專利名稱：平行，反平行,同源或互補(bǔ)結(jié)合的核酸的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在諸如雙鏈體，三鏈體和四鏈體的復(fù)合體中的核堿基結(jié)合，更具體涉及在含單鏈或雙鏈核堿基的探針和含單鏈或雙鏈核堿基的靶序列之間通過特異性結(jié)合形成這種復(fù)合體的方法。
2.相關(guān)技術(shù)描述核酸的沃森-克里克模型近50年來在分子生物學(xué)中一直認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)。正如James watson在其題為“DNA結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)的人名冊(cè)(A PersonalAccount of the Discovery of the Structure of DNA)”(1968)的書中所敘述，沃森-克里克模型使得沃森和克里克榮獲諾貝爾獎(jiǎng)，源于被他們拋棄的理論的殘余，所述理論認(rèn)為堿基同位于相對(duì)鏈上的類似堿基結(jié)合(watson，第125頁(yè))。沃森描述了當(dāng)他認(rèn)識(shí)到基于A:T和G:C結(jié)合的模型的優(yōu)點(diǎn)時(shí)如何放棄他的“簡(jiǎn)單考慮的類似與類似配對(duì)(brieflyconsidered like-with-like pairing)”模型。同上。
盡管反平行核酸雙鏈體首先由沃森和克里克提出，是多鏈核酸結(jié)構(gòu)中研究最廣泛的類型，但是已發(fā)現(xiàn)核酸在某些條件下還可形成三鏈體結(jié)構(gòu)和四鏈體結(jié)構(gòu)。
直到最近，三條核酸鏈之間的結(jié)合形成三鏈體才被普遍認(rèn)為局限于很有限的核酸物種(例如，聚嘌呤或聚嘧啶序列]。參見，例如Floris等“陽離子對(duì)嘌呤-嘌呤-嘧啶三螺旋在混合價(jià)鹽溶液中形成的影響”260 Eur.J.Biochem.801-809(1999)。此外，還認(rèn)為經(jīng)典三鏈體結(jié)合或雜交是基于有限種類的相鄰核堿基之間的Hoogsteen結(jié)合，而非沃森-克里克堿基配對(duì)，參見，例如，F(xiàn)loris等和授權(quán)給Dervan等的美國(guó)專利號(hào)5,874,555。然而，本發(fā)明人近來已在若干個(gè)專利申請(qǐng)中公開了基于沃森-克里克堿基配對(duì)的特異性結(jié)合的混合堿基序列三鏈體核酸可得以產(chǎn)生，并用作高度準(zhǔn)確和靈敏的分析特異結(jié)合的基礎(chǔ)。參見，分別于2000年7月10日和1999年12月21日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?9/613,263和09/468,679。
Zhurkin等239 J.Mol.Biol.181(1994)公開了平行DNA三鏈體的可能性，然而，這些三鏈體據(jù)說是在諸如RecA蛋白的重組蛋白存在下，由雙鏈體的大溝結(jié)合第三條鏈所產(chǎn)生的。
正如同三鏈體核酸的情形一樣，涉及四鏈體核酸的傳統(tǒng)知識(shí)一直認(rèn)為這種特定的結(jié)構(gòu)僅在相對(duì)極端條件下存在于狹窄的核酸種類中。具體而言，Sen等(Nature 334364-366(1988))公開了富含鳥嘌呤的寡核苷酸可在體外自發(fā)地自我組裝成四鏈螺旋。Sen等(Biochemistry 3165-70(1992))公開了這些四鏈復(fù)合體可進(jìn)一步結(jié)合成由8，12或16寡聚體組成的超結(jié)構(gòu)。
Marsh等(Biochemistry 3310718-10724(1994)和Nucleic AcidsResearch 23696-700(1995))公開了一些富含鳥嘌呤的寡核苷酸也可以一種補(bǔ)償?shù)钠叫信帕械姆绞浇M裝，形成長(zhǎng)的“G-絲”。這些更高級(jí)的結(jié)構(gòu)被G-四聯(lián)體所穩(wěn)定，所述G-四聯(lián)體由四個(gè)排列在平面上的鳥苷殘基組成，并通過Hoogsteen堿基配對(duì)結(jié)合在一起。根據(jù)Sen等(Biochemistry 3165-70(1992))，寡聚體中的至少三個(gè)鄰近鳥嘌呤對(duì)這些高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成至關(guān)重要。
已有人提出，四鏈DNA在諸如HIV-1整合酶抑制的各種各樣的生物過程中起作用(Mazumder等，Biochemistry 3513762-13771(1996))，在減數(shù)分裂過程中聯(lián)會(huì)染色體形成(Sen等，Nature 334364-366(1988))和端粒維持(Williamson等，Cell 59871-880(1989))；Baran等，Nucleic Acids Research 25297-303(1997))。還有人進(jìn)一步提出控制富含鳥嘌呤的四鏈體的產(chǎn)生可能是控制這種生物過程的鑰匙。例如，授權(quán)給Hardin等的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?,017,709提出端粒酶活性可通過藥物抑制形成鳥嘌呤四聯(lián)體而得以控制。
授權(quán)給Pitner等的美國(guó)專利號(hào)5,888,739公開了基于G-四聯(lián)體的四鏈體可用于檢測(cè)核酸的分析中。當(dāng)與互補(bǔ)寡核苷酸雜交后，G-四聯(lián)體解折疊或線性化，由此增加了G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)中的不同部位上供體和受體部分之間的距離，導(dǎo)致它們相互作用的增加以及自結(jié)構(gòu)中發(fā)射的信號(hào)(例如，熒光強(qiáng)度)的可檢測(cè)的變化。
授予Agrawal等的美國(guó)專利5,912,332公開了合成寡核苷酸的純化方法，其中所述合成寡核苷酸特異性與期望的全長(zhǎng)寡核苷酸雜交，相伴形成多聚體聚合體，如四鏈體DNA。多聚體聚合體含有待純化的寡核苷酸，然后利用大小排阻層析技術(shù)加以分離。
盡管有上述進(jìn)展，但仍有需要進(jìn)行系統(tǒng)地研究和歸類所有在混合的堿基序列核酸之間的特異性相互作用并且創(chuàng)建新型、有效和快速的方法，用于產(chǎn)生和分析在核酸和/或核酸類似物之間的特異性相互作用。
所有在此引用的參考文獻(xiàn)以其全文引作參考。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供一種復(fù)合體，所述復(fù)合體包含(1)含有核酸或核酸類似物的雜聚探針序列的探針；以及(2)含有核酸或核酸類似物的雜聚靶序列的靶，其中(a)探針和靶中的至少一種是純化的或合成的；以及(b)雜聚探針序列通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基相互作用或通過同源堿基相互作用與雜聚靶序列結(jié)合，條件是當(dāng)復(fù)合體為雙鏈體時(shí)，雜聚探針序列反平行于雜聚靶序列，多聚體探針序列通過同源堿基相互作用與雜聚靶序列結(jié)合，以及條件是當(dāng)復(fù)合體為三鏈體時(shí)，復(fù)合體不含重組蛋白。
本發(fā)明還提供一種分析靶的方法，所述方法包括(1)提供含有靶的樣品，所述靶含有核酸或核酸類似物的雜聚靶序列；(2)提供含有核酸或核酸類似物的雜聚探針序列的探針；(3)提供含有靶、探針、水和緩沖液的雜交混合物；(4)將雜交混合物溫育一段有效時(shí)間，以使雜聚靶序列與雜聚探針序列結(jié)合生成復(fù)合體；以及(5)檢測(cè)與探針和靶之間的結(jié)合親和性相關(guān)的信號(hào)以分析靶，其中雜聚探針序列通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基相互作用或通過同源堿基相互作用與雜聚靶序列結(jié)合，條件是當(dāng)復(fù)合體為雙鏈體時(shí)，雜聚探針序列反平行于雜聚靶序列，雜聚探針序列通過同源堿基相互作用與雜聚靶序列結(jié)合，以及條件是當(dāng)復(fù)合體為三鏈體時(shí)，復(fù)合體不含重組蛋白。
附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明將結(jié)合下列附圖加以描述，其中相同的標(biāo)號(hào)代表相同的元件，以及其中

圖1A、1B、1C、2A、2B、3A、3B、4、5A、5B、6、7、8、9、10A、10B、11A、11B、12A、2B、13A和13B為各分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)繪制的熒光強(qiáng)度的合成圖；以及圖14A、14B和14C為各分析樣品以時(shí)間為函數(shù)繪制的熒光強(qiáng)度的合成圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明闡述雜聚核酸鏈的特異性結(jié)合特性。我們?cè)缦纫压_了雜聚鏈與雙鏈體核酸的特異性結(jié)合以及雙鏈體核酸與其他雙鏈體核酸的特異性結(jié)合。我們現(xiàn)在公開雜聚核酸(和/或其類似物)通過同源堿基結(jié)合以及沃森-克里克堿基相互作用可特異性相互結(jié)合，并且堿基結(jié)合不受限于方向上相互之間反平行的鏈。因此，雜聚核酸(和/或其類似物)可以平行或反平行方向相互之間特異性結(jié)合，其中堿基通過同源堿基結(jié)合和/或沃森-克里克堿基結(jié)合規(guī)則而結(jié)合。
本發(fā)明不僅僅公開非正統(tǒng)的核酸的結(jié)合特性。本發(fā)明還包括新型化合物以及核酸的分析方法，診斷方法，治療方法，預(yù)防方法，基因療法和遺傳工程。
本發(fā)明包括新型的核酸(和/或其類似物)的雙鏈體，三鏈體和四鏈體復(fù)合體。
核酸鏈具有固有的方向性。傳統(tǒng)知識(shí)認(rèn)為方向性彼此相對(duì)(即，方向反平行)的鏈可通過其各自堿基的沃森-克里克互補(bǔ)結(jié)合而形成雙鏈體。
根據(jù)本發(fā)明，某些雙鏈體一方面包括兩條相互以平行關(guān)系雜交的核酸(和/或核酸類似物)鏈，其中特異性結(jié)合或者是通過同源堿基配對(duì)或者是沃森-克里克堿基配對(duì)。傳統(tǒng)知識(shí)認(rèn)為這種雙鏈體不存在，或由于例如主鏈的不規(guī)則性，至少極端不穩(wěn)定，所述不規(guī)則性對(duì)平行堿基結(jié)合的構(gòu)象要求是必須的。在適當(dāng)?shù)碾s交條件下，同源結(jié)合顯示的特異性和穩(wěn)定性超過了沃森-克里克互補(bǔ)反平行雙鏈體的特異性和穩(wěn)定性，我們的這一發(fā)現(xiàn)甚至更為驚奇。
本發(fā)明還包括含有兩條相互之間以反平行關(guān)系雜交的核酸(和/或核酸類似物)鏈的雙鏈體，其中特異性結(jié)合是通過同源堿基配對(duì)。
如本文所用的術(shù)語“沃森-克里克堿基配對(duì)”，“互補(bǔ)堿基配對(duì)”等旨在定義核酸和/或核酸類似物鏈的相對(duì)或相鄰堿基對(duì)之間通過匹配堿基(例如A:T，G:C和/或A:U)的特異性結(jié)合。在本文所述的非經(jīng)典復(fù)合體情形中，包括平行雙鏈體，平行和反平行三鏈體以及平行和反平行四鏈體，術(shù)語如“沃森-克里克堿基結(jié)合”和“互補(bǔ)堿基結(jié)合”旨在表示A和T，A和U和/或G和C之間的結(jié)合，而不必位于首先由沃森和克里克描述的邊緣平面構(gòu)象中。除了首先由沃森和克里克提出的常規(guī)結(jié)合基元(“W-C基元”)及其由沃森-克里克堿基結(jié)合的前述定義所含括的構(gòu)象變體以外，本發(fā)明還包括由同源堿基結(jié)合所形成的復(fù)合體。在同源堿基結(jié)合中，堿基與相同的堿基而非互補(bǔ)堿基特異性結(jié)合。因此，在“同源基元”中，同源堿基對(duì)包括A:A，G:G，C:C，T:T和U:U。
核酸鏈的堿基的結(jié)合受到眾多因素的影響或制約，特別是根據(jù)W-C基元或同源基元鏈的結(jié)合潛力，以及離子條件(例如鹽濃度和/或種類)。鹽條件利于形成沃森-克里克結(jié)合，而不利于形成比同源結(jié)合。在相同的緩沖液條件下，同源基元四鏈體比W-C基元四鏈體有利，這極可能是因?yàn)榫植炕沫h(huán)境基于兩條雙鏈體核酸的帶電主鏈的存在而變得相對(duì)低鹽。
本發(fā)明復(fù)合體中的各條鏈可包括任何核堿基和/或核堿基類似物的序列，條件是核堿基通過W-C基元或同源基元與它們將要特異性結(jié)合的核堿基相關(guān)。同現(xiàn)有技術(shù)的某些教導(dǎo)相反，靶和探針的結(jié)合無需是同多聚體的，即使是在三鏈體或四鏈體形成的情形下。因此，在某些實(shí)施方案中，探針核堿基在散布的嘌呤和嘧啶的雜聚探針序列中排列，而靶核堿基在至少部分互補(bǔ)或部分同源于探針序列的靶序列中排列。例如，探針序列可以任何順序含有25％-75％的嘌呤堿基和75％-25％的嘧啶堿基。本發(fā)明的復(fù)合體可形成自在此定義的雜聚序列，表示在至少它們的雜交區(qū)段中含有至少一個(gè)嘌呤核堿基或嘌呤類似物以及至少一個(gè)嘧啶核堿基或嘧啶類似物的序列。雜聚序列優(yōu)選缺失長(zhǎng)度大于5個(gè)堿基的同多聚體片段。其他核堿基也適用于本發(fā)明中，例如，天然存在的堿基的合成類似物，與其他堿基具有特異沃森-克里克和/或同源結(jié)合親和性。
除了雙鏈體，本發(fā)明復(fù)合體還包括三鏈體和四鏈體，其中相對(duì)的雜聚鏈通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基或通過同源堿基而得以連接，以及結(jié)合序列的相對(duì)方向彼此平行或反平行。
探針鏈可特異性結(jié)合在雙鏈靶的大溝或小溝中。此外，單鏈探針的堿基可與雙鏈靶中的一條鏈或兩條鏈上的堿基特異性相互作用。同樣，雙鏈探針中的各條鏈上的堿基在本發(fā)明四鏈體復(fù)合體中可與雙鏈靶中的一條或兩條鏈上的堿基特異性相互作用。
在某些三鏈體和四鏈體的實(shí)施方案中，各個(gè)核堿基與其他一個(gè)或兩個(gè)核堿基結(jié)合。因此，除了上述的傳統(tǒng)雙鏈體沃森-克里克堿基配對(duì)和雙鏈體同源堿基對(duì)以外，這種實(shí)施方案中包括下列沃森-克里克堿基結(jié)合三聯(lián)體A:T:A，T:A:T，U:A:T，T:A:U，A:U:A，U:A:U，G:C:G和/或C:G:C(包括C+:G:C，和/或任何其他離子化堿基物種)，和/或下列同源堿基三聯(lián)體A:A:T，T:T:A，U:U:A，T:U:A，A:A:U，U:T:A，G:G:C和/或C:C:G(包括C:C+:G，和/或任何其他離子化堿基物種)。
因此，在某些四鏈體實(shí)施方案中，其中探針定義成第一和第二鏈的雙鏈體，而靶定義成第三和第四鏈的雙鏈體，據(jù)信第一和第三鏈的堿基也相互結(jié)合，除了(a)第一和第二鏈的相對(duì)堿基之間的結(jié)合；(b)第三和第四鏈的相對(duì)堿基之間的結(jié)合；以及(c)第二和第四鏈的相對(duì)堿基之間的結(jié)合。
在本發(fā)明三鏈體和四鏈體的某些實(shí)施方案中，沒有堿基的結(jié)合序列與另一堿基的結(jié)合序列相鄰。即，存在至少三條單獨(dú)的鏈。盡管折疊的構(gòu)象等(例如，發(fā)夾回轉(zhuǎn)等)落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，但是單鏈的折疊部分不使鏈計(jì)數(shù)多于一次，接近三條單獨(dú)鏈的最小值。
本發(fā)明的復(fù)合體優(yōu)選不依賴于Hoogsteen鍵合或G-G四聯(lián)體來維持復(fù)合體結(jié)構(gòu)，盡管可能存在Hoogsteen鍵合和/或G-G四聯(lián)體。即，本發(fā)明的復(fù)合體優(yōu)選基本上無Hoogsteen鍵合，并且基本上無G-G四聯(lián)體。
復(fù)合體的各條鏈獨(dú)立地包括具有脫氧核糖磷酸或核糖磷酸骨架(例如，DNA，RNA，mRNA，hnRNA，rRNA，tRNA或cDNA)的核酸或核酸類似物。優(yōu)選的核酸類似物含有不帶電荷的或帶部分電荷的主鏈(即，具有電荷的主鏈，其不如天然DNA主鏈那樣帶負(fù)電荷)，并且包括例如PNA和LNA。某些實(shí)施方案不含PNA。
至少部分復(fù)合體是分離的，純化的，人工的或合成的。
在實(shí)施方案中，部分復(fù)合體為PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。
本發(fā)明的復(fù)合體可以體外或體內(nèi)或電腦中(in silico)形式存在于溶液中，固相支持物上。
其中固相支持物或是導(dǎo)電性的(例如，電極)或是非導(dǎo)電性的。此外，復(fù)合體在被延長(zhǎng)后可通過光學(xué)加以作圖或測(cè)序，如授權(quán)于Schwartz的美國(guó)專利號(hào)6,147,198和5,720,928所教導(dǎo)的。
本發(fā)明的復(fù)合體可由一種方法提供，所述方法包括(a)提供一種含有靶，探針，水和緩沖液的雜交混合物，所述靶含有核酸或核酸類似物的雜聚靶序列，所述探針含有核酸或核酸類似物的雜聚探針序列，以及(b)將所述雜交混合物溫育一段有效時(shí)間，以使所述雜聚靶序列與所述雜聚探針序列雜交形成復(fù)合體。
