或變體菌株用作上述微生物，并且還可以使用通過細(xì)胞融合、遺傳操作或其他遺傳學(xué)技術(shù)獲得的重組菌株等。
推薦在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)并且生長(zhǎng)所述微生物，以便獲得所述微生物的微生物細(xì)胞。對(duì)用于這一目的的培養(yǎng)基沒有特定限制，只要它能使所述微生物生長(zhǎng)就行。所述培養(yǎng)基可以是含有必需的普通碳源、氮源、無(wú)機(jī)離子，和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)源的普通培養(yǎng)基。
例如，任何碳源都可以使用，只要它能被所述微生物利用就行?？梢允褂玫奶荚吹木唧w例子包括糖類，如葡萄糖、果糖、麥芽糖和直鏈淀粉，醇，如山梨糖醇、乙醇和甘油。有機(jī)酸，如富馬酸、檸檬酸、乙酸和丙酸，以及它們的鹽，烴類，如石蠟以及它們的混合物。
可以使用的氮源的例子包括無(wú)機(jī)鹽的銨鹽，如硫酸銨和氯化銨，有機(jī)酸的銨鹽，如富馬酸銨，和檸檬酸銨，硝酸鹽，如硝酸鈉和硝酸鉀，有機(jī)氮化合物，如蛋白胨，酵母膏，肉膏和玉米漿，以及它們的混合物。
另外，用于培養(yǎng)基中的普通營(yíng)養(yǎng)源，如無(wú)機(jī)鹽，微量金屬鹽和維生素也可以適當(dāng)?shù)鼗旌喜⑶沂褂谩?br> 在某些場(chǎng)合下，可以通過向培養(yǎng)基中進(jìn)一步添加L-氨基酸酰胺獲得具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的高的活性水平的微生物細(xì)胞。
對(duì)培養(yǎng)條件沒有特殊限制，并且，舉例來說，培養(yǎng)可以進(jìn)行大約12-大約48小時(shí)，同時(shí)在有氧條件下分別將pH適當(dāng)控制在5-8的范圍內(nèi)，并且將溫度控制在20-40℃的范圍內(nèi)。
L-氨基酸酰胺水解酶的特性舉上述谷氨酸棒桿菌菌株ATCC 13286為例，提供了對(duì)純化的L-氨基酸酰胺水解酶特性的說明，這種酶被用作具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的活性的酶。
L-氨基酸酰胺水解酶具有水解L-氨基酸酰胺形成L-氨基酸的活性，并且具有利用L-氨基酸酰胺和L-氨基酸作底物形成二肽的活性。以用L-丙氨酸酰胺和L-谷氨酰胺作為原材料(底物)為例，L-氨基酸酰胺水解酶至少具有通過水解L-丙氨酸酰胺形成L-丙氨酸的活性，以及通過利用L-丙氨酸酰胺和L-谷氨酰胺作底物形成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的活性。另外，以利用L-丙氨酸酰胺和-L-天冬酰胺作為原材料為例，L-氨基酸酰胺水解酶至少具有通過水解L-丙氨酸酰胺形成L-丙氨酸的活性，以及通過利用L-丙氨酸酰胺和-L-天冬酰胺作底物形成L-丙氨酰-L-天冬酰胺的活性。
就酶的功能而言，以使用L-丙氨酸酰胺和L-谷氨酰胺或L-天冬酰胺作原材料為例，L-氨基酸酰胺水解酶通過水解一個(gè)分子的L-丙氨酸酰胺形成了一個(gè)分子的L-丙氨酸和一個(gè)分子的氨，由一個(gè)分子的丙氨酸酰胺和一個(gè)分子的谷氨酰胺形成了一個(gè)分子的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和一個(gè)分子的氨，并且由一個(gè)分子的L-丙氨酸酰胺和一個(gè)分子的L-天冬酰胺形成了一個(gè)分子L-丙氨酰-L-天冬酰胺和一個(gè)分子的氨。
最佳pH接近6.0-10.0，最佳溫度接近30-50℃。計(jì)算出的所述甲基的分子量為42000-46000，它是通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳確定的。
分離編碼具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的DNA用于本發(fā)明中的能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)的酶或含有酶的物質(zhì)可以通過生產(chǎn)轉(zhuǎn)化體獲得，包括利用遺傳工程技術(shù)從具有所述酶的上述微生物中分離編碼所述酶的DNA。
例如，下面提供了編碼具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白的DNA的例子，它是從谷氨酸棒桿菌[III-1]以及已插入了這種DNA的轉(zhuǎn)化體[III-2]中分離的。
DNA分離首先，確定純化的L-氨基酸酰胺水解酶的氨基酸序列。所述氨基酸序列可以使用Edman′s方法確定(參見Edman，R，Acta Chem.Scand.，4，227(1950))。另外，還可以用Applied Biosystems確定所述氨基酸序列。通過用賴氨酰內(nèi)切肽酶等處理純化的L-氨基酸酰胺水解酶，確定這種酶的N-末端或大約10-大約30個(gè)殘基的氨基酸序列，并且，可以根據(jù)所確定的氨基酸序列推測(cè)編碼所述水解酶的DNA的堿基序列。在推測(cè)所述DNA的堿基序列時(shí)采用了通用密碼子。
根據(jù)推測(cè)的堿基序列，合成了具有大約30個(gè)堿基對(duì)的DNA分子。一種用于合成DNA分子的方法披露于Tetrahedron Letters，22，1859(1981)中。另外，還可以用合成儀(由Applied Biosystems生產(chǎn))合成所述DNA分子。然后，可以通過PCR方法用所述DNA分子作為引物，由染色體DNA擴(kuò)增編碼L-氨基酸酰胺水解酶的DNA。不過，由于用PCR方法擴(kuò)增的DNA不包括編碼L-氨基酸酰胺水解酶的完整長(zhǎng)度的DNA，編碼L-氨基酸酰胺水解酶的完整長(zhǎng)度的DNA，是利用通過使用擴(kuò)增的DNA作探針，通過PCR方法從基因文庫(kù)中分離的。
另外，當(dāng)所述基因的一部分堿基序列是已知的時(shí)候，編碼肽形成酶的完整長(zhǎng)度的DNA可以利用具有已知序列的DNA作探針從染色體基因文庫(kù)中分離。
另外，在所述基因的堿基序列具有與已知序列的同源性的場(chǎng)合下，編碼肽形成酶的完整長(zhǎng)度的DNA可以利用具有所述已知序列的DNA作探針從染色體基因文庫(kù)中分離。
在以下文獻(xiàn)中披露了所述PCR方法的方案White，T.J.等，TrendsGenet.5，185(1989)。在以下文獻(xiàn)中披露了用于制備染色體DNA的方法，以及用于利用DNA分子作探針從基因文庫(kù)中分離靶DNA分子的方法Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press(1989)。
用于確定編碼L-氨基酸酰胺水解酶的分離的DNA的堿基序列的方法披露于以下文獻(xiàn)中A Practical Guide to Molecular Cloning，JohnWiley & Sons，Inc.(1985)。另外，還可以利用DNA測(cè)序儀(AppliedBiosystems)確定其堿基序列。在SEQ ID No.4中示出了以這種方式從谷氨酸棒桿菌菌株ATCC 13286中分離的編碼L-氨基酸酰胺水解酶的DNA。在SEQ ID No.4的堿基序列中包括57-1295號(hào)堿基的堿基序列是CDS(編碼區(qū))(在本說明書中，“SEQ ID No.4所示堿基序列”表示CDS部分，除非另有特別說明)。另外，盡管SEQ ID No.4所示氨基酸酰胺水解酶是利用丙氨酸酰胺水解酶活性作為指標(biāo)，根據(jù)一種純化的酶分離的基因的固有的結(jié)果，它被稱為氨基酸酰胺水解酶，因?yàn)樗牡孜飳Ｒ恍圆⒉痪窒抻诒彼狨０?，而是具有極廣泛的范圍。
可用于本發(fā)明的DNA并不僅僅是SEQ ID No.4所限定的DNA。對(duì)于從谷氨酸棒桿菌菌株ATCC 13286中分離的SEQ ID No.4的DNA來說，即使已將DNA人工突變成從谷氨酸棒桿菌菌株ATCC 13286的染色體DNA中分離的編碼L-氨基酸酰胺水解酶的DNA，它仍然是本發(fā)明的DNA，只要它編碼L-氨基酸酰胺水解酶就行。一種常用的用于人工突變DNA的方法是披露于以下文獻(xiàn)中的位點(diǎn)專一性突變導(dǎo)入方法Methods in Enzymol.，154(1987)。
另外，具有能在嚴(yán)格條件下與具有互補(bǔ)于SEQ ID No.4所示57-1295號(hào)堿基的堿基序列的堿基序列的多核苷酸雜交的堿基序列，并且編碼具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白的DNA，也可以用作本發(fā)明的DNA。本文所說的“嚴(yán)格條件”表示能夠產(chǎn)生所謂的專一性雜交，而不能產(chǎn)生非專一性雜交的條件。盡管難以對(duì)所述條件進(jìn)行明顯定量，所述條件的例子包括使得具有高度同源性的DNAs，如具有50％或更高同源性，優(yōu)選80％或更高同源性，更優(yōu)選90％或更高同源性的DNAs能彼此雜交，而具有低度同源性的DNAs不能彼此雜交的條件，以及在相當(dāng)于60℃，1×SSC和0.1％SDS，優(yōu)選60℃，0.1×SCC和0.1％SDS，更優(yōu)選65℃，0.1×SSC和0.1％SDS的鹽濃度下使DNAs能雜交的條件，上述條件是普通Southern雜交的洗滌條件。L-氨基酸酰胺水解酶的活性如上文所述。不過，當(dāng)一種堿基序列能在嚴(yán)格條件下與互補(bǔ)于序列表中的SEQ ID No.4所示57-1295號(hào)堿基的堿基序列的堿基序列雜交時(shí)，在50℃和pH8的條件下，它優(yōu)選保留了大約10％，優(yōu)選大約50％或更高的具有序列表中的SEQ ID No.5所示氨基酸序列的蛋白的酶活性。
