專利名稱：誘導(dǎo)細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答的方法和用于該方法的重組猿猴腺病毒組合物的制作方法
本項(xiàng)工作得到國(guó)家衛(wèi)生研究院授予的P30 DK47757-08號(hào)和P01 HL 59407-02以及NIAID授予的AI 49766-01號(hào)基金的支持。美國(guó)政府享有本發(fā)明部分權(quán)利。
背景技術(shù)：
現(xiàn)已測(cè)試了人血清型5型重組腺病毒作為衍生自病毒、寄生蟲或腫瘤細(xì)胞的各種抗原的疫苗載體。結(jié)果是鼓舞人心的，因?yàn)镋1缺失的腺病毒重組體引發(fā)了針對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的免疫反應(yīng)。人血清型5型(Ad5)腺病毒是一種遍在的感冒病毒，它感染了生命第一年內(nèi)的大多數(shù)人。發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，已存在的對(duì)常見人血清型的免疫力降低了基于病毒同源血清型的腺病毒重組疫苗的效力。在一些情況下，這種效力降低可通過輸送更高劑量的人重組腺病毒來克服。然而，更高的劑量可能伴有其它不希望的副作用。
因此，需要有一種用來誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)所選分子的免疫反應(yīng)(免疫應(yīng)答)的組合物，從而避免目前的輸送方法所伴有的問題。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種方法，該方法通過靠重組猿猴腺病毒來向宿主輸送分子，從而優(yōu)先誘導(dǎo)針對(duì)異源分子的細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)。本發(fā)明者出人意料地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所用的重組猿猴腺病毒呈遞免疫原的方式與用相應(yīng)的人5型病毒來輸送免疫原相比，誘導(dǎo)出了明顯更強(qiáng)效的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。另外，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，重組黑猩猩腺病毒誘導(dǎo)出的α干擾素和β干擾素水平比人腺病毒高約5倍。
因此，本發(fā)明一方面提供了一種方法，該方法通過向?qū)ο筝斔蛿y帶所述分子的重組猿猴腺病毒，從而在對(duì)象中優(yōu)先誘導(dǎo)出針對(duì)異源分子的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。在一個(gè)理想的方案中，重組猿猴腺病毒是重組黑猩猩腺病毒株。
本發(fā)明另一方面提供了一種在對(duì)象中誘導(dǎo)出α干擾素和/或β干擾素反應(yīng)的方法，該方法是向該對(duì)象輸送重組猿猴腺病毒。
本發(fā)明還有一方面提供了一種用于誘導(dǎo)針對(duì)人免疫缺陷病毒的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的免疫原性組合物。該組合物含有重組猿猴腺病毒，該病毒包含編碼人免疫缺陷病毒-1的經(jīng)修飾的gag蛋白的最佳核酸序列以及生理上相容的載體。
本發(fā)明還有一方面提供了一種在哺乳動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)人免疫缺陷病毒的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的方法，該方法是給予該哺乳動(dòng)物本發(fā)明的免疫原性組合物。
本發(fā)明還有一方面提供了一種在哺乳動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)人乳頭瘤病毒的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的方法，該方法是給予該哺乳動(dòng)物重組猿猴腺病毒，該病毒編碼了衍生自人乳頭瘤病毒的免疫原性蛋白。
本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)可從下列發(fā)明詳述中輕而易舉地得知。