雜交混合物可包括任何常規(guī)的已知適合于保存核苷酸的介質(zhì)。參見，例如，Sambrook等，“Molecular CloningA Lab Manual”Vol.2(1989)。例如，介質(zhì)可包括核苷酸，水，緩沖液和標(biāo)準(zhǔn)鹽濃度。當(dāng)二價(jià)陽離子專門用于促進(jìn)三鏈體或四鏈體形成時(shí)，諸如EDTA或EGTA的螯合劑不應(yīng)包括在反應(yīng)混合物中。
在很多種條件下發(fā)生互補(bǔ)堿基之間的特異性結(jié)合，所述條件在溫度，鹽濃度，靜電強(qiáng)度和緩沖液組成方面不同。這些條件及其應(yīng)用方法的例子在本領(lǐng)域是已知的。我們于2001年6月20提交的在審美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?9/885,731公開特別適用于本發(fā)明中的條件。
與許多Hoogsteen類型的復(fù)合體不同，它們?cè)趐H值高于約7.6是不穩(wěn)定或非存在的，本發(fā)明的復(fù)合體在大范圍的pH水平下是穩(wěn)定的，優(yōu)選從約pH5到約pH9。
本發(fā)明的復(fù)合體可用于分析，診斷，治療和/或工程目的。所述復(fù)合體可用于分析，診斷和/或治療與生物體或病毒感染相關(guān)的癥狀。如果需要，生物體或病毒可進(jìn)行定量測(cè)定。
本發(fā)明的復(fù)合體可在常規(guī)雜交條件，三鏈體雜交條件，四鏈體雜交條件或原位雜交條件下得以形成。優(yōu)選的是復(fù)合體在溫度為約2-約55℃下形成約2小時(shí)或更少。在某些實(shí)施方案中，溫育時(shí)間甚至在室溫下優(yōu)選少于5分鐘。更長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間是不需要的，但在大多數(shù)情況中，溫育長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)不會(huì)對(duì)復(fù)合體有不利影響。本發(fā)明的復(fù)合體的快速結(jié)合時(shí)間與Hoogsteen結(jié)合的復(fù)合體需要更長(zhǎng)的結(jié)合時(shí)間形成對(duì)照。
雜交介質(zhì)中的促進(jìn)劑優(yōu)選是一種嵌入劑或陽離子，正如在2000年7月10日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?9/613,263中所公開的。嵌入劑任選是熒光的。嵌入劑可以是例如熒光團(tuán)，諸如選自YOYO-1、TOTO-1、YOYO-3、TOTO-3、POPO-1、BOBO-1、POPO-3、BOBO-3、LOLO-1、JOJO-1、花菁二聚體、YO-PRO-1、TO-PRO-1、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5、PO-PRO-1、BO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-3、LO-PRO-1、JO-PRO-1、花菁單體、溴化乙錠、乙錠同型二聚體-1、乙錠同型二聚體-2、乙錠衍生物、吖啶、吖啶橙、吖啶衍生物、乙錠吖啶異型二聚體、單疊氮化乙錠、碘化丙錠、SYTO染料、SYBR綠1、SYBR染料、皮可綠(Pico Green)、SYTOX染料以及7-氨基放線菌素D。
合適的陽離子包括例如，單價(jià)陽離子，如Na+(優(yōu)選濃度為40-200mM)，K+(優(yōu)選濃度為40-200mM)及其他堿金屬離子；二價(jià)陽離子，如堿土金屬離子(例如Mg+2和Ca+2)和二價(jià)過渡金屬離子(例如Mn+2、Ni+2、Cd+2、Co+2和Zn+2)；以及正電荷至少為3的陽離子，如Co(NH3)6+3，三價(jià)亞精胺和四價(jià)精胺。Mn+2優(yōu)選以10-45mM的濃度提供。Mg+2優(yōu)選以10-45mM的濃度提供。Ni+2優(yōu)選以約20mM的濃度提供。在實(shí)施方案中，Mg+2和Mn+2組合分別以1mM、2mM、3mM...40mM(即各為1-40mM)的濃度提供。
陽離子向形成復(fù)合體的介質(zhì)中的加入量依賴于許多因素，包括陽離子的性質(zhì)、探針的濃度、靶的濃度、其他陽離子的存在以及探針和靶的堿基含量。優(yōu)選的陽離子濃度和混合物通?？山?jīng)過實(shí)驗(yàn)找到。對(duì)于三鏈體而言，優(yōu)選以下列量向介質(zhì)中加入陽離子(a)10mM-30mMMn+2；(b)[10mM-20mM Mg+2；(c)20mM Ni+2；或(d)Mn+2和Mg+2各為1mM-30mM。對(duì)于四鏈體而言，優(yōu)選以下列量向介質(zhì)中加入陽離子(a)10mM-45mM Mn+2；(b)10mM-45mM Mg+2；或(c)Mn+2和Mg+2各為10mM-40mM。
盡管不需要，其他促進(jìn)劑包括例如單鏈結(jié)合蛋白，諸如Rec A蛋白質(zhì)、T4基因32蛋白質(zhì)、大腸桿菌單鏈結(jié)合蛋白質(zhì)、大或小核酸溝結(jié)合蛋白質(zhì)、紫羅堿和其他嵌入物質(zhì)如放線菌素D、補(bǔ)骨脂內(nèi)酯和當(dāng)歸根素。這樣的促進(jìn)劑可證明在極端操作條件，例如異常pH水平或極端高溫下是有用的。某些提供本發(fā)明復(fù)合體的方法在沒有諸如Rec A和/或其他重組蛋白的蛋白促進(jìn)劑下進(jìn)行。
本發(fā)明提供用于分析結(jié)合的快速、靈敏、環(huán)保和安全的方法。本發(fā)明分析可用于例如識(shí)別折疊核苷酸序列中的可接近區(qū)域，從而確定雜交復(fù)合體中的錯(cuò)配堿基對(duì)的數(shù)目，并且對(duì)基因組進(jìn)行作圖。
本發(fā)明分析不僅檢測(cè)特異性探針一靶結(jié)合的存在，而且提供有關(guān)探針和靶之間相互作用的性質(zhì)的定量和定性信息。因此，本發(fā)明使得業(yè)者能夠區(qū)分雙鏈探針或單鏈探針中的序列和雙鏈靶或單鏈靶中的序列之間出現(xiàn)的完全匹配，單堿基對(duì)錯(cuò)配，兩堿基對(duì)錯(cuò)配，三堿基對(duì)錯(cuò)配，單堿基對(duì)缺失，兩堿基對(duì)缺失和三堿基對(duì)缺失。
本發(fā)明的實(shí)施方案包括對(duì)照與相同的靶結(jié)合的其它探針?biāo)@示的相同類型的信號(hào)來校正第一探針-靶混合物的測(cè)定信號(hào)(例如光學(xué)、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、電或電機(jī)械特性)，其中其它各個(gè)探針與第一探針至少有一個(gè)堿基的區(qū)別。
形成校正曲線，其中測(cè)定信號(hào)(例如熒光強(qiáng)度)的大小是靶和探針之間結(jié)合親和力的函數(shù)。由于靶和多個(gè)不同探針之間的結(jié)合親和力隨著復(fù)合體內(nèi)的錯(cuò)配堿基數(shù)、錯(cuò)配性質(zhì)(例如W-C基元中的A:G對(duì)A:C對(duì)T:G對(duì)T:C等)、錯(cuò)配位置等而變化，因此本發(fā)明的分析可用于對(duì)靶進(jìn)行測(cè)序。
在實(shí)施方案中，所測(cè)定的信號(hào)可以是測(cè)試樣品中所含熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度。在這樣的實(shí)施方案中，探針和靶之間的結(jié)合親和力可以與強(qiáng)度正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，這依賴于熒光團(tuán)是否通過信號(hào)猝滅或信號(hào)放大對(duì)雜交發(fā)信號(hào)。在選擇的條件下，由嵌入劑所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度可以與探針-靶結(jié)合親和力正相關(guān)，而在利用非嵌入熒光團(tuán)共價(jià)結(jié)合探針的優(yōu)選實(shí)施方案中，強(qiáng)度可以與探針-靶結(jié)合親和力反相關(guān)。隨著探針和靶之間的匹配程度(例如，匹配對(duì)錯(cuò)配的量和/或錯(cuò)配的類型)增加，優(yōu)選包括0-2個(gè)錯(cuò)配和/或缺失的范圍內(nèi)，更優(yōu)選包括0-3個(gè)錯(cuò)配和/或缺失的范圍內(nèi)，非嵌入熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度降低。
本發(fā)明能夠定量測(cè)定探針和靶之間的結(jié)合親和力。這種信息對(duì)各種用途是有價(jià)值的，包括設(shè)計(jì)具有優(yōu)化結(jié)合特征的反義藥物。
本發(fā)明分析優(yōu)選是勻相的。該分析的進(jìn)行無需在檢測(cè)測(cè)定信號(hào)大小之前從雜交復(fù)合體中分離出游離探針和游離靶。該分析也無需凝膠分離步驟，由此使得測(cè)試通量大幅提高。定量分析簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確。結(jié)果，結(jié)合分析節(jié)省大量時(shí)間和花費(fèi)，并且可容易加以自動(dòng)化。另外，其還使得結(jié)合變量快速確定，這些變量如緩沖液、pH、離子濃度、溫度、溫育時(shí)間、探針和靶序列的相對(duì)濃度、嵌入劑濃度、靶序列長(zhǎng)度、探針序列長(zhǎng)度以及可能的必要輔助因子(即促進(jìn)劑)。
分析可在例如孔內(nèi)或微通道內(nèi)的溶液中不可滲透表面或生物芯片上進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，靶在探針前提供給雜交介質(zhì)，以及探針在通過與雜交介質(zhì)接觸再水合之前以脫水形式提供。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明分析的進(jìn)行優(yōu)選無需在靶或探針上提供信號(hào)猝滅劑。
本發(fā)明排除在分析前對(duì)靶進(jìn)行變性的需要。令人驚奇的是，本發(fā)明人已經(jīng)能夠特異性測(cè)定雜聚三鏈體和四鏈體，其中探針和靶之間的相互作用基于沃森-克里克或同源堿基相互作用(至少在A結(jié)合T(或U，在RNA的情況下)和G結(jié)合C的意義上)，而不是很有限的如Pitner等，同上的復(fù)合體雜交的Hoogsteen模型。
合適的靶的長(zhǎng)度優(yōu)選為8-3.3×109堿基對(duì)，可以是單鏈或雙鏈的。
本發(fā)明的探針優(yōu)選長(zhǎng)度為2-75個(gè)堿基(更優(yōu)選長(zhǎng)度為5-30個(gè)堿基)，并且可以是單鏈或雙鏈的。因此，用于本發(fā)明分析中的合適的探針包括例如ssDNA、RNA、ssPNA、LNA、dsDNA、dsRNA、DNA:RNA雜合體、dsPNA、PNA:DNA雜合體，和其它不帶電荷或帶部分電荷的糖磷酸/肽主鏈的單鏈和雙鏈核酸和核酸類似物?？蛇x擇探針的長(zhǎng)度來匹配靶的長(zhǎng)度。
本發(fā)明不需要使用放射性探針，它們?cè)谑褂弥惺俏ｋU(xiǎn)、麻煩和耗時(shí)的，并需要不斷地再生。本發(fā)明的探針優(yōu)選使用時(shí)是安全的，并且常年穩(wěn)定。因此，探針可以大量制造或定購(gòu)和儲(chǔ)存。
復(fù)合體優(yōu)選通過在至少一種探針中的變化而加以檢測(cè)。所述至少一種標(biāo)記可連接到探針和/或靶，和/或可游離在測(cè)試介質(zhì)中。所述至少一種標(biāo)記可包括至少兩個(gè)部分。
標(biāo)記優(yōu)選為至少一個(gè)成員，選自自旋標(biāo)記物，熒光團(tuán)，發(fā)色團(tuán)，化學(xué)發(fā)光劑和電化學(xué)發(fā)光劑，放射性同位素，酶，半抗原，抗體和標(biāo)記抗體。優(yōu)選的，復(fù)合體通過至少一個(gè)來自標(biāo)記的發(fā)射或通過監(jiān)測(cè)復(fù)合體的電子特征進(jìn)行檢測(cè)。
標(biāo)記抗體可以是例如一種標(biāo)記的抗核酸/核酸抗體，其用可檢測(cè)的部分加以標(biāo)記，所述可檢測(cè)的部分選自熒光團(tuán)，發(fā)色團(tuán)，自旋標(biāo)記，放射性同位素，酶，半抗原，化學(xué)發(fā)光劑和電化學(xué)發(fā)光劑。
復(fù)合體可在至少一種不同條件下加以檢測(cè)，諸如公開在2000年1月24日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?9/490,273中。合適的不同條件包括例如，(a)測(cè)試介質(zhì)中非水性組分的變化，(b)測(cè)試介質(zhì)中pH的變化，(c)測(cè)試介質(zhì)中鹽濃度的變化，(d)測(cè)試介質(zhì)中有機(jī)溶劑含量的變化，(e)測(cè)試介質(zhì)中甲酰胺含量的變化，(f)測(cè)試介質(zhì)中溫度的變化，以及(g)測(cè)試介質(zhì)中離液鹽濃度的變化。此外，不同條件可以是刺激的應(yīng)用，例如電流(直流和/或交流電)，光子照射(例如，激光)或電磁力。刺激可以恒定或脈沖方式施加。檢測(cè)可通過使用單一不同條件或通過組合系列不同的條件進(jìn)行。
測(cè)試介質(zhì)中復(fù)合體的特征對(duì)不同條件或刺激的反應(yīng)可得以監(jiān)控以檢測(cè)復(fù)合體。特征可以為例如電導(dǎo)率或Q(測(cè)試介質(zhì)中傳輸線信號(hào)傳播的振幅或相的變化或傳輸線的共振結(jié)構(gòu))。
在實(shí)施方案中，所述檢測(cè)方法包括(a)檢測(cè)標(biāo)記物信號(hào)，其中信號(hào)與所述探針和所述靶之間的結(jié)合親和力相關(guān)；(b)改變測(cè)試介質(zhì)的條件；(c)檢測(cè)后續(xù)信號(hào)；以及(d)比較標(biāo)記物信號(hào)和后續(xù)信號(hào)。改變和檢測(cè)可重復(fù)至少一次或僅僅進(jìn)行一次。
標(biāo)記優(yōu)選為熒光團(tuán)。嵌入熒光團(tuán)和非嵌入熒光團(tuán)均適用于本發(fā)明。熒光團(tuán)可游離在溶液中，共價(jià)結(jié)合于探針和/或共價(jià)結(jié)合于靶。當(dāng)熒光團(tuán)共價(jià)結(jié)合于探針時(shí)，優(yōu)選在任一末端與探針結(jié)合。優(yōu)選的熒光標(biāo)記包括生物素，若丹明，丫啶和熒光素，以及其他標(biāo)記，這些標(biāo)記當(dāng)用激發(fā)能照射時(shí)發(fā)熒光。適當(dāng)?shù)姆乔度霟晒鈭F(tuán)包括例如Alexa染料、BODIPY染料、生物素結(jié)合物、硫醇活性探針、熒光素及其衍生物(包括“籠”型探針)、Oregon綠、若丹明綠、QSY染料(其猝滅可見光激發(fā)的熒光團(tuán)的熒光)。
選擇激發(fā)波長(zhǎng)(通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)和/或常識(shí))，以對(duì)應(yīng)于在用熒光團(tuán)的激發(fā)最大值，優(yōu)選地是200-1000nm。優(yōu)先選擇熒光團(tuán)具有200-1000nm的輻射波長(zhǎng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氬離子激光器用來照射熒光團(tuán)，其光的波長(zhǎng)范圍是400-540nm，并在500-750nm的范圍內(nèi)檢測(cè)熒光輻射。
本發(fā)明分析可以在各種溫度下進(jìn)行，如約2℃-約60℃?，F(xiàn)有技術(shù)的某些分析需要提高溫度、增加成本和延遲測(cè)定。然而，本發(fā)明可在室溫或低于室溫(例如低于25℃)下進(jìn)行。
本發(fā)明的可靠性不依賴于所述探針或靶中的鳥嘌呤和胞嘧啶的含量。在傳統(tǒng)的W-C基元中，G:C堿基對(duì)形成三個(gè)氫鍵，而A:T堿基對(duì)僅形成兩個(gè)氫鍵，具有更高的G或C含量的靶和探針序列更穩(wěn)定，具有更高的解鏈溫度。結(jié)果，提高雜交探針和靶區(qū)域的GC含量在完全匹配的雜合體所含的之上，堿基對(duì)錯(cuò)配可以抵銷與錯(cuò)配探針相關(guān)的結(jié)合弱化。
本發(fā)明分析是極其靈敏的，從而排除了對(duì)靶進(jìn)行PCR擴(kuò)增的需要。例如，可以分析具有約20微升體積的測(cè)試樣品，其含有約10fmol的靶和約10fmol的探針。本發(fā)明的實(shí)施方案是靈敏的，足以測(cè)定濃度為5×10-9M、優(yōu)選不超過5×10-10M的靶。本發(fā)明的實(shí)施方案是靈敏的，足以利用濃度為5×10-9M、優(yōu)選不超過5×10-10M的探針。不用說，前面的值并非旨在提示該方法不能檢測(cè)更高的濃度。
探針與靶之比優(yōu)選約1∶1-約1000∶1。
與某些現(xiàn)有技術(shù)分析不同，本發(fā)明不僅檢測(cè)雜交(即結(jié)合)的存在，而且提供有關(guān)探針和靶之間結(jié)合性質(zhì)的定量和定性信息。因此，本發(fā)明能使業(yè)者(a)檢測(cè)測(cè)試介質(zhì)中靶的存在；(b)檢測(cè)靶中等位或雜合變異；(c)定量分析靶；(d)檢測(cè)探針和靶之間的互補(bǔ)程度(在W-C基元的結(jié)合情形下)或同源程度(在同源基元的結(jié)合情形下)；以及(e)檢測(cè)單元型。