另外，還可以將大體上與由序列表中的SEQ ID No.4所示DNA編碼的L-氨基酸酰胺水解酶相同的蛋白用于本發(fā)明。因此，還可以將編碼“具有在序列表中的SEQ ID No.5所示氨基酸序列上包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列，并且具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白”的DNA用于本發(fā)明。在本文中，術(shù)語(yǔ)“多種”表示不會(huì)明顯破壞具有所述氨基酸殘基的蛋白的三維結(jié)構(gòu)或L-氨基酸酰胺水解酶的活性的范圍，更具體地講，它的值為2-50，優(yōu)選2-30，更優(yōu)選2-10。另外，L-氨基酸酰胺水解酶的活性如上文所述。不過，對(duì)于在序列表中的SEQ ID No.5所示氨基酸序列上包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列來說，它優(yōu)選保留了在50℃和pH8的條件下具有序列表中的SEQ ID No.5所示氨基酸序列的蛋白的大約10％，優(yōu)選大約50％或更高的酶活性。
正如已披露的，在具有從諸如谷氨酸棒桿菌菌株ATCC 13286中分離的DNA的場(chǎng)合下，優(yōu)選將以下DNA用于本發(fā)明(i)包括序列表中的SEQ ID No.4所示57-1295號(hào)堿基的堿基序列的DNA；(ii)能在嚴(yán)格條件下與包括互補(bǔ)于序列表中的SEQ ID No.4所示57-1295號(hào)堿基的堿基序列的堿基序列的多核苷酸雜交，并且編碼具有能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)的L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白的DNA；(iii)編碼具有序列表中的SEQ ID No.5所示氨基酸序列的蛋白的DNA；和(iv)編碼具有在序列表中的SEQ ID No.5所示氨基酸序列上包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列，并且具有能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)的L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白的DNA。
轉(zhuǎn)化體的生產(chǎn)下面將說明能表達(dá)具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白的轉(zhuǎn)化體的生產(chǎn)。利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)酶，生理學(xué)活性物質(zhì)和其他有用蛋白的多種例子是已知的，并且重組DNA技術(shù)的使用能夠大量生產(chǎn)在天然狀態(tài)下僅以微小數(shù)量存在的有用蛋白。
可以用于本發(fā)明方法生產(chǎn)中的轉(zhuǎn)化體的優(yōu)選例子，包括能夠表達(dá)下面的蛋白(A)，(B)或(C)的轉(zhuǎn)化體。
(A)具有序列表中的SEQ ID No.5所示氨基酸序列的蛋白，(B)具有在序列表中的SEQ ID No.5所示的氨基酸序列上包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列，并且具有能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)的L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白，(C)由能在嚴(yán)格條件下與包括互補(bǔ)于序列表的SEQ ID No.4所示堿基序列的堿基序列的多核苷酸雜交的DNA編碼的蛋白，并且編碼具有能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)的L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白。
為了生產(chǎn)能表達(dá)具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的上述(A)-(C)蛋白的轉(zhuǎn)化體，應(yīng)當(dāng)將上述[III-1]部分中所述的(i)-(iv)的DNA插入宿主細(xì)胞。即，將(i)，(ii)，(iii)或(iv)的DNA整合在一種表達(dá)載體上，在將所述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞之后，該載體能在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)。
在使用重組DNA技術(shù)大量生產(chǎn)蛋白的場(chǎng)合下，將所述蛋白綴合在能生產(chǎn)所述蛋白的轉(zhuǎn)化體內(nèi)，以便生產(chǎn)蛋白的包含體，這也是實(shí)施本發(fā)明的一種優(yōu)選方式。該表達(dá)和生產(chǎn)方法的優(yōu)點(diǎn)包括，保護(hù)靶蛋白免受存在于微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶的消化作用，并且通過在破碎所述微生物細(xì)胞之后進(jìn)行離心分離簡(jiǎn)單地純化靶蛋白。
以這種方式獲得的蛋白包含體，在經(jīng)過活性再生過程之后被轉(zhuǎn)化成適當(dāng)折疊的、具有生理學(xué)活性的蛋白，所述再生過程主要包括用一種蛋白變性劑溶解所述蛋白，然后除去所述變性劑。有多種有關(guān)再生的例子，包括再生白介素-2的活性(特開昭61-257931號(hào)公報(bào))。
為了從蛋白包含體中獲得活性蛋白，需要一系列操作，包括溶解和活性再生，并且該方法比直接生產(chǎn)所述活性蛋白的方法更為復(fù)雜。不過，在微生物細(xì)胞內(nèi)大量生產(chǎn)對(duì)微生物生長(zhǎng)具有有害作用的蛋白時(shí)，通過在所述微生物細(xì)胞內(nèi)以蛋白的無(wú)活性包含體形式積累所述蛋白可以抑制所述作用。
以包含體形式大量生產(chǎn)靶蛋白的例子包括在高效啟動(dòng)子的控制下獨(dú)立表達(dá)靶蛋白的方法，以及以與已知能大量表達(dá)的蛋白融合的融合蛋白形式表達(dá)靶蛋白的方法。
另外，還可以將限制蛋白酶的識(shí)別序列安排在合適的位點(diǎn)，以便在以融合蛋白形式表達(dá)之后裂解所述靶蛋白。
在利用重組DNA技術(shù)大量生產(chǎn)蛋白的場(chǎng)合下，盡管被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的例子包括細(xì)菌細(xì)胞、放線菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、霉菌細(xì)胞、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞，不過，通常使用的是諸如大腸桿菌的腸道細(xì)菌。這是因?yàn)楝F(xiàn)有多條信息都提到了利用大腸桿菌大量生產(chǎn)蛋白的技術(shù)。下面提供了對(duì)利用轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌生產(chǎn)L-氨基酸酰胺水解酶的方法的一種形式的說明。
可以將通常被用于在大腸桿菌中進(jìn)行異源蛋白生產(chǎn)的啟動(dòng)子用作表達(dá)編碼L-氨基酸酰胺水解酶的DNA的啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子的例子包括高效啟動(dòng)子，如T7啟動(dòng)子，trp啟動(dòng)子，lac啟動(dòng)子，trc啟動(dòng)子，tac啟動(dòng)子，入噬菌體PR啟動(dòng)子和PL啟動(dòng)子。
為了以融合蛋白的包含體形式生產(chǎn)L-氨基酸酰胺水解酶，可以將編碼另一種蛋白，優(yōu)選編碼親水性肽的基因連接在L-氨基酸酰胺水解酶基因的上游或下游，以便獲得融合蛋白基因。所述編碼另一種蛋白的基因可以是能夠提供融合蛋白的提高了的積累量和在變性和再生步驟之后提高融合蛋白的溶解度的基因。例如，所述基因的候選者包括T7基因10，β-半乳糖苷酶基因，脫氫葉酸還原酶基因，干擾素γ基因，白介素-2基因和原凝乳酶基因。
在連接所述基因與編碼L-氨基酸酰胺水解酶的基因時(shí)，使密碼子讀框匹配?？梢詫⑺鼈冞B接在合適的限制酶位點(diǎn)上，或者可以使用具有合適序列的合成DNA。
另外，為了提高生產(chǎn)量，優(yōu)選將終止子形式的轉(zhuǎn)錄終止序列連接在所述融合蛋白基因的下游。該終止子的例子包括T7終止子，fd噬菌體終止子，T4終止子，四環(huán)素抗性基因終止子和大腸桿菌trpA基因終止子。
優(yōu)選用所謂的多拷貝載體作為將編碼L-氨基酸酰胺水解酶或包括L-氨基酸酰胺水解酶和另一種蛋白的融合蛋白的基因?qū)氪竽c桿菌，所述載體的例子包括具有源于ColE1的復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒，如pUC質(zhì)粒，pBR322質(zhì)粒或它的衍生物?！把苌铩北硎就ㄟ^堿基取代、缺失、插入、添加或倒位修飾所述質(zhì)粒的結(jié)果。另外，在本文中所說的修飾，包括由通過誘變劑或UV輻射進(jìn)行誘變處理或自發(fā)突變所導(dǎo)致的修飾。更具體地講，可以使用的載體的例子包括pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219和pMW218。另外，還可以使用噬菌體DNA的載體。
另外，所述載體優(yōu)選具有諸如氨芐青霉素抗性的標(biāo)記，以便篩選轉(zhuǎn)化體?？梢杂猛ㄟ^商業(yè)渠道獲得的具有高效啟動(dòng)子的表達(dá)載體作為所述質(zhì)粒(如pUC載體(由寶酒造公司生產(chǎn))，pPROK載體(由Clontech生產(chǎn))和pKK233-2載體(由Clontech生產(chǎn)))。
重組DNA是通過將DNA片段連接在載體DNA上獲得的。在這種場(chǎng)合下，按以下順序連接啟動(dòng)子，編碼L-氨基酸酰胺水解酶或包括L-氨基酸酰胺水解酶和另一種蛋白的融合蛋白的基因，并且根據(jù)情況包括一個(gè)終止子。
