專利名稱：利用來源于感染亞洲梨樹之新病原體Erwinia pyrifoliae WT#3的基因的新生物農(nóng)藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用來源于從Chunchon，Kangwon Province，Korea分離之新植物病原體Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM 10283)的基因的新生物農(nóng)藥。此病原體僅存在于韓國。這種新型生物農(nóng)藥具有比HrpN更有效的性能，例如，對植物疾病的抗性增強、植物生長促進(jìn)作用及驅(qū)蟲性，HrpN是從解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)(ATCC15580T)中分離的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白，在韓國不存在。因而，它可被用作有效防治由病原體和昆蟲引起的植物疾病并促進(jìn)植物生長的生物農(nóng)藥及肥料。
背景技術(shù)：
糧食短缺已經(jīng)顯現(xiàn)為目前全世界人民正面臨的最嚴(yán)重問題之一。然而，作物的產(chǎn)量已經(jīng)由于如病原體和昆蟲等病蟲害的爆發(fā)而大大降低。當(dāng)前，主要使用化學(xué)農(nóng)藥預(yù)防或控制害蟲的傳播。然而，其過度的和持續(xù)的應(yīng)用誘導(dǎo)了害蟲對這些化學(xué)農(nóng)藥的抗性，盡管快速的殺蟲效果可以通過采用更容易的噴霧方法來直接殺死害蟲而得到證明。此外，大部分有效的農(nóng)藥毒性強烈，已經(jīng)由于嚴(yán)重的土壤和水污染而導(dǎo)致了許多社會問題。因此，非常迫切需要開發(fā)一種有利于環(huán)境的生物農(nóng)藥，它不會誘導(dǎo)害蟲的任何抗性而又具有有效的殺蟲活性。
使用生物農(nóng)藥的一般目的是通過向植物直接應(yīng)用拮抗微生物本身去防治病蟲害，但這在害蟲的防治中不被認(rèn)為是非常有效的。因此，最近的研究已經(jīng)正在向通過利用拮抗微生物的產(chǎn)物來刺激植物的自身防御系統(tǒng)以防治病害蟲上發(fā)展，而不是利用微生物本身。換句話說，生物防治的根本目標(biāo)是通過用來源于微生物的物質(zhì)對植物進(jìn)行處理以激活植物的自身免疫功能來減少或預(yù)防害蟲。
植物的抗病主要通過植物憑借諸如表皮細(xì)胞中的角質(zhì)，蠟質(zhì)層和各種類型的多孔性等結(jié)構(gòu)障礙的防御體系來實現(xiàn)。當(dāng)植物病原體滲透到植物細(xì)胞中時，由植物分泌的諸如皂角苷或凝集素等化學(xué)物質(zhì)可以防止病原體群數(shù)量的增加[Agrios，G.N.1997.Plant Pathology.4th ed.Academic Press，New York；Dong，X.1998.SA.JA，乙烯及在植物中抗病性.Curr.Opin.Plant.Biol.1316-323；Feys，B.J.& Parker，J.E.2000.植物抗病中信號路徑的相互作用。Trends Genet.16339-455]。
從更本質(zhì)上講，植物的抗病性涉及到過敏反應(yīng)(HR)，它是防止病原體擴散的一種快速的局部壞死，這種壞死與植物利用某些來源于微生物的物質(zhì)來刺激其自身防御系統(tǒng)，以抵抗許多病原體的積極防御相關(guān)[Richberg，M.H.，Aviv，D.H.& Dangl，J.L.1998.死亡細(xì)胞在說話。Curr.Poin.PlantBiol.1480-485]。植物與HR誘導(dǎo)相關(guān)的抗病性的第一種方法是植物向鄰近感染細(xì)菌病原體的細(xì)胞啟動早期預(yù)警系統(tǒng)，以使其鄰近的細(xì)胞能夠增強對病原體的抗性。這種防御體系被稱為“LAR”(局部獲得性抗性)。
第二種方法是通過激活植物非感染部位的防御系統(tǒng)，從而激活對第二次感染更有效的防御系統(tǒng)。結(jié)果，整個植物都可以作為對抗病原體的更強大的防御系統(tǒng)。這種防御系統(tǒng)被稱為“SAR”(系統(tǒng)獲得性抗性)。SAR可以持續(xù)幾周或更長，使植物對許多其它無關(guān)病原體也表現(xiàn)出一定的抗性[Hunt，M.D.，Neuenschwander，U.H.，Delaney，T.P.，Weymann，K.B.，F(xiàn)riedrich，L.B.，Lawton，K.A.，Steiner，H.Y.和Ryals，J.A.1996.系統(tǒng)獲得抗性研究新進(jìn)展評述.Gene 17989-95]。
除此之外，也報道了對害蟲的ISR(誘導(dǎo)性全身抗性)和傷害反應(yīng)作為另一種植物抗性的類型[Pieterse，C.M.，van Wees，S.C.，vanPelt，J.A.，Knoester，M.，Laan，R.，Gerrits，H.，Weisbeek，P.J.和vanLoon，L.C.1998.控制擬南芥誘導(dǎo)性系統(tǒng)抗性的新信號路徑.PlantCell 101571-1580；Ryan，C.A.and Pearce，G.1998.SYSTEMIN植物防御基因的多肽信號.Annu.Rev.Cell Dev.Biol.141-17]。
植物的抗病機制由誘導(dǎo)植物防御系統(tǒng)的誘導(dǎo)物而啟動[Kessmann，H.，Staub，T.，Hofmann，C.，Maetzke，T.，Herzog，J.，Ward，E.，Uknes，S.和Ryals，J.1994.植物系統(tǒng)獲得抗病性的化學(xué)誘導(dǎo).Annu.Rev.Phytopathol.32439-459]。典型的SAR誘導(dǎo)物包括由植物產(chǎn)生的酚信號化合物SA(水楊酸)以及從病原體中分離的elicitin和harpin[Ponchet，M.，Panabieres，F(xiàn).，Milat，M.L.，Mikes，V.，Montillet，J.L.，Suty，L.，Triantaphylides，C.，Tirilly，Y.and Blein，J.P.1999.誘導(dǎo)素是植物-卵菌通信中的密碼嗎.Cell Mol.Life Sci.561020-1047]。
Harpin是由植物致病菌hrp基因島(gene island)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)之總稱，其中一種Harpin，稱為HrpN，是由hrpN基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，此基因位于解淀粉歐文氏菌的約40kb的hrp基因島中，而解淀粉歐文氏菌在韓國是不存在的。當(dāng)以HrpN接種宿主植物，例如蘋果時，它起致病因子的作用。相反，當(dāng)以HrpN接種非宿主植物時，它被植物視為外源化合物從而誘出HR。
HrpN是一種酸性的熱穩(wěn)定(100℃)蛋白質(zhì)，其分子量為44kDa[分子量測定的方法是進(jìn)行丙稀酰胺凝膠電泳后，蛋白質(zhì)以0.025％的考馬斯蘭R-250染色，并與Bio-Rad公司(Catalog#161-0305，Bio-RadLaboratories，2000 Alfred Nobel Drive Hercules，CA 94547，USA)的分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較]，富含甘氨酸而不含半胱氨酸[Zhong-Min，W.，Laby，R.J.，Zumoff，C.H.，Bauer，D.W.，He，S.Y.，Collmer，A.andBeer，S.V.1992.harpin，植物病原體解淀粉歐文氏菌產(chǎn)生的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物.Science 25785-88；US Pat.Nos.6,001,959，5,850,015，6,172,184-B1，6,174,717-B1，5,849,868，6,977,060，5,859,324，和5,776,889；韓國已審專利申請Nos.1999-022577，2000-075771，2000-070495，和2000-057395]。
這些植物防御誘導(dǎo)物已經(jīng)通過各種制劑而銷售。由于SA(水楊酸)已經(jīng)被報道為SAR誘導(dǎo)物，發(fā)現(xiàn)與SA具有類似結(jié)構(gòu)的INA(2，6-二氯異煙酸)和BTH(苯并噻二唑)誘導(dǎo)SAR并被成功地注冊為植物激活劑。目前，ActigardTM和BION已經(jīng)在美國和歐洲作為蔬菜、番茄和煙草的防病劑得到銷售。在日本，PBZ(噻菌靈(Probenazole))也被以商品名Oryzemate而得到銷售用于防治水稻稻瘟病和細(xì)菌性葉枯病[Yoshioka，K.，Nakashita，H.，Klessig，D.F.and yamaguchi，I.2001.噻菌靈以新作用方式誘導(dǎo)擬南芥系統(tǒng)獲得性抗性.Plant J.25149-157]。
HrpN，是一種非化學(xué)蛋白質(zhì)，首先在解淀粉歐文氏菌(Erwiniaamylovora)，一種導(dǎo)致薔薇科植物疫病的革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)。當(dāng)將其直接向植物噴霧時，它作為防治各種植物病害、幾種昆蟲、螨和線蟲的SAR誘導(dǎo)物而起作用，并通過增強光合作用與營養(yǎng)吸收而表現(xiàn)出促進(jìn)植物生長的效果[Dong，H.S.，Delaney，T.P.，Bauer，D.W.和Beer，S.V.1999.HrpN通過由水楊酸和NIM1基因介導(dǎo)的系統(tǒng)獲得抗性途徑誘導(dǎo)擬南芥抗病性.Plant J.20207-215]。HrpN毒性很小且由于其可以生物降解而不會產(chǎn)生任何環(huán)境污染，且它由于對甚至100℃煮沸的耐熱性而易于配制[Zhong-Min，W.，Laby，R.J.，Zumoff，C.H.，Bauer，D.W.，He，S.Y.，Collmer，A.和Beer，S.V.1992.Harpin，植物病原體解淀粉歐文氏菌產(chǎn)生的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物.Science 25785-88]。
因此，來源于解淀粉歐文氏菌的HrpN于2000年在美國被EdenBioscience公司以商品名Messenger成功商品化以防治諸如棉花、番茄、煙草、胡椒、黃瓜、草莓和小麥等作物的病害。它已經(jīng)被有效用作殺真菌劑、殺細(xì)菌劑、殺蟲劑及植物生長促進(jìn)劑[US Pat.Nos.6,174,717 B1，5,849,868，6,977,060，5,859,324，和5,776,889；KoreaExamined Pat.Appl.Nos.1999-022577，2000-075771，2000-070495，和2000-057395]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人在韓國Chunchon的梨園中，從正表現(xiàn)出壞死的植株上受感染的損傷部位中分離并鑒定出了一些細(xì)菌病原體，并發(fā)現(xiàn)了新的種Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM 10283)，它在形態(tài)學(xué)上不同于最近由德國研究者報道的Erwinia pyrifoliae，即Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM 10283)沒有鞭毛，而由德國研究小組報道的Erwiniapyrifoliae則具有周鞭毛。它也不同于已經(jīng)熟知的導(dǎo)致火疫病的解淀粉歐文氏菌。
在從新種Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM 10283)中分離出誘導(dǎo)非宿主植物過敏反應(yīng)的基因和蛋白質(zhì)后，注意到，這種蛋白質(zhì)被證明比來源于導(dǎo)致火疫病的解淀粉歐文氏菌的HrpN能更有效地賦予植物對病原體和昆蟲的抗病性及促進(jìn)植物生長。為此，我們完成了本發(fā)明。
從而，本發(fā)明的一個目的是提供一個新種Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM 10283)和來源于這種病原體的蛋白質(zhì)以作為一種有效的生物農(nóng)藥、植物生長激活劑、種子處理劑、驅(qū)蟲劑及肥料。
本發(fā)明另一方面是提供編碼Erwinia pyrifoliae中對植物非感染形式的蛋白質(zhì)或多肽之基因(KCCM 10282)，此基因在當(dāng)植物細(xì)胞與其接觸或以其處理時，誘導(dǎo)非宿主的過敏反應(yīng)或在植物中誘導(dǎo)對病原體的抗性。
本發(fā)明的另一方面是提供包含編碼來源于Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM 10283)的以對植物非感染形式存在的蛋白質(zhì)或多肽之基因(KCCM 10282)的轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明的另一方面是提供包含該蛋白質(zhì)或多肽及載體的生物農(nóng)藥組合物。
本發(fā)明的另一方面是提供能被作為農(nóng)藥、植物生長激活劑、種子處理劑、驅(qū)蟲劑和肥料施用給植物的組合物。
本發(fā)明的另一方面是提供通過從Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM 10283)和包含來自Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM 10283)的菌株(KCCM 10282)的植物HR誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中分離和純化蛋白質(zhì)或多肽，從而大規(guī)模生產(chǎn)誘導(dǎo)過敏反應(yīng)或抗性的蛋白質(zhì)或多肽的方法。
本發(fā)明的新型Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM 10283)是在Chun chon(Kangwon Prorince，Korea)的梨園中，從一株壞死植株受感染的莖分離的。此菌株被鑒定為歐文氏菌屬，與火疫病的致病病原體解淀粉歐文氏菌、及導(dǎo)致壞死病的Erwinia pyrifoliae(導(dǎo)致亞洲梨樹壞死病，1999年由德國研究小組報道的Erwinia pyrifoliae)同屬。解淀粉歐文氏菌和Erwinia pyrifoliae都是周鞭毛菌，然而我們的病原體Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM 10283)是無鞭毛的，表現(xiàn)出與在韓國僅發(fā)現(xiàn)的Erwinia pyrifoliae巨大的形態(tài)學(xué)差異。我們將此新型菌株命名為Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM 10283)，于2001年6月11日保藏于韓國微生物保藏中心，并分配以保藏號No.KCCM10283。
特別地，將從Erwinia pyrifoliaeWT#3中分離的編碼誘導(dǎo)非宿主植物中過敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)之基因與編碼被美國Cornell大學(xué)發(fā)現(xiàn)并由Eden Bioscience公司銷售的HrpN蛋白質(zhì)之基因進(jìn)行了比較。結(jié)果，我們的新基因表現(xiàn)出與編碼HrpN之hrpN基因的低相似性。值得注意的是，在來源于Erwinia pyrifoliaeWT#3、編碼誘導(dǎo)非宿主植物中過敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)之基因中，發(fā)現(xiàn)有核苷酸序列片段的若干插入，這在來源于解淀粉歐文氏菌的hrpN基因中是不存在的。更具體地講，這些核苷酸序列片段插入在位點222-230bp、249-263bp、348-371bp和397-411bp處。因此，由此基因表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽具有不同于HrpN肽的氨基酸序列和分子量。
構(gòu)建了包含來源于Erwinia pyrifoliaeWT#3的基因的高表達(dá)重組體pKEP3并向大腸桿菌(Escherichia coli)進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。此轉(zhuǎn)化體于2001年6月11日保藏于韓國微生物保藏中心，并分配以保藏號No.KCCM 10282。
誘導(dǎo)過敏反應(yīng)及抗病性的蛋白質(zhì)或多肽可以通過大量培養(yǎng)大腸桿菌重組體而獲得高產(chǎn)，此重組體包含表達(dá)載體，與來源于解淀粉歐文氏菌的HrpN相比，它具有更有效的性質(zhì)，諸如對植物疾病的增強抗性，促進(jìn)植物生長及驅(qū)蟲性。
結(jié)果，通過對誘導(dǎo)過敏反應(yīng)或植物抗病性之蛋白質(zhì)或多肽的生物活性進(jìn)行評估，證明了其在抗黃瓜白粉病、胡椒炭疽病、胡椒枯萎病、甜瓜(Oriental melon)霜霉病、甜椒(Sweet pepper)枯萎病及稻葉枯病(leaf blight)中具有比HrpN增強的有效性。此外，其對黃瓜、胡椒、甜椒及草莓產(chǎn)率的提高上也比HrpN蛋白強。來源于ErwiniapyrifoliaeWT#3的誘導(dǎo)非宿主植物中過敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽也在增強黃瓜和胡椒的光合作用和葉綠素含量上表現(xiàn)突出。因此，來源于Erwinia pyrifoliaeWT#3的蛋白質(zhì)或多肽能被作為農(nóng)藥、植物生長激活劑及肥料施用給植物。
除此之外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽能被以常規(guī)方法應(yīng)用于植物作為驅(qū)蟲劑(例如，蚜蟲)處理植物的莖和葉。此外，以本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽處理的稻種子在育秧期表現(xiàn)出快速生長。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽能被以常規(guī)方法應(yīng)用于植物作為驅(qū)蟲劑及種子處理劑。
附圖簡述