我們已經(jīng)注意到雙鏈體復(fù)合含有互補(bǔ)堿基序列的核酸的平行鏈，以不同速率結(jié)合形成三鏈體，并且以與通過方向性相反的核酸鏈所形成的雙螺旋中堿基非常相異過程的最高點(diǎn)結(jié)合。方向性相反的鏈(即反平行鏈)在沿面取向上給與最低骨架扭曲相反的堿基容易地呈現(xiàn)間隔規(guī)則的堿基。
本發(fā)明的各種復(fù)合體包括探針和靶，所述探針含有核堿基和/或核堿基類似物的雜聚探針序列，所述靶含有核堿基和/或核堿基類似物的雜聚靶序列。復(fù)合體是合成或純化的，在于探針或靶中的至少一種是合成或純化的。探針的骨架是脫氧核糖磷酸骨架，諸如在DNA中，或肽類骨架，諸如在PNA中，或?qū)儆谄渌恍┪磶щ姾苫驇Р糠蛛姾?負(fù)或正)的部分。
在某些實(shí)施方案中，探針和靶是單鏈的，以及復(fù)合體為雙鏈體。當(dāng)所述探針和靶為雙鏈體時(shí)，它們具有W-C互補(bǔ)或同源結(jié)合的平行方向，或具有同源結(jié)合的反平行方向。
在其他實(shí)施方案中，探針或靶是單鏈的，所述探針或靶的另一個(gè)為雙鏈的，并且所得復(fù)合體是三鏈體。這個(gè)復(fù)合體可以不含PNA。
在某些實(shí)施方案中，三鏈體含有平行于雜聚靶序列的雜聚探針序列，其中雜聚探針序列通過同源堿基結(jié)合或沃森-克里克互補(bǔ)堿基結(jié)合與雜聚靶序列結(jié)合。在其他某些實(shí)施方案中，雜聚探針序列反平行于雜聚靶序列，而雜聚探針序列通過同源堿基結(jié)合或沃森-克里克互補(bǔ)堿基結(jié)合與雜聚靶序列結(jié)合。
在三鏈體復(fù)合體的某些實(shí)施方案中，靶包括第一鏈和第二鏈，所述第一鏈含有雜聚靶序列，所述第二鏈含有沃森-克里克互補(bǔ)和反平行于第一雜聚靶序列的第二雜聚靶系列。雜聚探針序列通過同源堿基結(jié)合與第一雜聚靶序列結(jié)合，并且還通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基結(jié)合與第二雜聚靶序列結(jié)合。
在三鏈體復(fù)合體的其他某些實(shí)施方案中，靶包括第一鏈和第二鏈，所述第一鏈含有雜聚靶序列，所述第二鏈含有沃森-克里克互補(bǔ)和反平行于第一雜聚靶序列的第二雜聚靶系列。雜聚探針序列通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基結(jié)合與第一雜聚靶序列結(jié)合，并且還通過同源堿基結(jié)合與第二雜聚靶序列結(jié)合。
在某些實(shí)施方案中，探針和靶是雙鏈的，并且所得復(fù)合體是四鏈體。這個(gè)復(fù)合體可以不含PNA。
在某些實(shí)施方案中，四鏈體含有平行或反平行于雜聚靶序列的雜聚探針序列，其中雜聚探針序列通過同源堿基結(jié)合或沃森-克里克互補(bǔ)堿基結(jié)合與雜聚靶序列結(jié)合。在這種實(shí)施方案中，四鏈體復(fù)合體含有第一探針鏈和第二探針鏈，所述第一探針鏈含有所述雜聚探針序列，所述第二探針鏈含有互補(bǔ)和反平行于第一探針序列的第二雜聚探針序列。靶包括第一靶鏈和第二靶鏈，所述第一靶鏈含有雜聚靶序列，所述第二靶鏈含有互補(bǔ)和反平行于第一靶鏈的第二雜聚靶序列。
在這種四鏈體實(shí)施方案中，雜聚探針序列可分別通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基結(jié)合或同源堿基結(jié)合與雜聚靶序列結(jié)合，以及通過同源堿基結(jié)合或沃森-克里克互補(bǔ)堿基結(jié)合任選和附加地與第二雜聚靶序列結(jié)合。因此，當(dāng)雜聚探針序列通過同源堿基結(jié)合與雜聚靶序列結(jié)合時(shí)，雜聚探針序列可任選通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基結(jié)合與第二雜聚靶序列結(jié)合，而當(dāng)雜聚探針序列通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基結(jié)合與雜聚靶序列結(jié)合時(shí)，雜聚探針序列任選通過同源堿基結(jié)合與第二雜聚靶序列結(jié)合。
本發(fā)明將參照下列實(shí)施例更詳細(xì)加以說明，但應(yīng)理解本發(fā)明不視為受此限制。
實(shí)施例實(shí)施例1互補(bǔ)有義和反義50聚體ssDNA靶序列，衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10(Nature 380，207(1996))，在DNA合成儀(Expedite 8909，PerSeptive Biosystems)上合成并通過HPLC純化。將ssDNA寡核苷酸溶解在雙蒸餾水中，并且稀釋至濃度為1pmol/μl。等摩爾量的互補(bǔ)寡核苷酸在95℃加熱10分鐘，并隨著溫度在1.5小時(shí)冷卻到21℃，允許在10mM Tris pH7.5、1mM EDTA和100mM NaCl存在下逐漸退火。將dsDNA寡核苷酸以濃度為1pmol/μl稀釋在雙蒸餾水中。
野生型靶DNA的有義鏈的序列(SEQ ID NO1)為5′-TGG CACCAT TAA AGA AAA TAT CAT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGAATA TA-3′。
野生型靶DNA的反義鏈的序列(SEQ ID NO1)為5′-TAT ATTCAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA TGA TAT TTT CTT TAA TGGTGC CA-3′。
SEQ ID NO2為與野生型靶DNA(SEQ ID NO1)相同的50聚體突變dsDNA靶序列，除了在氨基酸位置507有一個(gè)堿基對(duì)突變(下劃線)以外，在該位置上野生型有義鏈序列CAT變?yōu)镃GT。
SEQ ID NO2的有義鏈序列為5′-TGG CAC CAT TAA AGA AAATAT CGT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3′。
SEQ ID NO2的反義鏈序列為5′-TAT ATT CAT CAT AGG AAACAC CAA AGACGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3′。
SEQ ID NO3為與野生型靶DNA(SEQ ID NO1)相同的50聚體突變dsDNA靶序列，除了在氨基酸位置506和507有連續(xù)兩個(gè)堿基對(duì)突變(下劃線)以外，在該位置上野生型有義鏈序列CAT變?yōu)锳CT。
SEQ ID NO3的有義鏈序列為5′-TGG CAC CAT TAA AGA AAATATACT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3′。
SEQ ID NO3的反義鏈序列為5′-TAT ATT CAT CAT AGG AAACAC CAA AGAGTA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3′。
SEQ ID NO4為與野生型靶DNA(SEQ ID NO1)相同的50聚體突變dsDNA靶序列，除了在氨基酸位置506和507有連續(xù)三個(gè)堿基對(duì)突變(下劃線)以外，在該位置上野生型有義鏈序列CAT變?yōu)锳CG。
SEQ ID NO4的有義鏈序列為5′-TGG CAC CAT TAA AGAAAA TATACGCTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3′。
SEQ ID NO4的反義鏈序列為5′-TAT ATT CAT CAT AGG AAACAC CAA AGCGTA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3′。
SEQ ID NO5為修飾自SEQ ID NO1的50聚體dsDNA靶序列，其中GC百分含量從30％變?yōu)?2％。
野生型靶DNA的有義鏈序列(SEQ ID NO5)為5′-GAG CAC CATGAC AGA CAC TGT CAT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTCTG-3′。
野生型靶DNA的反義鏈序列(SEQ ID NO5)為5′-CAG AGT CATCGT AGG ACA CAC CAG AGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGCTC-3′。
SEQ ID NO6為與SEQ ID NO5相同的50聚體突變dsDNA靶序列，除了有一個(gè)堿基對(duì)突變(下劃線)以外，在該位置上有義鏈序列CAT變?yōu)镃GT。
突變SEQ ID NO6的有義鏈序列為5′-GAG CAC CAT GAC AGACAC TGT CGT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3′。
突變SEQ ID NO6的反義鏈序列為5′-CAG AGT CAT CGT AGGACA CAC CAG AGACGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3′。
SEQ ID NO7為與SEQ ID NO5相同的50聚體突變dsDNA靶序列，除了有一個(gè)堿基對(duì)突變(下劃線)以外，在該位置上有義鏈序列CTC變?yōu)镃TT。
突變SEQ ID NO7的有義鏈序列為5′-GAG CAC CAT GAC AGACAC TGT CAT CTTTGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3′。
突變SEQ ID NO7的反義鏈序列為5′-CAG AGT CAT CGT AGGACA CAC CAA AGATGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3′。
SEQ ID NO8為與SEQ ID NO5相同的50聚體突變dsDNA靶序列，除了有連續(xù)兩個(gè)堿基對(duì)突變(下劃線)以外，在該位置上有義鏈序列 CAT變?yōu)锳CT。
突變SEQ ID NO8的有義鏈序列為5′-GAG CAC CAT GAC AGACAC TGTACT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3′。
突變SEQ ID NO8的反義鏈序列為5′-CAG AGT CAT CGT AGGACA CAC CAG AGAGTA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3′。
SEQ ID NO9為與野生型靶DNA(SEQ ID NO1)相同的47聚體突變dsDNA靶序列，除了在氨基酸位置507和508有連續(xù)三個(gè)堿基對(duì)缺失(以三點(diǎn)表示)以外，在該位置上野生型有義鏈序列CTT缺失。
SEQ ID NO9的有義鏈序列為5′-TGG CAC CAT TAA AGA AAATAT CAT...TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3′。
SEQ ID NO9的反義鏈序列為5′-TAT ATT CAT CAT AGG AAACAC CA...A TGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3′。
SEQ ID NO10為與SEQ ID NO5相同的50聚體突變dsDNA靶序列，除了有一個(gè)堿基對(duì)突變(下劃線)以外，在該位置上有義鏈序列CAT變?yōu)镃TT。
突變SEQ ID NO10的有義鏈序列為5′-GAG CAC CAT GACAGA CAC TGT CTT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3′。
突變SEQ ID NO10的反義鏈序列為5′-CAG AGT CAT CGT AGGACA CAC CAG AGAAGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3′。
SEQ ID NO11為與SEQ ID NO5相同的50聚體突變dsDNA靶序列，除了有一個(gè)堿基對(duì)突變(下劃線)以外，在該位置上有義鏈序列CTC變?yōu)镃CC。
突變SEQ ID NO11的有義鏈序列為5′-GAG CAC CAT GACAGA CAC TGT CAT CCC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3′。
突變SEQ ID NO11的反義鏈序列為5′-CAG AGT CAT CGT AGGACA CAC CAGGGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3′。
PNA探針由Commonwealth Biotechnologies，Inc.(Richmond，VA，USA)合成，HPLC純化并通過質(zhì)譜確認(rèn)。PNA探針首先溶解于0.1％TFA(三氟乙酸)至濃度為10mg/ml，然后加入雙蒸餾水稀釋至1mg/ml。最終在雙蒸餾水中以濃度為1pmol/μl制備終了PNA儲(chǔ)液。
探針1號(hào)為15聚體PNA，其設(shè)計(jì)成完全互補(bǔ)于50聚體野生型靶DNA(SEQ ID NO1)有義鏈的15個(gè)核苷酸區(qū)段，在氨基酸位置505-510上重疊(Nature 380，207(1996))。探針在方向上與靶中有義鏈相反或反平行。
探針1號(hào)的序列(SEQ ID NO12)為5′-H-CAC CAA AGA TGATAT-Lys-CONH2-3′。
探針2號(hào)為在序列上與探針1號(hào)相同的15聚體PNA，但是與dsDNA靶中的有義鏈在方向性上相同或平行。
探針2號(hào)的序列(SEQ ID NO13)為5′-H-TAT AGT AGA AACCAC-Lys-CONH2-3′。
如上所述合成和通過HPLC純化15聚體ssDNA探針。將ssDNA探針以濃度為1pmol/μl溶解于雙蒸餾水中。
探針3號(hào)為15聚體ssDNA探針，其設(shè)計(jì)成完全互補(bǔ)于50聚體野生型靶DNA(SEQ ID NO5)有義鏈的15個(gè)核苷酸區(qū)段。探針在方向性上與靶中有義鏈相反或反平行。
探針3號(hào)的序列(SEQ ID NO14)為5′-CAC CAG AGA TGACAG-3′。
探針4號(hào)為在序列上與探針3號(hào)相同的15聚體ssDNA探針，但是在方向性上與dsDNA靶中的有義鏈相同或平行。
探針4號(hào)的序列(SEQ ID NO15)為5′-GAC AGT AGA GACCAC-3′。
探針5號(hào)為與探針3號(hào)相同的15聚體反平行ssDNA探針，除了在其5’位置連接熒光素部分以外。
探針5號(hào)的序列(SEQ ID NO16)為5′-Flu-CAC CAG AGA TGACAG-3′。
探針6號(hào)為與探針4號(hào)相同的15聚體平行ssDNA探針，除了在其5’位置連接熒光素部分。
探針6號(hào)的序列(SEQ ID NO17)為5′-Flu-GAC AGT AGA GACCAC-3′。
探針7號(hào)為15聚體ssDNA探針，在其5’位置連接熒光素部分，其設(shè)計(jì)成完全互補(bǔ)于50聚體野生型靶DNA(SEQ ID NO1)有義鏈的15個(gè)核苷酸區(qū)段。探針在方向性上與靶中的有義鏈相反或反平行。
探針7號(hào)的序列(SEQ ID NO18)為5′-Flu-CAC CAA AGA TGATAT-3′。
探針8號(hào)為15聚體ssDNA探針，其設(shè)計(jì)成完全互補(bǔ)于50聚體野生型靶DNA(SEQ ID NO1)有義鏈的15個(gè)核苷酸區(qū)段。探針在方向性上與靶中的有義鏈反平行。
探針8號(hào)的序列(SEQ ID NO19)為5′-CAC CAA AGA TGATAT-3′。
探針9號(hào)和探針10號(hào)為在序列上與野生型探針8號(hào)相同的15聚體突變ssDNA探針，除了有一個(gè)堿基突變(下劃線)以外。
探針9號(hào)的序列(SEQ ID NO20)為5′-CACGAA AGA TGATAT-3′。
探針10的序列(SEQ ID NO21)為5′-CAC CAA ACA TGA TAT-3′。
眾所周知，混合堿基序列的ssDNA鏈當(dāng)室溫下與反平行或平行合成的ssPNA鏈反應(yīng)時(shí)在沃森-克里克配對(duì)基礎(chǔ)上容易形成ssPNA:ssDNA雙鏈體。早先我們已顯示，這種ssPNA:ssDNA復(fù)合體含有完全匹配的序列，當(dāng)在DNA嵌入劑YOYO-1(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)存在下分析時(shí)，可容易地與含有1bp錯(cuò)配的ssPNA:ssDNA復(fù)合體加以區(qū)分，以及顯示PNA鏈的組裝次序?qū)ζ涮禺愋越Y(jié)合ssDNA靶的能力具有顯著意義。實(shí)施例1比較了當(dāng)野生型或突變ssDNA靶序列與沃森-克里克互補(bǔ)反平行ssDNA探針或與同源即同樣平行的ssDNA探針反應(yīng)時(shí)，dsDNA雙鏈體的形成效率。
