專利名稱：檢測(cè)內(nèi)毒素的方法和試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及檢測(cè)內(nèi)毒素的試劑和方法。
背景技術(shù)：
革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素廣泛污染各種各樣的物質(zhì)，例如水，食物，藥品，和腸胃外制劑。
針對(duì)內(nèi)毒素污染最常使用的試驗(yàn)使用來自鱟血淋巴的阿米巴樣細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。但是由于這些動(dòng)物的總數(shù)減少，開發(fā)用于檢測(cè)內(nèi)毒素的不依靠使用鱟血淋巴的快捷而可靠的方法變得越來越重要。
發(fā)明概述本發(fā)明提供檢測(cè)內(nèi)毒素的試劑和方法。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是檢測(cè)內(nèi)毒素的試劑，含有純化的鱟因子C蛋白和表面活性劑。所述表面活性劑可以是下式所示的兩性表面活性劑
其中R1是具有1-4個(gè)碳原子的亞烷基；Y和Y′各自是(1)氫，(2)低級(jí)烷基，或(3)羥基低級(jí)烷基；R2和R3各自是(1)低級(jí)烷基或(2)羥基低級(jí)烷基；n是0或1，當(dāng)n是0時(shí)，R4是具有大約8至大約18個(gè)碳原子的烷基；當(dāng)n是1時(shí)，R4是具有1至大約6個(gè)碳原子的亞烷基；R5是具有大約8至大約18個(gè)碳原子的烷基；并且M是氫，鈉，鉀或銨。表面活性劑可以是下式所示的陰離子表面活性劑(R6)n1-(Y)Ar(SO3M)n2(E)R5OSO3M(F)其中R5，Y，和M具有上面給出的相同定義；R6是8-24個(gè)碳原子的烷基；nl是1-3的整數(shù)；n2是1或2；并且Ar是苯基或萘基。表面活性劑可以是下式所示的陽離子表面活性劑 其中R5，Y，和Y′具有上面給出的相同定義。表面活性劑可以是下式所示的非離子型表面活性劑R5R7R8N O (H)其中R5、Y和Y′具有上面給出的相同定義，并且R7和R8各自是甲基或乙基。表面活性劑是選自大約10-30摩爾的環(huán)氧乙烷與具有6個(gè)碳原子的六元醇和具有10-20個(gè)碳原子的酯基的單酯的縮合產(chǎn)物的那些非離子型表面活性劑。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是檢測(cè)試驗(yàn)樣品中的內(nèi)毒素的方法。試驗(yàn)樣品接觸(1)一種含有(a)純化的鱟因子C蛋白和(b)表面活性劑的試劑，形成試驗(yàn)樣品-試劑混合物和(2)因子C底物，形成接觸過的試驗(yàn)樣品。因子C底物的裂解產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。接觸過的試驗(yàn)樣品中是否存在可檢測(cè)信號(hào)?？蓹z測(cè)信號(hào)的量相對(duì)不分析含內(nèi)毒素的對(duì)照樣品有所增加則表明試驗(yàn)樣品中存在內(nèi)毒素。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是檢測(cè)試驗(yàn)樣品中的內(nèi)毒素的方法。試驗(yàn)樣品接觸(1)一種含有(a)重組Carcinoscorpius rotundicauda因子C蛋白和(b)表面活性劑的試劑，和(2)N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素從而形成接觸過的試驗(yàn)樣品。通過在因子C蛋白被表達(dá)到上清液中的條件下在上清液中培養(yǎng)包含編碼因子C蛋白的載體的宿主細(xì)胞的方法來制備因子C蛋白。分析接觸過的試驗(yàn)樣品中是否存在熒光信號(hào)。可檢測(cè)信號(hào)的量相對(duì)不含有內(nèi)毒素的對(duì)照樣品有所增加則表明試驗(yàn)樣品中存在內(nèi)毒素。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是檢測(cè)試驗(yàn)樣品中的內(nèi)毒素的方法。試驗(yàn)樣品接觸含有純化的鱟因子C蛋白和如上所述的表面活性劑的試劑從而形成試驗(yàn)樣品-試劑混合物。試驗(yàn)樣品-試劑混合物接觸因子C底物，其中因子C底物的裂解產(chǎn)生了可檢測(cè)信號(hào)。分析接觸過的試驗(yàn)樣品-試劑混合物中是否存在可檢測(cè)信號(hào)?？蓹z測(cè)信號(hào)的量相對(duì)于不含有內(nèi)毒素的對(duì)照樣品有所增加則表明試驗(yàn)樣品中存在內(nèi)毒素可測(cè)信號(hào)量相對(duì)不含內(nèi)毒素的對(duì)照樣品有所增加則表明試驗(yàn)樣品中存在內(nèi)毒素。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是檢測(cè)試驗(yàn)樣品中的內(nèi)毒素的方法。試驗(yàn)樣品接觸一種試劑，該試劑含有重組Carcinoscorpius rotundicauda因子C蛋白和表面活性劑。通過在因子C蛋白被表達(dá)到上清液中的條件下在上清液中培養(yǎng)包含編碼因子C蛋白的載體的宿主細(xì)胞的方法來制備因子C蛋白。試驗(yàn)樣品-試劑混合物接觸N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素。分析接觸過的試驗(yàn)樣品-試劑混合物中是否存在熒光信號(hào)?？蓹z測(cè)信號(hào)的量相對(duì)不合有內(nèi)毒素的對(duì)照樣品有所增加則表明試驗(yàn)樣品中存在內(nèi)毒素。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是檢測(cè)內(nèi)素素的試劑盒。試劑盒包括一種試劑，該試劑含有(a)純化的鱟因子C蛋白和(b)如上所述的表面活性劑，和檢測(cè)試驗(yàn)樣品中內(nèi)毒素的方法的說明書。該方法包括步驟(1)使試驗(yàn)樣品接觸含有(a)純化的鱟因子C蛋白和(b)如上所述的表面活性劑的試劑，從而形成試驗(yàn)樣品-試劑混合物；(2)試驗(yàn)樣品-試劑混合物接觸因子C底物，其中因子C底物的裂解產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)；和(3)分析接觸過的試驗(yàn)樣品-試劑混合物中是否存在可檢測(cè)信號(hào)?？蓹z測(cè)信號(hào)的量相對(duì)不含有內(nèi)毒素的對(duì)照樣品有所增加則表明試驗(yàn)樣品中存在內(nèi)毒素。
附圖的簡(jiǎn)要描述附

圖1.說明Zwittergent 3-14和Tween 20對(duì)重組因子C活性的影響的圖。
附圖2.說明Zwittergent 3-14和Tween 80對(duì)重組因子C活性的影響的圖。
附圖3.說明Zwittergent 3-14和TritonX-114對(duì)重組因子C活性的影響的圖。
附圖4.說明使用DPR(N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基)香豆素底物檢測(cè)內(nèi)毒素的圖。
附圖5.說明使用VPR(N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基)香豆素底物檢測(cè)內(nèi)毒素的圖。
附圖6.說明不同Zwittergent濃度下的鱟屬因子C活性的圖。
附圖7.說明存在和不存在表面活性劑的條件下內(nèi)毒素靈敏度的圖。
附圖8.說明以DPR香豆素作為底物一小時(shí)一步驟的內(nèi)毒素測(cè)定結(jié)果的圖。
附圖9.說明Zwittergent 3-14和辛基硫代苷對(duì)重組因子C活性的影響的圖。
附圖10.說明Zwittergent 3-14和Genapol C-100對(duì)重組因子C活性的影響的圖。
附圖11.說明Zwittergent 3-14和TX-100對(duì)重組因子C活性的影響的圖。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及用于檢測(cè)內(nèi)毒素的試劑和使用該試劑的方法。所述試劑含有純化的鱟因子C蛋白和表面活性劑。該試劑能與因子C的底物聯(lián)合使用，所述底物通過裂解產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)從而檢測(cè)試驗(yàn)樣品中的內(nèi)毒素。表面活性劑的存在將內(nèi)毒素對(duì)純化的因子C的激活作用提高了3-7倍，能夠更加快捷和靈敏地測(cè)定試驗(yàn)樣品中的內(nèi)毒素水平。試劑優(yōu)選含有重組因子C，因此消除了連續(xù)供給鱟血淋巴的需要。
純化的因子C本發(fā)明的試劑的一個(gè)成分包括純化的鱟因子C蛋白。本發(fā)明的實(shí)施中可以使用來自四個(gè)已知鱟種LiTnulus polyphemus，Cacinoscorpius rotundicauda，Tachypleudus tridentata或Tachypleudus gigas中的任一種純天然因子C。天然因子C能被生物化學(xué)純化或者能重組制備純化的因子C。