圖1顯示根據(jù)本發(fā)明的新Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM10283)、Erwinia pyrifoliaeEp16T和解淀粉歐文氏菌ATCC15580T的TEM(透射電子顯微鏡)照片。
圖2顯示Erwinia pyrifoliaeWT#3與解淀粉歐文氏菌ATCC15580T對溫度的生長曲線。
圖3顯示Erwinia pyrifoliaeWT#3與解淀粉歐文氏菌ATCC15580對pH值的生長曲線。
圖4顯示根據(jù)Biolog系統(tǒng)對Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM10283)進(jìn)行的數(shù)值分類。
圖5顯示本發(fā)明Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM 10283)基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)生分類。
圖6顯示本發(fā)明Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM 10283)的ITS區(qū)中tRNAAla編碼區(qū)的系統(tǒng)發(fā)生分類結(jié)果。
圖7顯示本發(fā)明Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM 10283)的ITS區(qū)中tRNAGlu編碼區(qū)的系統(tǒng)發(fā)生分類結(jié)果。
圖8顯示攜含5個質(zhì)粒的Erwinia pyrifoliae(WT#3、Ep1、Ep16)及攜含1個質(zhì)粒的解淀粉歐文氏菌(ATCC15580T、LMG1877、LMG1946)的質(zhì)粒圖譜分析[泳道11kb序列梯，2ErwiniapyrifoliaeEp1，3Erwinia pyrifoliaeEp16T，4Erwinia pyrifoliaeWT#3，5解淀粉歐文氏菌ATCC15580T，6解淀粉歐文氏菌LMG1877，7解淀粉歐文氏菌LMG1946]。
圖9顯示在煙草葉片上接種從Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM10283)構(gòu)建的基因組文庫克隆后24小時觀察到的過敏反應(yīng)[BMES緩沖液，C解淀粉歐文氏菌ATCC 15580T的植物HR誘導(dǎo)蛋白(HrpN)，1來源于1號克隆的植物HR誘導(dǎo)蛋白，2來源于2號克隆的植物HR誘導(dǎo)蛋白，3來源于pCEP33的植物HR誘導(dǎo)蛋白，4來源于4號克隆的植物HR誘導(dǎo)蛋白，以及NC來源于pLAFR3載體的蛋白質(zhì)]。
圖10顯示Erwinia pyrifoliaeWT#3基因組文庫克隆(pCEP33)中編碼植物HR誘導(dǎo)基因的物理圖譜。
圖11顯示本發(fā)明Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM 10283)編碼植物HR誘導(dǎo)蛋白之基因(KCCM 10282)與解淀粉歐文氏菌ATCC15580T的HR誘導(dǎo)基因(hrpN)間的基因比較[A來源于ErwiniapyrifoliaeWT#3的植物HR誘導(dǎo)基因，B來源于解淀粉歐文氏菌ATCC15580T的植物HR誘導(dǎo)基因(hrpN)]。
圖12顯示來自Erwinia pyrifoliaeWT#3的基因在質(zhì)粒載體pKEP3中表達(dá)的植物HR誘導(dǎo)蛋白(下文稱之為“Pioneer”)[M蛋白質(zhì)大小標(biāo)志，1Pioneer，41.1kD，2HrpN，39.7kD，3pET15b載體]。
圖13顯示Pioneer與來源于解淀粉歐文氏菌ATCC15580T的植物HR誘導(dǎo)蛋白(HrpN)氨基酸序列間的比較[APioneer，BHrpN]。
圖14顯示以不同濃度來源于Erwinia pyrifoliaeWT#3的Pioneer及來源于解淀粉歐文氏菌ATCC15580T(對照)的HrpN處理的煙草葉片上的HR。
圖15顯示分別接種Pioneer和緩沖液(對照)4天后未成熟梨果實表面上的疾病癥狀。
下列實施例用于舉例說明本發(fā)明，但不應(yīng)被認(rèn)為是將本發(fā)明的范圍限定為在此的化合物或?qū)嵤├薅ǖ姆秶?br> 實施例實施例1新菌株的分離與鑒定1)基于Schaad實驗指導(dǎo)和Bergey手冊的生理/生化測定為了從Chunchon(Kangwon Province，韓國)果園梨上受壞死病感染的受損部位鑒別病原體細(xì)菌，基于Schaad實驗指導(dǎo)[Schaad，N.W.1988.常見屬別的初步鑒定.In植物病原體細(xì)菌鑒定實驗指導(dǎo)，N.W.Schaad編.American Phytopathological Society，Minnesot.pp.44-59]及Bergey手冊[Lelliott，R.A.和Dickey，R.S.1984.Erwinia屬.InBergey系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊vol.1，pp.469-476，Williams and WillkinsCo.，Baltimore/London]進(jìn)行了不同的生理和生化測試，如下列表1所示。
表1