圖1總結(jié)了黑猩猩腺病毒C68基因組的基因組織結(jié)構(gòu)。在圖1A中，C68黑猩猩腺病毒的基因組用頂部的方框表示。反向末端重復(fù)序列用黑色陰影表示，早期區(qū)域用灰色陰影表示。方框上方的箭頭表示早期基因的表達(dá)方向。方框下的線條表示基因組被分為100個(gè)圖譜單位。線條下方的箭頭表示5個(gè)晚期基因區(qū)域和每個(gè)區(qū)域中編碼的蛋白。方框或箭頭下的數(shù)字表示每個(gè)區(qū)域的開頭(啟動(dòng)子或起始密碼子)和末端(典型的PolyA信號(hào))。*表示E2A晚期啟動(dòng)子。圖1B描述了PstI克隆。圖1C描述了BamHI克隆。圖1D描述了HindIII克隆。對(duì)于1B-1D，無陰影的區(qū)域表示片段被克隆到質(zhì)粒載體中(如表1所示)，而有陰影的區(qū)域表示限制性片段沒有被克隆。對(duì)于每個(gè)部分，片段名稱中大寫字母A表示最大的片段，片段的大小列于方框上方，片段的末端點(diǎn)列于方框下。
圖2提供了六鄰體蛋白的多序列對(duì)比。用CLUSTAL X比較黑猩猩腺病毒與高度相似的人腺病毒六鄰體的推導(dǎo)的氨基酸序列。左邊的區(qū)域顯示了血清型和亞型，其后是殘基數(shù)。數(shù)字指相對(duì)于翻譯起始點(diǎn)的氨基酸位置。與C68相似的氨基酸用灰色表示，相同的用黑色表示。環(huán)結(jié)構(gòu)域DE1和FG1中的7個(gè)超變區(qū)沿底部標(biāo)記，其對(duì)應(yīng)于序列對(duì)比中的下列Ad2序列HVR1，137-188；HVR2，194-204；HVR3，222-229；HVR4，258-271；HVR5，278-294；HVR6，316-327；和HVR7，433-465。這些序列的GenBank登錄號(hào)如下所示AAD03657(Ad4)，S37216(Ad16)，S39298(Ad3)，AAD03663(Ad7)和NP040525(Ad2)。
發(fā)明詳述將人重組腺病毒株5的免疫原性與黑猩猩腺病毒株68相比，兩者均表達(dá)了截短的gag序列，而黑猩猩腺病毒表現(xiàn)更強(qiáng)效。用表達(dá)綠色熒光蛋白和狂犬病病毒糖蛋白的重組黑猩猩腺病毒觀察到了類似的結(jié)果。重組黑猩猩腺病毒的這種較高能力很可能與較高的轉(zhuǎn)基因表達(dá)沒有關(guān)聯(lián)，因?yàn)檠芯渴怯肁d和黑猩猩重組病毒進(jìn)行的，這兩者攜帶了類似的表達(dá)盒，其中轉(zhuǎn)基因受早期巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的控制。本文提供的數(shù)據(jù)也表明，這不可能反映嗜性的差別，因?yàn)楹谛尚珊虯d5病毒均采用相同的細(xì)胞受體。然而，這些結(jié)果表明，本發(fā)明所用的重組黑猩猩腺病毒出入意料地具有與人腺病毒不同的佐劑活性。這一更佳的佐劑活性對(duì)于黑猩猩腺病毒誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因特異性免疫反應(yīng)的程度和動(dòng)力學(xué)具有深刻的影響。
較佳的是，這一較高的效力允許可以使用比人腺病毒輸送系統(tǒng)所需劑量更低的黑猩猩腺病毒。另外，本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，重組黑猩猩腺病毒誘導(dǎo)了比人腺病毒高約5倍水平的α干擾素和β干擾素。
另外，發(fā)現(xiàn)重組黑猩猩腺病毒對(duì)樹突細(xì)胞的能力與人5型腺病毒幾乎相同。猿猴腺病毒的這種能力以及出人意料的效力在誘導(dǎo)針對(duì)所選抗原的細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)以及治療需要增強(qiáng)α干擾素和/或β干擾素誘導(dǎo)的病癥提供了顯著的優(yōu)點(diǎn)。
I.重組猿猴腺病毒A.來源各種黑猩猩腺病毒序列的來源可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，10801University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209)和其它來源獲得。理想的黑猩猩病毒株是Pan5[ATCC VR-591]、Pan6[ATCC VR-592]和Pan7[ATCC VR-593]。特別理想的黑猩猩腺病毒株是黑猩猩腺病毒株Bertha或C1[ATCC No.VR-20]和黑猩猩腺病毒株P(guān)an9或CV68[ATCC VR-594]。為了方便起見，病毒CV68在本說明書全文中稱為“C68”。