用所述重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并且培養(yǎng)所得到的大腸桿菌，導(dǎo)致了L-氨基酸酰胺水解酶或包括L-氨基酸酰胺水解酶和另一種蛋白的融合蛋白的表達(dá)和生產(chǎn)。盡管可以將常用于異源基因表達(dá)的菌株用作要轉(zhuǎn)化的宿主，舉例來說，大腸桿菌菌株JM109是優(yōu)選的。用于實(shí)施轉(zhuǎn)化的方法以及用于篩選轉(zhuǎn)化體的方法披露于Molecular Cloning，2ndEdition，Cold Spring Harbor Press(1989)和其他文獻(xiàn)中。
在以融合蛋白形式表達(dá)時(shí)，可以用限制性蛋白酶裂解重組L-氨基酸酰胺水解酶，所述蛋白酶使用了不存在L-氨基酸酰胺水解酶上的序列作為識(shí)別序列，如凝血因子Xa或激肽釋放酶。
可以將常用于培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基，如M9-酪蛋白氨基酸培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基用作生產(chǎn)培養(yǎng)基。另外，可以根據(jù)所使用的載體的標(biāo)記、啟動(dòng)子、宿主微生物的類型等，適當(dāng)選擇培養(yǎng)條件和生產(chǎn)誘導(dǎo)條件。
可以用以下方法回收L-氨基酸酰胺水解酶或包括L-氨基酸酰胺水解酶和另一種蛋白的融合蛋白。如果L-氨基酸酰胺水解酶或它的融合蛋白已經(jīng)溶解在所述微生物細(xì)胞內(nèi)的話，在回收所述微生物細(xì)胞之后，破碎或裂解所述微生物細(xì)胞，以便可將其用作粗制酶液體。另外，在使用之前，可以根據(jù)需要通過諸如沉淀或過濾、柱層析的普通技術(shù)，純化L-氨基酸酰胺水解酶或它的融合蛋白。在這種場(chǎng)合下，還可以使用利用L-氨基酸酰胺水解酶或它的融合蛋白的抗體的純化方法。
在生產(chǎn)蛋白包含體的場(chǎng)合下，用一種變性劑溶解所述包含體。盡管可以用微生物細(xì)胞蛋白溶解它們，考慮到以下純化方法，優(yōu)選分離所述包含體，然后再溶解?？梢杂靡阎椒◤募?xì)菌細(xì)胞中回收包含體。例如，可以通過破碎細(xì)菌細(xì)胞，然后離心分離回收包含體。能夠溶解蛋白包含體的變性劑的例子包括鹽酸胍(例如，6摩爾(M)，pH 5-8)和尿素(例如8M)。
例如，通過透析除去所述變性劑，再生具有活性的蛋白。在透析時(shí)，可以利用Tris-HCl或磷酸緩沖液等作為透析溶液，并且，舉例來說，其濃度可以為20毫摩爾(mM)-0.5M，舉例來說，pH可以為5-8。
在再生步驟期間，蛋白的濃度優(yōu)選保持在大約500μg/ml或更低。透析溫度優(yōu)選等于或低于5℃，以便抑制再生的L-氨基酸酰胺水解酶出現(xiàn)自我交聯(lián)。另外，除了透析之外，還可以利用稀釋或超濾除去變性劑，并且預(yù)計(jì)通過采用上述任意一種方法都能夠再生所述酶活性。
在將序列表中的SEQ ID No.4所示DNA用作編碼L-氨基酸酰胺水解酶的DNA時(shí)，生產(chǎn)了具有SEQ ID No.5所示氨基酸序列的L-氨基酸酰胺水解酶。
應(yīng)當(dāng)指出的是，可以按照在諸如Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press(1989)的文獻(xiàn)中披露的技術(shù)，實(shí)施遺傳工程技術(shù)。
二肽生產(chǎn)方法本發(fā)明的二肽生產(chǎn)方法，利用具有能夠由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的活性的酶或含有酶的物質(zhì)，由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸酰生產(chǎn)二肽，更具體地講，利用微生物培養(yǎng)物，從所述培養(yǎng)物中分離的微生物細(xì)胞和來自所述微生物的處理過的微生物細(xì)胞。
上述L-氨基酸酰胺水解酶具有通過水解L-氨基酸酰胺形成L-氨基酸的活性，以及通過利用L-氨基酸酰胺和L-氨基酸作底物生產(chǎn)二肽的活性。
圖1是本發(fā)明二肽生產(chǎn)方法的流程圖。
首先，在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的能力的微生物，并且在所述培養(yǎng)物和/或細(xì)胞中生產(chǎn)并且積累L-氨基酸酰胺水解酶(步驟S1)。
然后，通過回收并且純化L-氨基酸酰胺水解酶，生產(chǎn)純化的L-氨基酸酰胺水解酶(步驟S2)。
然后，通過將L-氨基酸酰胺和L-氨基酸添加到在步驟S2中生產(chǎn)的純化的L-氨基酸酰胺水解酶或在步驟S1中積累的L-氨基酸酰胺水解酶中，并且讓反應(yīng)能夠進(jìn)行(步驟S3)，可以大量生產(chǎn)二肽。
對(duì)于通過上述微生物生產(chǎn)L-氨基酸酰胺水解酶的方法來說，讓所述微生物作用于L-氨基酸酰胺和L-氨基酸，可以在培養(yǎng)上述微生物時(shí)將所述底物直接添加到培養(yǎng)液中，或者通過離心等從細(xì)菌培養(yǎng)物中分離微生物細(xì)胞，然后直接或者在洗滌之后將它們重新懸浮在緩沖液中，并且添加L-氨基酸酰胺和L-氨基酸，然后讓所得到的混合物起反應(yīng)。另外，可以使用已通過已知方法用聚丙烯酰胺凝膠、角叉菜膠、藻酸凝膠等固定的微生物細(xì)胞。
另外，可以將破碎的微生物細(xì)胞、丙酮處理過的微生物細(xì)胞或冷凍干燥的微生物細(xì)胞用作處理過的微生物細(xì)胞制品。將諸如超聲波破碎、弗氏壓力破碎和玻璃珠破碎的方法用于破碎微生物細(xì)胞，不過，在裂解微生物細(xì)胞的場(chǎng)合下，可以使用卵白溶菌酶的方法，肽酶處理或它們的合適的組合。
另外，可以從處理過的微生物細(xì)胞制品中回收L-氨基酸酰胺水解酶，并且用作粗制酶液體，或者在必要時(shí)，在使用之前純化所述酶?？梢杂闷胀讣兓椒兓瘡呐囵B(yǎng)物中獲得的酶。更具體地講，通過離心分離等方法收集微生物細(xì)胞，然后通過機(jī)械方法破碎所述細(xì)胞，如超聲波處理，玻璃珠或動(dòng)力磨(dynomill)，并且通過離心分離除去諸如細(xì)胞片段的固體材料，以便獲得粗制酶，然后通過進(jìn)行超級(jí)離心分離、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、離子交換層析、吸附層析、凝膠過濾層析、疏水性層析等，純化上述L-丙氨基酸酰胺水解酶。
就是說，當(dāng)一種級(jí)份具有由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸形成二肽的活性時(shí)，可以使用整個(gè)的酶和含有酶的物質(zhì)。在本文中，“含有酶的物質(zhì)”表示含有所述酶的任何物質(zhì)，并且包括諸如能產(chǎn)生所述酶的微生物的培養(yǎng)物、從所述培養(yǎng)物中分離的微生物細(xì)胞和處理過的微生物細(xì)胞的具體形式。微生物培養(yǎng)物表示通過培養(yǎng)微生物獲得的物質(zhì)，更具體地講，表示微生物細(xì)胞、用于培養(yǎng)所述微生物的培養(yǎng)基和由所培養(yǎng)的微生物生產(chǎn)的物質(zhì)的混合物。另外，可以洗滌所述微生物細(xì)胞，并且用作洗滌過的微生物細(xì)胞，或者可以使用已通過共價(jià)連接、吸附或包含方法固定的固定化細(xì)胞。另外，由于根據(jù)所使用的微生物，某些微生物在培養(yǎng)期間被部分裂解，在這種情況下，還可以將培養(yǎng)上清液用作含有酶的物質(zhì)。
所使用的酶或含有酶的物質(zhì)的量，應(yīng)當(dāng)是能夠表現(xiàn)出預(yù)期作用的量(以下稱之為“有效量”)，盡管該有效量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過簡(jiǎn)單的初步實(shí)驗(yàn)方便地加以確定，在使用洗滌過的細(xì)胞的場(chǎng)合下，舉例來說，所述使用量為每升反應(yīng)混合物1-500克(g)。
任何L-氨基酸酰胺都可用作所述L-氨基酸酰胺，只要它是能夠被L-氨基酸酰胺水解酶的底物專一性水解的L-氨基酸酰胺就行。L-氨基酸酰胺的例子不僅包括相當(dāng)于天然存在的氨基酸的L-氨基酸酰胺，而且還包括相當(dāng)于非天然存在的氨基酸或它們的衍生物的L-氨基酸酰胺。另外，由于用于本發(fā)明的L-氨基酸酰胺水解酶通過非對(duì)稱地水解消旋L-氨基酸酰胺產(chǎn)生L-氨基酸，還可以使用Strecker方法廉價(jià)合成的消旋氨基酸酰胺。在本發(fā)明中，L-氨基酸酰胺的優(yōu)選例子包括L-丙氨酸酰胺，甘氨酸酰胺和L-天冬氨酸酰胺，特別優(yōu)選的是L-丙氨酸酰胺。
對(duì)L-氨基酸沒有具體限制，只要它能通過L-氨基酸酰胺水解酶的底物專一性作用與L-氨基酸酰胺形成二肽就行，并且可以使用已知的L-氨基酸。L-氨基酸的優(yōu)選例子包括L-谷氨酰胺，L-天冬酰胺，甘氨酸，L-丙氨酸，L-纈氨酸，L-亮氨酸，L-異亮氨酸，L-甲硫氨酸，L-脯氨酸，L-苯丙氨酸，L-色氨酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸，L-酪氨酸，L-賴氨酸，L-精氨酸，L-組氨酸，和L-谷氨酰胺，特別優(yōu)選L-谷氨酸和L-天冬酰胺。
可以通過選擇上述每一種L-氨基酸酰胺和L-氨基酸中的一種類型生產(chǎn)二肽，或者可以通過篩選兩種以上類型生產(chǎn)二肽。
被用作原始材料的L-氨基酸酰胺和L-氨基酸的濃度分別為1mM-10M，優(yōu)選0.1-2M。不過，在某些場(chǎng)合下，所添加的L-氨基酸的數(shù)量?jī)?yōu)選等于或大于L-氨基酸酰胺的數(shù)量。另外，在必要時(shí)，例如，在高濃度底物抑制所述反應(yīng)的場(chǎng)合下，在將它們調(diào)整到不會(huì)導(dǎo)致抑制作用的濃度之后，可以在反應(yīng)期間連續(xù)添加所述底物。