雜交反應(yīng)混合物產(chǎn)生圖1A所示的數(shù)據(jù)，分別含有下列混合物2pmol ssDNA靶，2pmol ssDNA探針，0.5×TBE和500nM YOYO-1，終體積為40μl。將反應(yīng)混合物室溫(21℃)下溫育5分鐘，放置在石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。對(duì)各個(gè)分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)將熒光輻射強(qiáng)度繪圖。
在圖1B和1C中，雜交反應(yīng)混合物(40μl)各含有下列組分2pmolssDNA靶，2pmol 5′熒光素標(biāo)記的ssDNA探針，10mM Tris-HCl pH7.5，以及1mM EDTA。將反應(yīng)混合室溫下(21℃)溫育30分鐘或90分鐘。溫育后，將各個(gè)樣品置于石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。最大熒光強(qiáng)度出現(xiàn)在波長(zhǎng)525nm處，這是熒光素的輻射波長(zhǎng)。對(duì)各個(gè)分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)將熒光輻射強(qiáng)度繪圖。
當(dāng)ssDNA探針3號(hào)在YOYO-1存在下與SEQ ID NO5的50聚體野生型有義鏈或與SEQ ID NO7的50聚體突變有義鏈反應(yīng)時(shí)，形成反平行互補(bǔ)ssDNA:ssDNA雙鏈體(圖1A)。由1bp T-G錯(cuò)配的反平行互補(bǔ)雙鏈體(SEQ ID NO7的有義鏈+探針3號(hào))發(fā)射的熒光強(qiáng)度要比由完全匹配的反平行互補(bǔ)雙鏈體(SEQ ID NO5的有義鏈+探針3號(hào))所獲得的低56％。
當(dāng)ssDNA探針3號(hào)與SEQ ID NO5的50聚體野生型反義鏈在YOYO-1存在下反應(yīng)時(shí)，平行同源ssDNA:ssDNA雙鏈體形成的效率比反平行互補(bǔ)ssDNA:ssDNA雙鏈體形成的效率僅低3％(圖1A)。該結(jié)果完全是未預(yù)料的。當(dāng)SEQ ID NO7的50聚體突變反義鏈與ssDNA探針3號(hào)在YOYO-1存在下反應(yīng)時(shí)所形成的1bp A-G錯(cuò)配的平行同源雙鏈體產(chǎn)生的熒光發(fā)射強(qiáng)度要比完全平行同源雙鏈體所發(fā)射的低56％(圖1A)。含有各個(gè)50聚體ssDNA靶加上500nM YOYO-1的對(duì)照樣品顯示出的熒光水平比完全匹配的雙鏈體所觀察到的低91％-92％(圖1A)。由15聚體ssDNA探針3號(hào)加上500nM YOYO-1所發(fā)射的熒光水平比單獨(dú)由YOYO-1所產(chǎn)生的稍高些。用ssDNA靶和探針觀察到的熒光發(fā)射波長(zhǎng)的位移通常屬于ssDNA存在下的YOYO-1的發(fā)射圖譜。
YOYO-1促進(jìn)了ssDNA探針和反平行ssDNA靶中的互補(bǔ)堿基序列之間或ssDNA探針和平行ssDNA靶中的相同堿基序列之間以類似的功效形成DNA復(fù)合體，從而區(qū)分完全匹配的復(fù)合體和那些含有1bp錯(cuò)配的復(fù)合體。在平行同源復(fù)合體中，1bp錯(cuò)配為非同源堿基對(duì)。
利用ssDNA靶和ssDNA-F探針在缺乏諸如YOYO-1或陽離子的復(fù)合體促進(jìn)劑時(shí)，對(duì)反平行互補(bǔ)和平行同源dsDNA雙鏈體形成的比較效率進(jìn)一步加以檢查。當(dāng)ssDNA-F探針5號(hào)室溫下在Tris緩沖液中與SEQ ID NO5的50聚體野生型有義鏈溫育30分鐘后，沃森-克里克互補(bǔ)反平行ssDNA:ssDNA-F雙鏈體的形成非常有效，導(dǎo)致其熒光發(fā)射與單獨(dú)由探針5號(hào)所發(fā)射的比較減少53％(圖1B)。相比之下，反平行互補(bǔ)ssDNA:ssDNA-F復(fù)合體含有1bp T-G錯(cuò)配(SEQ ID NO7的有義鏈+探針5號(hào))，較不穩(wěn)定，導(dǎo)致其熒光發(fā)射在溫育30分鐘后僅比單獨(dú)由探針5號(hào)所發(fā)射的降低40％(圖1B)。
當(dāng)ssDNA探針5號(hào)與SEQ ID NO5的50聚體野生型反義鏈或與SEQ ID NO7的50聚體突變反義鏈反應(yīng)時(shí)形成平行同源ssDNA:ssDNA-F復(fù)合體，在溫育30分鐘生成的熒光發(fā)射強(qiáng)度分別比單獨(dú)由ssDNA探針5號(hào)所發(fā)射的低44％和37％(圖1B)。在缺乏促進(jìn)劑時(shí)渴望形成平行同源ssDNA:ssDNA-F復(fù)合體是完全未預(yù)料的。從完全匹配的雙鏈體和1bp錯(cuò)配的雙鏈體在缺乏復(fù)合體促進(jìn)劑時(shí)所發(fā)射的信號(hào)之間的區(qū)分不如當(dāng)YOYO-1存在并用作促進(jìn)劑和信號(hào)劑時(shí)所觀察的那么顯著(比較圖1A和1B)。這既是反平行雙鏈體的情形也是平行雙鏈體的情形。當(dāng)平行同源ssDNA靶用于產(chǎn)生ssDNA:ssDNA-F復(fù)合體時(shí)，比反平行互補(bǔ)ssDNA靶觀察到在完全匹配和1bp錯(cuò)配的DNA復(fù)合體之間區(qū)別稍小(圖1B)。
溫育90分鐘后，沃森-克里克反平行dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體由完全互補(bǔ)的序列(SEQ ID NO5的有義鏈+探針5號(hào))或1bp T-G錯(cuò)配序列(SEQ ID NO7的有義鏈+探針5號(hào))組成，產(chǎn)生的熒光發(fā)射強(qiáng)度與單獨(dú)由探針5號(hào)所發(fā)射的比較分別降低了39％和30％(圖1C)。顯然，溫育90分鐘后，平行同源ssDNA:ssDNA-F復(fù)合體所顯現(xiàn)的穩(wěn)定性水平與沃森-克里克反平行ssDNA:ssDNA-F復(fù)合體相同。溫育90分鐘后，完全平行的同源雙鏈體(SEQ ID NO5的反義鏈+探針5號(hào))和1bp A-G錯(cuò)配的平行同源雙鏈體(SEQ ID NO7的反義鏈+探針5號(hào))的熒光強(qiáng)度分別比單獨(dú)由ssDNA探針5號(hào)所發(fā)射的低40％和25％(圖1C)。
現(xiàn)在還未知平行dsDNA雙鏈體中同源堿基識(shí)別和結(jié)合的機(jī)制。然而，平行同源ssDNA序列識(shí)別和結(jié)合發(fā)生在構(gòu)象中，使得能區(qū)分完全匹配的ssDNA:ssDNA復(fù)合體和那些含有1bp或2bp錯(cuò)配的復(fù)合體。在這些平行同源復(fù)合體中，1bp錯(cuò)配為非同源堿基對(duì)。
實(shí)施例2在實(shí)施例1中，平行同源ssDNA:ssDNA雙鏈體形成既在諸如YOYO-1的復(fù)合體促進(jìn)劑存在下又在任何復(fù)合體促進(jìn)劑缺乏下均表現(xiàn)出顯著效率。平行dsDNA雙鏈體中同源堿基識(shí)別和結(jié)合使得容易區(qū)分完全同源堿基序列和含有1bp錯(cuò)配的平行同源序列。根據(jù)沃森-克里克互補(bǔ)識(shí)別和結(jié)合規(guī)則，這些平行同源1bp錯(cuò)配也可清晰識(shí)別成錯(cuò)配。實(shí)施例2檢查含有A-T或G-C堿基配對(duì)的平行同源dsDNA雙鏈體的識(shí)別和結(jié)合效率，從而確定這些沃森-克里克互補(bǔ)配對(duì)在平行同源結(jié)合反應(yīng)中是否以錯(cuò)配出現(xiàn)。
雜交反應(yīng)混合物(40μl)各含有下列組分2pmol ssDNA靶，2pmolssDNA探針，0.5×TBE和500nM YOYO-1。將反應(yīng)混合物室溫(21℃)下溫育5分鐘，置于石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。對(duì)各個(gè)分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)將熒光強(qiáng)度繪圖。
當(dāng)ssDNA探針3號(hào)(GC含量為53％)與SEQ ID NO5的50聚體野生型反義鏈或SEQ ID NO10的50聚體突變反義鏈在YOYO-1存在下反應(yīng)時(shí)，形成平行同源ssDNA:ssDNA雙鏈體(圖2A)。由1bp A-T錯(cuò)配的平行同源雙鏈體(SEQ ID NO10反義鏈+探針3號(hào))所發(fā)射的熒光強(qiáng)度比由完全平行同源雙鏈體(SEQ ID NO5反義鏈+探針3號(hào))所得到的要低72％(圖2A)。含有1bp A-T的平行同源雙鏈體的熒光發(fā)射顯著降低，這有力提示當(dāng)部分平行同源鏈試圖獲得穩(wěn)定的雙鏈體時(shí)，沃森-克里克A-T結(jié)合受到施加在A和T堿基上的空間和/或電荷構(gòu)象的阻礙。對(duì)照樣品含有各個(gè)50聚體ssDNA靶加上500nMYOYO-1，其所示的熒光水平比用完全匹配的雙鏈體所觀察到的低96％-97％(圖2A)。由15聚體ssDNA探針3號(hào)加上500nM YOYO-1所發(fā)射的熒光水平比單獨(dú)由YOYO-1所產(chǎn)生的稍高些。用ssDNA靶和探針觀察到的熒光發(fā)射波長(zhǎng)的位移通常屬于ssDNA存在下的YOYO-1的發(fā)射圖譜。
當(dāng)SEQ ID NO1的50聚體野生型反義鏈(GC含量為33％)與野生型ssDNA探針8號(hào)或與突變ssDNA探針9號(hào)和10號(hào)在YOYO-1存在下反應(yīng)時(shí)，也形成平行同源ssDNA:ssDNA雙鏈體(圖2B)。由1bp G-C錯(cuò)配的平行同源雙鏈體(SEQ ID NO1的反義鏈+探針9號(hào))和1bpC-G錯(cuò)配的平行同源雙鏈體(SEQ ID NO1的反義鏈+探針10號(hào))分別比完全平行同源雙鏈體(SEQ ID NO1的反義鏈+探針8號(hào))所得到的要低67％和66％(圖2B)。平行同源雙鏈體中相互作用堿基的構(gòu)象對(duì)沃森-克里克互補(bǔ)G-C結(jié)合是不利的，導(dǎo)致熒光發(fā)射降低，指示1bp錯(cuò)配。由50聚體ssDNA靶加上500nM YOYO-1或各個(gè)15聚體ssDNA探針加上500nM YOYO-1組成的對(duì)照樣品導(dǎo)致熒光水平比單獨(dú)由YOYO-1所產(chǎn)生的稍大些(圖2B)。
因此，在YOYO-1存在下形成的平行同源dsDNA雙鏈體中的相互作用堿基對(duì)所采用的構(gòu)象對(duì)沃森-克里克互補(bǔ)堿基對(duì)之間的結(jié)合是不利的，導(dǎo)致這種雙鏈體似乎含有1bp錯(cuò)配。
我們面臨結(jié)合序列中的錯(cuò)配，無論其是作為部分發(fā)夾還是以多鏈復(fù)合體出現(xiàn)，如何致使高能運(yùn)動(dòng)和重復(fù)運(yùn)動(dòng)，因?yàn)閴A基序列在任一結(jié)合基元下都試圖獲得理想結(jié)合構(gòu)象的穩(wěn)定性。成核位點(diǎn)上游或下游堿基對(duì)的結(jié)合強(qiáng)度，金屬離子和其他因素會(huì)對(duì)實(shí)現(xiàn)結(jié)合的努力產(chǎn)生影響，這是可以預(yù)料的。
實(shí)施例3本實(shí)施例檢查由YOYO-1或單價(jià)陽離子促進(jìn)形成反平行同源ssDNA:ssDNA雙鏈體的效率。
雜交反應(yīng)產(chǎn)生圖3A所示的數(shù)據(jù)，分別含有下列混合物2pmolssDNA靶，2pmol ssDNA探針，0.5×TBE和500nM YOYO-1，終體積為40μl。將反應(yīng)混合物室溫(21℃)下溫育5分鐘，放置在石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。對(duì)各個(gè)分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)將熒光輻射強(qiáng)度繪圖。
在圖3B中，雜交反應(yīng)混合物(40μl)各含有下列組分2pmolssDNA靶，2pmol 5′熒光素標(biāo)記的ssDNA探針，10mM Tris-HCl pH7.5，以及50mM NaCl。將反應(yīng)混合室溫(21℃)下溫育1-60分鐘的各種長(zhǎng)度的時(shí)間。溫育后，將樣品放置于石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。對(duì)各個(gè)分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)將熒光輻射強(qiáng)度繪圖。
ssDNA探針4號(hào)與SEQ ID NO5的50聚體野生型反義鏈在YOYO-1存在下溫育導(dǎo)致反平行同源ssDNA:ssDNA復(fù)合體形成(圖3A)。盡管反平行同源復(fù)合體形成的效率只有常規(guī)反平行互補(bǔ)dsDNA形成的65％(比較圖1A和3A)，但是反平行同源ssDNA序列識(shí)別和結(jié)合還是通過YOYO-1促進(jìn)而發(fā)生了。該結(jié)果是完全未預(yù)料到的。此外，反平行同源ssDNA:ssDNA復(fù)合體含有野生型序列，它們與那些含有1bp或2bp錯(cuò)配的復(fù)合體有明顯區(qū)別。由1bp A-G錯(cuò)配DNA復(fù)合體(SEQID NO7的反義鏈+探針4號(hào))，1bp C-T錯(cuò)配DNA復(fù)合體(SEQ IDNO6的反義鏈+探針4號(hào))，以及連續(xù)2bp錯(cuò)配DNA復(fù)合體(SEQ IDNO8的反義鏈+探針4號(hào))所發(fā)射的熒光強(qiáng)度分別比由完全反平行同源復(fù)合體(SEQ ID NO5的反義鏈+探針4號(hào))所得到的要低25％，65％和71％(圖3A)。隨著探針和靶之間的同源程度降低，熒光發(fā)射水平降低。含有各個(gè)50聚體ssDNA靶加上500nM YOYO-1的對(duì)照樣品所示的熒光水平比用完全匹配的復(fù)合體所觀察到的要低88％-90％(圖3A)。由15聚體ssDNA探針4號(hào)加上500nM YOYO-1所發(fā)射的熒光水平比單獨(dú)由YOYO-1所產(chǎn)生的稍高些。
利用ssDNA靶和ssDNA-F探針既存在又缺乏50mM NaCl條件下對(duì)反平行同源ssDNA:ssDNA復(fù)合體形成進(jìn)一步加以檢查。ssDNA-F探針6號(hào)與SEQ ID NO5的50聚體野生型反義鏈在50mM NaCl存在下溫育15分鐘后，形成反平行同源ssDNA:ssDNA-F復(fù)合體，正如其觀察到的熒光與單獨(dú)由探針6號(hào)所發(fā)射的比較降低34％(圖3B)。溫育15分鐘后，反平行同源復(fù)合體形成的效率是反平行互補(bǔ)復(fù)合體形成的62％(數(shù)據(jù)未顯示)。相比之下，反平行同源ssDNA:ssDNA-F復(fù)合體含有1bp A-G錯(cuò)配(SEQ ID NO7的反義鏈+探針6號(hào))，1bp C-T錯(cuò)配(SEQ ID NO6的反義鏈+探針6號(hào))，1bp A-T錯(cuò)配(SEQ IDNO10的反義鏈+探針6號(hào))，以及連續(xù)2bp錯(cuò)配(SEQ ID NO8的反義鏈+探針6號(hào))，在溫育15分鐘后，與單獨(dú)由探針6號(hào)發(fā)射的比較，熒光分別降低24％，26％，23％和13％(圖3B)。反平行同源雙鏈體中相互作用堿基的構(gòu)象明顯不利于沃森-克里克互補(bǔ)A-T結(jié)合，導(dǎo)致熒光發(fā)射變化，指示1bp錯(cuò)配。較少的反平行同源復(fù)合體形成在50mM NaCl存在下溫育30分鐘后出現(xiàn)(數(shù)據(jù)未顯示)。溫育45分鐘后，明顯沒有復(fù)合體形成。反平行同源復(fù)合體在沒有NaCl的Tris緩沖液中觀察到相似的形成速率和穩(wěn)定性(數(shù)據(jù)未顯示)。
由YOYO-1或NaCl促進(jìn)，反平行同源ssDNA序列識(shí)別和結(jié)合發(fā)生在構(gòu)象中，使得能區(qū)別完全匹配的ssDNA:ssDNA復(fù)合體以及那些含有1bp或2bp錯(cuò)配的復(fù)合體。反平行同源雙鏈體中的堿基對(duì)的相互作用導(dǎo)致常規(guī)沃森-克里克A-T堿基對(duì)由于錯(cuò)配而去穩(wěn)定。
實(shí)施例4本實(shí)施例顯示由單價(jià)陽離子促進(jìn)形成平行互補(bǔ)ssDNA:ssDNA復(fù)合體的效率。雜交反應(yīng)混合物(40μl)各含有下列組分2pmol ssDNA靶，2pmol 5′熒光素標(biāo)記的ssDNA探針，10mM Tris-HCl pH7.5，以及50mM NaCl。將反應(yīng)混合室溫(21℃)下溫育1-60分鐘的各種長(zhǎng)度的時(shí)間。溫育后，將樣品放置于石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。對(duì)各個(gè)分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)將熒光輻射強(qiáng)度繪圖。