該病毒最初分離自受感染的黑猩猩的糞便[C1，Rowe等人，Proc.Soc.Exp.Med.，91260(1956)]或腸系膜淋巴結(jié)[C68，Basnight等人，Am.J.Epidemiol.，94166(1971)]。這些病毒株的序列以及腺病毒基因E1a，E1b，E2a，E2b，E3，E4，L1，L2，L3，L4和L5提供在美國(guó)專利6,083,716中，該專利納入本文作為參考。另外，非黑猩猩的猿猴腺病毒序列可用來制備本發(fā)明的重組載體。這些非黑猩猩的腺病毒包括從狒狒腺病毒株獲得的腺病毒[例如ATCC VR-275]、從獼猴分離獲得的腺病毒株[例如ATCC VR-209，ATCC VR-275，ATCC VR-353，ATCC VR-355]以及從非洲綠猴分離獲得的腺病毒株[例如ATCC VR-541；ATCC VR-941；ATCC VR-942；ATCC VR-943]。
本文所述的重組黑猩猩(或其它猿猴)腺病毒可含有衍生自一種或多種猿猴腺病毒株的腺病毒序列。這些序列可得自天然來源，用重組方法、合成方法或其它基因工程方法或化學(xué)方法制得。
B.重組猿猴腺病毒用于本發(fā)明的重組猿猴腺病毒是病毒顆粒，它由重組猿猴腺病毒序列以及其攜帶的異源分子和/或猿猴腺病毒衣殼蛋白組成。這些猿猴腺病毒，尤其是黑猩猩C68和C1序列，還可用來與其它猿猴以及非猿猴腺病毒一起形成雜交載體，以及形成假型重組病毒(即具有腺病毒載體的重組病毒，該載體攜帶了有包裝在猿來源的異源衣殼蛋白中的異源分子)。
1.重組猿猴腺病毒用于本發(fā)明的重組猿猴腺病毒至少含有用于復(fù)制和毒粒包殼所需的猿猴腺病毒順式元件，該順式元件側(cè)接于異源基因。即，該載體含有腺病毒的順式作用的5′反向末端重復(fù)序列(ITR)(其作為復(fù)制起點(diǎn))，天然的5′包裝/增強(qiáng)結(jié)構(gòu)域(含有包裝線性Ad基因組所需的序列和E1啟動(dòng)子所需的增強(qiáng)子元件)，異源分子和5′ITR序列。例如見美國(guó)專利6,023,975中關(guān)于制備“最少”的人腺病毒載體的技術(shù)(該專利納入本文作為參考)，很容易對(duì)其加以變化來用于重組猿猴腺病毒。
用于本發(fā)明的重組猿猴腺病毒可任選地含有上述最少猿猴腺病毒序列以外的序列。其它腺病毒載體的特征是具有修飾，這些修飾破壞了腺病毒表達(dá)一個(gè)或多個(gè)所選基因產(chǎn)物的能力。本文所用的術(shù)語(yǔ)“功能性缺失”就是用來描述這些修飾。這些“功能性缺失”通常采用的是病毒基因全部或部分缺失的形式。然而，這些功能性缺失也可采用移碼突變的形式。其它實(shí)現(xiàn)功能性缺失的合適操作對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
在特別佳的實(shí)施方案中，由于喪失表達(dá)腺病毒E1a和E1b的能力，猿猴腺病毒是復(fù)制缺陷型的(即E1a和E1b功能性缺失)。這些重組猿猴腺病毒也可在其它基因中具有功能性缺失。
例如，可從構(gòu)成重組病毒一部分的猿猴腺病毒序列中除去腺病毒的延遲早期基因E3。E3的功能對(duì)于產(chǎn)生重組腺病毒顆粒不是必需的。因此，為了包裝本發(fā)明所用的重組猿猴腺病毒，不必取代該基因產(chǎn)物的功能。
重組猿猴腺病毒也可構(gòu)建成具有E4基因的功能性缺失，但是可能需要保留E4ORF6的功能。本發(fā)明的其它載體在延遲早期基因E2a中有缺失。缺失也可在猿猴腺病毒基因組的晚期基因L1至L5中的任何部位。類似地，出于某些目的，中期基因IX和IVa2中的缺失可能是有用的。在其它結(jié)構(gòu)性或非結(jié)構(gòu)性腺病毒基因中可有缺失。上述缺失可個(gè)別采用，即，本發(fā)明所用的腺病毒序列中僅有E1缺失?；蛘?，可以任何組合方式使整個(gè)基因或其部分缺失以有效地破壞其生物活性。例如，在一個(gè)典型的載體中，腺病毒序列可以有E1基因和E4基因缺失，或E1、E2a和E3基因缺失，或E1和E3基因缺失，或E1、E2a和E4基因缺失，有或沒有E3缺失等等。這些缺失可與其它突變(如溫度敏感型突變)組合，以獲得所需的結(jié)果。
轉(zhuǎn)基因可插入猿猴腺病毒的任何缺失區(qū)域中?；蛘呷缧枰蓪⑥D(zhuǎn)基因插入已有的基因區(qū)域中，以破壞該區(qū)域的功能。
無論重組猿猴腺病毒是僅含最少的Ad序列還是含有整個(gè)Ad基因組而只有在E1和/或E3區(qū)域有功能性缺失，該重組病毒都含有猿猴腺病毒衣殼?；蛘?，在其它方案中，可在本發(fā)明方法中采用重組假型腺病毒。該假型腺病毒采用了猿猴腺病毒衣殼蛋白，衣殼中包裝了攜帶異源猿猴腺病毒序列或非猿猴腺病毒序列的核酸分子。本發(fā)明的這些重組猿猴腺病毒可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來制備。