總體來說，分析結(jié)果顯示，對此菌株在生理測定(例如，明膠的液化、在3％瓊脂中的運動性及果膠酸酯的分解)上與Erwiniapyrifoliae菌株Ep16T中的接近。與此形成對照的是，對碳源利用的生化檢測揭示了不同的結(jié)果，尤其是海藻糖和L-阿拉伯糖，表明根據(jù)本發(fā)明分離的菌株之生理和生化特性與菌株Erwinia pyrifoliaeEp16T和解淀粉歐文氏菌ATCC15580T不同。
2)菌株WT#3的形態(tài)學(xué)特性在TEM(透射電子顯微鏡)中觀察到的菌株WT#3的形態(tài)學(xué)特性與最近報道的導(dǎo)致亞洲梨樹壞死病的Erwinia pyrifoliaeEp16T及導(dǎo)致蘋果和梨火疫病的解淀粉歐文氏菌ATCC15580T的不同[圖1]。
結(jié)果，歐文氏菌屬物種，包括Erwinia pyrifoliaeEp16T和解淀粉歐文氏菌ATCC15580T具有周鞭毛而成棒狀，而新菌株ErwiniapyrifoliaeWT#3無鞭毛而稍成橢圓棒狀。
3)在不同溫度條件下菌株WT#3的生長為了調(diào)查生理和生化特性，繪制了Erwinia pyrifoliaeWT#3在不同溫度條件下的生長曲線，生長情況采用Bioscreen根據(jù)濁度而測定。
每隔3℃在12℃至39℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行測量，計算ErwiniapyrifoliaeWT#3和解淀粉歐文氏菌ATCC15580T的倍增時間及在不同溫度下的比生長速率[圖2]。
結(jié)果顯示Erwinia pyrifoliaeWT#3具有比解淀粉歐文氏菌更高的生長速率(27-30℃)和更短的倍增時間。菌株WT#3的最適溫度為27℃。
在低于20℃的更低溫度下，Erwinia pyrifoliaeWT#3也顯示出比解淀粉歐文氏菌ATCC15580T更好的生長，表明Erwinia pyrifoliaeWT#3具有耐冷性，因為此病原體在Chunchan附近具有很好的適應(yīng)性。Chunchan是一個在冬季相對寒冷的地區(qū)并與解淀粉歐文氏菌ATCC15580T的環(huán)境條件不同。
4)菌株WT#3在不同pH值水平下的生長為了調(diào)查pH值對Erwinia pyrifoliaeWT#3生長的影響，采用Bioscreen C根據(jù)濁度測定其在不同pH值水平的生長。在恒溫28℃條件下在pH5.5至9.5的范圍內(nèi)每隔0.5進(jìn)行測定，并計算ErwiniapyrifoliaeWT#3和解淀粉歐文氏菌ATCC15580T的倍增時間和在不同pH值水平下的比生長速率[圖3]。
結(jié)果顯示Erwinia pyrifoliaeWT#3的最適生長pH范圍為7.0至8.0，并在pH7.5的堿性條件下觀察到了其快速生長，這與解淀粉歐文氏菌ATCC15580T的不同。
5)采用Biolog系統(tǒng)分析菌株WT#3的特性應(yīng)用設(shè)計以檢測96種不同碳源和氮源利用的Biolog系統(tǒng)[BIOLOG，Hayward，CA 94545，USA]詳細(xì)調(diào)查菌株WT#3的生化特性。
在TSA(triptic soy瓊脂)中于28℃溫育24小時后，將分離的菌株懸浮于含0.4％NaCl，0.03％pluronic F-68和0.01％吉蘭糖膠的溶液中至濁度為63％并接種于包含96種不同碳源和氮源的孔室中。
然后，將菌株WT#3進(jìn)一步在35-37℃于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用示讀器記錄作為碳源和氮源利用的紫色變化，并將其值按數(shù)值進(jìn)行分類。
如圖4所示，屬于解淀粉歐文氏菌的菌株ATCC15580、LMG2068、LMG1877、LMG1946及ea246菌株(USA)被顯示為同組。與此對照的是，菌株WT#3位于Erwinia pyrifoliae(Ep4、Ep8、Ep16T)組中。因此，很清楚，菌株WT#3不同于火疫病病原體解淀粉歐文氏菌。
6)菌株WT#3中16S rRNA基因的分析為了調(diào)查菌株WT#3的系統(tǒng)發(fā)生，鑒于它為控制生命的基本成分，其核苷酸序列很保守并易于進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析的事實，對其16SrRNA基因的核苷酸序列進(jìn)行了分析。
使用fD1引物(SEQ.ID.NO.1)和rP2引物(SEQ.ID.NO.2)對16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴增，然而將其克隆到pGEM-T載體中以分析其核苷酸序列。
圖5顯示了采用mega程序繪制的基于16S rRNA核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)生樹[Kumar，S.，Tamura，K.and Nei，M.1993.MEGA分子進(jìn)化遺傳分析，version 1.0.The Pennsylvania State University，University Park]。
菌株WT#3分別與Erwinia pyrifoliaeEp16T和解淀粉歐文氏菌15580T具有98.9％和97.5％序列一致性的相似性，與解淀粉歐文氏菌相比更接近Erwinia pyrifoliae。表2顯示了每個菌株16S rRNA基因的相似性。
表2