本文使用的″純化的因子C″是指下文中定義的因子C蛋白的組合物，其含有少于30％重量的來自四個(gè)已知的鱟種中任一種的非因子C天然阿米巴樣細(xì)胞溶胞產(chǎn)物成分。組合物具體含有細(xì)胞培養(yǎng)上清液，其含有重組因子C蛋白質(zhì)(見下文)。從天然來源純化鱟因子C的方法是已知的，例如公開于Nakamura等，Eur.J.Biochem.154，511-21，1986；Navas等，Biochem.Intl.21，805-13，1990；Tokunaga等，J.Biochem.109，150-157，1991；美國(guó)專利5,985,590和美國(guó)專利5,716,834中。這些方法或者它們的等同方法中的任何方法都能用來獲得純化的因子C。還可以參見實(shí)施例11。利用本領(lǐng)域中公知的任何方法例如SDS凝膠電泳來評(píng)價(jià)因子C制劑的純度。
優(yōu)選地，重組制備純化的因子C。來自Tachypleus tridentata和Carcinoscorpius rotundicauda的天然因子C的氨基酸序列是已知的，是這些蛋白質(zhì)的天然存在的編碼序列。SEQ ID NO1和3分別提供了SEQ ID NO2和4所示的Tachypleus tridentata因子C氨基酸序列的編碼序列。SEQ ID NO5和7分別提供了SEQ ID NO6和8所示的Carcinoscorpius rotundicauda因子C氨基酸序列的編碼序列。因?yàn)檫z傳密碼子的簡(jiǎn)并性，可以預(yù)期編碼各種天然因子C蛋白的很多其它序列，本發(fā)明具體涉及這些編碼序列制備純化因子C的用途。
本發(fā)明還涉及純化的天然和非天然存在的，即重組制備的因子C變體的用途，前提是所述變體保留了因子C酶活性。利用本領(lǐng)域公知的因子C酶活性的測(cè)定方法能評(píng)價(jià)因子C酶活性。參見，例如，Tokunaga等，J.Biochem.109，150-57(1991)和Nakamura等，Eur.J.Biochem.176，89-94，1988。也可以應(yīng)用下面實(shí)施例1和13中描述的內(nèi)毒素分析方法。天然存在的因子C變體包括，例如，因子C mRNA剪接變體或突變的因子C基因的產(chǎn)物。
利用堿基取代，插入，或缺失能構(gòu)建非天然存在的因子C變體從而制備具有因子C活性的蛋白質(zhì)。根據(jù)使用Blast2排列程序(Blosum62，預(yù)期10，標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼子)測(cè)定的結(jié)果，非天然存在的因子C變體與天然存在的因子C之間有50，75，80，85，90，95，97，98，或99％的差異。在本發(fā)明實(shí)施中也能使用保留了因子C活性的天然的和重組制備的因子C的片段。因此，本文使用的″因子C″包括天然存在的和非天然存在的具有上述特性蛋白和蛋白片段。
重組制備蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域公知的，一般包括在表達(dá)蛋白質(zhì)的條件下在上清液中培養(yǎng)包含編碼因子C蛋白的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。回收表達(dá)蛋白或者，優(yōu)選地，含有表達(dá)蛋白的上清液被直接用作重組因子C的來源。因此，″純化的因子C″特別包括含有重組因子C的上清液。用于制備重組因子C的宿主細(xì)胞包括但不限于酵母細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞。美國(guó)專利5,985,590中具體公開了在巴斯德畢赤氏酵母(Pichiapastoris)和啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細(xì)胞中重組制備Carcinoscorpius rotundicauda因子C的方法。
獲得重組因子C的一種特別優(yōu)選的方法是根據(jù)實(shí)施例2-5所述在桿狀病毒系統(tǒng)中制備蛋白質(zhì)。簡(jiǎn)要地說，將因子C編碼序列克隆到pFASTBACI中。將得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH10BAC感受態(tài)細(xì)胞中，所述細(xì)胞包含帶有小-attTn7靶位點(diǎn)的桿粒和輔助質(zhì)粒。在有輔助質(zhì)粒提供的轉(zhuǎn)座蛋白存在的條件下，pFASTBAC質(zhì)粒上小-Tn7轉(zhuǎn)座因子可以與桿粒上的小-attTn7靶位點(diǎn)易位。通過IacZα基因的裂解鑒定包含重組桿粒的菌落。從包含重組桿粒的選擇性DH10BAC克隆制備高分子量DNA。然后使用這種DNA轉(zhuǎn)染S9昆蟲細(xì)胞，然后分泌重組因子C。本發(fā)明特別令人驚奇地發(fā)現(xiàn)含有從培養(yǎng)細(xì)胞分離的被分泌的因子C的培養(yǎng)基不用進(jìn)一步純化就能和表面活性劑(如下所述)一起用作內(nèi)毒素測(cè)定中的試劑。
表面活性劑本發(fā)明的試劑還含有表面活性劑。實(shí)施本發(fā)明的過程中使用的表面活性劑包括美國(guó)專利4,322,217中描述的那些，但是也可以使用其它表面活性劑。有用的表面活性劑包括其結(jié)構(gòu)中包括陰離子和陽離子基團(tuán)的兩性表面活性劑。例證是由式A所示的磺基甜菜堿 R1是具有1至大約4個(gè)碳原子的亞烷基，Y是無害的適當(dāng)化學(xué)取代基，包括(1)氫，(2)被取代的或未被取代的低級(jí)烷基，例如，含有1-4個(gè)碳原子，例如甲基，乙基，丙基或羥基等；R2和R3各自選自被取代的或未被取代的含有1-4個(gè)碳原子的低級(jí)烷基，例如，甲基，乙基，丙基，羥乙基，羥甲基，羥丙基等。
n＝0或1，當(dāng)n＝0時(shí)，R4是被取代的或未被取代的烷基，例如，含有大約8至大約18個(gè)碳原子，和當(dāng)n＝1時(shí)，R4是具有大約1至大約6個(gè)碳原子的亞烷基，R5是被取代的或未被取代的烷基，例如，含有大約8至大約18個(gè)碳原子。
術(shù)語″亞烷基″包括聚亞甲基和其它二價(jià)飽和的脂肪族基團(tuán)。因此，連接中可以有亞烷基支化。術(shù)語″低級(jí)″是指含有1-4個(gè)碳原子的基團(tuán)。
能在本發(fā)明的試劑中使用的磺基甜菜堿是本領(lǐng)域公知的并且被描述為兩性離子表面活性劑。例如Fernley，J.Am.Oil Chem.Soc.55，98-103(1978)和美國(guó)專利3,280,179中記載了這樣的化合物的制備。在優(yōu)選的磺基甜菜堿表面活性劑中，上述結(jié)構(gòu)中的R2和R3是甲基。并且優(yōu)選的是R1是亞丙基。
有用的磺基甜菜堿表面活性劑的一種類型具有上述結(jié)構(gòu)，其中n等于0并且R4是具有大約8至大約18個(gè)碳原子的烷基，優(yōu)選直鏈烷基。對(duì)于這些磺基甜菜堿表面活性劑，R4成分的合適來源是牛油脂肪醇，其由各種鏈長(zhǎng)的混合物組成，典型組成是大約66％的C18，30％的C16，和4％的C14等。其它合適的來源是被蒸餾的椰油脂肪醇的中間餾分，其也是由各種鏈長(zhǎng)的混合物組成，典型組成是大約66％的C12，23％的C14，9％的C16和2％的C10。
其中n等于0的上述結(jié)構(gòu)的具體磺基甜菜堿表面活性劑在美國(guó)專利3,539,521中給出。特別優(yōu)選的這種類型的表面活性劑是N-十四烷基-N，N-二甲基-3-銨-1-丙磺酸鹽，它是從Calbiochem-Behring公司購(gòu)得的，商品名是ZWITTERGENT 3-14。
另一種類型的有用磺基甜菜堿表面活性劑具有上述結(jié)構(gòu)，其中n等于1并且R4是具有大約1至大約6個(gè)碳原子的亞烷基。在這些磺基甜菜堿中，n等于1，R5是具有大約8至大約18個(gè)碳原子的烷基。優(yōu)選R5是直鏈。如上面所討論的，具有大約10至大約18個(gè)碳原子的烷基的合適來源是牛油脂肪醇椰油脂肪醇。其中n等于1的上述結(jié)構(gòu)的具體磺基甜菜堿表面活性劑在美國(guó)專利3,280,179中給出。
特別優(yōu)選的磺基甜菜堿表面活性劑是3-(N，N-二甲基-N-酰基酰氨丙基銨)-2-羥基-丙烷-1-磺酸鹽，其中酰基得自牛油脂肪醇或椰油脂肪醇，椰油脂肪醇是優(yōu)選的。本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)，在牛油脂肪醇或椰油脂肪醇的這些衍生物的常規(guī)制備中，會(huì)產(chǎn)生?；兼滈L(zhǎng)度不同的磺基甜菜堿的混合物。如上面所討論的，這些脂肪醇主要含有提供具有期望的碳原子數(shù)，例如大約8至大約18個(gè)碳原子的?；奶兼滈L(zhǎng)度。因此，由牛油脂肪醇或椰油脂肪醇獲得的這些混合物被用于提供用于本發(fā)明試劑的磺基甜菜堿表面活性劑。
在本發(fā)明的試劑中使用的特別優(yōu)選的這類材料是N-椰油酰氨基-丙基-N，N-二甲基-N-2-羥基丙基磺基甜菜堿。這種物質(zhì)的一個(gè)例子是LONZAINE CS，是從Lonza，Inc.，F(xiàn)air Lawn，N.J.購(gòu)得的。
其它兩性表面活性劑包括式B例示的N-長(zhǎng)鏈烷基氨基羧酸 式C例示的N-長(zhǎng)鏈烷基亞氨基二羧酸 和式D例示的N-長(zhǎng)鏈烷基或酰氨基甜菜堿 其中R1，R2，R3，R4，Y，和n具有它們?cè)谑紸中的相同定義，M是氫或者成鹽金屬，并且Y′具有和式A中的Y相同的定義。Y和Y′可以是相同或不同的。具體的兩性洗滌劑例子是N-烷基-β-氨基丙酸，N-烷基-β-亞氨基二丙酸，和N-烷基-N，N-二甲基甘氨酸；烷基可以是，例如，得自椰油脂肪醇，十二烷基醇，十四烷基醇(或者十二烷基-十四烷基混合物)，氫化牛油醇，十六烷基醇，十八烷基醇，或者這些醇的混合物。被取代的氨基丙酸和亞氨基二丙酸經(jīng)常以鈉鹽或其它鹽的形式供給，這些鹽也可以在本發(fā)明的試劑中使用。