在50mM NaCl存在下溫育15分鐘后，由完全互補(bǔ)序列組成的ssDNA:ssDNA-F雙鏈體(SEQ ID NO5的有義鏈+探針6號(hào))容易形成，導(dǎo)致其熒光發(fā)射強(qiáng)度與單獨(dú)由探針6號(hào)所發(fā)射的比較降低41％(圖4)。這種平行互補(bǔ)雙鏈體形成的高效是完全未預(yù)料的。相比之下，不完全互補(bǔ)ssDNA:ssDNA-F復(fù)合體含有1bp T-G錯(cuò)配(SEQ ID NO7的有義鏈+探針6號(hào))，1bp G-T錯(cuò)配(SEQ ID NO6的有義鏈+探針6號(hào))，1bp T-T錯(cuò)配(SEQ ID NO10的有義鏈+探針6號(hào))，以及連續(xù)2bp錯(cuò)配(SEQ ID NO8的有義鏈+探針6號(hào))生成的熒光發(fā)射強(qiáng)度與單獨(dú)由探針6號(hào)所顯示的比較，分別降低18％，20％，10％和16％(圖4)。
一旦在50mM NaCl存在下形成，完全匹配的平行互補(bǔ)雙鏈體極不穩(wěn)定，溫育30和45分鐘后導(dǎo)致其熒光發(fā)射與單獨(dú)由探針6號(hào)所發(fā)射的比較分別降低40％和47％(數(shù)據(jù)未顯示)。1bp和2bp錯(cuò)配的平行互補(bǔ)復(fù)合體在50mM NaCl存在下溫育30和45分鐘后是非常不穩(wěn)定的(數(shù)據(jù)未顯示)。平行互補(bǔ)ssDNA:ssDNA-F形成的速率和效率在50mM NaCl存在下前45分鐘溫育過程中類似于反平行互補(bǔ)ssDNA:ssDNA-F形成(數(shù)據(jù)未顯示)。而反平行互補(bǔ)復(fù)合體在50mMNaCl存在下溫育60分鐘后繼續(xù)容易形成，此時(shí)沒有明顯的平行互補(bǔ)復(fù)合體形成(數(shù)據(jù)未顯示)。
NaCl以類似功效促進(jìn)了ssDNA-F探針和反平行互補(bǔ)ssDNA靶之間或ssDNA-F探針和平行互補(bǔ)ssDNA靶之間的DNA復(fù)合體形成，從而使得能區(qū)分完全匹配的復(fù)合體和那些含有1bp或2bp錯(cuò)配的復(fù)合體。
實(shí)施例5實(shí)施例1-4表明了交替堿基識(shí)別和結(jié)合基元發(fā)生在反平行或平行ssDNA探針和互補(bǔ)或同源ssDNA靶之間生成ssDNA:ssDNA雙鏈體，而非常規(guī)的反平行沃森-克里克互補(bǔ)dsDNA復(fù)合體。本實(shí)施例將顯示堿基能夠同時(shí)識(shí)別和相互作用于互補(bǔ)和同源堿基。
將2pmol ssDNA探針3號(hào)的樣品在95℃下加熱10分鐘，并在各種濃度的游離堿基存在下冷卻至室溫，歷時(shí)30分鐘，產(chǎn)生含有共軛堿基的ssDNA探針。ssDNA探針3號(hào)的復(fù)制樣品在沒有外加的游離堿基條件下進(jìn)行類似的變性和冷卻，從而生成非共軛的ssDNA探針。然后，將2pmol的這些共軛或非共軛的ssDNA探針與2pmol ssDNA靶在500nM YOYO-1和0.5×TBE存在下混合，終反應(yīng)體積為40μl。將反應(yīng)混合物室溫(21℃)下溫育5分鐘，放置在石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。對(duì)各個(gè)分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)將熒光強(qiáng)度繪圖。
當(dāng)非共軛的ssDNA探針3號(hào)與SEQ ID NO5的50聚體野生型有義鏈或SEQ ID NO7的50聚體突變有義鏈在YOYO-1存在下反應(yīng)時(shí)，形成反平行互補(bǔ)ssDNA:ssDNA復(fù)合體(圖5A)。由1bp T-G錯(cuò)配的反平行互補(bǔ)雙鏈體(SEQ ID NO7的有義鏈+探針3號(hào))所發(fā)射的熒光強(qiáng)度要比由完全匹配的反平行互補(bǔ)雙鏈體(SEQ ID NO5的有義鏈+探針3號(hào))所得到的低45％。對(duì)照樣品含有各個(gè)50聚體ssDNA靶加上500nM YOYO-1，所示的熒光水平比用完全匹配的雙鏈體所觀察到的要低92％-93％(圖5A)。由15聚體ssDNA探針3號(hào)加上500nM YOYO-1所發(fā)射的熒光水平比單獨(dú)由YOYO-1所產(chǎn)生的稍高些。
當(dāng)ssDNA探針3號(hào)與SEQ ID NO5的50聚體野生型反義鏈在YOYO-1存在下反應(yīng)時(shí)，平行同源ssDNA:ssDNA雙鏈體形成的效率要比反平行互補(bǔ)ssDNA:ssDNA雙鏈體形成的效率低14％(比較圖5A和5B)。當(dāng)SEQ ID NO7的50聚體突變反義鏈與ssDNA探針3號(hào)在YOYO-1存在下反應(yīng)時(shí)形成1bp A-G錯(cuò)配平行同源雙鏈體，其產(chǎn)生的熒光發(fā)射強(qiáng)度要比由完全平行同源雙鏈體所發(fā)射的低47％(圖5B)。
15聚體ssDNA探針3號(hào)含有6個(gè)腺嘌呤堿基。2pmol ssDNA探針3號(hào)與3pmol游離胸腺嘧啶的共軛可導(dǎo)致探針3號(hào)內(nèi)25％互補(bǔ)A或100％同源T結(jié)合到外加的胸腺嘧啶上。互補(bǔ)A-T結(jié)合在能量上是優(yōu)選的。2pmol ssDNA探針3號(hào)(與3pmol胸腺嘧啶共軛)與2pmol SEQID NO5的野生型反義鏈在YOYO-1存在下反應(yīng)導(dǎo)致平行同源ssDNA:ssDNA復(fù)合體形成顯著提高(圖5B)。ssDNA探針與3pmol胸腺嘧啶共軛25％使得完全同源序列之間的平行同源復(fù)合體形成增加了78％。這種平行同源復(fù)合體形成的增加可歸功于探針3號(hào)中的腺嘌呤與共軛互補(bǔ)胸腺嘧啶堿基以及與ssDNA靶中的同源腺嘌呤堿基能同時(shí)相互作用。此外，與可用的互補(bǔ)堿基相互作用對(duì)同源堿基及其相鄰堿基所采用的同源結(jié)合構(gòu)象是無害的。
相比之下，含有1bp A-G錯(cuò)配的平行同源復(fù)合體(SEQ ID NO7的反義鏈+探針3號(hào))形成的效率當(dāng)用胸腺嘧啶將探針3號(hào)共軛25％時(shí)比用非共軛探針3號(hào)增加了16％(圖5B)。這對(duì)應(yīng)于當(dāng)利用T-共軛的探針3號(hào)時(shí)，1bp A-G錯(cuò)配的平行同源復(fù)合體的熒光發(fā)射強(qiáng)度與完全匹配的平行同源復(fù)合體所觀察到的相比降低了65％。ssDNA探針的共軛增加了區(qū)分完全匹配的平行同源復(fù)合體和1bp錯(cuò)配平行同源復(fù)合體的特異性。
顯然，當(dāng)用胸腺嘧啶共軛25％的探針3號(hào)與SEQ ID NO5的有義鏈在YOYO-1存在下反應(yīng)時(shí)(圖5A)，完全匹配的反平行互補(bǔ)ssDNA:ssDNA復(fù)合體形成增強(qiáng)了48％。探針3號(hào)中的腺嘌呤與共軛的互補(bǔ)胸腺嘧啶和ssDNA靶中的互補(bǔ)T同時(shí)相互作用增加了完全匹配的反平行互補(bǔ)復(fù)合體的形成。顯然，1bp T-G錯(cuò)配反平行互補(bǔ)復(fù)合體的形成當(dāng)采用T-共軛的探針3號(hào)時(shí)非常低效，導(dǎo)致其熒光發(fā)射強(qiáng)度與由含有共軛T的完全匹配的反平行互補(bǔ)復(fù)合體所生成的比較降低了88％(圖5A)。通過利用共軛的ssDNA探針在YOYO-1存在下極大提高了完全匹配和1bp錯(cuò)配的反平行互補(bǔ)ssDNA:ssDNA復(fù)合體之間的區(qū)分，這也是顯著的。
用胞嘧啶或鳥苷使探針3號(hào)共軛25％，也提高了在YOYO-1存在下反平行互補(bǔ)和平行同源ssDNA:ssDNA復(fù)合體形成的效率以及改進(jìn)了完全匹配的復(fù)合體和1bp錯(cuò)配的復(fù)合體之間區(qū)分的特異性(數(shù)據(jù)未顯示)。
含有共軛堿基的ssDNA:ssDNA復(fù)合體的形成證明，序列中的堿基可特異性和同時(shí)識(shí)別和相互作用于互補(bǔ)堿基和同源堿基，條件是共軛堿基為沃森-克里克互補(bǔ)堿基，其位于一條鏈上與另一條鏈特異性結(jié)合。ssDNA探針中的堿基、共軛堿基和ssDNA靶中的堿基之間的識(shí)別和結(jié)合構(gòu)象可類似于本文所述的反平行和平行dsDNA:ssDNA復(fù)合體中所形成的堿基構(gòu)象。
實(shí)施例6實(shí)施例6表明在含有混合堿基序列的dsDNA靶和標(biāo)記有熒光素的同源dsDNA探針之間形成四鏈體DNA。四鏈體DNA形成由反應(yīng)中加入的單價(jià)陽離子的存在而得以增強(qiáng)。
如上所述，將互補(bǔ)有義和反義15聚體ssDNA序列合成，通過HPLC純化以及退火，生成15聚體dsDNA探針。使dsDNA探針以濃度為1pmol/μl稀釋在雙蒸餾水中。
探針11號(hào)為在其各個(gè)5’位置連接有熒光素部分的15聚體dsDNA探針，并且設(shè)計(jì)成與50聚體野生型靶DNA(SEQ ID NO5)的中央15bp區(qū)段完全同源。
探針11號(hào)的有義鏈序列(SEQ ID NO22)為5′-Flu-CTG TCA TCTCTG GTG-3′。
探針11號(hào)的反義鏈序列(SEQ ID NO22)為5′-Flu-CAC CAG AGATGA CAG-3′。
各個(gè)雜交反應(yīng)混合物(40μl)含有下列組分0.4pmol靶dsDNA，4pmol 5′-熒光素標(biāo)記的dsDNA探針11號(hào)，10mM Tris-HCl pH7.5和100mM KCl。將反應(yīng)混合物室溫(21℃)下溫育1小時(shí)，無需預(yù)變性。將樣品置于石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。最大熒光強(qiáng)度出現(xiàn)在波長(zhǎng)525nm處，這是熒光素的輻射波長(zhǎng)。圖6示出對(duì)各個(gè)分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)作圖的熒光強(qiáng)度。
在缺乏KCl時(shí)，未檢測(cè)到dsDNA靶和探針11號(hào)之間的結(jié)合，導(dǎo)致當(dāng)野生型dsDNA靶(SEQ ID NO5)或突變dsDNA靶(SEQ ID NO7)與dsDNA探針11號(hào)混合時(shí)或當(dāng)dsDNA探針11號(hào)單獨(dú)存在時(shí)所觀察到的熒光強(qiáng)度相似(數(shù)據(jù)未顯示)。
在21℃存在100mM KCl條件下溫育1小時(shí)后，由dsDNA靶(SEQID NO5)和dsDNA探針11號(hào)上完全同源序列組成的dsDNA:dsDNA-F四鏈體容易形成，導(dǎo)致熒光發(fā)射強(qiáng)度與單獨(dú)由dsDNA探針11號(hào)(標(biāo)記dsDNA-F)所發(fā)射的比較降低62％(圖6)。相比之下，不完全同源的dsDNA:dsDNA-F四鏈體(SEQ ID NO7+探針11號(hào))含有1堿基對(duì)錯(cuò)配在這些反應(yīng)條件下是較不穩(wěn)定的，與單獨(dú)由dsDNA探針11號(hào)所顯示的比較，其熒光強(qiáng)度僅有18％的降低。
以特定濃度存在的諸如K+的單價(jià)陽離子足以使得在缺乏預(yù)變性條件下在dsDNA靶和標(biāo)記有熒光素的dsDNA探針之間形成四鏈體。四鏈體形成發(fā)生在同源堿基對(duì)親和性基礎(chǔ)之上，在完全同源雙鏈體鏈之間形成的四鏈體是可測(cè)量的和其量顯著更大。此外，利用天然dsDNA，室溫下溫育僅1小時(shí)就發(fā)生了反應(yīng)，探針∶靶的比率為10∶1。本實(shí)施例中所用的dsDNA靶和dsDNA探針是同源的，GC含量為53％，并且在任何DNA鏈上不含有同型嘌呤或同型嘧啶延伸。本發(fā)明的分析利用dsDNA探針能鑒定完全同源的dsDNA序列和那些含有一對(duì)錯(cuò)配堿基的dsDNA序列。
實(shí)施例7在實(shí)施例6中進(jìn)行的四鏈體DNA分析受到了反應(yīng)混合物中外加的單價(jià)陽離子的促進(jìn)。利用二價(jià)陽離子對(duì)分析的特異性進(jìn)一步加以檢查，以促進(jìn)dsDNA靶和GC含量為53％的dsDNA-F探針形成四鏈體DNA。
雜交反應(yīng)混合物(40μl)各含有下列組分0.4pmol靶dsDNA，4pmol 5′熒光素標(biāo)記的dsDNA探針11號(hào)，10mM Tris-HCl pH7.5，以及20mM MnCl2和20mM MgCl2。將反應(yīng)混合物室溫(21℃)下溫育1小時(shí)，無需預(yù)變性。樣品置于石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。圖7示出對(duì)各個(gè)分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)作圖的熒光強(qiáng)度。
當(dāng)dsDNA-F探針11號(hào)(GC含量為53％)與50聚體野生型dsDNA靶(SEQ ID NO5)或突變dsDNA靶(SEQ ID NO7)在20mM MnCl2和20mM MgCl2存在下溫育時(shí)，四鏈體在非變性條件下室溫下形成。當(dāng)完全同源的DNA四鏈體產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度最大降低34％時(shí)，較不利的含有1bp錯(cuò)配的dsDNA:dsDNA-F(SEQ ID NO7+探針11號(hào))所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與單獨(dú)用dsDNA探針11號(hào)所觀察的大約相同(圖7)。
諸如Mn+2和Mg+2的二價(jià)陽離子的存在促進(jìn)了非變性條件下四鏈體的形成，使得能準(zhǔn)確區(qū)分完全同源的dsDNA靶和dsDNA探針的四鏈體和含有一對(duì)錯(cuò)配堿基的四鏈體序列。
實(shí)施例8實(shí)施例6和7中進(jìn)行的四鏈體DNA分析受到了反應(yīng)混合物中外加單價(jià)陽離子或二價(jià)陽離子的促進(jìn)。下一個(gè)實(shí)施例表明當(dāng)利用DNA嵌入劑YOYO-1時(shí)，同源四鏈體DNA分析的特異性。
如上所述，互補(bǔ)有義和反義15聚體ssDNA序列合成，通過HPLC純化以及退火，生成15聚體dsDNA探針。將dsDNA探針以濃度為1pmol/μl稀釋在雙蒸餾水中。
探針12號(hào)為在序列上與探針11號(hào)相同的15聚體dsDNA探針，但是沒有連接5′熒光素部分。
探針12號(hào)的有義鏈序列(SEQ ID NO23)為5′-CTG TCA TCT CTGGTG-3′。
探針12號(hào)的反義鏈序列(SEQ ID NO23)為5′-CAC CAG AGATGA CAG-3′。
雜交反應(yīng)混合物(40μl)各含有下列組分0.4pmol dsDNA靶，4pmol dsDNA探針12號(hào)，0.5×TBE和500nM YOYO-1。將反應(yīng)混合物21℃下溫育5分鐘，放置在石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。對(duì)各個(gè)分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)將熒光輻射強(qiáng)度繪圖。
沒有探針或靶，只有YOYO-1存在時(shí)所觀察到的熒光強(qiáng)度示于圖8中。圖8還顯示當(dāng)dsDNA探針12號(hào)與含有同源序列的野生型50聚體dsDNA靶(SEQ ID NO5)或與其他四個(gè)dsDNA靶組成反應(yīng)混合物時(shí)所觀察到的熒光強(qiáng)度，所述其他四個(gè)dsDNA靶如沒有一個(gè)錯(cuò)配堿基對(duì)，就含有與dsDNA探針12號(hào)中堿基序列同源的序列。當(dāng)同源野生型dsDNA靶(SEQ ID NO5)與dsDNA探針12號(hào)存在于反應(yīng)混合物中時(shí)，產(chǎn)生了最大的熒光強(qiáng)度。當(dāng)錯(cuò)配的dsDNA靶與dsDNA探針12號(hào)在反應(yīng)混合物中溫育時(shí)，與由完全匹配的四鏈體所獲得的比較，生成的熒光強(qiáng)度從對(duì)dsDNA靶(SEQ ID NO10)而言低20％，至對(duì)dsDNA靶(SEQ ID NO11)而言低80％(圖8)。
當(dāng)探針含有完全同源序列時(shí)，比當(dāng)有單一堿基對(duì)，其與dsDNA靶中的堿基對(duì)不同源，也就是相同時(shí)，觀察到由YOYO-1嵌入穩(wěn)定的同源四鏈體在dsDNA靶和dsDNA探針之間更容易形成。上文三個(gè)實(shí)施例中所述的四鏈體復(fù)合體被我們稱為鏡像同源。
實(shí)施例9在此實(shí)施例中，將50聚體dsDNA靶與GC含量為53％的15聚體dsDNA探針(探針13號(hào))接觸，其中當(dāng)一條雙鏈體的大溝放置于其他雙鏈體的小溝中時(shí)，探針鏈的堿基和靶鏈的近堿基之間存在沃森-克里克互補(bǔ)性。雙鏈體探針中的堿基序列不是同源的，但是它們與雙鏈體靶中的那些堿基序列的關(guān)系是顛倒的。當(dāng)把大溝嵌套在小溝中時(shí)，雙鏈體相互是平行的，并被我們稱為嵌套互補(bǔ)性。
如上所述，互補(bǔ)有義和反義15聚體ssDNA序列合成，通過HPLC純化以及退火，生成15聚體dsDNA探針。將dsDNA探針以濃度為1pmol/μl稀釋在雙蒸餾水中。
探針13號(hào)的有義鏈序列(SEQ ID NO24)為5′-GAC AGT AGAGAC CAC-3′。
探針13號(hào)的反義鏈序列(SEQ ID NO24)為5′-GTG GTC TCT ACTGTC-3′。