同樣，16S rRNA基因的分析揭示了菌株WT#3屬于與Erwiniapyrifoliae同組而不同于解淀粉歐文氏菌ATCC15580T及幾年前報道的在韓國感染蘋果及梨的梨形腸桿菌(Enterobacter pyrinus)。
7)菌株WT#3 16S-23S ITS(基因間轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))的分析為了分析韓國來源病原體Erwinia pyrifoliae和國外來源病原體解淀粉歐文氏菌的ITS，采用R16-1F引物(SEQ.ID.NO.3)和R23-1R引物(SEQ.ID.NO.4)對16S-23S ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴增，然而將其克隆到pGEM-T載體以分析16S-23S ITS區(qū)的核苷酸序列。
結(jié)果，16S-23S ITS區(qū)被分為2個組解淀粉歐文氏菌具有約1215、970和720bp大小的3種帶型，而本地病原體Erwinia pyrifoliae具有970和720bp大小的帶型。
目前，所有菌株被顯示為兩組分別為具有約70bp tRNAAla區(qū)的970bp帶型和具有tRNAGlu區(qū)的720bp帶型。
圖6顯示了通過分析菌株Erwinia pyrifoliaeWT#3和解淀粉歐文氏菌ATCC15580T16S-23S ITS區(qū)核苷酸序列而繪制的系統(tǒng)發(fā)生樹。
通過分析編碼70bp tRNAAla區(qū)的970bp帶的核苷酸序列，結(jié)果揭示菌株WT#3不同于解淀粉歐文氏菌組并與解淀粉歐文氏菌具有47.4％的相似性。然而，我們不能與德國研究者們命名的Erwiniapyrifoliae的tRNAAla區(qū)進(jìn)行比較，因為它還沒在GenBank中注冊。
編碼tRNAGlu區(qū)的720bp帶的核苷酸序列的分析表明，菌株Erwinia pyrifoliaeWT#3具有與德國研究者們報道的Erwiniapyrifoliae具有85.2％-92.7％序列一致性，因而視為同組[圖7]8)根據(jù)質(zhì)粒圖譜分析Erwinia pyrifoliaeWT#3將韓國來源的Erwinia pyrifoliae和國外來源的解淀粉歐文氏菌分為以下兩組[圖8]。
組I解淀粉歐文氏菌(ATCC15580、LMG1877、10296)(一個大于29kb質(zhì)粒)。
組IIErwinia pyrifoliae(WT#3、Ep1、Ep16)(一個大于29kb質(zhì)粒，一個5kb質(zhì)粒及3個2-4kb大小的質(zhì)粒)。
即亞洲梨樹上的包括菌株WT#3的壞死病病原體Erwiniapyrifoliae包含5個質(zhì)粒，而火疫病病原體解淀粉歐文氏菌則僅包含1種質(zhì)粒。
9)根據(jù)DNA-DNA雜交的DNA相關(guān)性分析調(diào)查韓國來源的Erwinia pyrifoliae和國外來源的解淀粉歐文氏菌間的全基因組相關(guān)性。
將分離純化的總DNA溶于100μl TE緩沖液中至濃度為1ng/μl，加入10N NaOH，然后于80℃煮沸變性10分鐘。采用slot-blot裝置將變性DNA轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜上。用作探針的天然DNA用Dig-High Prime[Roche Molecular Biochemicals，Sandhofer Strasse116，德國]以DIG 11-dUTP標(biāo)記，在存在已經(jīng)固定于尼龍膜的DNA情況下于49℃預(yù)雜交3小時，然后于同樣溫度下雜交16小時。采用DIG Luminescent Detection Kit[Roche Molecular Biochemicals，Sandhofer Strasse 116，德國]進(jìn)行膜的顯色。
結(jié)果顯示，國外來源的解淀粉歐文氏菌(ATCC15580T，LMG1877，LMG1946，LMG2068)屬于組I，而韓國來源的Erwinia pyrifoliae(WT#3、Ep16T)則屬于組II。
更具體地講，國外來源的病原體解淀粉歐文氏菌屬于組I而韓國來源的病原體Erwinia pyrifoliae屬于組II。此結(jié)果清楚表明包括菌株WT#3的韓國病原體Erwinia pyrifoliae與國外病原體解淀粉歐文氏菌明顯不同，表明Erwinia pyrifoliae是韓國本地的。下列表3顯示了相關(guān)菌株的相似性。
表3