具體的例子包括Witco Chemical Corporation以商品名EMCOLCC 37-18出售的椰油甜菜堿，Lonza Inc.以商品名LONZAINE CO出售的椰油酰氨基丙基甜菜堿，和Henkel Corporation以商品名DERIPHAT 160出售的N-牛油-β-亞氨基二丙酸二鈉。
其它兩性洗滌劑的例子是脂肪咪唑啉，例如通過長(zhǎng)鏈脂肪酸(例如10-20個(gè)碳原子)與二亞乙基三胺和具有2-6個(gè)碳原子的一鹵代羧酸反應(yīng)制備的那些脂肪咪唑啉，例如1-椰油-5-羥乙基-5-羧甲基咪唑啉。具體的例子包括椰油咪唑啉，從Lonza，Inc.以商品名AMPHOTERGE K-2購(gòu)得，和癸二酸咪唑啉，從Lonza，Inc.以商品名AMPHOTERGE KJ-2購(gòu)得。
有用的表面活性劑的其它例子包括陰離子合成表面活性劑，一般被描述為其分子結(jié)構(gòu)中含有親水和親脂基團(tuán)并且在含水介質(zhì)中離子化從而產(chǎn)生帶有親脂基團(tuán)和親水基團(tuán)的陰離子的那些化合物。烷基芳基磺酸鹽，烷烴硫酸鹽，和硫酸氧乙基化烷基苯酚是陰離子類型的表面活性化合物。
烷基芳基磺酸鹽是一類由式E所示的合成陰離子表面活性劑(R6)n1-(Y)Ar(SO3M)n2[E]在式E中，R6是具有大約1至大約24個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烴基，至少一個(gè)R6具有至少8個(gè)碳原子；n1是1至3；n2是1至2；Ar是苯基或萘基，以及Y和M具有與在式B中相同的定義。R6可以是，例如，甲基，乙基，己基，辛基，叔辛基，異辛基，壬基，癸基，十二烷基，十八烷基等等。
作為例子的烷基芳基磺酸鹽化合物包括十二烷基苯磺酸鈉，癸基苯磺酸鈉，甲基十二烷基苯磺酸銨，十二烷基苯磺酸銨，十八烷基苯磺酸鈉，壬基苯磺酸鈉，十二烷基萘磺酸鈉，十七烷基苯磺酸鈉，二十烷基萘磺酸鉀，十一烷基萘磺酸乙胺和二十二烷基萘磺酸鈉。
烷基硫酸鹽是一類式F代表的合成陰離子表面活性劑R5OSO3M (F)其中R5和M具有與在式B中相同的定義。作為例子的硫酸烷基酯類陰離子表面活性劑化合物包括十八烷基硫酸鈉，十六烷基硫酸鈉，十二烷基硫酸鈉，壬基硫酸鈉，癸基硫酸銨，十四烷基硫酸鉀，二乙醇氨基辛基硫酸鹽，三乙醇胺十八烷基硫酸鹽，和壬基硫酸銨。
硫酸化氧乙烯化烷基苯酚是一類式G代表的合成陰離子表面活性劑 其中A是氧，硫，碳酰胺基團(tuán)，硫代碳酰胺基團(tuán)，羧基或硫代羧酸酯基團(tuán)，z是3-8的整數(shù)，并且R5和M具有與在式B中相同的定義。舉例說明的硫酸化氧乙烯化烷基苯酚類陰離子表面活性劑化合物包括壬基苯氧基四亞乙基氧硫酸銨，十二烷基苯氧基三亞乙基氧硫酸鈉，癸基苯氧基四亞乙基氧硫酸乙醇胺，和辛基苯氧基三亞乙基氧硫酸鉀。
其它有用的表面活性劑的例子包括非離子型表面活性化合物，廣義上被描述為非離子化但從氧化的側(cè)鏈獲得親水特性的化合物，例如聚氧乙烯；分子的親脂部分可以來自脂肪酸，苯酚，醇，酰胺或胺。通常，通過使烯化氧，例如環(huán)氧乙烷，環(huán)氧丁烷，環(huán)氧丙烷等，與脂肪酸，含有一個(gè)或多個(gè)羥基的直鏈或支鏈醇，酚類，硫代酚類，酰胺，或者胺反應(yīng)，從而生成聚亞氧烷基乙二醇醚類和酯類，聚氧乙烯烷基酚，聚氧乙烯硫酚，聚氧乙烯酰胺等。一般優(yōu)選對(duì)于每摩爾脂肪酸，醇，酚，硫酚，酰胺或胺反應(yīng)大約3至大約30摩爾，更優(yōu)選10至30摩爾的烯化氧。
舉例說明的這些非離子型表面活性劑是通過烯化氧與具有8至18個(gè)碳原子的脂肪族醇，例如辛基，壬基，癸基，十八烷基，十二烷基，十四烷基醇等，與酯基含有10-20個(gè)碳原子的六羥基醇的一元酯例如脫水山梨糖醇單月桂酸酯，脫水山梨糖醇單油酸酯和脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯，與其中烷基含有4-20個(gè)碳原子的烷基苯酚，例如丁基，二丁基，戊基，辛基，十二烷基，十四烷基苯酚等，或者與其中烷基含有1-8個(gè)碳原子的烷基的烷基胺反應(yīng)而獲得的。
舉例說明的合成非離子型表面活性劑化合物包括環(huán)氧乙烷或環(huán)氧丙烷與下面的化合物縮合而獲得的產(chǎn)物丙二醇，乙二胺，二乙二醇，十二烷基苯酚，壬基苯酚，十四烷基醇，N-十八烷基二乙醇酰胺，N-十二烷基一乙醇酰胺，商品名為TWEEN 80的聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯，和商品名為TWEEN 20的聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單月桂酸酯。
其他非離子型表面活性劑包括對(duì)應(yīng)于式H的長(zhǎng)鏈?zhǔn)灏费趸颮5R7R8N→O (H)其中R5具有與在式A中相同的定義，以及R7和R8各自是甲基或乙基。式中箭頭是半極性鍵的常規(guī)表示法。適合在本發(fā)明中使用的胺氧化物的例子包括二甲基十二烷基胺氧化物，二甲基辛基胺氧化物，二甲基癸基胺氧化物，二甲基十三烷基胺氧化物，和二甲基十六烷基胺氧化物。
陽離子表面活性試劑也可以被用作表面活性劑。這樣的試劑是含有有機(jī)疏水性基團(tuán)和陽離子增溶基團(tuán)的那些表面活性化合物。典型的陽離子增溶基團(tuán)是胺和四價(jià)基團(tuán)。這樣的陽離子表面活性試劑由式I所示
其中R5，Y，和Y′具有與式C中相同的定義。
其它合適的合成陽離子表面活性劑的例子包括二胺，例如式J所示的那些二胺R9NHC2H4NH2(J)其中R是大約12至22個(gè)碳原子的烷基，例如N-2-氨基乙基十八烷基胺和N-2-氨基乙基十四烷基胺；酰胺-鍵聯(lián)的胺如由式K所示的那些R5CONHC2H4NH3(K)諸如N-2-氨基乙基十八烷基酰胺和N-氨基乙基十四烷基酰胺；季銨化合物，其中典型地與氮原子連接的基團(tuán)中的一個(gè)是含有1-3個(gè)碳原子的烷基，包括帶有惰性取代基例如苯基的這種1-3個(gè)碳原子的烷基并且存在一種陰離子例如鹵原子，乙酸根，甲基硫酸根等。典型的季銨化合物是乙基-二甲基十八烷基氯化銨，芐基-二甲基-十八烷基氯化銨，芐基二甲基-十八烷基氯化銨，三甲基十八烷基氯化銨，三甲基十六烷基溴化銨，二甲基乙基二月桂基氯化銨，二甲基-丙基-十四烷基氯化銨，和相應(yīng)的甲硫酸鹽和乙酸鹽。
式L代表其它合適的陽離子表面活性劑 其中R5具有和式A中相同的定義。并且其中每一a是1-15的整數(shù)。一個(gè)例子是氫化牛油的聚乙二醇胺，其中R5代表牛油殘基并且a+a的平均值是5。
因子C-表面活性劑試劑中使用的其它有用表面活性劑包括TritonX100，Triton X-114，辛基-β-D-硫葡萄糖甙(OTG，Amresco #J575)，Genapol C 100(一種烷基聚氧乙烯C12E10；Calbiochem #345794)，Tween 20，和Tween 80。
因子C-表面活性劑為了形成本發(fā)明的試劑，在水溶液中混合純化的因子C和表面活性劑。為此目的的合適的緩沖液含有30mM Tris，pH 8.0，30mM NaCl，和0.3％乳糖。本發(fā)明的試劑中純化的因子C的濃度優(yōu)選范圍是0.03-3微克/毫升。本發(fā)明的試劑中表面活性劑的濃度優(yōu)選范圍是0.001-0.003％。
純化的因子C和表面活性劑的最佳濃度根據(jù)例如因子C和特定表面活性劑的純度而不同。應(yīng)用常規(guī)試驗(yàn)?zāi)艽_定純化的因子C和表面活性劑的最佳濃度。在實(shí)施例1和13舉例說明的測(cè)定中，表面活性劑ZWITTERGENT 3-14的最佳濃度是0.0025％。
內(nèi)毒素測(cè)定在對(duì)試驗(yàn)樣品檢測(cè)內(nèi)毒素的測(cè)定中可以使用上述試劑。試驗(yàn)樣品可以是對(duì)檢測(cè)內(nèi)毒素有用的任何樣品，包括水，水溶液，例如緩沖液，藥物制劑(例如，疫苗，靜脈注射液，藥物制劑)，生物醫(yī)學(xué)造影劑(例如，顏料，放射性溶液)，酶制劑(例如膠原酶)，組織培養(yǎng)基，飲料，血液，尿液，腦脊髓液，淋巴，血清，和通過溫育水或含有固體樣品例如食品或外科手套的水溶液而形成的溶液。
可以進(jìn)行兩步法或一步法測(cè)定。為了進(jìn)行兩步測(cè)定(實(shí)施例1)，將試驗(yàn)樣品與含有純化的因子C和表面活性劑的試劑一起溫育，然后加入裂解時(shí)會(huì)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的因子C底物。為了進(jìn)行一步法測(cè)定(實(shí)施例13)，一起加入內(nèi)毒素，含有純化因子C和表面活性劑的試劑和底物。
裂解時(shí)產(chǎn)生熒光信號(hào)的底物是特別優(yōu)選的，例如N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素(″DPR，″Bachem 1-1560.0050)和N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素(″VPR，″Bachem1-1120.0050)。DPR的濃度一般范圍是大約10-100mM，25-100mM，5-100mM，75-100mM，25-75mM，50-75mM，25-50mM，或50-75mM。VPR的濃度一般范圍是大約50-200mM，50-150mM，50-100mM，50-75mM，75-150mM，或75-100mM。