雜交反應(yīng)混合物(40μl)分別含有下列組分0.4pmol靶dsDNA，4pmol dsDNA探針13號(hào)，0.5×TBE和100nM YOYO-1。將反應(yīng)混合物室溫(21℃)下溫育5分鐘，放置在石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。對(duì)各個(gè)分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)將熒光輻射強(qiáng)度繪圖。
圖9舉例說明在缺乏預(yù)變性的條件下，當(dāng)野生型50聚體dsDNA靶(SEQ ID NO5)與15聚體dsDNA探針13號(hào)反應(yīng)時(shí)，得到最高的熒光強(qiáng)度，所述探針13號(hào)在嵌套互補(bǔ)性基礎(chǔ)上完全匹配于dsDNA靶(SEQID NO5)。在dsDNA靶和嵌套互補(bǔ)性dsDNA探針之間形成四鏈體的情形下，熒光強(qiáng)度是DNA結(jié)合發(fā)生的指征。
突變dsDNA靶與雙鏈體探針有單一堿基對(duì)的錯(cuò)配，當(dāng)匹配在嵌套互補(bǔ)性的反向同源性基礎(chǔ)上加以評(píng)價(jià)時(shí)，該突變dsDNA靶比完全互補(bǔ)性野生型dsDNA靶與dsDNA探針可測(cè)量地形成更少的四鏈體復(fù)合體。各種錯(cuò)配在實(shí)施例8中基于鏡像同源性加以分析，而在本實(shí)施例中基于嵌套互補(bǔ)性加以分析。
如圖9所示，以1bp錯(cuò)配的dsDNA靶加上dsDNA探針13號(hào)形成四鏈體，其所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度比由完全匹配的四鏈體(SEQ ID NO5+探針13號(hào))所得到的少8％-16％。
在實(shí)施例8中完全同源和部分同源的四鏈體之間觀察到熒光最大的區(qū)別。這提示完全互補(bǔ)或1bp錯(cuò)配的嵌套互補(bǔ)性dsDNA探針比鏡像同源dsDNA探針與dsDNA靶的結(jié)合更不易區(qū)分，后者結(jié)合具有更高的特異性。
本實(shí)施例表明，嵌套互補(bǔ)性DNA雙鏈體之間的沃森-克里克四鏈體結(jié)合在YOYO-1存在下容易發(fā)生。
實(shí)施例10實(shí)施例10表明，當(dāng)陽離子解縮合劑，諸如DNA嵌入劑YOYO-1存在時(shí)，本發(fā)明的分析可區(qū)分完全匹配的沃森-克里克互補(bǔ)dsDNA:ssPNA復(fù)合體以及含有1bp，2bp和3bp錯(cuò)配的dsDNA:ssPNA復(fù)合體。
雜交反應(yīng)混合物(40μl)各含有下列組分2pmol靶dsDNA，2pmol ssPNA探針，0.5×TBE和500nM YOYO-1。將反應(yīng)混合物室溫(21℃)下溫育5分鐘，置于石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。對(duì)各個(gè)分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)將熒光強(qiáng)度繪圖。
沒有DNA或PNA，只有YOYO-1存在時(shí)或野生型SEQ ID NO1，突變SEQ ID NO2或突變SEQ ID NO3與反平行PNA探針1號(hào)或平行PNA探針2號(hào)反應(yīng)時(shí)所觀察到的熒光強(qiáng)度分別示于圖10A和10B中。由完全互補(bǔ)序列組成的dsDNA:ssPNA復(fù)合體(SEQ ID NO1+探針1號(hào))使得在YOYO-1和復(fù)合體之間相互作用最大，生成最高的熒光強(qiáng)度(圖10A)。一個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配的dsDNA:ssPNA復(fù)合體(SEQ ID NO2+探針1號(hào))和兩個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配的dsDNA:ssPNA復(fù)合體(SEQ ID NO3+探針1號(hào))的熒光強(qiáng)度分別比完全匹配的dsDNA:ssPNA復(fù)合體低97％和99％(圖10A)。同樣，當(dāng)平行PNA探針2號(hào)與靶dsDNA序列結(jié)合時(shí)，一個(gè)和兩個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配的dsDNA:ssPNA復(fù)合體所示的熒光強(qiáng)度分別比完全互補(bǔ)的dsDNA:ssPNA復(fù)合體(SEQ ID NO1+探針號(hào)2)低92％和97％(圖10B)。三個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配的dsDNA:ssPNA復(fù)合體由SEQ IDNO4和探針1號(hào)，或者由SEQ ID NO4和探針2號(hào)組成，其產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度分別比完全匹配的dsDNA:ssPNA復(fù)合體低99％和97％(數(shù)據(jù)未顯示)。對(duì)照樣品含有50聚體dsDNA靶加上500nM YOYO-1，其所示的熒光水平等于或低于用3bp錯(cuò)配的復(fù)合體所觀察的熒光水平(數(shù)據(jù)未顯示)。由ssPNA探針加上500nM YOYO-1一起發(fā)射的熒光水平與單獨(dú)由YOYO-1所發(fā)射的相同(數(shù)據(jù)未顯示)。隨著探針和靶之間的錯(cuò)配程度增加，YOYO-1與錯(cuò)配復(fù)合體的相互作用水平降低。因而，熒光發(fā)射強(qiáng)度降低。無論采用反平行或平行PNA探針，都存在這種關(guān)系。由各個(gè)復(fù)合體所發(fā)射的熒光特征水平隨時(shí)間加以監(jiān)控，并在5分鐘-24小時(shí)之間穩(wěn)定。
有趣的是，當(dāng)15聚體靶dsDNA序列與15聚體PNA探針序列反應(yīng)時(shí)，采用平行PNA探針比采用反平行PNA探針在完全匹配的復(fù)合體和1或2bp錯(cuò)配的復(fù)合體之間觀察到的熒光發(fā)射差異更大(數(shù)據(jù)未顯示)。
因此，熒光強(qiáng)度分析測(cè)定dsDNA:ssPNA復(fù)合體形成，能區(qū)分野生型序列和那些含有1bp，2bp或3bp突變的序列，無需對(duì)雙鏈體DNA靶進(jìn)行預(yù)變性。
實(shí)施例11分析測(cè)定由YOYO-1促進(jìn)形成三鏈體的特異性，通過野生型和混合堿基序列的突變dsDNA靶與反平行和平行ssDNA探針在缺乏dsDNA靶的預(yù)變性條件下反應(yīng)而加以進(jìn)一步研究。
雜交反應(yīng)混合物(40μl)各含有下列組分2pmol靶dsDNA，2pmol ssDNA探針，0.5×TBE和500nM YOYO-1。將反應(yīng)混合物室溫(21℃)下溫育5分鐘，置于石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。對(duì)各個(gè)分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)將熒光強(qiáng)度繪圖。
當(dāng)反平行ssDNA探針3號(hào)(GC含量為53％)與50聚體野生型dsDNA靶(SEQ ID NO5)和突變dsDNA靶(SEQ ID NO6和SEQ IDNO8)反應(yīng)時(shí)，室溫下在非變性條件下形成dsDNA:ssDNA復(fù)合體(圖11A)。當(dāng)完全匹配的DNA復(fù)合體發(fā)射最高的熒光強(qiáng)度時(shí)，含有1bp錯(cuò)配的不完全互補(bǔ)復(fù)合體(SEQ ID NO6+探針3號(hào))和連續(xù)2bp錯(cuò)配的不完全互補(bǔ)復(fù)合體(SEQ ID NO8+探針3號(hào))產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度分別比用完全匹配序列所觀察到的低63％和95％(圖11A)。隨著探針和靶之間錯(cuò)配程度增加，熒光水平降低。由各個(gè)復(fù)合體所示的特征熒光強(qiáng)度隨時(shí)間加以監(jiān)測(cè)，并在5分鐘-24小時(shí)之間穩(wěn)定。對(duì)照樣品含有50聚體dsDNA靶加上500nM YOYO-1，所示的熒光水平低于用2bp錯(cuò)配的DNA復(fù)合體所觀察到的熒光水平(數(shù)據(jù)未顯示)。由ssDNA探針加上500nM YOYO-1所產(chǎn)生的熒光水平與單獨(dú)由YOYO-1所得到的相同(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)15聚體反平行ssDNA探針與GC含量為33％和73％的野生型或突變50聚體dsDNA靶在同樣反應(yīng)條件下反應(yīng)時(shí)獲得十分類似的結(jié)果，這表明了利用反平行ssDNA探針進(jìn)行dsDNA:ssDNA復(fù)合體形成分析的可靠性，其不依賴于ssDNA探針和dsDNA靶的GC百分比含量(數(shù)據(jù)未顯示)。
同樣，當(dāng)平行ssDNA探針4號(hào)與50聚體野生型dsDNA靶(SEQ IDNO5)和突變dsDNA靶(SEQ ID NO6和SEQ ID NO8)在YOYO-1存在下反應(yīng)時(shí)形成dsDNA:ssDNA復(fù)合體。1bp錯(cuò)配的DNA復(fù)合體(SEQID NO6+探針4號(hào))和連續(xù)2bp錯(cuò)配的DNA復(fù)合體(SEQ ID NO8+探針4號(hào))的熒光強(qiáng)度分別比由完全匹配的序列所得到的低48％和65％(圖11B)。隨著探針和靶之間的錯(cuò)配程度增加，熒光發(fā)射水平減少。利用平行ssDNA探針生成dsDNA:ssDNA復(fù)合體比利用反平行ssDNA探針生成dsDNA:ssDNA復(fù)合體，觀察到完全匹配和錯(cuò)配的DNA復(fù)合體之間區(qū)分稍少些。
YOYO-1促進(jìn)了反平行ssDNA探針和dsDNA靶之間以及平行ssDNA探針和dsDNA靶之間形成DNA復(fù)合體，從而區(qū)分完全匹配的復(fù)合體和那些含有1bp或2bp錯(cuò)配的復(fù)合體，無需對(duì)dsDNA靶進(jìn)行預(yù)變性。
實(shí)施例12實(shí)施例10和11中形成的復(fù)合體被存在于反應(yīng)混合物中的DNA嵌入劑YOYO-1穩(wěn)定。利用二價(jià)陽離子促進(jìn)和穩(wěn)定dsDNA靶和ssDNA-F探針之間形成的復(fù)合體，對(duì)分析的特異性進(jìn)一步加以檢查。
雜交反應(yīng)混合物(40μl)各含有下列組分0.4pmol靶dsDNA，4pmol 5′熒光素標(biāo)記的ssDNA探針，10mM Tris-HCl pH7.5，以及MnCl2和MgCl2各為1-20mM。將反應(yīng)混合物室溫(21℃)下溫育1分鐘-2小時(shí)的各種時(shí)間長(zhǎng)度，無需對(duì)dsDNA靶進(jìn)行預(yù)變性。溫育后，將樣品置于石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。最大熒光強(qiáng)度出現(xiàn)在波長(zhǎng)525nm處，這是熒光素的輻射波長(zhǎng)。對(duì)各個(gè)分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)將熒光輻射強(qiáng)度繪圖。
當(dāng)反平行ssDNA-F探針5號(hào)與50聚體野生型dsDNA靶(SEQ IDNO5)在15mM MgCl2和15mM MnCl2存在下溫育1小時(shí)時(shí)，非常有效地形成完全互補(bǔ)dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體，生成的熒光與單獨(dú)由探針5號(hào)獲得的比較降低74％(圖12A)。相比之下，含有1bp T-G錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ ID NO7+探針5號(hào))在15mM MgCl2和15mM MnCl2存在下很不穩(wěn)定，溫育1小時(shí)后，生成的熒光與單獨(dú)由探針5號(hào)所發(fā)射的比較減少15％(圖12A)。當(dāng)探針號(hào)5(GC含量為53％)與dsDNA靶SEQ ID NO9(GC含量為33％)反應(yīng)時(shí)，觀察到的熒光與單獨(dú)由探針5號(hào)所獲得的比較增加了3％(圖12A)，指示沒有DNA復(fù)合體形成。考慮到這種探針和靶的組合會(huì)導(dǎo)致5bp錯(cuò)配，該結(jié)果是預(yù)料中的。
在10mM MgCl2和10mM MnCl2存在下，dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體具有53％ GC含量，并含有完全互補(bǔ)序列(SEQ ID NO5+探針5號(hào))或1bp T-G錯(cuò)配的序列(SEQ ID NO7+探針號(hào)5)，溫育1小時(shí)后，生成的熒光強(qiáng)度與單獨(dú)由探針5號(hào)所發(fā)射的比較，分別低68％和20％，而溫育30分鐘后分別低76％和16％(數(shù)據(jù)未顯示)。溫育1小時(shí)后測(cè)試，加入5mM MgCl2和5mM MnCl2(或更低濃度)不足以讓復(fù)合體在反平行ssDNA-F探針5號(hào)和所有dsDNA靶之間形成(數(shù)據(jù)未顯示)。
當(dāng)平行ssDNA探針6號(hào)與50聚體野生型dsDNA靶(SEQ ID NO5)和突變dsDNA靶(SEQ ID NO7)反應(yīng)時(shí)也形成dsDNA:ssDNA復(fù)合體。在這種情形下，用更低濃度的MgCl2和MnCl2(即各為1-5mM)促進(jìn)DNA復(fù)合體形成，要求更短的溫育期。在1mM MgCl2和1mM MnCl2或2mM MgCl2和2mM MnCl2的存在下溫育15分鐘足以生成DNA復(fù)合體(數(shù)據(jù)未顯示)。在3mM MgCl2和3mM MnCl2存在下溫育45分鐘后，完全匹配的DNA復(fù)合體(SEQ ID NO5+探針6號(hào))和1bp錯(cuò)配的DNA復(fù)合體(SEQ ID NO7+探針6號(hào))的熒光強(qiáng)度分別比單獨(dú)由平行ssDNA探針6號(hào)所獲得的要低29％和6％(圖12B)。
盡管在10mM MgCl2和10mM MnCl2下溫育1小時(shí)后，容易形成DNA復(fù)合體，但采用平行ssDNA探針時(shí)，觀察到在完全匹配和錯(cuò)配的復(fù)合體之間沒有區(qū)別。高于15mM MgCl2和15mM MnCl2的濃度對(duì)采用平行ssDNA探針形成DNA復(fù)合體有抑制作用(數(shù)據(jù)未顯示)。
加入鹽橋，諸如二價(jià)陽離子的縮合劑，促進(jìn)在非變性dsDNA靶和熒光標(biāo)記的反平行或平行ssDNA探針之間形成DNA復(fù)合體，從而使得準(zhǔn)確和可靠的區(qū)別完全互補(bǔ)序列和那些含有1bp突變的序列。反應(yīng)發(fā)生在室溫下溫育15-60分鐘內(nèi)，探針∶靶的比率為10∶1。dsDNA靶和ssDNA探針不含有DNA同型嘌呤或同型嘧啶的延伸。盡管有5個(gè)嘧啶堿基散布在15個(gè)核苷酸ssDNA探針內(nèi)，但是以序列特異的方式容易形成DNA復(fù)合體。
實(shí)施例13當(dāng)利用單價(jià)陽離子來促進(jìn)和穩(wěn)定利用dsDNA靶形成的復(fù)合物時(shí)，不同方向性的探針的效用也得到評(píng)價(jià)。
雜交反應(yīng)混合物(40μl)各含有下列組分0.4pmol靶dsDNA，4pmol 5′熒光素標(biāo)記的ssDNA探針，10mM Tris-HCl pH7.5，以及10-150mM NaCl。將反應(yīng)混合室溫(21℃)下溫育1分鐘-2小時(shí)的各種長(zhǎng)度的時(shí)間，無需對(duì)dsDNA靶進(jìn)行預(yù)變性。溫育后，將樣品放置于石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。最大熒光強(qiáng)度出現(xiàn)在波長(zhǎng)525nm處，這是熒光素的輻射波長(zhǎng)。對(duì)各個(gè)分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)將熒光輻射強(qiáng)度繪圖。
在缺乏NaCl或存在10mM或25mM NaCl時(shí)，在全部溫育期后，都未檢測(cè)到dsDNA靶(SEQ ID NO1或SEQ ID NO2)與反平行ssDNA-F探針7號(hào)之間的結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。
在50mM NaCl存在下溫育1小時(shí)后，由完全互補(bǔ)序列(SEQ IDNO1+探針7號(hào))組成的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體容易形成，導(dǎo)致熒光發(fā)射強(qiáng)度與同樣溫育在反應(yīng)混合物中的對(duì)照探針7號(hào)所發(fā)射的比較降低49％(圖13A)。相比之下，不完全互補(bǔ)的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體含有1bp G-T錯(cuò)配(SEQ ID NO2+探針7號(hào))，生成的熒光發(fā)射強(qiáng)度與由探針7號(hào)對(duì)照樣品所示的比較降低11％。