反應(yīng)溫度為10-70℃，優(yōu)選20-50℃，反應(yīng)pH為2-12，優(yōu)選3-11。通過以這種方式進(jìn)行所述反應(yīng)大約2-48小時(shí)，在反應(yīng)混合物中產(chǎn)生并且積累了二肽。由于所述二肽生產(chǎn)反應(yīng)是一種平衡反應(yīng)，為了實(shí)現(xiàn)有效生產(chǎn)，通過分離所生產(chǎn)的二肽和氨讓所述反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。
實(shí)施例下面將通過實(shí)施例形式對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)地說明。不過，不應(yīng)當(dāng)將本發(fā)明理解成局限于這些實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)指出的是，在所述實(shí)施例中，L-丙氨酸，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-天冬酰胺的定量測(cè)定，是通過使用高效液相層析的方法進(jìn)行的(柱Inertsil ODS-2，由GLScience生產(chǎn)，洗脫液含水磷酸溶液(pH 2.1)，2.5mM 1-辛烷磺酸鈉/甲醇＝10/1，流速1.0mL/分鐘，檢測(cè)210納米(nm))。
實(shí)施例1 L-丙氨酰-L-天冬酰胺的生產(chǎn)將含有0.5％(w/v)酵母膏，0.5％(w/v)蛋白胨，0.5％(w/v)甘油，0.5％(w/v)氯化鈉和0.5％(w/v)L-丙氨酸酰胺氫氯酸鹽(pH 7.0)的500毫升(mL)等份樣品，分裝到500mL坂口燒瓶中，并且在120℃下滅菌20分鐘。將一整環(huán)表1所示的微生物接種到上述培養(yǎng)基中，并且在30℃和120次沖程/分鐘的條件下?lián)u晃培養(yǎng)20小時(shí)，在接種之前，所述微生物在含有0.5％(w/v)酵母膏，0.5％(w/v)蛋白胨，0.5％(w/v)甘油，0.5％(w/v)氯化鈉，0.5％(w/v)L-丙氨酸酰胺氫氯酸鹽和2％(w/v)瓊脂(pH 7.0)的斜面培養(yǎng)基上，在30℃下培養(yǎng)了24小時(shí)。在所述培養(yǎng)之后，通過離心分離所述微生物細(xì)胞，用與培養(yǎng)液等量的生理鹽水洗滌2次，并且再次離心，以便收集所述微生物細(xì)胞，然后用0.2M Tris-HCl緩沖液(pH9.0)懸浮，達(dá)到10mL的最終體積。然后將1mL的該微生物細(xì)胞懸浮液添加到4mL含有62.5mM L-丙氨酸酰胺氫氯酸鹽和250mM L-天冬酰胺的上述緩沖液中，在將總體積調(diào)整到5mL之后，讓它在30℃下反應(yīng)24小時(shí)。作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)建立了一個(gè)在其中不添加微生物細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果如表1所示。
表1


L-Ala-L-AsnL-丙氨酰-天冬酰胺實(shí)施例2從谷氨酸棒桿菌菌株ATCC 13286中純化L-丙氨酸酰胺水解酶按下文所述方法進(jìn)行酶效價(jià)的測(cè)定。添加200微摩爾Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)，50微摩爾L-丙氨酸酰胺氫氯酸鹽和合適數(shù)量的酶液體，并且混合，將最終體積調(diào)整到1ml，并且讓它在30℃下反應(yīng)60分鐘。然后，添加4ml含水磷酸溶液(pH 2.1)，以便終止該反應(yīng)。通過高效液相層析對(duì)所產(chǎn)生的L-丙氨酸進(jìn)行定量。將在1分鐘內(nèi)產(chǎn)生1微摩爾的L-丙氨酸的酶的數(shù)量定義為1個(gè)酶單位。
按與實(shí)施例1相同的方法培養(yǎng)8升谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13286，然后通過離心分離收集微生物細(xì)胞。以下過程是在冰上或在4℃下進(jìn)行的。在用50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)洗滌所述微生物細(xì)胞之后，用直徑為0.1mm的玻璃珠對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行大約10分鐘的破碎處理。然后分離所述玻璃珠和破碎的細(xì)胞液體，并且通過以20,000×g的速度離心分離30分鐘，除去破碎的細(xì)胞片段，以便獲得無(wú)細(xì)胞提取物。另外，通過以200,000×g的速度超速離心60分鐘，除去不溶性級(jí)份，以便獲得上清液形式的可溶性級(jí)份。然后將硫酸銨添加到所得到的可溶性級(jí)份中，使其達(dá)到60％的飽和度，然后通過以20,000×g的速度離心30分鐘回收沉淀物。將所得到的沉淀物溶解在少量50mM的磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)中，并且用50mM的磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)透析。將該酶溶液加樣到用50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)預(yù)平衡的Q-Sepharose HP柱上，并且用含有0-1.0M氯化鈉的線性濃度梯度的50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)洗脫所述酶。收集活性級(jí)份，并且加樣到用50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)預(yù)平衡的Superdex200pg柱上，并且用相同的緩沖液洗脫所述酶。收集活性級(jí)份，并且用含有0.5M硫酸銨的20mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)透析，然后加樣到用含有0.5M硫酸銨的20mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)預(yù)平衡的苯基-Sepharose HP柱上。然后用含有0.5-0M硫酸銨的線性濃度梯度的20mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)洗脫所述酶。收集活性級(jí)份，并且用50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)透析，然后將透析物加樣到用50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)預(yù)平衡的MonoQ柱上，用0-1.0M氯化鈉的線性濃度梯度的50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)洗脫酶。L-丙氨酸酰胺水解酶是以這種方式根據(jù)電泳均勻純化的。在表2中示出了蛋白的總量以及每一個(gè)純化步驟的活性。
表2

實(shí)施例3評(píng)估L-丙氨酸水解酶的分子量將按照實(shí)施例2的方法獲得的等同的0.5微克(μg)純化的酶制劑用于聚丙烯酰胺電泳。在電泳緩沖液中使用0.3％(w！v)Tris，1.44％(w/v)甘氨酸和0.1％(w/v)月桂基硫酸鈉，使用凝膠濃度為10-20％的濃度梯度凝膠(Multigel 10-20，由Dauchi Pure Chemicals生產(chǎn))用于所述聚丙烯酰胺凝膠，并且用精確預(yù)染色的標(biāo)準(zhǔn)物(由Biorad生產(chǎn))作為分子量標(biāo)記。在電泳結(jié)束之后，用考馬斯亮蘭R-250對(duì)所述凝膠進(jìn)行染色，并且檢測(cè)單一的帶，在該位點(diǎn)上計(jì)算出它具有42,000-46,000的分子量。
實(shí)施例4 L-丙氨酸酰胺水解酶的最佳pH的評(píng)估用在實(shí)施例2中均勻純化的L-丙氨酸酰胺水解酶水解L-丙氨酸酰胺，然后按以下方法評(píng)估能產(chǎn)生L-丙氨酸的反應(yīng)的pH。添加包括乙酸鈉緩沖液(pH 3.0-6.0)，磷酸鉀緩沖液(pH 6.0-8.0)，Tris-HCl緩沖液(pH7.0-9.0)，碳酸鈉緩沖液(pH 8.0-10.0)或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液的200μmol的緩沖液，50μmol L-丙氨酸酰胺水解酶氫氯酸鹽和適量的酶溶液，并且混合到1ml的最終體積，然后讓它們?cè)?0℃下反應(yīng)60分鐘，并且評(píng)估酶活性。在圖2中示出使用Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)確定100％活性值的結(jié)果。
實(shí)施例5評(píng)估L-丙氨酸酰胺水解酶反應(yīng)溫度用按實(shí)施例2方法均勻純化的L-丙氨酸酰胺水解酶水解L-丙氨酸酰胺，然后按以下方法評(píng)估能產(chǎn)生L-丙氨酸的反應(yīng)的反應(yīng)溫度。然后添加200μl Tris-HCl緩沖液，50μmol L-丙氨酸酰胺氫氯酸鹽和適量的酶，并且混合到1ml的最終體積，然后在25，30，40，50或60℃的溫度下，讓它們反應(yīng)60分鐘，并且評(píng)估酶活性。在圖3中示出了在40℃的反應(yīng)溫度下確定的100％活性值的結(jié)果。