對(duì)于特定底物的最佳濃度是不同的。例如，DPR的最佳濃度是50mM，而VPR的最佳濃度是100mM。此外，可以根據(jù)預(yù)計(jì)試驗(yàn)樣品中存在的內(nèi)毒素水平選擇特定底物。內(nèi)毒素濃度越高VPR底物線性范圍越好，而DPR底物在較低內(nèi)毒素濃度下就具有較好線性范圍。因此，在期望更高靈敏度的測(cè)定中能使用DPR，而當(dāng)預(yù)期存在較高內(nèi)毒素水平并且要求較低靈敏度時(shí)，VPR是優(yōu)選的底物。
利用本領(lǐng)域公知的任何方法能測(cè)定熒光。如果熒光劑與上述DPR或VPR底物使用，在360，380，390或395nm(狹縫寬5-40nm)下進(jìn)行激發(fā)并且在440或460nm(狹縫寬2.5-40nm)下測(cè)定發(fā)光。參照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度曲線，測(cè)定可以是定性或定量的。
測(cè)定可以在清澈的容器，例如玻璃或聚苯乙烯組織培養(yǎng)板中進(jìn)行，或者可以在黑色容器(例如，黑色96-孔微量板)中進(jìn)行。如果需要，測(cè)定適于使用例如96-孔微量滴定板對(duì)大量樣品進(jìn)行高通量篩選。
試劑盒本發(fā)明還提供用于檢測(cè)內(nèi)毒素的試劑盒。試劑盒包括純化的鱟因子C蛋白質(zhì)和表面活性劑，如上所述。包括檢測(cè)內(nèi)毒素的試劑的使用說明。試劑盒還包括測(cè)定中使用的因子C底物。
本說明書中引用的所有的專利，專利申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)在這里表述上引作參考。上面的公開內(nèi)容一般性地描述了本發(fā)明。參照下面的具體實(shí)施例能獲得更完全的理解，提供實(shí)施例只是為了詳細(xì)描述的目的而不是為了要限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1兩步法內(nèi)毒素測(cè)定在測(cè)定緩沖液(30mM Tris，pH 8.0，30mM NaCl，0.3％乳糖，和0.0025％Zwittergent 3-14)中將內(nèi)毒素與含有從產(chǎn)生重組因子C的Sf9細(xì)胞獲得的重組Carcinoscorpius rotundicauda因子C的培養(yǎng)基一起預(yù)先溫育1小時(shí)。向混合物中加入底物N-t-Boc-Asp(Obzl)-ProArg-7-酰氨基-4-甲基香豆素(DPR-香豆素)至50mM的終濃度。15-20分鐘之后測(cè)定激活的因子C對(duì)底物進(jìn)行裂解產(chǎn)生的熒光。圖4給出結(jié)果。圖5給出使用最終濃度是100mM的底物N-t-Boc-Val-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素進(jìn)行相似測(cè)定的結(jié)果。
實(shí)施例2將桿粒DNA-因子C轉(zhuǎn)染到Sf細(xì)胞中并且收集重組病毒上清液在含有50U/ml青霉素和50mg/ml鏈霉素的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基(ICCM)中以每35mm孔5×106的密度在6-孔組織培養(yǎng)板上接種Sf9細(xì)胞。Insect-Xpress(BioWhittaker Cat.#04-10270)或Sf-900 SFM是合適的培養(yǎng)基。但是，可以使用其中SF9細(xì)胞得以生長(zhǎng)的任何參照培養(yǎng)基。平板在27℃溫育1小時(shí)使細(xì)胞定居。同時(shí)，制備下述物質(zhì)(每孔)(1)100ml ICCM(沒有抗生素)中的7mg桿粒-因子CDNA和(2)6mlCELLFECTIN(Gibco-BRL)加100ml ICCM(沒有抗生素)。將溶液(1)和(2)輕輕混合并且在室溫下溫育1小時(shí)。向該混合物加入0.8ml的ICCM(沒有抗生素)。
用2ml的ICCM(沒有抗生素)小心沖洗粘著Sf9細(xì)胞。向各個(gè)孔加入1毫升CELLFECTIN-DNA復(fù)合物并且在27℃溫育5小時(shí)。完全去除轉(zhuǎn)染混合物，并且加入含有抗生素的2ml ICCM。27℃溫育96小時(shí)之后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。在SIGMA 3K10甩平式轉(zhuǎn)頭，Nr.11133中以5000rpm離心10分鐘來澄清上清液。在4℃下儲(chǔ)存含有重組桿狀病毒的上清液。
實(shí)施例3重組病毒原液的擴(kuò)增在單層或懸浮液中用Sf9細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增。對(duì)于單層培養(yǎng)，從在75cm2組織培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)了一天的80％匯合Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)物傾析掉培養(yǎng)基。使用0.1-1的MOI的1毫升病毒(實(shí)施例2)感染細(xì)胞單層。使用Millipore GV millex過濾器(黃色；低-蛋白質(zhì)結(jié)合)無菌過濾病毒原液。如下計(jì)算病毒接種物接種物體積＝(MOI×細(xì)胞總數(shù))/以pfu/ml表示的病毒滴度因此，對(duì)于1×107個(gè)細(xì)胞，以2×107pfu/ml的病毒滴度，接種物體積是0.5毫升。在引入細(xì)胞之前用ICCM將接種物體積調(diào)節(jié)至1毫升。
將燒瓶搖動(dòng)幾次，保證細(xì)胞單層被1毫升病毒接種物完全覆蓋。然后燒瓶在不搖動(dòng)下在27℃溫育1小時(shí)。溫育之后，豎直放置燒瓶，并且加入14ml新鮮ICCM。然后將燒瓶在27℃溫育3天。
將培養(yǎng)上清液收集到滅菌無熱源試管中并且使用Sigma3K10甩平式轉(zhuǎn)頭在4℃下以2000rpm離心10分鐘。為了直接使用，將病毒原液保存在4℃下。對(duì)于長(zhǎng)期貯存，將病毒原液放在-80℃下。
對(duì)于懸浮培養(yǎng)，使用存活率＞95％的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增。測(cè)定細(xì)胞密度和存活率。用新鮮InsectXPRESS將Sf9細(xì)胞稀釋至1×106細(xì)胞/毫升。按照下述方法以0.02MOI(病毒/細(xì)胞)對(duì)Sf9培養(yǎng)物加待擴(kuò)增的病毒病毒接種原液的體積(ml)＝(總細(xì)胞/毫升)×(培養(yǎng)物總體積×(MOI)/(以pfu/ml表示的病毒滴度)在27℃+/-2℃下將旋轉(zhuǎn)燒瓶溫育三天，以90-120rpm恒速攪拌。將細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到無菌離心瓶中并且在4℃下以2000rpm離心10分鐘。將上清液收集到滅菌容器中并且棄除細(xì)胞沉積物。上清液通過0.45微米過濾器被過濾到滅菌容器中。上清液進(jìn)一步通過滅菌的0.2微米過濾器被過濾到滅菌容器中。最終的病毒原液在2-8℃下進(jìn)行避光貯存。根據(jù)實(shí)施例4中的解釋進(jìn)行滴度測(cè)定。
實(shí)施例4桿狀病毒滴定利用噬菌斑測(cè)定，終點(diǎn)稀釋，或者其它病毒滴度試劑盒(例如，BacPAK Baculovirus Rapid Titer Kit，Clontech#K1599-1)能測(cè)定病毒滴度(每毫升的噬菌斑形成單位(PFU))。在固定的單層培養(yǎng)物中進(jìn)行噬菌斑測(cè)定。如下進(jìn)行噬菌斑測(cè)定噬菌斑測(cè)定數(shù)＝病毒稀釋數(shù)×4(一式四份)+2正對(duì)照和2負(fù)對(duì)照例如，對(duì)于病毒稀釋度105，106，107，108，一式四份孔中每一份稀釋液將是一個(gè)16-孔噬菌斑測(cè)定。噬菌斑測(cè)定中包括兩個(gè)正對(duì)照和兩個(gè)負(fù)對(duì)照，總共20孔。
在10％FBS血清培養(yǎng)基中制備每毫升5×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液。用上述細(xì)胞懸浮液以每孔2毫升接種6-孔板。在實(shí)驗(yàn)之前讓細(xì)胞附著2小時(shí)。細(xì)胞達(dá)到大約80％匯合。
使用4.5ml培養(yǎng)基和0.5ml病毒原液在15毫升的無菌試管中制備10倍系列病毒稀釋液。從各孔中抽吸出培養(yǎng)基。每孔加入1毫升病毒稀釋液并且在27℃下溫育2小時(shí)。
將1.3xSF-90011(Gibco-BRL #10967-032)加溫至27℃。融化4％瓊脂糖(Gibco 18300-012)并且保持在50℃水浴中。以3∶1的比例加入1.3x培養(yǎng)基和4％瓊脂糖，制成含1％瓊脂糖的培養(yǎng)基。將這種瓊脂保持在40℃水浴中(例如，在可以放在通風(fēng)廚中的燒杯中)。
快速操作以不使瓊脂糖混合物固化，從細(xì)胞單層抽吸出病毒溶液。向各個(gè)孔中加入2ml 1％瓊脂糖。將平板放在通風(fēng)廚中，蓋子微微開啟10分鐘。將平板倒置并且將它們放在具有用以提供濕度的潮濕紙巾的密封盒中。在27℃下溫育5-7天，或者直到噬菌斑形成完好。
感染后第7天，加入0.5ml 0.033％中性紅(在水中)，溫育3分鐘，并棄除。或者，加入0.5ml 0.1％臺(tái)盼藍(lán)(在水中)，搖動(dòng)蓋上蓋子，靜置3分鐘，并棄除。將培養(yǎng)板溫育2小時(shí)。借助光盒和放大鏡，計(jì)數(shù)每個(gè)板上的噬菌斑。應(yīng)用下式計(jì)算病毒滴度病毒滴度(pfu/ml)＝噬菌斑數(shù)目×病毒稀釋度。