在反應(yīng)混合物中存在75mM，100mM和125mM NaCl也導(dǎo)致熒光發(fā)射猝滅，這與完全匹配的SEQ ID NO1靶和反平行探針7號(hào)之間形成顯著量的復(fù)合體一致，以及當(dāng)1bp G-T錯(cuò)配的SEQ ID NO2靶和探針號(hào)7存在時(shí)，導(dǎo)致顯著較少的猝滅，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與在50mMNaCl存在下所觀察到的相似(數(shù)據(jù)未顯示)。
當(dāng)平行ssDNA探針6號(hào)與50聚體野生型dsDNA靶(SEQ ID NO5和突變dsDNA靶(SEQ ID NO7)在50mM，75mM，100mM或150mMNaCl存在下反應(yīng)時(shí)，也形成dsDNA:ssDNA復(fù)合體。最佳的結(jié)果在100mM NaCl存在下獲得。在含有100mM NaCl的反應(yīng)混合物中室溫下溫育75分鐘后，完全匹配的DNA復(fù)合體(SEQ ID NO5+探針號(hào)6)和1bp錯(cuò)配的DNA復(fù)合體(SEQ ID NO7+探針號(hào)6)的熒光發(fā)射強(qiáng)度分別比由對(duì)照平行ssDNA探針6號(hào)在相同條件下反應(yīng)所獲得的要低53％和9％(圖13B)。在溫育45分鐘期間50mM NaCl促進(jìn)了完全匹配和錯(cuò)配的復(fù)合體之間最大的區(qū)分(數(shù)據(jù)未顯示)?？傊蟹雌叫谢蚱叫衧sDNA探針的復(fù)合體似乎以類似的效率、在類似的NaCl濃度和溫育期下形成。
利用已知是DNA縮合劑的單價(jià)陽離子，促進(jìn)了在非變性dsDNA靶和熒光標(biāo)記的反平行或平行ssDNA探針之間形成DNA復(fù)合體，從而允許可靠地區(qū)分含有完全互補(bǔ)序列的復(fù)合體和那些含有1bp錯(cuò)配序列的復(fù)合體。
實(shí)施例14室溫下溫育5分鐘內(nèi)容易形成由YOYO-1促進(jìn)的dsDNA:ssDNA復(fù)合體，并以同樣水平的強(qiáng)度生成熒光發(fā)射數(shù)小時(shí)。含有堿基對(duì)錯(cuò)配的復(fù)合體類似地發(fā)射持續(xù)的熒光信號(hào)，這說明隨時(shí)間形成同樣水平的復(fù)合體。為了檢查在諸如陽離子的縮合劑存在下形成的dsDNA:ssDNA復(fù)合體的形成速率，穩(wěn)定性和解離速率，進(jìn)行時(shí)間過程實(shí)驗(yàn)。
雜交反應(yīng)混合物(40μl)各含有下列組分0.4pmol非變性靶dsDNA，4pmol 5′熒光素標(biāo)記的ssDNA探針，10mM Tris-HCl pH7.5，以及10mM MgCl2和10mM MnCl2。將反應(yīng)混合室溫(21℃)下溫育1分鐘-2小時(shí)的各種期間。溫育后，將樣品放置于石英杯中，用波長(zhǎng)為488nm的氬離子激光束照射，并且檢測(cè)熒光輻射。在所示時(shí)間，在后續(xù)多激光照射后，進(jìn)一步對(duì)相同樣品進(jìn)行熒光測(cè)定(圖14)。對(duì)各個(gè)分析樣品以波長(zhǎng)為函數(shù)將熒光強(qiáng)度繪圖。
由含有4pmol探針5號(hào)加上10mM MgCl2和10mM MnCl2的對(duì)照樣品在缺乏靶dsDNA時(shí)發(fā)射的熒光，在僅僅溫育5分鐘內(nèi)就顯著降低了3倍(數(shù)據(jù)未顯示)，然后在接著的數(shù)小時(shí)內(nèi)以更慢的速率穩(wěn)定地下降(圖14A)。這種效應(yīng)我們稱作“陽離子猝滅”。此熒光抑制，與ssDNA-F探針與特異陽離子溫育期的增加相關(guān)，通常在二價(jià)陽離子存在下發(fā)生，但是在單價(jià)陽離子存在下不發(fā)生(數(shù)據(jù)未顯示)。該觀察使得以與實(shí)驗(yàn)的測(cè)試樣品反應(yīng)完全相同的條件在實(shí)驗(yàn)中溫育對(duì)照樣品的重要性顯而易見。溫育不同期間后，各個(gè)ssDNA-F對(duì)照樣品的多激光抑制了熒光團(tuán)的進(jìn)一步猝滅，導(dǎo)致其后熒光水平的穩(wěn)定(圖14A)。此結(jié)果是完全未預(yù)料到的。
當(dāng)反平行ssDNA-F探針5號(hào)與50聚體野生型dsDNA靶(SEQ IDNO5)在10mM MgCl2和10mM MnCl2存在下溫育時(shí)，溫育15分鐘后，明顯形成dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體，導(dǎo)致熒光降低，其比對(duì)照探針5號(hào)的進(jìn)行性陽離子猝滅高出6％(比較圖14A和14B)。SEQ ID NO5與探針5號(hào)在10mM MgCl2和10mM MnCl2存在下溫育30和60分鐘后，大大顯示復(fù)合體形成，生成的熒光與單獨(dú)由陽離子猝滅的探針5號(hào)所獲得的比較，分別降低76％和61％(圖14B)。在10mM MgCl2和10mM MnCl2存在下溫育90和120分鐘后，沒有信號(hào)顯示形成復(fù)合體(圖14B)。90和120分鐘所見的熒光發(fā)射水平可完全歸功于陽離子猝滅效應(yīng)(比較圖14A和14B)。
相比之下，含有1bp T-G錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA-F復(fù)合體(SEQ IDNO7+探針5號(hào))以更慢的速率形成，并且一旦在10mM MgCl2和10mM MnCl2存在下形成更不穩(wěn)定。溫育30分鐘后，首先觀察到1bp T-G錯(cuò)配的復(fù)合體，而溫育60分鐘后，又似乎已得以消除(圖14C)。再一次，探針反平行于雙鏈體中的互補(bǔ)鏈(圖14C)。
多激光照射在10mM MgCl2和10mM MnCl2存在下溫育30或60分鐘后形成的完全互補(bǔ)的dsDNA:ssDNA復(fù)合體(SEQ ID NO5+探針5號(hào))，導(dǎo)致熒光發(fā)射以含有反平行ssDNA探針的DNA復(fù)合體特有的速率與這些復(fù)合體的破壞一致(圖14B)。當(dāng)30分鐘時(shí)對(duì)完全互補(bǔ)的復(fù)合體發(fā)射激光后，在45分鐘時(shí)進(jìn)行隨后的測(cè)定，發(fā)射強(qiáng)度為1869，這是復(fù)合體迅速破壞的證據(jù)(數(shù)據(jù)未顯示)。熒光發(fā)射水平在多激光發(fā)射后，返回到單獨(dú)由未復(fù)合的探針5號(hào)對(duì)照所觀察到的陽離子猝滅值(比較圖14A和14B)。唯一的例外是溫育15分鐘后形成并在其后反復(fù)照射的完全匹配的復(fù)合體(圖14B)。在這種情形下，熒光發(fā)射與復(fù)合體破壞不一致(圖14B)，即使進(jìn)一步陽離子猝滅探針5號(hào)，當(dāng)溫育15分鐘后加以多照射時(shí)，受到完全抑制(圖14A)。含有1bp T-G錯(cuò)配的dsDNA:ssDNA復(fù)合體(SEQ ID NO7+探針5號(hào))同樣受到多激光發(fā)射的明顯破壞(圖14C)。
進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定多激光發(fā)射對(duì)復(fù)合體影響的基礎(chǔ)。當(dāng)新鮮陽離子加入到已被激光發(fā)射兩次的反應(yīng)混合物中時(shí)，發(fā)現(xiàn)在由ssDNA-F探針?biāo)l(fā)射的熒光中抑制陽離子猝滅可能不是反向的，此外，陽離子猝滅不發(fā)生在進(jìn)一步溫育后，這強(qiáng)烈提示ssDNA-F探針通過仍未知的機(jī)制被多照射失活(數(shù)據(jù)未顯示)。同樣，當(dāng)新鮮ssDNA-F探針加入到已經(jīng)被激光發(fā)射兩次的反應(yīng)混合物中時(shí)，在對(duì)新鮮探針的熒光發(fā)射增加規(guī)格化后，在進(jìn)一步溫育反應(yīng)混合物時(shí)，沒有觀察到隨后的進(jìn)行性陽離子猝滅，這強(qiáng)烈提示激光發(fā)射的陽離子不知何故失效了(數(shù)據(jù)未顯示)。
在前述實(shí)施例和說明中，我們已經(jīng)闡述了雜聚核酸鏈基于同源堿基配對(duì)可特異性結(jié)合。這些結(jié)合可發(fā)生在平行或反平行鏈中。
我們還闡述了結(jié)合在沃森-克里克互補(bǔ)雙鏈體中的核酸堿基相對(duì)于鄰近核酸鏈的堿基不是靜止不動(dòng)的，并且闡述了依據(jù)由可能的結(jié)合基元所確定的堿基鄰近序列的結(jié)合潛力，基于沃森-克里克互補(bǔ)堿基配對(duì)或同源堿基配對(duì)，這些堿基可相互作用。雙鏈體中的堿基是否與第三鏈中的堿基相互作用形成特異性結(jié)合的三鏈體結(jié)構(gòu)或者雙鏈體的堿基是否與自身偶合到沃森-克里克互補(bǔ)雙鏈體中的鄰近堿基特異性相互作用，這是真實(shí)的。因此，本發(fā)明包括下列發(fā)現(xiàn)沃森-克里克偶合的堿基作為與其他鏈上的鄰近堿基相互作用和結(jié)合的特異堿基保留活性，并且這樣做具有更高的特異性和敏捷性。雖然所有這一切是顯而易見的，但是尤其顯著的想法是A:T和G:C配對(duì)作為結(jié)合反應(yīng)中的錯(cuò)配而加以檢測(cè)，其中同源結(jié)合基元是顯性的，并通過鏈寬規(guī)則被強(qiáng)迫在所有堿基對(duì)上。同樣顯而易見的是，同源四鏈體結(jié)合比沃森-克里克互補(bǔ)四鏈體結(jié)合更特異。不可避免，四鏈體結(jié)合發(fā)生在雙鏈體偶合堿基或堿基對(duì)的大溝一側(cè)以及雙鏈體偶合的堿基或堿基對(duì)的小溝一側(cè)之間。迄今為止，雖然進(jìn)一步通過已經(jīng)復(fù)合在雙鏈體中的堿基結(jié)合的潛力是未知的，但是已經(jīng)假定雙鏈體中堿基的第三條鏈識(shí)別唯一發(fā)生在雙鏈體的大溝中。我們所示的不是這種情形。我們還已經(jīng)表明公認(rèn)的骨架排斥不是雙鏈體雙鏈體相互作用的障礙。
本發(fā)明涉及容易實(shí)現(xiàn)的結(jié)合反應(yīng)，其在室溫下通常以短的溫育期獲得，以及其不依賴于過摩爾量的試劑以驅(qū)動(dòng)反應(yīng)。因此，本發(fā)明顯示不僅容易獲得，而且顯然是生物相關(guān)的。
最后，我們已經(jīng)顯示與游離堿基的部分沃森-克里克互補(bǔ)共軛可歸功于雙鏈體結(jié)合增加和特異性增加。
本發(fā)明組成了對(duì)堿基結(jié)合的知識(shí)的實(shí)質(zhì)增加，并且同樣將是闡明許多生物功能的核心，這些功能的機(jī)制目前是神秘的，諸如基因沉默。
最明顯的是通過事先和穩(wěn)定地偶合到沃森-克里克互補(bǔ)雙鏈體中的堿基來檢測(cè)特異同源識(shí)別和結(jié)合。
我們相信，我們已經(jīng)闡明的東西將要求放棄許多“經(jīng)典的”理念，并且重新打開了核酸結(jié)合力的潘多拉盒。
雖然本發(fā)明參照其特異實(shí)施例已詳細(xì)加以描述，但對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的情形下，可對(duì)其進(jìn)行各種改變和修飾將是一目了然的。
序列表<110> 英詹尼斯公司(Ingeneus Research)<120> 核酸及其類似物的平行或反平行，同源或互補(bǔ)結(jié)合形成雙鏈體，三鏈體或四鏈體復(fù)合體(Parallel and Antiparallel Duplex，Triplex and Quadruplex Complexes ofNucleic Acids and Analogues thereof)<130> SCT040187-47<150> US 09/664,827<151> 2000-09-19<150> US 09/613,263<151> 2000-07-10<160> 24<170> PatentIn version 3.0<210> 1<211> 50<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<400> 1tggcaccatt aaagaaaata tcatctttgg tgtttcctat gatgaatata50<210> 2<211> 50<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<400> 2tggcaccatt aaagaaaata tcgtctttgg tgtttcctat gatgaatata50<210> 3<211> 50<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10
<400> 3tggcaccatt aaagaaaata tactctttgg tgtttcctat gatgaatata50<210> 4<211> 50<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<400> 4tggcaccatt aaagaaaata tacgctttgg tgtttcctat gatgaatata50<210> 5<211> 50<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<400> 5gagcaccatg acagacactg tcatctctgg tgtgtcctac gatgactctg50<210> 6<211> 50<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<400> 6gagcaccatg acagacactg tcgtctctgg tgtgtcctac gatgactctg50<210> 7<211> 50<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<400> 7gagcaccatg acagacactg tcatctttgg tgtgtcctac gatgactctg50<210> 8<211> 50<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10
<400> 8gagcaccatg acagacactg tactctctgg tgtgtcctac gatgactctg50<210> 9<211> 47<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<400> 9tggcaccatt aaagaaaata tcattggtgt ttcctatgat gaatata 47<210> 10<211> 50<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<400> 10gagcaccatg acagacactg tcttctctgg tgtgtcctac gatgactctg50<210> 11<211> 50<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<400> 11gagcaccatg acagacactg tcatccctgg tgtgtcctac gatgactctg50<210> 12<211> 15<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<220>
<221> misc_特征<222> ()..()<223> 5′端以H開始，3′端以賴氨酸-CONH2結(jié)束<400> 12caccaaagat gatat 15
<210> 13<211> 15<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<220>
<221> misc_特征<222> ()..()<223> 5′端以H開始，3′端以賴氨酸-CONH2結(jié)束<400> 13tatagtagaa accac15<210> 14<211> 15<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<400> 14caccagagat gacag15<210> 15<211> 15<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<400> 15gacagtagag accac15<210> 16<211> 15<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<220>
<221> misc_特征<222> ()..()<223> 5′位上連接熒光素部分
<400> 16caccagagat gacag15<210> 17<211> 15<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<220>
<221> misc_特征<222> ()..()<223> 5′位上連接熒光素部分<400> 17gacagtagag accac15<210> 18<211> 15<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<220>