以上菌株WT#3的生理、生化和遺傳特性顯示，根據(jù)基于Schaad實驗指導(dǎo)和Bergey手冊的生理和生化特性、溫度和pH水平相關(guān)特性、Biolog system、16S rRNA基因、16S-23S ITS、質(zhì)粒圖譜及DNA-DNA雜交相關(guān)性，菌株WT#3屬于Erwinia pyrifoliae組，Erwinia pyrifoliae僅于1999年在韓國存在，盡管在Erwinia pyrifoliaeWT#3和Ep16T之間還存在其它幾種不同特性。
然而，由于菌株WT#3在形態(tài)學(xué)上不具有在歐文氏菌屬中最初報道的鞭毛，它看起來不同于那些由德國研究者報道的Erwiniapyrifoliae及解淀粉歐文氏菌。
我們將菌株WT#3命名為Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM10283)并于2001年6月11日保藏于韓國微生物保藏中心。保藏號為KCCM 10283。同樣，構(gòu)建了包含來源于Erwinia pyrifoliaeWT#3的基因的高表達(dá)重組體pKEP3并向大腸桿菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。此轉(zhuǎn)化體于2001年6月11日保藏于韓國微生物保藏中心，并分配以保藏號No.KCCM 10282。
實施例2來自Erwinia pyrifoliaeWT#3的觸發(fā)植物過敏反應(yīng)的特定蛋白質(zhì)及其編碼基因的特性1)來自Erwinia pyrifoliaeWT#3的植物HR誘導(dǎo)基因的分析為了分析編碼誘導(dǎo)植物過敏反應(yīng)的特定蛋白質(zhì)的基因，將ErwiniapyrifoliaeWT#3的總DNA于37℃溫育以保證其被Sau3 AI部分消化。然后每隔1小時取1μl DNA電泳檢測是否適當(dāng)?shù)叵?，結(jié)果表明約6小時的消化最適合。經(jīng)過這樣處理的總DNA被預(yù)備作為插入DNA并使用DNA連接酶于14℃溫育12小時而連接到克隆載體pLAFR3的BamHI多接頭位點。將完整的連接有插入DNA及載體的質(zhì)粒DNA通過CaCl2轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(HB101)。然后，將大腸桿菌菌株于37℃在含有四環(huán)素(30mg/ml)的Luria瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時，由此獲得了2000個基因組文庫克隆。
為了從Erwinia pyrifoliaeWT#3的2000個基因組DNA文庫克隆中選擇編碼誘導(dǎo)植物過敏反應(yīng)的特定蛋白質(zhì)之克隆，按以下方法從每個克隆提取總蛋白質(zhì)。將于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時的溶液離心以收獲沉淀，在沉淀懸浮于包含5mM MES緩沖液和0.1mM PMSF的混合物中后，以超聲裂解混合物并100℃煮沸10分鐘。然后，收集離心后的上清液并利用注射器注射到煙草(Nicotiana tabacum L.Samsun)葉背面，這些煙草長有4片以上的真葉，每一片葉子直徑大于15cm。注射后24小時煙草葉子的壞死被視為HR，然后選擇顯示HR的基因組DNA文庫克隆[圖9]。
將所選定的克隆pCEP33中包含HR誘導(dǎo)基因的8.5kb DNA片段克隆到pUC19載體并利用限制性核酸內(nèi)切酶構(gòu)建物理圖譜[圖10]。
圖11通過分析選定基因的核苷酸序列，比較了本發(fā)明來自ErwiniapyrifoliaeWT#3(KCCM10283)的植物HR誘導(dǎo)蛋白的編碼基因(KCCM 10282)與來自解淀粉歐文氏菌ATCC15580T的HR誘導(dǎo)基因(hrpN)。
從本發(fā)明的Erwinia pyrifoliaeWT#3中，可以獲得編碼植物過敏反應(yīng)蛋白質(zhì)的1287bp基因。這1287bp基因被命名為“WT#3的植物HR誘導(dǎo)基因”并調(diào)查了其與解淀粉歐文氏菌ATCC15580T的hrpN基因(1212bp)的相似性。
結(jié)果表明，有5個新核苷酸序列片段插入到WT#3的植物HR誘導(dǎo)基因的如下位點222-230bp(TTTAACGGG)，249-263bp(TGGCGGCGGTCTGCT)，327-333bp(TCTGGGT)，348-371bp(CGGCATTGGCGGCGGCATTGGTGG)，及397-411bp(ACCGTGGGGACCTCT)，因而使此基因的分子量增加。WT#3的植物HR誘導(dǎo)基因與解淀粉歐文氏菌的hrpN基因具有83.2％同源的低序列相似性。
因此，證明了編碼Erwinia pyrifoliaeWT#3的植物HR-誘導(dǎo)蛋白的基因具有不同于解淀粉歐文氏菌的hrpN基因的核苷酸序列，并包含新核苷酸序列片段的插入，因此表明WT#3的植物HR誘導(dǎo)基因具有在解淀粉歐文氏菌的hrpN基因中沒有的新基因結(jié)構(gòu)。
Erwinia pyrifoliaeWT#3的植物HR誘導(dǎo)蛋白的編碼基因之核苷酸序列見SEQ.ID.No.5。
2)構(gòu)建Erwinia pyrifoliaeWT#3的植物HR誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)載體為了通過Erwinia pyrifoliaeWT#3的植物HR誘導(dǎo)基因大規(guī)模提取和純化植物過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白，按下文構(gòu)建了包含此基因的表達(dá)載體pKEP3應(yīng)用大腸桿菌重組蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)(Novagen，Inc.Madison，WI53711 USA)構(gòu)建表達(dá)載體pKEP3。此系統(tǒng)來源于pBR322質(zhì)粒，其中在外源基因插入位點之前，T7啟動子和操縱基因能與lac阻遏物結(jié)合。該結(jié)構(gòu)能容易地通過宿主大腸桿菌基因組產(chǎn)生的T7 RNA聚合酶利于插入基因的大量表達(dá)。特別地，當(dāng)在孵育3小時后加入IPTG底物時，lacI基因產(chǎn)生的Lac阻遏物與IPTG的結(jié)合不阻遏T7 RNA聚合酶的表達(dá)，從而使蛋白質(zhì)大量合成。為了選擇完全轉(zhuǎn)化體，構(gòu)建包含氨芐青霉素抗性基因的pKEP3，氨芐青霉素可被用于培養(yǎng)基中作為一種選擇標(biāo)記。將編碼Erwinia pyrifoliaeWT#3的植物HR誘導(dǎo)蛋白的基因及重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒以限制性核酸內(nèi)切酶NdeI和BamHI于37℃消化12小時以產(chǎn)生同樣的5′-和3′-末端。然而利用DNA連接酶于14℃經(jīng)過16小時將它們連接到限制位點，并采用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中。
pKEP3具有許多優(yōu)點(1)氨芐青霉素抗性基因可用作選擇標(biāo)記，(2)它擁有His標(biāo)簽，使其更易于純化，(3)它擁有T7 Lac強啟動子，可保證由連接的插入DNA產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)。
包含表達(dá)載體pKEP3的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體于2001年6月11日在韓國微生物保藏中心保藏，保藏號為KCCM 10282。
在本發(fā)明中，采用同樣的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)(Novagen，Inc.，Madison，WI 53711，USA)克隆解淀粉歐文氏菌ATCC15580T中的hrpN基因，并用作pKEP3的生物學(xué)檢測的對照，pKEP3包含來自Erwinia pyrifoliaeWT#3的新植物HR誘導(dǎo)基因。
3)植物HR誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)為了從包含pKEP3的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體(KCCM 10282)產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)，將細(xì)菌細(xì)胞接種于LB培養(yǎng)基中，并通過加入氨芐青霉素(50ug/ml)作為選擇標(biāo)記以及加入氯霉素(33ug/ml)以抑制大腸桿菌基因組產(chǎn)生的其它蛋白質(zhì)的合成，并于37℃繼代培養(yǎng)12小時。然后利用同樣的培養(yǎng)基將本發(fā)明的細(xì)菌轉(zhuǎn)化體(KCCM 10282)于30℃培養(yǎng)7小時，在培養(yǎng)約3小時后轉(zhuǎn)化體(KCCM 10282)的OD值達(dá)到0.6時，在培養(yǎng)物中加入0.4mM IPTG并冷卻到30℃，然后再培養(yǎng)4小時。在總共培養(yǎng)7小時后，將混合物于6000rpm離心15分鐘。然后棄去上清液并以包含5mM MES緩沖液及0.1mM PMSF的溶液懸浮沉淀。以超聲波法裂解轉(zhuǎn)化體(KCCM 10282)的懸浮液直到懸浮液變得透明，然后于100℃煮沸10分鐘。然后，將混合物于15,000rpm離心10分鐘并棄掉上清液。在以1/1000的比率加入蛋白質(zhì)抑制劑混合物后，以0.45um的濾膜過濾混合物并精確稱量蛋白質(zhì)。
經(jīng)過上述處理后，從編碼Erwinia pyrffoliaeWT#3植物HR誘導(dǎo)基因(KCCM 10282)的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的植物HR誘導(dǎo)蛋白被命名為“Pioneer”。
根據(jù)本發(fā)明，采用同樣的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)(Novagen，Inc.Madison，WI53711 USA)克隆解淀粉歐文氏菌ATCC15580T中的hrpN基因，并作為Pioneer的生物測定的對照。
如圖12所示，證明了采用重組體蛋白表達(dá)系統(tǒng)，編碼植物HR誘導(dǎo)蛋白的基因Erwinia pyrifoliaeWT#3和解淀粉歐文氏菌ATCC15580T都成功得到了表達(dá)并合成了大量植物HR誘導(dǎo)蛋白。
4)植物HR誘導(dǎo)蛋白(Pioneer)的相似性分析通過分析純化Pioneer的氨基酸序列比較Pioneer與解淀粉歐文氏菌中HR誘導(dǎo)蛋白的相似性[圖13]。
結(jié)果，注意到Pioneer的蛋白質(zhì)新結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生于N末端位點76-79(Thr-Gly-Leu-Leu)，88-92(Leu-Gly-Gly-Gly-Ser)，102-113(Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Ser-Thr)，和131-137(Gly-Ala-Thr-Val-Gly-Thr-Ser)處。
Pioneer具有與HrpN 85.9％同源的低氨基酸序列一致性。Pioneer的分子量為41.4kD，與此比較的HrpN為39.7kD。Pioneer和HrpN的分子量都沒有在丙烯酰胺凝膠中與分子量標(biāo)準(zhǔn)比較，而是采用Winstar程序從基因的核苷酸序列推測的每個氨基酸的分子量。
因此，Pioneer由于新肽域的插入而成為新型蛋白質(zhì)，預(yù)期這樣的差異會導(dǎo)致許多改進(jìn)的生物學(xué)活性，這在HrpN中沒有。
5)植物HR誘導(dǎo)蛋白(Pioneer)的過敏反應(yīng)直到最近，植物HR誘導(dǎo)蛋白被認(rèn)為是宿主植物中的致病因子，但誘導(dǎo)非宿主植物中的HR。
采用注射器將來源于Erwinia pyrifoliaeWT#3的Pioneer及來源于解淀粉歐文氏菌ATCC15580T的HrpN接種于煙草(非宿主植物)葉片上，并同時接種MES緩沖液(蛋白質(zhì)裂解緩沖液)以作為對照[圖14]。
如圖14所示，很顯然，Pioneer和HrpN分別于10ug/ml和20ug/ml的劑量在煙草葉正面表現(xiàn)出明顯的HR，在同一煙草葉片背面，Pioneer和HrpN分別于5ug/ml和10ug/ml的劑量表現(xiàn)出明顯的HR。這反應(yīng)了Pioneer可在比HrpN相對低的濃度誘導(dǎo)HR。
如下列表4所示，表明當(dāng)Pioneer以5ug/ml和10ug/ml接種時，分別于接種后24小時和14小時觀察到明顯的HR，然而HrpN在同樣濃度下分別于接種后48小時和18小時誘導(dǎo)明顯的HR。這表明在5ug/ml時Pioneer表現(xiàn)出HR比HrpN快24小時，而在10μg/ml時Pioneer表現(xiàn)出HR比HrpN快4小時。
該實驗重復(fù)進(jìn)行3次，結(jié)果表明，Pioneer在比HrpN更低的劑量比HrpN更快地誘導(dǎo)植物免疫系統(tǒng)。
表4