實(shí)施例5在無血清培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)染用于生產(chǎn)重組因子C的Sf9細(xì)胞使用高成活率Sf9細(xì)胞(例如，在無血清條件下成活率95-100％)。將對(duì)數(shù)期Sf9細(xì)胞培養(yǎng)至每毫升懸浮培養(yǎng)物至細(xì)胞密度達(dá)到1.5×106和2.5×106細(xì)胞。通過感染單層培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的Sf9細(xì)胞也可以進(jìn)行重組因子C制備。測(cè)定細(xì)胞密度和成活率。用新鮮InsectXPRESS將Sf9細(xì)胞稀釋至每毫升1.5×106細(xì)胞。如下，在MOI為1(病毒/細(xì)胞)下，向Sf9培養(yǎng)物加重組桿狀病毒高滴度原液接種物HTS的體積(ml)＝(總細(xì)胞/毫升)×(培養(yǎng)物總體積×(MOI)/(以pfu/ml表示的病毒滴度)感染后72小時(shí)收集上清液。將細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到無菌離心瓶中并且在4℃下以2000rpm離心10分鐘。將上清液收集到無菌容器中并且棄除細(xì)胞沉積物。上清液通過0.45微米過濾器被過濾到無菌容器中。上清液進(jìn)一步通過滅菌的0.2微米過濾器被過濾到無菌容器中。這種含有重組因子C的培養(yǎng)上清液可以在4℃下貯存至多一年并且能直接用來形成用于本發(fā)明內(nèi)毒素檢測(cè)的試劑。
實(shí)施例6適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)Sf9細(xì)胞在沒有CO2下在27℃下培養(yǎng)。最大通風(fēng)是優(yōu)選的。如果使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，則將旁邊的螺旋蓋松開以增加通氣。適應(yīng)在無血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的Sf9細(xì)胞在常規(guī)基礎(chǔ)上應(yīng)該以4-5天間隔進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
在含有100毫升培養(yǎng)基的250ml旋轉(zhuǎn)或搖瓶中以5.0×105細(xì)胞/毫升進(jìn)行傳代培養(yǎng)，松開蓋子以提供最大通風(fēng)。以90-100rpm攪拌培養(yǎng)物。細(xì)胞成活率應(yīng)高于90％。
從27℃保溫箱取出了4-5天齡的培養(yǎng)物并且用70％乙醇刮出。取出一份細(xì)胞懸浮液，使用臺(tái)盼藍(lán)染料測(cè)定細(xì)胞成活率和總的細(xì)胞數(shù)。確定達(dá)到5×105細(xì)胞/毫升所需要的細(xì)胞稀釋度。將原液培養(yǎng)瓶旋轉(zhuǎn)幾次并且根據(jù)計(jì)算結(jié)果取出合適體積的細(xì)胞懸浮液。對(duì)含有制成體積達(dá)到100毫升的最終培養(yǎng)物所需要的足量預(yù)熱新鮮培養(yǎng)基的新的250ml轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行接種。將培養(yǎng)物放回到保溫箱中。攪拌速度設(shè)置在90-100rpm。
實(shí)施例7Sf9細(xì)胞的無血清培養(yǎng)物的低溫保藏在單層或者懸浮液中培養(yǎng)Sf9細(xì)胞。在生長(zhǎng)的中對(duì)數(shù)期收集細(xì)胞(大約2天)，成活率＞90％。利用冰浴和滅菌過濾器保持條件培養(yǎng)基。
使用臺(tái)盼藍(lán)排除方法測(cè)定細(xì)胞成活率。計(jì)算達(dá)到1-2×107細(xì)胞/毫升終密度所必需的低溫保藏培養(yǎng)基(50％新鮮無血清ICCM培養(yǎng)基和50％條件培養(yǎng)基中7.5％DMSO；無菌過濾)的體積。在冰上保持低溫保藏混合物。同時(shí)，以800rpm/500×g離心3分鐘從懸浮液中離心出細(xì)胞。如果大量細(xì)胞沒有沉淀而是在上清液中，則棄除樣品。
在所確定的冷卻低溫保藏混合物體積中重新懸浮細(xì)胞，達(dá)到1-2×107細(xì)胞/毫升。將1-1.5ml等份的細(xì)胞懸浮液快速分配到冷凍管中。在液氮的上部氣相中在-70至-90℃下冷凍細(xì)胞。將小瓶置于液氮中。
實(shí)施例8回收低溫保藏的無血清Sf9細(xì)胞在37℃水浴中快速搖動(dòng)解凍瓶直到融化。從水浴中取出瓶子并且用無菌70％異丙醇刮擦。開啟小瓶，將小瓶中的物質(zhì)取出并放到合適大小的滅菌離心管中；用5個(gè)體積的在保溫箱中已經(jīng)平衡至27℃+/-2℃的InsectXPRESS培養(yǎng)基(或者等同物)稀釋細(xì)胞懸浮液。以125×G將稀釋的懸浮液離心10分鐘。棄除液體并且將細(xì)胞再次懸浮于等于棄除液體體積的培養(yǎng)基中。測(cè)定細(xì)胞數(shù)和成活率。使用無血清培養(yǎng)基將成活的細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至每毫升2×105細(xì)胞和3×105細(xì)胞之間。將27℃+/-2℃保溫箱中的燒瓶轉(zhuǎn)移到平臺(tái)搖動(dòng)器上連續(xù)搖動(dòng)，每分鐘轉(zhuǎn)100-125轉(zhuǎn)。當(dāng)至少每26小時(shí)培養(yǎng)物的成活細(xì)胞數(shù)翻翻時(shí)，如實(shí)施例6所述可以擴(kuò)展培養(yǎng)物。
實(shí)施例9Sf9細(xì)胞對(duì)懸浮培養(yǎng)物的適應(yīng)開始100ml懸浮培養(yǎng)需要6-10匯合的75cm2單層T-瓶的Sf9細(xì)胞。通過一只手拿住燒瓶并且在另一只手的掌心扣打而使細(xì)胞離開瓶底。合并細(xì)胞懸浮液并且計(jì)數(shù)成活率。
室溫下，使用250ml轉(zhuǎn)瓶中含有的完全血清補(bǔ)充的或無血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基將細(xì)胞懸浮液稀釋至大約5×105成活細(xì)胞/毫升。攪拌葉片頂部稍高于細(xì)胞懸浮液。從而提供了額外的換氣。側(cè)臂蓋子應(yīng)當(dāng)松開四分之一圈。
以100rpm恒定攪拌速度在27℃溫育細(xì)胞。成活細(xì)胞數(shù)達(dá)到1-2×106細(xì)胞/毫升(接種后3-7天)時(shí)的傳染培養(yǎng)，將攪拌速度加快5rpm，直到培養(yǎng)物成活率＞80％傳代培養(yǎng)。反復(fù)進(jìn)行直到轉(zhuǎn)瓶達(dá)到100rpm的攪拌速度或者搖瓶培養(yǎng)物達(dá)到130-140rpm。在這一點(diǎn)上，在傳代培養(yǎng)期間將接種密度減小至3×105細(xì)胞/毫升。
如果還有大塊細(xì)胞(例如，每塊多于10個(gè)細(xì)胞)存在，在傳代培養(yǎng)之前于不攪拌條件下將轉(zhuǎn)瓶/搖瓶靜置2-3分鐘。這使得大塊沉降到瓶底。合并上部三分之一的懸浮細(xì)胞用以計(jì)數(shù)并且接種到新的培養(yǎng)物中。對(duì)生長(zhǎng)為單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞總體選用這個(gè)步驟。有必要重復(fù)該步驟2-3次直到結(jié)塊減少。
實(shí)施例10不同的去污劑和不同的去污劑濃度對(duì)重組因子C測(cè)定的影響材料和方法從指定廠家購(gòu)買下面的試劑Zwittergent 3-14(Calbiochem，Cat#693017)，Tween 20(ICN，Cat#194841)，Tween 80(ICN，Cat#194842)，Triton X-114(ICN，Cat#193971)，)，正辛基-β-D-硫代吡喃葡糖苷(OTG，Amresco，Cat#J575)和Triton X-100(ICN，Cat#194854)。使用20微升的各種去污劑(大約是終濃度的10倍)，150微升的1EU/毫升EC-6，10微升的rFC上清液031901I，20微升的300mM Tris，pH8.0和20微升的0.55mM DPR香豆素底物進(jìn)行重組因子C(rFC)測(cè)定。使用Cytofluor讀數(shù)器在38℃讀取測(cè)定結(jié)果，讀數(shù)器設(shè)置在390/440nm，每次循環(huán)5分鐘，1小時(shí)。30分鐘之后將數(shù)據(jù)作圖。
結(jié)果如圖1-3和9-11所示，低濃度的Zwittergent 3-14，Tween20，Tween 80，Triton X-114，OTG，Genapol C-100和Triton X-100將rFC測(cè)定提高2-7倍。Zwittergent 3-14，Triton X114，OTG和TritonX-100增加的濃度范圍窄，Tween 20，Tween 80和Genapol C-100增加的濃度范圍寬。
表1總結(jié)了測(cè)試9種去污劑獲得的結(jié)果。這些去污劑可以被分為三組對(duì)于提高重組因子C活性具有窄濃度范圍的去污劑，對(duì)于提高重組因子C活性具有寬濃度范圍的去污劑，和抑制重組因子C活性的去污劑。
表1.