實(shí)施例6 L-丙氨酰-L-天冬酰胺和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生產(chǎn)讓按實(shí)施例2方法均勻純化的L-丙氨酸酰胺水解酶作用于L-丙氨酸酰胺氫氯酸鹽和L-天冬酰胺或L-丙氨酸酰胺氫氯酸鹽和L-谷氨酰胺，以便生產(chǎn)L-丙氨酰-L-天冬酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。為了獲得L-丙氨酰-L-天冬酰胺，添加200μmol Tris-HCI緩沖液(pH 9.0)，50μmol或L-丙氨酸酰胺氫氯酸鹽，150μmol L-天冬酰胺和含有0.08個(gè)單位的L-丙氨酸酰胺水解酶的酶溶液，并且混合到1ml的最終體積。為了獲得L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，以與為了獲得相同的條件混合反應(yīng)物，所不同的是，用150μmol L-谷氨酰胺取代了150μmol的L-天冬酰胺。用一種底物建立了上述實(shí)驗(yàn)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，或者建立不添加酶的實(shí)驗(yàn)組。在30℃下的反應(yīng)溫度下讓所述反應(yīng)進(jìn)行10小時(shí)，并且在表3中示出了對(duì)所述目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行定量的結(jié)果。
表3

實(shí)施例7 L-丙氨酸酰胺水解酶基因的分離下面，將要說明L-丙氨酸酰胺水解酶基因的分離和L-丙氨酸酰胺水解酶在大腸桿菌(E.coil)中的表達(dá)。將谷氨酸棒桿菌菌株ATCC 13286用作微生物菌株。將大腸桿菌JM109用作宿主細(xì)胞，并且將pUC18用作基因分離和L-丙氨酸酰胺水解酶表達(dá)的載體。
1.根據(jù)確定的氨基酸序列生產(chǎn)PCR引物分別具有SEQ ID No2和SEQ ID No.3所示堿基序列的混合引物是根據(jù)源于上述谷氨酸棒桿菌菌株ATCC 13286的L-丙氨酸酰胺水解酶的N-末端氨基序列生產(chǎn)的。
2.微生物細(xì)胞的獲得在30℃下在CM2Gly瓊脂培養(yǎng)基(0.5g/dl甘油，1.0g/dl酵母膏，1.0g/dl蛋白胨，0.5g/dl NaCl，2g/dl瓊脂，pH 7.0)上培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌菌株ATCC 13286 24小時(shí)，以便恢復(fù)所述微生物。然后將一整環(huán)的所述微生物接種到裝有CM2Gly液體培養(yǎng)基的500ml體積的坂口燒瓶中，然后在30℃，在通氣條件下?lián)u晃培養(yǎng)16小時(shí)。
3.從微生物細(xì)胞中獲得染色體DNA對(duì)50ml培養(yǎng)液進(jìn)行離心(12,000rpm，4℃，15分鐘)，以便收集所述微生物細(xì)胞。然后將所述微生物細(xì)胞懸浮在10ml含有20mM EDTA的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)中，然后通過離心分離回收所述微生物細(xì)胞。將所述微生物細(xì)胞重新懸浮在10ml含有20mM EDTA的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)中。另外，在將0.5ml的20mg/ml溶菌酶溶液和1ml的10％SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液添加到該懸浮液中之后，在55℃下培養(yǎng)該溶液20分鐘。然后通過添加等體積的用含有1mMEDTA的10mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)飽和的苯酚對(duì)培養(yǎng)的溶液進(jìn)行脫蛋白化。將等體積的2-丙醇添加到所分離的含水層中，以便使DNA沉淀，然后回收所沉淀的DNA。將沉淀的DNA溶解在0.5ml含有20mMEDTA的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)中，然后添加5μl的10mg/mlRNase和5μl的10mg/ml蛋白酶K，并且使其在55℃下反應(yīng)2小時(shí)。在反應(yīng)之后，通過添加等體積的含有1mM EDTA的10mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)飽和的苯酚使該溶液脫蛋白化。另外，將等體積的24∶1的氯仿/異戊醇添加到分離的含水層中，以便回收所述含水層。向重復(fù)以上過程兩次所獲得的含水層中添加3M乙酸鈉溶液(pH5.2)，并且將最終濃度調(diào)整為0.4M，并且添加2倍體積的乙醇?；厥找猿恋硇问疆a(chǎn)生的DNA，并且在用70％乙醇洗滌之后，進(jìn)行干燥，并且溶解在1mM EDTA的10mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)中。
4.通過盒式(Cassette)PCR方法獲得包括L-丙氨酸酰胺水解酶基因的部分的DNA片段使用盒式PCR方法，將TaKaRa LA PCR體外克隆試劑盒(TakaraShuzo)用于分離和擴(kuò)增含有編碼L-丙氨酸酰胺水解酶的基因(aah)的DNA分子。除非另有專門說明，有關(guān)實(shí)驗(yàn)是根據(jù)在所述手冊(cè)中披露的方法進(jìn)行的。在盒式PCR方法中，在用引物1(1st PCR，SEQ ID No.2)和引物2(2nd PCR，SEQ ID No.3)作為引物時(shí)，用Eco RI盒擴(kuò)增了大約0.5kb的帶(片段1)。
作為確定該片段堿基序列的結(jié)果，證實(shí)了片段1是aah的一部分。
5.克隆來自基因文庫(kù)的L-丙氨酸酰胺水解酶基因?yàn)榱双@得完整長(zhǎng)度的aah，首先用片段1作探針進(jìn)行了Southern雜交。
被用作探針的DNA片段被制備成大約50納克/微升(ng/ml)，并且通過在37℃下將16μl的該DNA溶液與DIG High Prime(Boehringer-Mannheim)一起培養(yǎng)24小時(shí)對(duì)所述探針進(jìn)行標(biāo)記，使用所述方案。
通過組合各種限制酶徹底消化1μg的染色體DNA，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳，然后吸印到尼龍膜上(Boehringer-Mannheim，帶正電荷的尼龍膜)。然后按照已確定的方法進(jìn)行Southern雜交。雜交是用DIGEasy Hyb(Boehringer-Mannheim)進(jìn)行的，并且在50℃下雜交30分鐘之后，添加所述探針，然后在50℃下雜交18小時(shí)。用DIG核苷酸檢測(cè)試劑盒(Boehringer-Mannheim)進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果，在Bgl II裂解產(chǎn)物的大約7kb的位置上檢測(cè)到一條帶。收集該7kb的結(jié)構(gòu)域片段，并且連接在pUC18上，以便用大腸桿菌JM109產(chǎn)生一種文庫(kù)(120個(gè)菌株)。然后按照建立的方法進(jìn)行菌落雜交。然后將所述菌落轉(zhuǎn)移到尼龍膜濾膜上(Boehringer-Mannheim，用于菌落和噬斑雜交的尼龍膜)，然后進(jìn)行堿性變性，中和，和固定化處理。用DIGEasy Hyb進(jìn)行雜交。將所述濾膜浸泡在一種緩沖液中，并且在42℃下預(yù)雜交30分鐘。然后，添加上述標(biāo)記過的探針，隨后在42℃下雜交18小時(shí)。在用SSC緩沖液洗滌之后，用DIG核苷酸檢測(cè)試劑盒選擇了一個(gè)陽(yáng)性克隆。
6.源于谷氨酸棒桿菌菌株ATCC 13286的L-丙氨酸酰胺水解酶基因的堿基序列按照披露于以下文獻(xiàn)中的方法制備由所選擇的轉(zhuǎn)化體保留的質(zhì)粒Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press(1989)，并且確定靠近與所述探針雜交的部位的堿基序列。存在一個(gè)開放讀框(ORF)，它所編碼的蛋白含有L-丙氨酸酰胺水解酶的N-末端氨基酸的30個(gè)殘基，并且證實(shí)它是編碼L-丙氨酸酰胺水解酶的基因aah。在序列表的SEQ ID No.4中示出了完整長(zhǎng)度L-丙氨酸酰胺水解酶基因的堿基序列。在用Genetyx檢查所得到的ORF的同源性時(shí)，所述堿基序列表現(xiàn)出與源于丙酸桿菌屬細(xì)菌的已知脯氨酸亞氨基肽酶具有57.6％的同源性。
實(shí)施例8在大腸桿菌中表達(dá)L-丙氨酸酰胺水解酶基因構(gòu)建了與pUC18的lac啟動(dòng)子的aah下游連接的質(zhì)粒pUCAAH，以便在大腸桿菌中表達(dá)aah。用Sac I和Sma I處理用谷氨酸棒桿菌ATCC 13286的染色體DNA作模板，并且用表4所示寡核苷酸作引物通過PCR擴(kuò)增的片段，并且連接到Sac I-和Sma I-裂解的pUC18產(chǎn)物上，然后用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。從氨芐青霉素抗性菌株中篩選具有靶質(zhì)粒的菌株，并且將所構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒命名為pUCAAH。
表4用于構(gòu)建L-丙氨酸酰胺水解酶表達(dá)載體的引物

接種能在具有pUCAAH的大腸桿菌中表達(dá)L-丙氨酸酰胺水解酶的轉(zhuǎn)化體，并且在含有0.1mg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)16小時(shí)。將1ml該預(yù)培養(yǎng)液體接種到裝有50ml LB培養(yǎng)基中的500ml坂口燒瓶中，然后在37℃下進(jìn)行最后培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)之后2小時(shí)，以1mM的最終濃度添加異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，然后再培養(yǎng)3小時(shí)。在所述培養(yǎng)結(jié)束之后，收集微生物，并且洗滌，懸浮在10ml 20mM磷酸緩沖液(pH 8.0)中，然后以180W的功率進(jìn)行超聲波破碎30分鐘?；厥账鋈芤?，并且以12,000rpm的速度離心10分鐘，并且將所得到的上清液用作無(wú)細(xì)胞提取物。