6)植物HR誘導(dǎo)蛋白(Pioneer)對梨的致病性試驗將純化的Pioneer以500ug/ml的劑量通過打洞(直徑0.5mm，深10mm)接種到未成熟果實的表面。
如圖15所示，與對照相比，處理后4天，未成熟果實作為進(jìn)行性癥狀變黑。因此，盡管還需進(jìn)一步研究，Pioneer可能對梨具有強致病性。
如上所述，Pioneer及其編碼基因的特性可總結(jié)如下(1)編碼Pioneer的基因顯示出幾個新核苷酸序列片段插入到Pioneer基因的幾個位點中，這在hrpN基因中沒有發(fā)現(xiàn)；Pioneer基因的大小為1287bp，與之對比的hrpN基因大小為1212bp。
(2)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上，具新肽域的Pioneer的分子量(41.4KD)比HrpN(39.7KD)的大[Pioneer和HrpN的分子量都沒有在丙烯酰胺凝膠中與分子量標(biāo)準(zhǔn)比較，而是采用Winstar程序從基因的核苷酸序列推測其每個氨基酸的分子量]。
(3)在煙草葉上所觀察的HR中，注意到Pioneer可以以比HrpN更低的劑量比HrpN更快地誘導(dǎo)植物免疫系統(tǒng)。
因此，很顯然Pioneer比解淀粉歐文氏菌中的HrpN更適合于開發(fā)更好的、誘導(dǎo)優(yōu)良HR的生物農(nóng)藥。
實施例3使用植物HR誘導(dǎo)蛋白(Pioneer)進(jìn)行的生物學(xué)活動研究1)對黃瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)的防治效果為了評估Pioneer對白粉病的防治效果，將編碼植物HR誘導(dǎo)蛋白的基因克隆到pKEP3載體中以純化該蛋白質(zhì)。
采用在農(nóng)場中盛行的常規(guī)“rain-protecting”(遮雨)方法栽培黃瓜?；?次重復(fù)隨機化完全區(qū)組設(shè)計，施用測試材料。以HR誘導(dǎo)蛋白Pioneer，按EDEN Bioscience公司的推薦劑量以20μg/ml處理黃瓜的莖和葉。
以同上劑量的EDEN Bioscience公司之Messenger作為對照，同時還按使用說明施用本地生產(chǎn)的Fenarimol(化學(xué)農(nóng)藥)作比較。處理方法如下(1)3次處理在白粉病(Sphaerotheca fuliginea)的早期階段以后，用Pioneer、Messenger及Fenarimol向黃瓜的莖和葉噴霧3次，每次間隔10天。
(2)4次處理在移植后的第7、21、35和49天，用Pioneer、Messenger和Fenarimol向黃瓜的莖和葉噴霧3次。
在處理后7天，基于下列標(biāo)準(zhǔn)(0沒發(fā)病；11-5％；25.1-20％；320.1-40％；4大于40％)衡量黃瓜從上部8葉到底部3葉的白粉病嚴(yán)重程度。
表5

如表5所示，預(yù)期Pioneer可用作優(yōu)良的農(nóng)藥，因為3次和4次處理表現(xiàn)出其與Messenger相比在防治效果上增加了122.6％和187.0％。
2)增加黃瓜產(chǎn)量為了確定Pioneer處理對黃瓜的增產(chǎn)效果，從移植前7天開始，以20μg/ml劑量的Pioneer處理黃瓜的莖和葉5次，每次間隔14天。此外，用對照HrpN按上述同樣劑量處理黃瓜的莖和葉。
用于本實驗的黃瓜于移植后第8、10、12、14、16、18、21、23、25和30天收獲。以黃瓜長度達(dá)20cm時可被出售作為判定標(biāo)準(zhǔn)，以可銷售率將結(jié)果顯示如下表6


*注可銷售果實/總果實根據(jù)上表，顯然，與沒經(jīng)處理的相比，經(jīng)Pioneer處理后可銷售率增加了8.1％；與經(jīng)HrpN處理的相比增加了4.6％。
因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作植物生長促進(jìn)劑和肥料。
3)增加黃瓜光合作用和葉綠素含量為了確定黃瓜的生理反應(yīng)，即在以Pioneer處理后，黃瓜光合作用和葉綠素含量的增加，從移植前7天開始，以20μg/ml劑量的Pioneer處理黃瓜的莖和葉5次，每次間隔14天。以對照HrpN按上述同樣劑量處理黃瓜的莖和葉。
用于本實驗的黃瓜于移植后第34、42和56天收獲，并使用便攜式光合測定儀(LCA-4系統(tǒng)，ADC BioScientific Ltd.，UNK；光源1,500μmole)和葉綠素測定儀(Chlorophyll meter SPAD-502，Minolta，日本)進(jìn)行測定。
表7

*注P，光合作用量；C，葉綠素含量根據(jù)上表，顯然，與沒經(jīng)處理的相比，黃瓜經(jīng)Pioneer處理后，光合作用和葉綠素的量分別增加了16.2％和5.4％；與HrpN相比，分別增加了9.8％和2.0％。
因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作植物生長促進(jìn)劑和肥料。
4)對胡椒枯萎病(Phytophthora capsici)的防治效果為了評估Pioneer對胡椒枯萎病(Phytophthora capsici)的防治效果，將編碼植物HR誘導(dǎo)蛋白的基因克隆到pKEP3載體中以純化該蛋白質(zhì)。采用在農(nóng)場中盛行的常規(guī)“open field culture(露地栽培法)”方法栽培胡椒。以10、20和40μg/ml劑量的Pioneer處理胡椒的莖和葉。以對照HrpN按上述同樣劑量處理胡椒的莖和葉。處理按如下進(jìn)行①在移植后第8天和第12天的間隔，以各自濃度的Pioneer和HrpN處理胡椒的莖和葉。以Phytophthora capsici(2×106個細(xì)胞/ml)接種經(jīng)如此處理的胡椒，在處理后63天測定其疾病嚴(yán)重程度。
表8

如表8所示，顯然，Pioneer(10μg/ml)比HrpN(40μg/ml)表現(xiàn)出更好的防治效果。
因此，Pioneer比HrpN蛋白質(zhì)能以更低的劑量有效地用作農(nóng)藥.
5)對胡椒炭疽病(Colletotrichum orbiculare)的防治效果為了評估Pioneer對胡椒炭疽病(Colletotrichum orbiculare)的防治效果，將編碼植物HR誘導(dǎo)蛋白的基因克隆到pKEP3載體中以純化此蛋白。采用在農(nóng)場中盛行的常規(guī)“露地栽培”方法栽培胡椒。從處理前7天開始，在移植后第14天，以10μg/ml劑量的Pioneer處理胡椒的莖和葉5次。以對照HrpN按上述同樣劑量處理胡椒的莖和葉。處理按如下進(jìn)行①在移植后第8天和第12天，以各自濃度的Pioneer和HrpN處理胡椒的莖和葉。在移植后的第20、27、34和40天，經(jīng)這樣處理后的移植的胡椒表現(xiàn)為健康和不健康的果實。
表9

如表9所示，Pioneer比HrpN表現(xiàn)出對胡椒炭疽病有高14.3％的更好防治效果。因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作農(nóng)藥。
6)增加胡椒產(chǎn)量為了確定Pioneer處理對胡椒的增產(chǎn)作用，在移植后第8和12天，以10μg/ml劑量的Pioneer噴霧胡椒的莖和葉5次。以對照HrpN按同樣劑量處理胡椒的莖和葉。處理按如下進(jìn)行①浸泡加噴霧方法于28℃將胡椒種子浸泡到10μg/ml劑量的Pioneer和HrpN中24小時。然后將這些胡椒種子播種到裝有土壤的盆中，生長46天后移植到露地。在移植后第8和12天，以Pioneer和HrpN蛋白質(zhì)噴霧胡椒的莖和葉。本試驗的胡椒在移植后第18、25、32、39和46天收獲。
表10