還使用純化的鱟屬因子C測(cè)定了Zwittergent 3-14的增強(qiáng)/抑制作用(圖6)。發(fā)現(xiàn)了相似的增強(qiáng)/抑制作用，但是相對(duì)因子C活性比例，增強(qiáng)和抑制去污劑濃度與重組因子C測(cè)定中的那些不同。
實(shí)施例11抗鱟屬因子C抗血清我們從鱟屬中分離到了因子C并且產(chǎn)生了抗這種蛋白質(zhì)的抗血清。將鱟溶胞產(chǎn)物先用S-100凝膠進(jìn)行過濾分離，接著用陽離子交換柱分離。使用N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素底物測(cè)定各級(jí)分的因子C活性。鱟屬因子C被純化73倍，同利用酶測(cè)定和SDS-PAGE所測(cè)定的結(jié)果具有80％的不相同性。通過非還原條件下SDS-PAGE測(cè)定，鱟屬因子C的分子量是117kDa。還原SDS-PAGE表明存在79kDa和40kDa兩個(gè)主帶，相當(dāng)于重鏈和輕鏈。胰蛋白酶肽測(cè)序表明鱟屬因子C序列與亞洲人種密切匹配，序列同一性＞90％。在兔體內(nèi)產(chǎn)生抗鱟屬因子C的特異多克隆抗體?？?因子C純化的IgG抑制LPS對(duì)因子C的激活作用，但是因子C一旦被LPS激活，則對(duì)蛋白酶活性沒有影響。因子C抗血清證明這種蛋白質(zhì)在鱟屬溶胞產(chǎn)物對(duì)LPS的最初識(shí)別中的重要性。
實(shí)施例12在表面活性劑存在下內(nèi)毒素測(cè)定靈敏性提高在一步法中，進(jìn)行1-小時(shí)終點(diǎn)測(cè)定。內(nèi)毒素O55B5，0.01，0.1，1，和10EU/ml被用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。向96-孔板加空白對(duì)照物和內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)物(每孔100微升)。以1∶4∶5的比例混合重組因子C上清液，測(cè)定緩沖液(150mMNaCl，150mM Tris，pH 8.0，和1.5％乳糖，有或沒有0.0125％Zwittergent)和底物溶液(0.2mM水溶液)。向各空白對(duì)照物和內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)物中加這種混合物。在零時(shí)和1小時(shí)讀取熒光度。用空白對(duì)照物矯正熒光度差異(δ熒光度)。然后用標(biāo)準(zhǔn)化δ熒光度對(duì)內(nèi)毒素濃度的log-log數(shù)值作圖。各個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是雙份測(cè)定的結(jié)果。
圖7給出結(jié)果。當(dāng)存在表面活性劑時(shí)內(nèi)毒素測(cè)定靈敏度提高10-倍。
實(shí)施例13一步法內(nèi)毒素測(cè)定使用100微升各種空白對(duì)照物和內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)物在96-孔板中進(jìn)行一步法內(nèi)毒素測(cè)定。以1∶4∶5的比例向平板的各孔中加入100微升的重組因子C上清液(桿狀病毒-感染的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)基)，緩沖液(150mM Tri，pH 8.0，150mM NaCl，1.5％β乳糖和0.0125％Zwittergent3-14)與熒光基質(zhì)(DPR香豆素，0.2mM)的混合物。平板在37℃下溫育1小時(shí)。在熒光微量板讀數(shù)器上分別在390和440nm讀出激發(fā)光和發(fā)射光。
圖8中給出一步法重組因子C內(nèi)毒素測(cè)定的結(jié)果。
序列表<110>Chen，LinPepe，Michael<120>檢測(cè)內(nèi)毒素的方法和試劑<130>02877.00008<150>US 60/310,125<151>2001-06-28<160>8<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1906<212>DNA<213>Tachypleudus tridentata<400>1gtaagtatca tcaggtttaa cgcgaacgtg gaagaactct gaaggtaact taagtatggt 60cttagcgtcg tttttggtgt ctggtttagt tctagggata ctagcccaac aaatgcgtcc 120agttcagtcc agaggagtag atctgggctt gtgtgatgaa acgaggttcg agtgtaagtg 180tggagatcca ggctatgtgt tcaacgtccc tatgaaacaa tgcacgtact tctatcgatg 240gaggccttat tgtaaaccat gtgatgacct ggaggctaag gacatttgtc caaagtacaa 300acgatgtcaa gagtgtaagg ctggtcttga tagttgtgtt acttgtccac ctaacaaata 360tggtacttgg tgtagcggtg aatgtcaatg taagaatgga ggtatctgtg accagaggac 420aggagcttgt acctgtcgtg acagatatga aggagcgcac tgtgaaattc tcaaaggttg 480tcctcttctt ccatcggatt ctcaagttca ggaagtcaga aacccaccag ataatcccca 540aactattgac tacagctgtt caccagggtt caagcttaaa ggcgtggcac gaattagctg 600tctcccaaat ggacagtgga gtagctttcc acccaaatgt attcgagaat gtgccaaggt 660ttcatctcca gaacacggga aagtgaatgc tcctagtggc aatatgatag aaggggctac 720tttacggttc tcatgtgata gtccctacta cttgattggt caagaaacat taacctgcca 780gggtaatggt cagtggagtg gacaaatacc acaatgtaag aagttggtct tctgtcctga 840ccttgatcct gtaaaccatg ctgaacacca ggttaaaatt ggtgtggaac aaaaatatgg 900tcagtttcct caaggcactg aagtgaccta tacgtgttcg ggtaactact tcttgatggg 960ttttaacacc ttaaaatgta accctgatgg gtcctggtca ggatcacagc catcctgtgt 1020taaagtggca gacagagagg tcgactgtga cagtaaagct gtagacttct tggatgatgt 1080tggtgaacct gtcaggatcc actgtcctgc tggctgttct ttgacagctg gtactgtgtg 1140gggtacagcc atataccacg aactttcctc agtgtgtcgt gcagccatcc atgctggcaa 1200gcttccaaac tctggagggg cggtgcatgt agtgaacaat ggcccctact cggactttct 1260gggtagtgac ctgaatggga taaaatcgga agagttgaag tctcttgccc gcagttttcg 1320atttgattat gtcagttcat ccacagcagg tagatcagga tgtcctgatg gatggtttga 1380ggtagaagag aactgtgtgt acgttacatc aaaacagaga gcctgggaaa gagctcaagg 1440tgtgtgtacc aatatggctg ctcgtcttgc tgtgctagac aaagatctaa ttccgagttc 1500cttgactgag actctacgag ggaaaggtac tgataatgtt actgcaacct aagtagactt 1560tattttagtc taagatatct tgtgtcaatt gttgacttgc tactcttact ttattgtaat 1620aaaactgtta taaagtatta agtcttgttt attttattac tgtttaaagt atactacaag 1680ggttacacct aaaaggaaat ttctatctga caatttcata aaaagtggat gttacttttg 1740attttcgttg gttgttaaat gcacatccgg tttgtaaaca tctaagttcc cacaaacagg 1800ctctgtggtc ttgtaaaaat ctaaactaat accactttta atatgtttta aacctttttt 1860ttatgtatgc ttatcagaga ctaaaataaa ggtttttaat aactgt1906
<210>2<211>498<212>PRT<213>Tachypleudus tridentata<400>2Met Val Leu Ala Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Gly Ile Leu1 5 10 15Ala Gln Gln Met Arg Pro Val Gln Ser Arg Gly Val Asp Leu Gly Leu20 25 30Cys Asp Glu Thr Arg Phe Glu Cys Lys Cys Gly Asp Pro Gly Tyr Val35 40 45Phe Asn Val Pro Met Lys Gln Cys Thr Tyr Phe Tyr Arg Trp Arg Pro50 55 60Tyr Cys Lys Pro Cys Asp Asp Leu Glu Ala Lys Asp Ile Cys Pro Lys65 70 75 80Tyr Lys Arg Cys Gln Glu Cys Lys Ala Gly Leu Asp Ser Cys Val Thr85 90 95Cys Pro Pro Asn Lys Tyr Gly Thr Trp Cys Ser Gly Glu Cys Gln Cys100 105 110Lys Asn Gly Gly Ile Cys Asp Gln Arg Thr Gly Ala Cys Thr Cys Arg115 120 125Asp Arg Tyr Glu Gly Ala His Cys Glu Ile Leu Lys Gly Cys Pro Leu130 135 140Leu Pro Ser Asp Ser Gln Val Gln Glu Val Arg Asn Pro Pro Asp Asn145 150 155 160Pro Gln Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Ser Pro Gly Phe Lys Leu Lys Gly165 170 175Val Ala Arg Ile Ser Cys Leu Pro Asn Gly Gln Trp Ser Ser Phe Pro180 185 190Pro Lys Cys Ile Arg Glu Cys Ala Lys Val Ser Ser Pro Glu His Gly195 200 205Lys Val Asn Ala Pro Ser Gly Asn Met Ile Glu Gly Ala Thr Leu Arg210 215 220Phe Ser Cys Asp Ser Pro Tyr Tyr Leu Ile Gly Gln Glu Thr Leu Thr225 230 235 240Cys Gln Gly Asn Gly Gln Trp Ser Gly Gln Ile Pro Gln Cys Lys Lys245 250 255Leu Val Phe Cys Pro Asp Leu Asp Pro Val Asn His Ala Glu His Gln260 265 270Val Lys Ile Gly Val Glu Gln Lys Tyr Gly Gln Phe Pro Gln Gly Thr275 280 285Glu Val Thr Tyr Thr Cys Ser Gly Asn Tyr Phe Leu Met Gly Phe Asn290 295 300Thr Leu Lys Cys Asn Pro Asp Gly Ser Trp Ser Gly Ser Gln Pro Ser305 310315 320Cys Val Lys Val Ala Asp Arg Glu Val Asp Cys Asp Ser Lys Ala Val325 330 335Asp Phe Leu Asp Asp Val Gly Glu Pro Val Arg Ile His Cys Pro Ala340 345 350Gly Cys Ser Leu Thr Ala Gly Thr Val Trp Gly Thr Ala Ile Tyr His355 360 365Glu Leu Ser Ser Val Cys Arg Ala Ala Ile His Ala Gly Lys Leu Pro370 375 380Asn Ser Gly Gly Ala Val His Val Val Asn Asn Gly Pro Tyr Ser Asp385 390395 400Phe Leu Gly Ser Asp Leu Asn Gly Ile Lys Ser Glu Glu Leu Lys Ser