實(shí)施例9測(cè)定L-丙氨酸酰胺水解酶的活性在所述培養(yǎng)結(jié)束之后，制備無(wú)細(xì)胞提取物，并且用它作為酶源，確定L-丙氨酸酰胺水解酶的活性。L-丙氨酸酰胺水解酶活性的測(cè)定是通過以下方法進(jìn)行的在30℃下培養(yǎng)含有50mML-丙氨酸酰胺，150mML-谷氨酰胺，100mMTris-HCl緩沖液(pH 9.0)，10mM EDTA和酶溶液的反應(yīng)混合物60分鐘，然后通過添加相當(dāng)于所述反應(yīng)物4倍體積的含水磷酸(pH 1.5)終止該反應(yīng)。通過HPLC確定L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的量。對(duì)于酶活性的單位來說，將在這種條件下，在1分鐘產(chǎn)生1μmol L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶活性定義為1個(gè)單位(U)。
用于分析的HPLC的條件如下文所述。
柱Inertsil ODS-2移動(dòng)相(含水磷酸溶液(pH 2.1))，2.5mM1-辛烷磺酸鈉/甲醇＝10/1柱溫度40℃流速1.0ml/分鐘檢測(cè)UV，210nm結(jié)果，在插入pUC18 AAH時(shí)檢測(cè)到了0.05U/mg L-丙氨酸酰胺水解酶活性，因此證實(shí)了克隆的aah在大腸桿菌中的表達(dá)。另外，作為對(duì)照，在僅插入PUC18檢測(cè)不到活性。
實(shí)施例10 His-標(biāo)記的L-丙氨酸酰胺水解酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)構(gòu)建能表達(dá)L-丙氨酸酰胺水解酶的質(zhì)粒pQEAAH作為pUC的lac啟動(dòng)子的His-Taq蛋白下游，以便在大腸桿菌中表達(dá)aah。用Sac I和Sma I處理用谷氨酸棒桿菌菌株ATCC 13286的染色體DNA作模板，并且用圖5所示寡核苷酸作引物通過PCR擴(kuò)增的片段，并且連接到用Sac I-Sma I-裂解的pQE-30(Qiagen)的產(chǎn)物上，并且用所得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。從氨芐青霉素抗性菌株中篩選具有所述靶質(zhì)粒的菌株，并且將所構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒定義為pQEAAH。
表5用于構(gòu)建His-標(biāo)記L-丙氨酸酰胺水解酶表達(dá)載體的引物

當(dāng)按上述方法測(cè)定在具有pQEAAH的大腸桿菌中表達(dá)的L-丙氨酸酰胺水解酶的轉(zhuǎn)化體的活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)它具有0.48U/mg的L-丙氨酸酰胺水解酶活性。
實(shí)施例11 His-標(biāo)記純化酶的制備按照上述方法破碎來自具有pQEAAH的大腸桿菌JM109的100ml培養(yǎng)液的微生物細(xì)胞，并且用His Trap試劑盒(由Amersham PharmaciaBiotech生產(chǎn))，按照該試劑盒提供的方案純化His-標(biāo)記的L-丙氨酸酰胺水解酶。獲得了24毫克蛋白，它在SDS-PAGE上表現(xiàn)出一條帶，并且該蛋白的L-丙氨酸酰胺水解酶的比活性為13.4U/mg。與L-丙氨酸酰胺相比，Ala-Gln的產(chǎn)率為7.2％。
實(shí)施例12用His-標(biāo)記純化的酶研究底物專一性用His-標(biāo)記純化的酶研究了所獲得的L-丙氨酸酰胺水解酶對(duì)除了實(shí)施例6所示L-丙氨酰-L-天冬酰胺和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺以外的肽的合成。
(1)L-丙氨酸酰胺和其他L-氨基酸的肽合成通過在25℃下培養(yǎng)含有100mM L-丙氨酸酰胺，150mM實(shí)驗(yàn)氨基酸，100mM Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)，10mM EDTA和酶溶液(0.0045U/ml)3小時(shí)，實(shí)施所述合成反應(yīng)，然后通過HPLC定量所生產(chǎn)的肽。結(jié)果，除了L-丙氨酰-L-天冬酰胺和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺之外，產(chǎn)生了下面所示出的多種其他的肽。在用甘氨酸作為實(shí)驗(yàn)氨基酸時(shí)，合成了7.54mM L-丙氨酰-甘氨酸，在使用L-丙氨酸時(shí)，合成了10.11mM L-丙氨酰-L-丙氨酸，在使用L-纈氨酸時(shí)，合成了9.72mM L-丙氨酰-L-纈氨酸，在使用L-亮氨酸時(shí)，合成了9.60mM L-丙氨酰-L-亮氨酸，在使用L-異亮氨酸時(shí)，合成了14.11mM L-丙氨酰-L-異亮氨酸，在使用L-甲硫氨酸時(shí)，合成了14.49mM L-丙氨酰-L-甲硫氨酸，在使用L-脯氨酸時(shí)，合成了0.81mM L-丙氨酰-L-脯氨酸，在使用L-苯丙氨酸時(shí)，合成了13.42mM L-丙氨酰-L-苯丙氨酸，在使用L-色氨酸時(shí)，合成了10.09mML-丙氨酰-L-色氨酸，在使用L-絲氨酸時(shí)，合成了24.67mM L-丙氨酰-L-絲氨酸，在使用L-蘇氨酸時(shí)，合成了20.76mM L-丙氨酰-L-蘇氨酸，在使用L-酪氨酸時(shí)，合成了1.52mM L-丙氨酰-L-酪氨酸，在使用L-賴氨酸時(shí)，合成了18.83mM L-丙氨酰-L-賴氨酸，在使用L-精氨酸時(shí)，合成了27.69mM L-丙氨酰-L-精氨酸，在使用L-組氨酸時(shí)，合成了12.52mML-丙氨酰-L-組氨酸，在使用L-谷氨酸時(shí)，合成了1.20mM L-丙氨酰-L-谷氨酸。
(2)由其他L-氨基酸進(jìn)行的肽合成和用甘氨酸酰胺和L-天冬氨酸-α-酰胺取代L-丙氨酸酰胺進(jìn)行的L-谷氨酰胺肽合成。
通過在25℃下培養(yǎng)含有100mM實(shí)驗(yàn)氨基酸酰胺，150mM L-谷氨酰胺，100mM Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)，10mM EDTA和酶(0.0045U/ml)的反應(yīng)混合物3小時(shí)，進(jìn)行所述合成反應(yīng)，然后通過HP LC定量所產(chǎn)生的肽。結(jié)果，在使用甘氨酸酰胺時(shí)，合成了17.7mM甘氨酰-L-谷氨酰胺。另外，在使用L-天冬氨酸-α-酰胺時(shí)，產(chǎn)生了21.2mMα-L-天冬氨酰-谷氨酰胺。
正如上文所述，已明確證實(shí)了按上述方法獲得的L-丙胺酸酰胺水解酶能夠使用各種類型的L-氨基酸酰胺和L-氨基酸作為底物。因此，明確證實(shí)了將所得到的酶稱為L(zhǎng)-氨基酸酰胺水解酶比將它稱作L-丙氨酸酰胺水解酶更為合適。
SEQ ID No.1源于谷氨酸棒桿菌的L-丙氨酸酰胺水解酶的N-末端氨基酸序列SEQ ID No.2PCR引物SEQ ID No.3PCR引物SEQ ID No.4源于谷氨酸棒桿菌的L-丙氨酸酰胺水解酶的CDS序列SEQ ID No.5源于谷氨酸棒桿菌的L-丙氨酸酰胺水解酶的氨基酸序列SEQ ID No.6引物SEQ ID No.7引物SEQ ID No.8引物工業(yè)應(yīng)用性根據(jù)本發(fā)明的二肽生產(chǎn)方法，可以使用能夠較廉價(jià)地獲得的L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽，而不進(jìn)行復(fù)雜的合成方法。這樣，可以降低可用作藥物材料，功能食品等的二肽的生產(chǎn)成本。另外，根據(jù)本發(fā)明的二肽生產(chǎn)方法，可以用各種類型的L-氨基酸酰胺和L-氨基酸作為原材料生產(chǎn)各種類型的二肽。另外，本發(fā)明的L-氨基酸酰胺水解酶，優(yōu)選被用于本發(fā)明的二肽生產(chǎn)方法中。
序列表<110>味之素公司<120>二肽生產(chǎn)方法，所用的L-氨基酸酰胺水解酶，以及L-氨基酸酰胺水解酶生產(chǎn)方法<130>PAMA-14170<150>日本專利申請(qǐng)2001-226568<151>2001-07-26<150>日本專利申請(qǐng)2001-310547<151>2001-10-05<160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>30<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>1Thr Lys Thr Leu Gly Ser Leu Gln Leu Glu Glu Ile Thr Leu Thr Leu1 5 10 15Pro Leu Thr Glu Asp Val Ala Asp Glu Xaa Arg Xaa Glu Xaa20 25 30<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述盒式PCR引物1<400>2gghwsnytbc arytbgarga ratyac 26<210>3