<221> misc_特征<222> ()..()<223> 5′位上連接熒光素部分<400> 18caccaaagat gatat15<210> 19<211> 15<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<400> 19caccaaagat gatat15<210> 20<211> 15<212> DNA
<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<400> 20cacgaaagat gatat15<210> 21<211> 15<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<400> 21caccaaacat gatat15<210> 22<211> 15<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<220>
<221> misc_特征<222> ()..()<223> 5′位上連接熒光素部分<400> 22ctgtcatctc tggtg15<210> 23<211> 15<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<400> 23ctgtcatctc tggtg15<210> 24<211> 15<212> DNA<213> 人囊性纖維化基因的外顯子10<400> 24
gacagtagag accac1權(quán)利要求
1.一種復(fù)合體，其包含含有核酸或核酸類似物的雜聚探針序列的探針；以及含有核酸或核酸類似物的雜聚靶序列的靶，其中(a)所述探針和所述靶中的至少一種是純化的或合成的；以及(b)所述雜聚探針序列通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基相互作用或通過同源堿基相互作用與所述雜聚靶序列結(jié)合，條件是當(dāng)所述復(fù)合體為雙鏈體時(shí)，所述雜聚探針序列反平行于所述雜聚靶序列，所述雜聚探針序列通過同源堿基相互作用與所述雜聚靶序列結(jié)合，以及條件是當(dāng)所述復(fù)合體為三鏈體時(shí)，所述復(fù)合體不含重組蛋白。
2.權(quán)利要求1的復(fù)合體，其中所述復(fù)合體為雙鏈體，而所述雜聚探針序列通過同源堿基相互作用或通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基相互作用與所述雜聚靶序列結(jié)合，以及所述雜聚探針序列平行或反平行于所述雜聚靶序列。
3.權(quán)利要求1的復(fù)合體，其中所述探針和所述靶中的一種為單鏈的，而另一種為雙鏈的，以及所述復(fù)合體為三鏈體。
4.權(quán)利要求3的復(fù)合體，其中所述復(fù)合體不含PNA。
5.權(quán)利要求3的復(fù)合體，其中所述雜聚探針序列和所述雜聚靶序列的方向性平行，以及所述雜聚探針序列通過同源堿基相互作用與所述雜聚靶序列結(jié)合。
6.權(quán)利要求3的復(fù)合體，其中所述雜聚探針序列和所述雜聚靶序列的方向性平行，以及所述雜聚探針序列通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基相互作用與所述雜聚靶序列結(jié)合。
7.權(quán)利要求3的復(fù)合體，其中(a)所述雜聚探針序列和所述雜聚靶序列的方向性平行；(b)所述靶包括含有所述雜聚靶序列的第一鏈以及含有互補(bǔ)和反平行于所述第一雜聚靶序列的第二雜聚靶序列的第二鏈；以及(c)所述雜聚探針序列通過同源堿基相互作用與所述雜聚靶序列結(jié)合，以及所述雜聚探針序列通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基相互作用與所述第二雜聚靶序列結(jié)合。
8.權(quán)利要求3的復(fù)合體，其中所述雜聚探針序列和所述雜聚靶序列的方向性反平行，以及所述雜聚探針序列通過同源堿基相互作用與所述雜聚靶序列結(jié)合。
9.權(quán)利要求3的復(fù)合體，其中所述雜聚探針序列和所述雜聚靶序列的方向性反平行，以及所述雜聚探針序列通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基相互作用與所述雜聚靶序列結(jié)合。
10.權(quán)利要求3的復(fù)合體，其中(a)所述雜聚探針序列和所述雜聚靶序列的方向性反平行；(b)所述靶包括含有所述雜聚靶序列的第一鏈以及含有互補(bǔ)和反平行于所述第一雜聚靶序列的第二雜聚靶序列的第二鏈；以及(c)所述雜聚探針序列通過同源堿基相互作用與所述雜聚靶序列結(jié)合，以及所述雜聚探針序列通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基相互作用與所述第二雜聚靶序列結(jié)合。
11.權(quán)利要求1的復(fù)合體，其中所述探針和所述靶是雙鏈的，以及所述復(fù)合體是四鏈體。
12.權(quán)利要求11的復(fù)合體，其中所述復(fù)合體不含有PNA。
13.權(quán)利要求11的復(fù)合體，其中所述雜聚探針序列和所述雜聚靶序列的方向性平行，以及所述雜聚探針序列通過同源堿基相互作用與所述雜聚靶序列結(jié)合。
14.權(quán)利要求11的復(fù)合體，其中所述雜聚探針序列和所述雜聚靶序列的方向性平行，以及所述雜聚探針序列通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基相互作用與所述雜聚靶序列結(jié)合。
15.權(quán)利要求11的復(fù)合體，其中(a)所述雜聚探針序列和所述雜聚靶序列的方向性平行；(b)所述探針包括含有所述雜聚探針序列的第一探針鏈以及含有互補(bǔ)和反平行于所述第一雜聚探針序列的第二雜聚探針序列的第二探針鏈；(c)所述靶包括含有所述雜聚靶序列的第一靶鏈以及含有互補(bǔ)和反平行于所述第一雜聚靶序列的第二雜聚靶序列的第二靶鏈；以及(d)所述雜聚探針序列通過同源堿基相互作用與所述雜聚靶序列結(jié)合，以及所述雜聚探針序列通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基相互作用任選與所述第二雜聚靶序列結(jié)合。
16.權(quán)利要求11的復(fù)合體，其中(a)所述雜聚探針序列和所述雜聚靶序列的方向性平行；(b)所述探針包括含有所述雜聚探針序列的第一探針鏈以及含有互補(bǔ)和反平行于所述第一雜聚探針序列的第二雜聚探針序列的第二探針鏈；(c)所述靶包括含有所述雜聚靶序列的第一靶鏈以及含有互補(bǔ)和反平行于所述第一雜聚靶序列的第二雜聚靶序列的第二靶鏈；以及(d)所述雜聚探針序列通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基相互作用與所述雜聚靶序列結(jié)合，以及所述雜聚探針序列通過同源堿基相互作用任選與所述第二雜聚靶序列結(jié)合。
17.權(quán)利要求11的復(fù)合體，其中(a)所述雜聚探針序列和所述雜聚靶序列的方向性反平行；(b)所述探針包括含有所述雜聚探針序列的第一探針鏈以及含有互補(bǔ)和反平行于所述第一雜聚探針序列的第二雜聚探針序列的第二探針鏈；(c)所述靶包括含有所述雜聚靶序列的第一靶鏈以及含有互補(bǔ)和反平行于所述第一雜聚靶序列的第二雜聚靶序列的第二靶鏈；以及(d)所述雜聚探針序列通過同源堿基相互作用與所述雜聚靶序列結(jié)合，以及所述雜聚探針序列通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基相互作用任選與所述第二雜聚靶序列結(jié)合。
18.權(quán)利要求11的復(fù)合體，其中(a)所述雜聚探針序列和所述雜聚靶序列的方向性反平行；(b)所述探針包括含有所述雜聚探針序列的第一探針鏈以及含有互補(bǔ)和反平行于所述第一雜聚探針序列的第二雜聚探針序列的第二探針鏈；(c)所述靶包括含有所述雜聚靶序列的第一靶鏈以及含有互補(bǔ)和反平行于所述第一雜聚靶序列的第二雜聚靶序列的第二靶鏈；以及(d)所述雜聚探針序列通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基相互作用與所述雜聚靶序列結(jié)合，以及所述雜聚探針序列通過同源堿基相互作用任選與所述第二雜聚靶序列結(jié)合。
19.權(quán)利要求1的復(fù)合體，其中所述探針位于所述靶的小溝中。
20.權(quán)利要求1的復(fù)合體，其中所述探針位于所述靶的大溝中。
21.權(quán)利要求3的復(fù)合體，其中所述探針的堿基同時(shí)與所述靶的兩條鏈上的堿基相互作用。
22.權(quán)利要求11的復(fù)合體，其中所述探針的堿基同時(shí)與所述靶的兩條鏈上的堿基相互作用。
23.權(quán)利要求1的復(fù)合體，其中探針的骨架包括脫氧核糖磷酸。
24.權(quán)利要求1的復(fù)合體，其中探針的骨架為不帶電荷、帶部分負(fù)電荷或帶正電荷的。
25.權(quán)利要求1的復(fù)合體，其中所述探針中的至少一個(gè)堿基是天然存在的堿基的合成類似物，根據(jù)沃森-克里克互補(bǔ)性或同源結(jié)合具有特異的結(jié)合親和力。
26.一種分析靶的方法，所述方法包括提供含有靶的樣品，所述靶含有核酸或核酸類似物的雜聚靶序列；提供含有核酸或核酸類似物的雜聚探針序列的探針；提供含有所述靶、所述探針、水和緩沖液的雜交混合物；將上述雜交混合物溫育一段有效時(shí)間，以使所述雜聚靶序列與所述雜聚探針序列結(jié)合生成復(fù)合體；以及檢測(cè)與所述探針和所述靶之間的結(jié)合親和性相關(guān)的信號(hào)以分析所述靶，其中所述雜聚探針序列通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基相互作用或通過同源堿基相互作用與所述雜聚靶序列結(jié)合，條件是當(dāng)所述復(fù)合體為雙鏈體時(shí)，所述雜聚探針序列反平行于所述雜聚靶序列，所述雜聚探針序列通過同源堿基相互作用與所述雜聚靶序列結(jié)合，以及條件是當(dāng)所述復(fù)合體為三鏈體時(shí)，所述復(fù)合體不含重組蛋白。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述雜聚探針序列的堿基和所述雜聚靶序列的堿基之間的匹配和錯(cuò)配得以檢測(cè)。
28.權(quán)利要求26的方法，其中所述探針和所述靶是單鏈的，以及所述復(fù)合體為雙鏈體，其中所述雜聚探針序列通過同源堿基相互作用或通過沃森-克里克互補(bǔ)堿基相互作用與所述雜聚靶序列結(jié)合，并且所述雜聚探針序列平行或反平行于所述雜聚靶序列。
29.權(quán)利要求26的方法，其中所述探針和所述靶中的一種是單鏈的，而另一種是雙鏈的，以及所述復(fù)合體為三鏈體。
30.權(quán)利要求26的方法，其中所述探針和所述靶是雙鏈的，以及所述復(fù)合體為四鏈體。
31.權(quán)利要求26的方法，其中所述靶共價(jià)結(jié)合到支持物、表面或半滲透的膜上。
32.權(quán)利要求26的方法，其中所述探針共價(jià)結(jié)合到支持物、表面或半滲透的膜上。
33.權(quán)利要求26的方法，其中將電流或電磁力施加到所述復(fù)合體上以生成或改變所述信號(hào)。
34.權(quán)利要求26的方法，其中所述探針或所述靶共價(jià)結(jié)合到支持物、表面或半滲透的膜上，并把電流或電磁力施加到所述復(fù)合體上以生成或改變所述信號(hào)。
35.權(quán)利要求26的方法，其進(jìn)一步包括反復(fù)改變所述雜交混合物的條件以改變所述信號(hào)，其中所述靶響應(yīng)于所述改變以信號(hào)方差為函數(shù)加以分析。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述改變導(dǎo)致所述探針從所述復(fù)合體中與所述靶解離。
37.權(quán)利要求35的方法，其中所述改變包括向所述雜交混合物施加第一刺激和第二刺激，所述第一刺激與所述第二刺激的大小相同但極性相反。
38.權(quán)利要求35的方法，其中所述改變包括施加一系列刺激，各種所述刺激都是相同的。
39.權(quán)利要求26的方法，其中所述信號(hào)由至少一種共價(jià)結(jié)合到所述探針上的標(biāo)記所發(fā)射。
40.權(quán)利要求26的方法，其中所述信號(hào)由至少一種共價(jià)結(jié)合到所述靶上的標(biāo)記所反射。
41.權(quán)利要求26的方法，其中所述信號(hào)由至少一種非共價(jià)與所述復(fù)合體結(jié)合的標(biāo)記所反射。
42.權(quán)利要求26的方法，其中所述探針侵入所述靶，取代與所述雜聚靶序列結(jié)合的堿基序列，以便雜聚探針序列的堿基根據(jù)沃森-克里克堿基識(shí)別或同源堿基識(shí)別與雜聚靶序列的堿基結(jié)合。
43.權(quán)利要求26的方法，其中將所述探針和所述靶中的至少一種以脫水形式導(dǎo)入所述雜交混合物中。
44.權(quán)利要求26的方法，其中所述方法的進(jìn)行無需使所述探針或所述靶變性。
45.權(quán)利要求26的方法，其中所述雜交混合物進(jìn)一步包括至少一種結(jié)合促進(jìn)劑。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述至少一種促進(jìn)劑為縮合劑或解縮合劑。
47.權(quán)利要求45的方法，其中所述促進(jìn)劑選自YOYO-1、TOTO-1、YOYO-3、TOTO-3、POPO-1、BOBO-1、POPO-3、BOBO-3、LOLO-1、JOJO-1、花菁二聚體、YO-PRO-1、TO-PRO-1、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5、PO-PRO-1、BO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-3、LO-PRO-1、JO-PRO-1、花菁單體、溴化乙錠、乙錠同型二聚體-1、乙錠同型二聚體-2、乙錠衍生物、吖啶、吖啶橙、吖啶衍生物、乙錠吖啶異型二聚體、單疊氮化乙錠、碘化丙錠、SYTO染料、SYBR綠1、SYBR染料、皮可綠、SYTOX染料以及7-氨基放線菌素D。
48.權(quán)利要求45的方法，其中所述至少一種促進(jìn)劑的濃度有利于所述復(fù)合體的一種結(jié)合結(jié)構(gòu)，而不利于所述復(fù)合體的其他可能的結(jié)合結(jié)構(gòu)。
49.權(quán)利要求26的方法，其進(jìn)一步包括對(duì)所述靶通過光學(xué)制作圖譜或進(jìn)行測(cè)序。
50.權(quán)利要求26的方法，其中所述信號(hào)包括一系列在連續(xù)變化的條件下檢測(cè)的信號(hào)。
51.權(quán)利要求36的方法，其中所述解離的所述特性與所述探針和所述靶之間的結(jié)合親和力相關(guān)。
52.權(quán)利要求26的方法，其中(a)提供同源結(jié)合條件，以及不完全同源探針以減小的效率與所述靶不結(jié)合或結(jié)合，或者(b)提供沃森-克里克互補(bǔ)結(jié)合條件，以及不完全互補(bǔ)探針以減小的效率與所述靶不結(jié)合或結(jié)合。
53.權(quán)利要求1的復(fù)合體，其進(jìn)一步包括至少一種結(jié)合到所述探針和所述靶中的至少一種上的游離堿基，核苷酸或核苷。
54.權(quán)利要求1的復(fù)合體，進(jìn)一步包括至少一種結(jié)合到所述探針和所述靶中的至少一種上的蛋白或酶。
55.權(quán)利要求1的復(fù)合體，其中所述復(fù)合體以體外，體內(nèi)或電腦中形式位于溶液中，固相支持物上。
56.權(quán)利要求1的復(fù)合體，其中所述探針為通過同源堿基相互作用與所述雜聚靶序列結(jié)合的雜聚PNA，以及所述靶為雙鏈體。
57.權(quán)利要求56的復(fù)合體，其中所述探針侵入所述雙鏈體靶中從而結(jié)合到所述雜聚靶序列上。
58.權(quán)利要求1的復(fù)合體，其中所述探針為雙鏈體，以及所述探針中的至少一條鏈?zhǔn)遣粠щ姾?，帶部分?fù)電荷或帶正電荷的，并且所述靶是單鏈或雙鏈的。
59.權(quán)利要求1的復(fù)合體，其適合于分析、診斷、治療或工程應(yīng)用。
60.權(quán)利要求1的復(fù)合體，進(jìn)一步包括至少一種來自形成復(fù)合體的混合物的結(jié)合促進(jìn)劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種復(fù)合體，所述復(fù)合體包括(1)含有核酸或核酸類似物的雜聚探針序列的探針；以及(2)含有核酸或核酸類似物的雜聚靶序列的靶，其中(a)探針和靶中的至少一種是純化的或合成的；以及(b)雜聚探針序列通過沃森－克里克互補(bǔ)堿基相互作用或通過同源堿基相互作用與雜聚靶序列結(jié)合，條件是當(dāng)復(fù)合體為雙鏈體時(shí)，雜聚探針序列反平行于雜聚靶序列，雜聚體探針序列通過同源堿基相互作用與雜聚靶序列結(jié)合，以及條件是當(dāng)復(fù)合體為三鏈體時(shí)，復(fù)合體不含重組蛋白。本發(fā)明還提供了一種分析靶的方法，所述方法包括檢測(cè)復(fù)合體的形成。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1650026SQ02814689
公開日2005年8月3日 申請(qǐng)日期2002年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月20日
發(fā)明者格倫·H·埃里克森, 雅斯曼·I·戴克希斯, 艾萬那·坎迪克, 皮埃爾·皮卡德 申請(qǐng)人:英詹尼斯公司