405 410 415Leu Ala Arg Ser Phe Arg Phe Asp Tyr Val Ser Ser Ser Thr Ala Gly420 425 430Arg Ser Gly Cys Pro Asp Gly Trp Phe Glu Val Glu Glu Asn Cys Val435 440 445Tyr Val Thr Ser Lys Gln Arg Ala Trp Glu Arg Ala Gln Gly Val Cys450 455 460Thr Asn Met Ala Ala Arg Leu Ala Val Leu Asp Lys Asp Leu Ile Pro465 470 475 480Ser Ser Leu Thr Glu Thr Leu Arg Gly Lys Gly Thr Asp Asn Val Thr485 490 495Ala Thr<210>3<211>3467<212>DNA<213>Tachypleudus tridentata<400>3caggtttaac gcgaacgtgg aagaactctg aaggtaactt aagtatggtc ttagcgtcgt 60ttttggtgtc tggtttagtt ctagggatac tagcccaaca aatgcgtcca gttcagtcca 120gaggagtaga tctgggcttg tgtgatgaaa cgaggttcga gtgtaagtgt ggagatccag 180gctatgtgtt caacgtccct atgaaacaat gcacgtactt ctatcgatgg aggccttatt 240gtaaaccatg tgatgacctg gaggctaagg acatttgtcc aaagtacaaa cgatgtcaag 300agtgtaaggc tggtcttgat agttgtgtta cttgtccacc taacaaatat ggtacttggt 360gtagcggtga atgtcaatgt aagaatggag gtatctgtga ccagaggaca ggagcttgta 420cctgtcgtga cagatatgaa ggagcgcact gtgaaattct caaaggttgt cctcttcttc 480catcggattc tcaagttcag gaagtcagaa acccaccaga taatccccaa actattgact 540acagctgttc accagggttc aagcttaaag gcgtggcacg aattagctgt ctcccaaatg 600gacagtggag tagctttcca cccaaatgta ttcgagaatg tgccaaggtt tcatctccag 660aacacgggaa agtgaatgct cctagtggca atatgataga aggggctact ttacggttct 720catgtgatag tccctactac ttgattggtc aagaaacatt aacctgccag ggtaatggtc 780agtggagtgg acaaatacca caatgtaaga agttggtctt ctgtcctgac cttgatcctg 840taaaccatgc tgaacaccag gttaaaattg gtgtggaaca aaaatatggt cagtttcctc 900aaggcactga agtgacctat acgtgttcgg gtaactactt cttgatgggt tttaacacct 960taaaatgtaa ccctgatggg tcctggtcag gatcacagcc atcctgtgtt aaagtggcag 1020acagagaggt cgactgtgac agtaaagctg tagacttctt ggatgatgtt ggtgaacctg 1080tcaggatcca ctgtcctgct ggctgttctt tgacagctgg tactgtgtgg ggtacagcca 1140tataccacga actttcctca gtgtgtcgtg cagccatcca tgctggcaag cttccaaact 1200ctggaggggc ggtgcatgta gtgaacaatg gcccctactc ggactttctg ggtagtgacc 1260tgaatgggat aaaatcggaa gagttgaagt ctcttgcccg cagttttcga tttgattatg 1320tcagttcatc cacagcaggt agatcaggat gtcctgatgg atggtttgag gtagaagaga 1380actgtgtgta cgttacatca aaacagagag cctgggaaag agctcaaggt gtgtgtacca 1440atatggctgc tcgtcttgct gtgctagaca aagatctaat tccgagttcc ttgactgaga 1500ctctacgagg gaaagggtta acaaccacat ggataggatt gcacagacta gatgctgaga 1560agccctttgt ttgggagcta atggatcgta gtaatgtggt tctgaatgat aacctaacat 1620tctgggcctc tggcgaacct ggaaatgaaa ctaactgtgt atatctggac atccgagatc 1680agctgcagcc tgtgtggaaa accaagtcat gttttcagcc ctcaagcttt gcttgcatga 1740tggatttgtc agacagaaat aaagccaaat gcgatgaccc tggaccactg gaaaatggac 1800acgccacact tcatggacaa agtattgatg ggttctatgc tggttcttct ataaggtaca 1860gctgtgaggt tctccactac ctcagtggaa ctgagaccgt aacttgtaca acaaatggca 1920catggagtgc tcctaaacct cgatgtatca aagtcatcac ctgccaaaac cctcctgtac 1980catcatatgg ttctgtggaa atcaaacccc caagtcggac aaactcgatc agtcgtgttg 2040ggtcaccttt cttgaggttg ccacggttac ccctcccatt agccagagca gccaaacctc 2100ctccaaaacc tagatcctca caaccctcta ctgtggactt ggcttctaaa gttaaactac 2160ctgaaggtca ttaccgggta gggtctcgag ccatttacac gtgcgagtcg agatactacg 2220
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Gly Arg Ser Asp Ser Pro Arg Ser Pro Phe Ile Trp Asn Gly Asn Ser820 825 830Thr Glu Ile Gly Gln Trp Pro Trp Gln Ala Gly Ile Ser Arg Trp Leu835 840 845Ala Asp His Asn Met Trp Phe Leu Gln Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn850 855 860Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Thr Tyr Ser Ala Thr865 870 875 880Ala Glu Ile Ile Asp Pro Asn Gln Phe Lys Met Tyr Leu Gly Lys Tyr885 890 895Tyr Arg Asp Asp Ser Arg Asp Asp Asp Tyr Val Gln Val Arg Glu Ala900 905 910Leu Glu Ile His Val Asn Pro Asn Tyr Asp Pro Gly Asn Leu Asn Phe915 920 925Asp Ile Ala Leu Ile Gln Leu Lys Thr Pro Val Thr Leu Thr Thr Arg930 935 940Val Gln Pro Ile Cys Leu Pro Thr Asp Ile Thr Thr Arg Glu His Leu945 950 955 960Lys Glu Gly Thr Leu Ala Val Val Thr Gly Trp Gly Leu Asn Glu Asn965 970 975Asn Thr Tyr Ser Glu Thr Ile Gln Gln Ala Val Leu Pro Val Val Ala980 985 990Ala Ser Thr Cys Glu Glu Gly Tyr Lys Glu Ala Asp Leu Pro Leu Thr995 10001005Val Thr Glu Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Lys Gly Arg Tyr Asp101010151020Ala Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Phe Ala Asp Asp Ser102510301035 1040Arg Thr Glu Arg Arg Trp Val Leu Glu Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser104510501055Pro Ser Gly Cys Gly Lys Ala Asn Gln Tyr Gly Gly Phe Thr Lys Val106010651070Asn Val Phe Leu Ser Trp Ile Arg Gln Phe Ile10751080<210>7<211>3438<212>DNA<213>Carcinoscorpius rotundicauda<400>7gtgaaggtaa cttaagtatg gtcttagcgt cgtttttggt gtctggttta gttctagggc60tactagccca aaaaatgcgc ccagttcagt ccaaaggagt agatctaggc ttgtgtgatg120aaacgaggtt cgagtgtaag tgtggcgatc caggctatgt gttcaacatt ccagtgaaac180aatgtacata cttttatcga tggaggccgt attgtaaacc atgtgatgac ctggaggcta240aggatatttg tccaaagtac aaacgatgtc aagagtgtaa ggctggtctt gatagttgtg300ttacttgtcc acctaacaaa tatggtactt ggtgtagcgg tgaatgtcag tgtaagaatg360gaggtatctg tgaccagagg acaggagctt gtgcatgtcg tgacagatat gaaggggtgc420actgtgaaat tctcaaaggt tgtcctcttc ttccatcgga ttctcaggtt caggaagtca480gaaatccacc agataatccc caaactattg actacagctg ttcaccaggg ttcaagctta540agggtatggc acgaattagc tgtctcccaa atggacagtg gagtaacttt ccacccaaat600gtattcgaga atgtgccatg gtttcatctc cagaacatgg gaaagtgaat gctcttagtg660gtgatatgat agaaggggct actttacggt tctcatgtga tagtccctac tacttgattg720gtcaagaaac attaacctgt cagggtaatg gtcagtggaa tggacagata ccacaatgta780agaacttggt cttctgtcct gacctggatc ctgtaaacca tgctgaacac aaggttaaaa840ttggtgtgga acaaaaatat ggtcagtttc ctcaaggcac tgaagtgacc tatacgtgtt900cgggtaacta cttcttgatg ggttttgaca ccttaaaatg taaccctgat gggtcttggt960
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Tyr Cys Lys Pro Cys Asp Asp Leu Glu Ala Lys Asp Ile Cys Pro Lys65 70 75 80Tyr Lys Arg Cys Gln Glu Cys Lys Ala Gly Leu Asp Ser Cys Val Thr85 90 95Cys Pro Pro Asn Lys Tyr Gly Thr Trp Cys Ser Gly Glu Cys Gln Cys100 105 110Lys Asn Gly Gly Ile Cys Asp Gln Arg Thr Gly Ala Cys Ala Cys Arg115 120 125Asp Arg Tyr Glu Gly Val His Cys Glu Ile Leu Lys Gly Cys Pro Leu130 135 140Leu Pro Ser Asp Ser Gln Val Gln Glu Val Arg Asn Pro Pro Asp Asn145 150 155 160Pro Gln Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Ser Pro Gly Phe Lys Leu Lys Gly165 170 175Met Ala Arg Ile Ser Cys Leu Pro Asn Gly Gln Trp Ser Asn Phe Pro180 185 190Pro Lys Cys Ile Arg Glu Cys Ala Met Val Ser Ser Pro Glu His Gly195 200 205Lys Val Asn Ala Leu Ser Gly Asp Met Ile Glu Gly Ala Thr Leu Arg210 215 220Phe Ser Cys Asp Ser Pro Tyr Tyr Leu Ile Gly Gln Glu Thr Leu Thr225 230 235 240Cys Gln Gly Asn Gly Gln Trp Asn Gly Gln Ile Pro Gln Cys Lys Asn245 250 255Leu Val Phe Cys Pro Asp Leu Asp Pro Val Asn His Ala Glu His Lys260 265 270Val Lys Ile Gly Val Glu Gln Lys Tyr Gly Gln Phe Pro Gln Gly Thr275 280 285Glu Val Thr Tyr Thr Cys Ser Gly Asn Tyr Phe Leu Met Gly Phe Asp290 295 300Thr Leu Lys Cys Asn Pro Asp Gly Ser Trp Ser Gly Ser Gln Pro Ser305 310 315 320Cys Val Lys Val Ala Asp Arg Glu Val Asp Cys Asp Ser Lys Ala Val325 330 335Asp Phe Leu Asp Asp Val Gly Glu Pro Val Arg Ile His Cys Pro Ala340 345 350Gly Cys Ser Leu Thr Ala Gly Thr Val Trp Gly Thr Ala Ile Tyr His355 360 365Glu Leu Ser Ser Val Cys Arg Ala Ala Ile His Ala Gly Lys Leu Pro370 375 380Asn Ser Gly Gly Ala Val His Val Val Asn Asn Gly Pro Tyr Ser Asp385 390 395 400Phe Leu Gly Ser Asp Leu Asn Gly Ile Lys Ser Glu Glu Leu Lys Ser405 410 415Leu Ala Arg Ser Phe Arg Phe Asp Tyr Val Arg Ser Ser Thr Ala Gly420 425 430Lys Ser Gly Cys Pro Asp Gly Trp Phe Glu Val Asp Glu Asn Cys Val435 440 445Tyr Val Thr Ser Lys Gln Arg Ala Trp Glu Arg Ala Gln Gly Val Cys450 455 460Thr Asn Met Ala Ala Arg Leu Ala Val Leu Asp Lys Asp Val Ile Pro465 470 475 480Asn Ser Leu Thr Glu Thr Leu Arg Gly Lys Gly Leu Thr Thr Thr Trp485490 495Ile Gly Leu His Arg Leu Asp Ala Glu Lys Pro Phe Ile Trp Glu Leu500 505 510Met Asp Arg Ser Asn Val Val Leu Asn Asp Asn Leu Thr Phe Trp Ala