<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述盒式PCR引物2<400>3carytbgarg aratyacbyt bacbytb 27<210>4<211>1307<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>CDS<222>(57)..(1295)<400>4ggcgagctcg ggcagtggtg ggggtggtgt ccacccctgc gcgtaacctg ggaagc atg 59Met1act aaa aca ctt ggt tcc ctt caa ctt gaa gaa att acc ttg acg ctc 107Thr Lys Thr Leu Gly Ser Leu Gln Leu Glu Glu Ile Thr Leu Thr Leu5 10 15cct ctg act gaa gat gtg gcc gat gaa cgc acc att gat gtg ttc gca 155Pro Leu Thr Glu Asp Val Ala Asp Glu Arg Thr Ile Asp Val Phe Ala20 25 30cgc att gcc aca cgc gtc ggt ggg gaa gac ctt cca tat tta gta ttc 203Arg Ile Ala Thr Arg Val Gly Gly Glu Asp Leu Pro Tyr Leu Val Phe35 40 45ctg cag ggt ggg cct ggc aat gaa gct cca cgt cca agc ctt aat ccc 251Leu Gln Gly Gly Pro Gly Asn Glu Ala Pro Arg Pro Ser Leu Asn Pro50 55 60 65ctc aac ccc aat tgg ttg ggc gtg gcc ttg gag gaa tac cgc gtg gtc 299Leu Asn Pro Asn Trp Leu Gly Val Ala Leu Glu Glu Tyr Arg Val Val70 75 80
atg ttg gat caa cgt ggc acc ggc cgt tcc acc cca gtg ggt aat gat 347Met Leu Asp Gln Arg Gly Thr Gly Arg Ser Thr Pro Val Gly Asn Asp85 90 95att ttg gaa aaa ccc aca gca gaa gta gtg gag tac tta tcc cac ctg 395Ile Leu Glu Lys Pro Thr Ala Glu Val Val Glu Tyr Leu Ser His Leu100 105 110cgc gca gat ggc att gtg cga gat gct gaa gcc ctg cgt aag cat ttg 443Arg Ala Asp Gly Ile Val Arg Asp Ala Glu Ala Leu Arg Lys His Leu115 120 125ggt gtg aat cag tgg aac ctt tta ggc cag tcc ttc gga ggt ttc acc 491Gly Val Asn Gln Trp Asn Leu Leu Gly Gln Ser Phe Gly Gly Phe Thr130 135 140 145acc ctg cat tac ttg tcc cgg cac gcc gat tcc ttg gac aac gtg ttt 539Thr Leu His Tyr Leu Ser Arg His Ala Asp Ser Leu Asp Asn Val Phe150 155 160att acc ggc ggt ctc agc gct att gat cgc cca gca gaa gac gtg tat 587Ile Thr Gly Gly Leu Ser Ala Ile Asp Arg Pro Ala Glu Asp Val Tyr165 170 175gcc aac tgt tac aac cgc atg cgc cga aac tct gag gaa ttc tac cgt 635Ala Asn Cys Tyr Asn Arg Met Arg Arg Asn Ser Glu Glu Phe Tyr Arg180 185 190cgc ttc ccg caa tta cgg gaa act ttc cga ggg ttg gtt aat cgt gct 683Arg Phe Pro Gln Leu Arg Glu Thr Phe Arg Gly Leu Val Asn Arg Ala195 200 205cgc gcc ggg gag att gtg ctt ccc acc ggc gaa gtt gtg tca gaa acc 731Arg Ala Gly Glu Ile Val Leu Pro Thr Gly Glu Val Val Ser Glu Thr210 215 220 225agg ctg cga tcc ctt ggt cac ttg ttg ggt agc aat gac ggc tgg ttt 779Arg Leu Arg Ser Leu Gly His Leu Leu Gly Ser Asn Asp Gly Trp Phe230 235 240gat ctg tac aac ctg ctg gaa tta gat ccc acc tcc aac gct ttt gtc 827Asp Leu Tyr Asn Leu Leu Glu Leu Asp Pro Thr Ser Asn Ala Phe Val245 250 255
cat gac ctg gca gga ctt ttg cct ttc ggc aac cgc aac cca att tat 875His Asp Leu Ala Gly Leu Leu Pro Phe Gly Asn Arg Asn Pro Ile Tyr260 265 270tac gtg ctc cat gag tcc tct tac gcc gac ggt gtg gtg aca aat tgg 923Tyr Val Leu His Glu Ser Ser Tyr Ala Asp Gly Val Val Thr Asn Trp275 280 285gca gca gag cgt gtg ctt cca gag gat ttc cgc gag gat cca aca ctg 971Ala Ala Glu Arg Val Leu Pro Glu Asp Phe Arg Glu Asp Pro Thr Leu290 295 300 305ctc acc ggt gag cac gtg ttc cag gag tgg aca gac acc gtg ccg tcg 1019Leu Thr Gly Glu His Val Phe Gln Glu Trp Thr Asp Thr Val Pro Ser310 315 320ctc aag ccg tgg aag gac gtt gcc ctg gca ttg gct cag cag gaa tgg 1067Leu Lys Pro Trp Lys Asp Val Ala Leu Ala Leu Ala Gln Gln Glu Trp325 330 335ccc aag ctt tat gat gcg aag gca ttg gaa aac tca cag gcc aag ggc 1115Pro Lys Leu Tyr Asp Ala Lys Ala Leu Glu Asn Ser Gln Ala Lys Gly340 345 350gct gca gca gtg tat ghc aat gac gtt ttc gtc cca gtg gat tac tct 1163Ala Ala Ala Val Tyr Xaa Asn Asp Val Phe Val Pro Val Asp Tyr Ser355 360 365ctg gaa acc gca caa cac ctg ccc ggt gtg cag ctg ttt atc acc agc 1211Leu Glu Thr Ala Gln His Leu Pro Gly Val Gln Leu Phe Ile Thr Ser370 375 380 385cag cat gaa cac aat gga ctt cgt gcc agc tca ggc gca gta ctg rag 1259Gln His Glu His Asn Gly Leu Arg Ala Ser Ser Gly Ala Val Leu Xaa390 395 400cac ctt ttc gat ctg gcc cac ggc cga gag gta cgc tgagggcccc cg 1307His Leu Phe Asp Leu Ala His Gly Arg Glu Val Arg405 410<210>5<211>413
<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>5Met Thr Lys Thr Leu Gly Ser Leu Gln Leu Glu Glu Ile Thr Leu Thr1 5 10 15Leu Pro Leu Thr Glu Asp Val Ala Asp Glu Arg Thr Ile Asp Val Phe20 25 30Ala Arg Ile Ala Thr Arg Val Gly Gly Glu Asp Leu Pro Tyr Leu Val35 40 45Phe Leu Gln Gly Gly Pro Gly Asn Glu Ala Pro Arg Pro Ser Leu Asn50 55 60Pro Leu Asn Pro Asn Trp Leu Gly Val Ala Leu Glu Glu Tyr Arg Val65 70 75 80Val Met Leu Asp Gln Arg Gly Thr Gly Arg Ser Thr Pro Val Gly Asn85 90 95Asp Ile Leu Glu Lys Pro Thr Ala Glu Val Val Glu Tyr Leu Ser His100 105 110Leu Arg Ala Asp Gly Ile Val Arg Asp Ala Glu Ala Leu Arg Lys His115 120 125Leu Gly Val Asn Gln Trp Asn Leu Leu Gly Gln Ser Phe Gly Gly Phe130 135 140Thr Thr Leu His Tyr Leu Ser Arg His Ala Asp Ser Leu Asp Asn Val145 150 155 160Phe Ile Thr Gly Gly Leu Ser Ala Ile Asp Arg Pro Ala Glu Asp Val165 170 175Tyr Ala Asn Cys Tyr Asn Arg Met Arg Arg Asn Ser Glu Glu Phe Tyr180 185 190Arg Arg Phe Pro Gln Leu Arg Glu Thr Phe Arg Gly Leu Val Asn Arg195 200 205Ala Arg Ala Gly Glu Ile Val Leu Pro Thr Gly Glu Val Val Ser Glu