C.重組病毒顆粒的制備合適的重組猿猴腺病毒的制備方法采用的是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，例如美國(guó)專利6,083,716中描述的方法。在構(gòu)建用于將異源分子輸送給對(duì)象(例如人、犬、貓或其它哺乳動(dòng)物)的重組猿猴腺病毒時(shí)，載體中采用腺病毒核酸序列可以從各種猿來源獲得。
含有猿(例如黑猩猩)腺病毒序列而缺少產(chǎn)生感染性重組病毒顆粒所需的猿猴腺病毒序列的載體可與輔助病毒或載體結(jié)合使用。輔助病毒提供了猿猴腺病毒病毒感染力和繁殖所需的基因產(chǎn)物。當(dāng)在功能性病毒載體中制作一個(gè)或多個(gè)猿猴腺病毒基因的選擇性缺失時(shí)，這些缺失的基因產(chǎn)物可在病毒載體產(chǎn)生過程中通過在所選的包裝細(xì)胞中繁殖該病毒來提供。
這樣，這些功能可由永久性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系來提供，這些細(xì)胞系提供了載體中缺少的而包裝卻需要的一些或全部腺病毒功能，例如E1a、E1b、E2a、E4 ORF6、VA RAN中的任一種。或者如果需要，可通過轉(zhuǎn)染或感染具有這些功能的構(gòu)建物來向包裝細(xì)胞提供所需的其它腺病毒功能?；蛘?，可以選擇腺病毒功能，使其允許將攜帶最小基因的病毒載體包裝入異源猿猴腺病毒衣殼蛋白中。在人假型腺病毒的技術(shù)已知的基礎(chǔ)上，利用猿(如C68)衣殼蛋白進(jìn)行“假型”的合適方法是不難明白的。例如見美國(guó)專利6,023,975。
將所選的腺病毒DNA序列、轉(zhuǎn)基因和其它載體元件裝配到各種中介質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒中，以及用質(zhì)粒和載體來產(chǎn)生重組病毒顆粒均采用常規(guī)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。這些技術(shù)包括常規(guī)的cDNA克隆技術(shù)(如課本[Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1998)]中所述)，使用腺病毒基因組的重疊的寡核苷酸序列，聚合酶鏈反應(yīng)以及提供所需核苷酸序列的任何合適的方法?？刹捎脴?biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染技術(shù)，如CaPO4沉淀技術(shù)。其它常規(guī)方法包括病毒基因組的同源重組，在瓊脂鋪層上產(chǎn)生病毒噬斑，以及測(cè)定信號(hào)產(chǎn)生的方法等。
例如，在構(gòu)建和裝配所需的含轉(zhuǎn)基因的穿梭質(zhì)粒后，將穿梭質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染入用于裝配的宿主細(xì)胞中。該宿主細(xì)胞具有任何缺少的腺病毒功能。輔助病毒和載體序列之間發(fā)生同源重組，使得載體中的腺病毒-轉(zhuǎn)基因序列復(fù)制并包裝到毒粒衣殼中，從而導(dǎo)致產(chǎn)生重組病毒顆粒。
較佳的是，本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人腺病毒E1蛋白與E1缺陷型猿猴腺病毒反式互補(bǔ)，從而允許其包裝到猿猴腺病毒顆粒中。然而，由于人Ad E1和缺失的猿Ad E1序列的側(cè)翼序列之間同源程度很低，因此猿Ad E1同源重組產(chǎn)生有復(fù)制能力的猿猴腺病毒的危險(xiǎn)性很小。
如此制得的重組猿猴腺病毒顆?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知可用于本發(fā)明的各種方法來分離純化。
II.用于輸送給宿主的異源分子A.免疫原猿猴腺病毒攜帶的用于輸送給宿主細(xì)胞的異源分子可以是任何所希望的物質(zhì)，包括但不局限于，多肽、蛋白質(zhì)、酶、碳水化合物、化學(xué)物質(zhì)或核酸分子(包括寡核苷酸、RNA、DNA和/或RNA/DNA雜合體)。在一個(gè)較佳的方案中，猿猴腺病毒攜帶的分子是轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因是核酸分子，它包含的核酸序列與腺病毒序列異源，該序列編碼感興趣的蛋白質(zhì)、肽、多肽、酶或其它產(chǎn)物。轉(zhuǎn)基因還包含指導(dǎo)編碼的產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的調(diào)控序列，該調(diào)控序列能使編碼的產(chǎn)物在宿主細(xì)胞或?qū)ο笾斜磉_(dá)。轉(zhuǎn)基因的組成取決于猿猴腺病毒的預(yù)計(jì)用途。