如表10所示，顯然，Pioneer表現(xiàn)出比HrpN增產(chǎn)22.7％。因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作植物生長促進(jìn)劑和肥料。
7)增加胡椒光合作用和葉綠素含量為了確定黃瓜的生理反應(yīng)，即在以Pioneer處理后，胡椒光合作用和葉綠素含量的增加，從處理前7天開始，以20μg/ml劑量的Pioneer處理胡椒的莖和葉5次，每次間隔14天。以對照HrpN按上述同樣劑量處理胡椒的莖和葉。
本實驗的胡椒于移植后第34、42和56天收獲，并使用便攜式光合測定儀(LCA-4系統(tǒng)，ADC BioScientific Ltd.，UNK；光源1,500μmole)和葉綠素測定儀(Chlorophyll meter SPAD-502，Minolta，Japan)進(jìn)行測定。
表11

*注P，光合作用量；C，葉綠素含量根據(jù)上表，顯然，與沒經(jīng)處理的相比，胡椒經(jīng)Pioneer處理后，光合作用和葉綠素含量分別增加了16.0％和6.7％；與HrpN相比，分別增加了7.5％和4.9％。
因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作植物生長促進(jìn)劑和肥料。
8)對甜瓜霜霉病(Pseudoperonospora cubensis)的防治效果為了評估Pioneer對甜瓜(Oriental melon)霜霉病(Pseudoperonospora cubensis)的防治效果，將編碼植物HR誘導(dǎo)蛋白的基因克隆到pKEP3載體中以純化該蛋白。以40μg/ml劑量的Pioneer處理甜瓜的莖和葉5次。以對照HrpN按上述同樣劑量處理甜瓜的莖和葉。處理按如下進(jìn)行①浸泡加噴霧方法將甜瓜種子浸泡到10μg/ml劑量的Pioneer和HrpN中24小時。然后將這些種子播種到盆中。在移植后第17和28天，以Pioneer和HrpN處理甜瓜的莖和葉。
②噴霧方法在移植后第17和28天，以Pioneer和HrpN處理甜瓜的莖和葉。
在處理后55天測定霜霉病嚴(yán)重程度。
表12

如表12所示，顯然，噴霧及浸泡加噴霧Pioneer分別表現(xiàn)出比HrpN高96.0％和44.6％的更好防治效果。因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作農(nóng)藥。
9)對甜椒枯萎病(Phytophthora capsici)的防治效果為了評估Pioneer對甜椒(Sweet peppers)枯萎病(Phytophthoracapsici)的防治效果，將編碼植物HR誘導(dǎo)蛋白的基因克隆到pKEP3載體中以純化該蛋白。
將甜椒移植到25cm的盆中并栽培于溫室。按EDEN Bioscience公司推薦的劑量，以20μg/ml劑量的Pioneer處理甜椒的莖和葉。以對照HrpN按同樣劑量處理甜椒的莖和葉。處理按如下進(jìn)行①在移植后第8天，以Pioneer和HrpN處理甜椒的莖和葉。以Phytophthora capsici(2×106個細(xì)胞/ml)接種如此處理的甜椒，在處理后45天測定疾病嚴(yán)重程度。
表13

如表13所示，顯然，Pioneer表現(xiàn)出比HrpN高87.1％的更好防治效果。
因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作農(nóng)藥。
10)增加甜椒產(chǎn)量為了確定Pioneer處理對甜椒的增產(chǎn)效果，從移植后8天，以40μg/ml劑量的Pioneer處理甜椒的莖和葉。以對照HrpN按同樣劑量處理甜椒的莖和葉。
將甜椒移植到25cm的盆中并栽培于溫室。對經(jīng)這樣處理后的甜椒，在移植后第41和45天進(jìn)行調(diào)查。
表14

如表14所示，顯然，Pioneer比HrpN對甜椒表現(xiàn)出高21.6％的增產(chǎn)效果。
因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作植物生長促進(jìn)劑和肥料。
11)提高草莓產(chǎn)量為了確定Pioneer處理對草莓的增產(chǎn)效果，以20μg/ml劑量的Pioneer處理栽培在溫室中的草莓的莖和葉。用對照HrpN按同樣劑量處理青椒(green pepper)的莖和葉。
在移植后第30、33、38、41、48和55天，收獲草莓并以總重量值(g)表示。
表15

如表14所示，顯然，Pioneer對草莓表現(xiàn)出比HrpN高13.8％的增產(chǎn)效果。
因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作植物生長促進(jìn)劑和肥料。
12)對水稻葉枯病(Magnaporthe grisea)的防治效果為了評估Pioneer對水稻葉枯病(Magnaporthe grisea)的防治效果，將編碼植物HR誘導(dǎo)蛋白的基因克隆到pKEP3載體中以純化此蛋白。
采用在農(nóng)場中盛行的常規(guī)“open field culture”方法栽培水稻。以10μg/ml劑量的Pioneer處理水稻的莖和葉，并于28℃浸泡24小時。將水稻種子播種于苗床，生長16天后移栽到測試圃。
然后，在第45和52天以Pioneer噴霧水稻的莖和葉。以對照HrpN按同樣劑量和前述方法處理水稻的莖和葉。在處理后85天測定疾病嚴(yán)重程度。
表16

如表16所示，顯然，Pioneer(10μg/ml)比HrpN(20μg/ml)表現(xiàn)出更好的防治效果。
因此，Pioneer比HrpN能以更低的劑量更有效地用作農(nóng)藥。
13)驅(qū)蚜蟲效果為了評估Pioneer對蚜蟲的驅(qū)蟲效果，將編碼植物HR誘導(dǎo)蛋白的基因克隆到pKEP3載體中以純化此蛋白。
選擇黃瓜作為蚜蟲的宿主植物。
采用在農(nóng)場中盛行的常規(guī)“遮雨”方法栽培黃瓜。以20μg/ml劑量的Pioneer處理黃瓜的莖和葉。以對照HrpN按同樣劑量處理黃瓜的莖和葉。
當(dāng)黃瓜的高度達(dá)到1m時，以Pioneer和HrpN處理黃瓜的莖和葉。在處理后7天，計算黃瓜上自然出現(xiàn)的蚜蟲數(shù)量。
表17