515 520 525Ser Gly Glu Pro Gly Asn Glu Thr Asn Cys Val Tyr Met Asp Ile Gln530 535 540Asp Gln Leu Gln Ser Val Trp Lys Thr Lys Ser Cys Phe Gln Pro Ser545 550 555 560Ser Phe Ala Cys Met Met Asp Leu Ser Asp Arg Asn Lys Ala Lys Cys565 570 575Asp Asp Pro Gly Ser Leu Glu Asn Gly His Ala Thr Leu His Gly Gln580 585 590Ser Ile Asp Gly Phe Tyr Ala Gly Ser Ser Ile Arg Tyr Ser Cys Glu595 600 605Val Leu His Tyr Leu Ser Gly Thr Glu Thr Val Thr Cys Thr Thr Asn610 615 620Gly Thr Trp Ser Ala Pro Lys Pro Arg Cys Ile Lys Val Ile Thr Cys625 630 635 640Gln Asn Pro Pro Val Pro Ser Tyr Gly Ser Val Glu Ile Lys Pro Pro645 650 655Ser Arg Thr Asn Ser Ile Ser Arg Val Gly Ser Pro Phe Leu Arg Leu660 665 670Pro Arg Leu Pro Leu Pro Leu Ala Arg Ala Ala Lys Pro Pro Pro Lys675 680 685Pro Arg Ser Ser Gln Pro Ser Thr Val Asp Leu Ala Ser Lys Val Lys690 695 700Leu Pro Glu Gly His Tyr Arg Val Gly Ser Arg Ala Ile Tyr Thr Cys705 710 715 720Glu Ser Arg Tyr Tyr Glu Leu Leu Gly Ser Gln Gly Arg Arg Cys Asp725 730 735Ser Asn Gly Asn Trp Ser Gly Arg Pro Ala Ser Cys Ile Pro Val Cys740 745 750Gly Arg Ser Asp Ser Pro Arg Ser Pro Phe Ile Trp Asn Gly Asn Ser755 760 765Thr Glu Ile Gly Gln Trp Pro Trp Gln Ala Gly Ile Ser Arg Trp Leu770 775 780Ala Asp His Asn Met Trp Phe Leu Gln Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn785 790 795 800Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Thr Tyr Ser Ala Thr805 810 815Ala Glu lle lle Asp Pro Asn Gln Phe Lys Met Tyr Leu Gly Lys Tyr820 825 830Tyr Arg Asp Asp Ser Arg Asp Asp Asp Tyr Val Gln Val Arg Glu Ala835 840 845Leu Glu Ile His Val Asn Pro Asn Tyr Asp Pro Gly Asn Leu Asn Phe850 855 860Asp Ile Ala Leu Ile Gln Leu Lys Thr Pro Val Thr Leu Thr Thr Arg865 870 875 880Val Gln Pro Ile Cys Leu Pro Thr Asp Ile Thr Thr Arg Glu His Leu885 890 895Lys Glu Gly Thr Leu Ala Val Val Thr Gly Trp Gly Leu Asn Glu Asn900 905 910Asn Thr Tyr Ser Glu Thr Ile Gln Gln Ala Val Leu Pro Val Val Ala915 920 925Ala Ser Thr Cys Glu Glu Gly Tyr Lys Glu Ala Asp Leu Pro Leu Thr930 935 940Val Thr Glu Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Lys Gly Arg Tyr Asp945 950 955 960Ala Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Phe Ala Asp Asp Ser965 970 975
Arg Thr Glu Arg Arg Trp Val Leu Glu Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser980 985 990Pro Ser Gly Cys Gly Lys Ala Asn Gln Tyr Gly Gly Phe Thr Lys Val995 10001005Asn Val Phe Leu Ser Trp Ile Arg Gln Phe Ile1010101權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)內(nèi)毒素的試劑，含有純化的鱟因子C蛋白；和表面活性劑。
2.權(quán)利要求1的試劑，其中所述表面活性劑選自(I)下式代表的兩性表面活性劑 其中R1是具有1-4個(gè)碳原子的亞烷基；Y和Y′各自是(1)氫，(2)低級(jí)烷基，或(3)羥基低級(jí)烷基；R2和R3各自是(1)低級(jí)烷基或(2)羥基低級(jí)烷基；n是0或1，當(dāng)n是0時(shí)，R4是具有大約8至大約18個(gè)碳原子的烷基；當(dāng)n是1時(shí)，R4是具有1至大約6個(gè)碳原子的亞烷基；R5是具有大約8至大約18個(gè)碳原子的烷基；和M是氫，鈉，鉀或銨；(II)下式代表的陰離子表面活性劑(R6)n1-(Y)Ar(SO3M)n2(E)R5OSO3M (F)其中R5，Y，和M具有上面給出的相同的定義；R6是8-24個(gè)碳原子的烷基；nl是1-3的整數(shù)；n2是1或2；和Ar是苯基或萘基；(III)下式代表的陽離子表面活性劑 其中R5，Y，和Y′具有上面給出的相同的定義；(IV)下式代表的非離子型表面活性劑R5R7R8N→O(H)其中R5具有上面給出的相同的定義，R7和R8各自是甲基或乙基；和(V)選自大約10-30摩爾的環(huán)氧乙烷與具有6個(gè)碳原子的六元醇和具有10-20個(gè)碳原子的酯基的單酯的縮合產(chǎn)物的那些非離子型表面活性劑。
3.權(quán)利要求1的試劑，其中所述鱟是Limulus polyphemus。
4.權(quán)利要求1的試劑，其中所述鱟是Carcinoscorpiusrotundicauda。
5.權(quán)利要求1的試劑，其中所述鱟是Tachypleus tridentatus。
6.權(quán)利要求1的試劑，其中所述鱟是Tachypleus gigas。
7.權(quán)利要求1的試劑，其中所述因子C蛋白通過在將因子C蛋白表達(dá)到上清液中的條件下在上清液中培養(yǎng)包含編碼因子C蛋白的載體的宿主細(xì)胞的方法來制備。
8.權(quán)利要求7的試劑，其中所述宿主細(xì)胞是Sf9細(xì)胞。
9.權(quán)利要求7的試劑，其中所述鱟是Carcinoscorpiusrotundicauda。
10.權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的試劑，其中所述表面活性劑選自ZWITTERGENT 3-14，Triton X-100，TritonX-114，辛基-β-D-硫代糖苷，Genapol C-100，Tween 20和Tween80。
11.一種測(cè)定試驗(yàn)樣品中內(nèi)毒素的方法，包括步驟使試驗(yàn)樣品接觸(1)含有(a)純化鱟因子C蛋白和(b)表面活性劑和(2)因子C底物的試劑，其中因子C底物的裂解產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，從而形成接觸過的試驗(yàn)樣品，形成試驗(yàn)樣品-試劑-底物混合物；和測(cè)定接觸過的試驗(yàn)樣品存在或不存在可檢測(cè)信號(hào)，其中可檢測(cè)信號(hào)的量相對(duì)于不含有內(nèi)毒素的對(duì)照樣品有所增加從而表明試驗(yàn)樣品中存在內(nèi)毒素。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述鱟是Limulus polyphemus。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述鱟是Carcinoscorpiusrotundicauda。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述鱟是Tachypleus tridentatus。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述鱟是Tachypleus gigas。
16.權(quán)利要求11的方法，其中所述因子C蛋白通過下面的方法制備在因子C蛋白被表達(dá)到上清液中的條件下在上清液中培養(yǎng)包含編碼因子C蛋白的載體的宿主細(xì)胞。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述宿主細(xì)胞是Sf9細(xì)胞。
18.權(quán)利要求15的方法，其中所述鱟是Carcinoscorpiusrotundicauda。
19.權(quán)利要求11-18中任一項(xiàng)的方法，其中所述表面活性劑選自ZWITTERGENT 3-14，Triton X-100，TritonX-114，辛基-β-D-硫代糖苷，Genapol C-100，Tween 20和Tween80。
20.權(quán)利要求11的方法，其中所述因子C底物選自N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素和N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素。
21.一種檢測(cè)試驗(yàn)樣品中的內(nèi)毒素的方法，包括步驟使試驗(yàn)樣品接觸(1)一種試劑，該試劑含有(a)重組Carcinoscorpiusrotundicauda因子C蛋白，其中所述因子C蛋白通過在將因子C蛋白表達(dá)到上清液中的條件下在上清液中培養(yǎng)包含編碼因子C蛋白的載體的宿主細(xì)胞的方法來制備和(b)表面活性劑和(2)N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素，從而形成接觸過的試驗(yàn)樣品；和測(cè)定接觸過的試驗(yàn)樣品存在或不存在熒光信號(hào)，其中熒光信號(hào)的量相對(duì)于不含有內(nèi)毒素的對(duì)照樣品有所增加從而表明試驗(yàn)樣品中存在內(nèi)毒素。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述宿主細(xì)胞是Sf9細(xì)胞。
23.一種檢測(cè)內(nèi)毒素的試劑盒，包括一種試劑，其含有(a)純化的鱟因子C蛋白和(b)表面活性劑，和對(duì)實(shí)施權(quán)利要求11的方法的說明書。
24.權(quán)利要求23的試劑盒，進(jìn)一步包括因子C底物，其中因子C底物的裂解產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。
25.權(quán)利要求24的試劑盒，其中所述因子C底物選自N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素和N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素。
26.權(quán)利要求23的試劑盒，其中所述純化的因子C通過在將因子C蛋白表達(dá)到上清液中的條件下在上清液中培養(yǎng)包含編碼因子C蛋白的載體的宿主細(xì)胞的方法來制備。
27.權(quán)利要求26的試劑盒，其中所述宿主細(xì)胞是Sf9細(xì)胞。
28.一種測(cè)定試驗(yàn)樣品中內(nèi)毒素的方法，包括步驟使試驗(yàn)樣品接觸一種試劑，該試劑含有(a)純化的鱟因子C蛋白和(b)表面活性劑，從而形成試驗(yàn)樣品-試劑混合物；試驗(yàn)樣品-試劑混合物與因子C底物接觸，其中因子C底物的裂解產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)；和測(cè)定接觸過的試驗(yàn)樣品-試劑混合物測(cè)定存在或不存在可檢測(cè)信號(hào)，其中可檢測(cè)信號(hào)的量相對(duì)于不含有內(nèi)毒素的對(duì)照樣品有所增加從而表明試驗(yàn)樣品中存在內(nèi)毒素。
29.一種測(cè)定試驗(yàn)樣品中內(nèi)毒素的方法，包括步驟使試驗(yàn)樣品接觸一種試劑，該試劑含有(a)重組Carcinoscorpiusrotundicauda因子C蛋白，其中所述因子C蛋白通過在將因子C蛋白表達(dá)到上清液中的條件下在上清液中培養(yǎng)包含編碼因子C蛋白的載體的宿主細(xì)胞的方法來制備，和(b)表面活性劑，從而形成試驗(yàn)樣品-試劑混合物；接觸試驗(yàn)樣品-試劑混合物與N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素；和測(cè)定接觸過的試驗(yàn)樣品-試劑混合物存在或不存在熒光信號(hào)，其中熒光信號(hào)的量相對(duì)于不含有內(nèi)毒素的對(duì)照樣品有所增加從而表明試驗(yàn)樣品中存在內(nèi)毒素。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有純化的鱟因子C，特別是重組制備的因子C，和表面活性劑的試劑可以在檢測(cè)內(nèi)毒素的靈敏，快速和可重復(fù)分析中使用。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1529711SQ02814296
公開日2004年9月15日 申請(qǐng)日期2002年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月28日
發(fā)明者L·陳, M·佩皮, L 陳 申請(qǐng)人:拜奧維塔克爾公司