210 215 220Thr Arg Leu Arg Ser Leu Gly His Leu Leu Gly Ser Asn Asp Gly Trp225 230 235 240Phe Asp Leu Tyr Asn Leu Leu Glu Leu Asp Pro Thr Ser Asn Ala Phe245 250 255Val His Asp Leu Ala Gly Leu Leu Pro Phe Gly Asn Arg Asn Pro Ile260 265 270Tyr Tyr Val Leu His Glu Ser Ser Tyr Ala Asp Gly Val Val Thr Asn275 280 285Trp Ala Ala Glu Arg Val Leu Pro Glu Asp Phe Arg Glu Asp Pro Thr290 295 300Leu Leu Thr Gly Glu His Val Phe Gln Glu Trp Thr Asp Thr Val Pro305 310 315 320Ser Leu Lys Pro Trp Lys Asp Val Ala Leu Ala Leu Ala Gln Gln Glu325 330 335Trp Pro Lys Leu Tyr Asp Ala Lys Ala Leu Glu Asn Ser Gln Ala Lys340 345 350Gly Ala Ala Ala Val Tyr Xaa Asn Asp Val Phe Val Pro Val Asp Tyr355 360 365Ser Leu Glu Thr Ala Gln His Leu Pro Gly Val Gln Leu Phe Ile Thr370 375 380Ser Gln His Glu His Asn Gly Leu Arg Ala Ser Ser Gly Ala Val Leu385 390 395 400Xaa His Leu Phe Asp Leu Ala His Gly Arg Glu Val Arg405 410<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述引物<400>6ggcgagctcg ggcagtggtg ggggtggtgt 30<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>7cgggggccct cagcgtacct ctcggccgtg 30<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>8ggcgagctca tgactaaaac acttggttcc30.
1權(quán)利要求
1.一種二肽生產(chǎn)方法，包括利用具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的酶或含有酶的物質(zhì)，由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽。
2.如權(quán)利要求1的二肽生產(chǎn)方法，其中酶或含有酶的物質(zhì)是選自下列的一種或兩種以上類型具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的微生物培養(yǎng)物，從所述培養(yǎng)物中分離的微生物細(xì)胞，以及來自所述微生物的處理過的微生物細(xì)胞制品。
3.如權(quán)利要求2的二肽生產(chǎn)方法，其中微生物屬于芽孢桿菌屬，棒桿菌屬，歐文氏菌屬，紅球菌屬，黃金桿菌屬，微球菌屬，假單胞菌屬，隱球菌屬，絲孢酵母屬，紅冬孢酵母屬，擲孢酵母屬，銀耳屬，有孢圓酵母屬，梗孢酵母屬或紅酵母屬。
4.如權(quán)利要求1的二肽生產(chǎn)方法，其中酶是蛋白(A)或(B)(A)具有序列表中的SEQ ID No.5所示氨基酸序列的蛋白；和(B)具有在序列表中的SEQ ID No.5的氨基酸序列上包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列的蛋白，并且具有L-氨基酸酰胺水解酶活性，這種活性能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)。
5.如權(quán)利要求1的二肽生產(chǎn)方法，其中酶是由(C)的DNA編碼的蛋白(C)能在嚴(yán)格條件下與由和序列表中的SEQ ID No.4所示堿基序列的57-1295號(hào)堿基互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸雜交，并且編碼具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白的DNA，所述活性能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)。
6.如權(quán)利要求2的二肽生產(chǎn)方法，其中微生物是已轉(zhuǎn)化過的微生物，以便能夠表達(dá)蛋白(A)、(B)或(C)(A)具有序列表中的SEQ ID No.5所示氨基酸序列的蛋白；(B)具有在序列表中的SEQ ID No.5的氨基酸序列上包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列的蛋白，并且具有L-氨基酸酰胺水解酶活性，這種活性能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)；和(C)由一種DNA編碼的蛋白，該DNA能在嚴(yán)格條件下與由和序列表中的SEQ ID No.4所示堿基序列的57-1295號(hào)堿基互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸雜交，并且編碼具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白，它能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)。
7.如權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的二肽生產(chǎn)方法，其中L-氨基酸酰胺是選自L-丙氨酸酰胺，甘氨酸酰胺和L-天冬氨酸-α-酰胺的一種或兩種以上的類型。
8.如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)的二肽生產(chǎn)方法，其中L-氨基酸是是選自下列的一種或兩種以上類型L-谷氨酰胺，L-天冬酰胺，甘氨酸，L-丙氨酸，L-纈氨酸，L-亮氨酸，L-異亮氨酸，L-甲硫氨酸，L-脯氨酸，L-苯丙氨酸，L-色氨酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸，L-酪氨酸，L-賴氨酸，L-精氨酸，L-組氨酸和L-谷氨酰胺。
9.一種L-氨基酸酰胺水解酶，它從屬于以下屬的微生物中獲得歐文氏菌屬，紅球菌屬，黃金桿菌屬，微球菌屬，隱球菌屬，絲孢酵母屬，紅冬孢酵母屬，擲孢酵母屬，銀耳屬，有孢圓酵母屬，梗孢酵母屬或紅酵母屬，所述酶能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)。
10.L-氨基酸酰胺水解酶的生產(chǎn)方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于以下屬的微生物歐文氏菌屬，紅球菌屬，黃金桿菌屬，微球菌屬，隱球菌屬，絲孢酵母屬，紅冬孢酵母屬，擲孢酵母屬，銀耳屬，有孢圓酵母屬，梗孢酵母屬或紅酵母屬，并且在所述培養(yǎng)基和/或細(xì)胞中積累能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)的L-氨基酸酰胺水解酶。
11.L-氨基酸酰胺水解酶的生產(chǎn)方法，包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化過的微生物，以便能夠表達(dá)蛋白(A)、(B)或(C)(A)具有序列表中的SEQ ID No.5所示氨基酸序列的蛋白；(B)具有在序列表中的SEQ ID No.5所示氨基酸序列上包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列的蛋白，并且具有L-氨基酸酰胺水解酶活性，這種活性能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)；和(C)由一種DNA編碼的蛋白，該DNA能在嚴(yán)格條件下與由和序列表中的SEQ ID No.4所示堿基序列的57-1295號(hào)堿基互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸雜交，并且編碼具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的蛋白，它能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)，并且在所述培養(yǎng)基和/或細(xì)胞中積累能催化由L-氨基酸酰胺和L-氨基酸生產(chǎn)二肽的反應(yīng)的L-氨基酸酰胺水解酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于通過常規(guī)途徑用較廉價(jià)的并且容易獲得的材料作為起始材料生產(chǎn)二肽的方法。即，通過使用能夠由L－氨基酸酰胺和L－氨基酸合成二肽的微生物培養(yǎng)物，從所述培養(yǎng)物中分離的微生物細(xì)胞或來自所述微生物的處理過的微生物細(xì)胞制品，由L－氨基酸酰胺和L－氨基酸生產(chǎn)二肽。
文檔編號(hào)C12N1/19GK1535279SQ0281484
公開日2004年10月6日 申請(qǐng)日期2002年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月26日
發(fā)明者野崎博之, 吉良郁夫, 鈴木園子, 橫關(guān)健三, 三, 夫, 子 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社