如表17所示，顯然，Pioneer比HrpN以低劑量產(chǎn)生高29.4％的更好驅(qū)蚜蟲效果。
因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作驅(qū)蟲劑。
14)在水稻育苗期促進(jìn)生長的效果為了確定Pioneer處理在水稻育苗期對生長的促進(jìn)效果，將編碼植物HR誘導(dǎo)蛋白的基因克隆到pKEP3載體中以純化此蛋白質(zhì)。
以稀釋在MES緩沖液中的10、20和40μg/ml劑量的Pioneer處理水稻的莖和葉，并于28℃浸泡24小時。將水稻種子播種于苗床，生長16天后移栽到測試圃。以對照HrpN按同樣劑量和前述方法處理水稻的莖和葉。
結(jié)果，觀察到以Pioneer處理時水稻育苗期生長更好，比未處理的高約3-4cm，比HrpN處理的高1cm。
更高劑量(40μg/ml)的Pioneer對更好地促進(jìn)水稻生長是必需的。因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作可促進(jìn)水稻種子生長的種子處理劑。
工業(yè)實用性如上所述，根據(jù)本發(fā)明的新Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM10283)得到了分離和鑒定，從此菌株的植物HR誘導(dǎo)基因(KCCM10282)翻譯而來的新蛋白質(zhì)(Pioneer)或多肽比來源于解淀粉歐文氏菌ATCC15580T中的HrpN在誘導(dǎo)植物抗性、促進(jìn)植物生長、驅(qū)昆蟲效果、提高光合作用和增加葉綠素含量及種子處理效果方面具有改進(jìn)的特性。前者比HrpN可以以更低劑量、更快地易于引起植物過敏反應(yīng)，因此，來源于Erwinia pyrifoliae WT#3(KCCM 10283)的此蛋白質(zhì)十分適合于開發(fā)新型及更好的誘導(dǎo)植物過敏反應(yīng)的生物農(nóng)藥。
因此，本發(fā)明在開發(fā)新型和改良的生物農(nóng)藥和肥料上具有優(yōu)勢。
序列表<110>Pioneer Co.，Ltd.
<120>利用來源于感染亞洲梨樹之新病原體Erwinia pyrifoliae WT#3的基因的新生物殺蟲劑<150>KR2001-0049047<151>2001-08-14<160>6<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>fD1引物<400>1agagtttgat cctggctcag t 21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>rP2引物<400>2acggctacct tgttacgact t 21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>R16-1F引物<400>3cttgtacaca ccgcccgtca 20
<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>R23-1R引物<400>4ggtacttaga tgtttcagtt c 21<210>5<211>1287<212>DNA<213>Erwinia pyrifoliae WT#3<400>5atgagtctga atacaagtgc gctgggagcg tcaacgatgc aaatttccat cggcggtgcg 60ggtggcggta acgggttgct gggtaccagt cgccagaatg cagggctggg tgaccattct120gcactgggtc tgggcggcgg caataacaat gatacggtca atcaactggc cggcatgctc180accggcatga tgatgatgat gagcatgatg ggcggtggtg gtttaacggg gctgctgggc240ggcggctttg gcggcggtct gctgggcggc ggttcaggtg gaggcctggg cggttcaggt300ggaggcctgg gcggtttggg cggcgatctg ggtagcacgc tgggcggcgg cattggcggc360ggcattggtg gtgcgttagg cggcccgttg ggtgcaaccg tggggacctc tctggggtcg420ggcatcgggg gcagcgccgc ttccggagtg ggttccgcgc tcgaccaggc gctgggtatt480aactcaacgt cccaaaacga cagctccacc tccggtacag attccagctc agactcgagc540gacccggtgc aacagctgat gaagatgttc agcgagataa tgcaaagcct gtttggcgag600gggcaagacg gtacacaaag cggttcttct gccggcaagc agccgaccga aggcgaacaa660agcgcctata aaaaaggcgt aagcgatgcg ctgtctgccc tgatgggtaa cggtttgagc720cagacccttg gcaacggcgg actggggggc ngtcaggggg ggagtgctgg cactggcctt780gacggttctg ggctgggcgg caaaggtttg caaaacctga gcgggccggt tgactaccag840cagttgggta acgccgtggg taccggtatc ggtatgaaag cgggcatcca ggcgctgaat900gatatcggta cgcacagtga cagctccacc cgttctttcg tcaataaagg cgaccgggcg960atggcgaagg aaattggcca gtttatggac cagtaccctg aagtgtttgg caagccgcag1020
taccagaaag ggccgggcca ggaagtgaaa acggatgata aatcctgggc aaaagcactg1080agcaagccgg atgacgacgg aatgacgccc gccagtatgg agcagttcaa caaggccaag1140ggcatgatca aaagcgccat ggcgggtgat accggtaacg gcaacctgca ggcgcgcggt1200gccggtggtt cttcgctggg tattgatgcc atgatggccg gtgacaccgt taacaatatg1260gcactgggca agctgggcgc ggcttaa1287<210>6<211>429<212>PRT<213>Erwinia pyrifoliae WT#3<400>6Met Ser Leu Asn Thr Ser Ala Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile Ser15 10 15Ile Gly Gly Ala Gly Gly Gly Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gln20 25 30Asn Ala Gly Leu Gly Asp His Ser Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn35 40 45Asn Asn Asp Thr Val Asn Gln Leu Ala Gly Met Leu Thr Gly Met Met50 55 60Met Met Met Ser Met Met Gly Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu Leu Gly65 70 75 80Gly Gly Phe Gly Gly Gly Leu Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Leu85 90 95Gly Gly Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Asp Leu Gly Ser100 105 110Thr Leu Gly Gly Gly Ile Gly Gly Gly Ile Gly Gly Ala Leu Gly Gly115 120 125Pro Leu Gly Ala Thr Val Gly Thr Ser Leu Gly Ser Gly Ile Gly Gly130 135 140Ser Ala Ala Ser Gly Val Gly Ser Ala Leu Asp Gln Ala Leu Gly Ile145 150 155 160Asn Ser Thr Ser Gln Asn Asp Ser Ser Thr Ser Gly Thr Asp Ser Ser165 170 175Ser Asp Ser Ser Asp Pro Val Gln Gln Leu Met Lys Met Phe Ser Glu180 185 190
Ile Met Gln Ser Leu Phe Gly Glu Gly Gln Asp Gly Thr Gln Ser Gly195 200 205Ser Ser Ala Gly Lys Gln Pro Thr Glu Gly Glu Gln Ser Ala Tyr Lys210 215 220Lys Gly Val Ser Asp Ala Leu Ser Ala Leu Met Gly Asn Gly Leu Ser225 230 235 240Gln Thr Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Gly Xaa Gln Gly Gly Ser Ala245 250 255Gly Thr Gly Leu Asp Gly Ser Gly Leu Gly Gly Lys Gly Leu Gln Asn260 265 270Leu Ser Gly Pro Val Asp Tyr Gln Gln Leu Gly Asn Ala Val Gly Thr275 280 285Gly Ile Gly Met Lys Ala Gly Ile Gln Ala Leu Asn Asp Ile Gly Thr290 295 300His Ser Asp Ser Ser Thr Arg Ser Phe Val Asn Lys Gly Asp Arg Ala305 310 315 320Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe325 330 335Gly Lys Pro Gln Tyr Gln Lys Gly Pro Gly Gln Glu Val Lys Thr Asp340 345 350Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met355 360 365Thr Pro Ala Ser Met Glu Gln Phe Asn Lys Ala Lys Gly Met Ile Lys370 375 380Ser Ala Met Ala Gly Asp Thr Gly Asn Gly Asn Leu Gln Ala Arg Glu385 390 395 400Ala Gly Gly Ser Ser Leu Gly Ile Asp Ala Met Met Ala Gly Asp Thr405 410 415Val Asn Asn Met Ala Leu Gly Lys Leu Gly Ala Ala Xaa420 42權(quán)利要求
1.有效防治植物疾病及促進(jìn)植物生長的歐文氏菌病原體ErwiniapyrifoliaeWT#3(KCCM 10283)。
2.來源于Erwinia pyrifoliae、編碼非感染形式的蛋白質(zhì)或多肽的基因(KCCM 10282)，當(dāng)植物細(xì)胞與所述基因接觸或以所述基因處理時，其在植物中誘導(dǎo)對害蟲的抗性或過敏反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的基因(KCCM 10282)，其中所述DNA分子具有No.5的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的基因，其中所述蛋白質(zhì)或多肽具有No.6的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的基因，其中所述Erwinia pyrifoliae為ErwiniapyrifoliaeWT#3(KCCM 10283)。
6.包含根據(jù)權(quán)利要求2的基因的表達(dá)系統(tǒng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述基因具有No.5的核苷酸序列。
8.包含根據(jù)權(quán)利要求2的基因的轉(zhuǎn)化體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)化體，其中所述轉(zhuǎn)化體選自由細(xì)菌和植物組成的組。
10.來源于Erwinia pyrifoliae的非感染形式的蛋白質(zhì)或多肽，其在與植物細(xì)胞接觸時，誘導(dǎo)植物中對病原體的抗性或過敏反應(yīng)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)或多肽，其中所述Erwinia pyrifoliae為Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM 10283)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)或多肽，其中所述蛋白質(zhì)或多肽具有No.6的核苷酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)或多肽，其中所述蛋白質(zhì)或多肽為重組體。
14.包含根據(jù)權(quán)利要求11的所述蛋白質(zhì)或多肽和載體的生物農(nóng)藥組合物。
15.利用根據(jù)權(quán)利要求11的所述蛋白質(zhì)或多肽及載體的農(nóng)藥。
16.利用根據(jù)權(quán)利要求11的蛋白質(zhì)或多肽及載體的植物生長促進(jìn)劑。
17.利用根據(jù)權(quán)利要求11的所述蛋白質(zhì)或多肽及載體的種子處理劑。
18.利用根據(jù)權(quán)利要求11的所述蛋白質(zhì)或多肽及載體的驅(qū)昆蟲劑。
19.利用根據(jù)權(quán)利要求11的所述蛋白質(zhì)或多肽及載體的肥料。
20.通過從Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM 10283)的培養(yǎng)物中及從包含來源于Erwinia pyrifoliaeWT#3(KCCM 10283)的菌株(KCCM 10282)之植物HR誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)化體中分離或純化所述蛋白質(zhì)或多肽，從而大規(guī)模生產(chǎn)誘導(dǎo)過敏反應(yīng)或抗性的蛋白質(zhì)或多肽的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用植物病原體的生物農(nóng)藥，更具體地講，涉及通過利用從WT#3(Erwinia pyrifoliaeWT#3)[KCCM 10283]中分離的基因、具有對植物病原體的增強抗性和促進(jìn)植物生長效果的生物農(nóng)藥，它優(yōu)于從解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)ATCC 15580中分離的植物敏感蛋白質(zhì)HrpH，因而可被用作肥料和生物農(nóng)藥。
文檔編號C12R1/18GK1582329SQ02814406
公開日2005年2月16日 申請日期2002年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月14日
發(fā)明者林春根, 許長鉉, 樸德煥, 裵后男, 趙埈模, 白秀真, 鄭千淳, 崔信建 申請人:派奧尼爾株式會社