例如，一種轉(zhuǎn)基因包含報(bào)道序列或標(biāo)記序列，這些序列在表達(dá)后產(chǎn)生了可檢測(cè)的信號(hào)。然而，特別佳的是能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體(最佳的是能誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng))的基因產(chǎn)物或其它分子。
這些免疫原性基因產(chǎn)物和分子可來自各種病原微生物，包括但不局限于，感染人或非人脊椎動(dòng)物的病毒、細(xì)菌、真菌或寄生性微生物，或來自癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。免疫原可包含衍生自蛋白質(zhì)的肽或多肽。在一些情況下，組成中可包含多個(gè)免疫原。
含有這些基因產(chǎn)物和其它分子的理想的免疫原性組合物包括涉及預(yù)防和/或治療由病毒所引起疾病的那些免疫原性組合物，其中所述病毒非限制性地是，例如人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、呼吸道合胞病毒、1-3型副流感病毒、流感病毒(例如A型和B型流感病毒)、單純皰疹病毒、人巨細(xì)胞病毒、肝炎病毒(包括甲肝、乙肝和丙肝病毒)、人乳頭瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、輪狀病毒、杯狀病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、風(fēng)疹病毒、腺病毒、狂犬病病毒、犬熱病病毒、牛瘟病毒、冠狀病毒、細(xì)小病毒、感染性鼻氣管炎病毒、貓白血病病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、鳥傳染性囊病病毒、新城疫病毒、Marek′s病病毒、豬呼吸道和生殖道綜合征病毒、馬動(dòng)脈炎病毒和各種腦炎病毒。
還有其它免疫原涉及預(yù)防和/或治療例如由細(xì)菌引起的疾病，這些細(xì)菌例如是流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)(典型性和非典型性)、睡眠嗜血菌(Haemophilussomnus)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)、糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Nesseria gonorrhoeae)、砂眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)、鸚鵡熱衣原體(Chamydia psittaci)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeraesuis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、志賀氏菌(Shigella)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、鳥分枝桿菌(Mycobaterium avium)、胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacteriumintracellulare)復(fù)合物、奇異變形菌(Proteus mirabilis)、普通變形菌(Proteus vulgaris)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)、問號(hào)鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)、布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、大葉性肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)和雞敗血支原體(Mycoplasma gallisepticum)。
還有其它免疫原涉及預(yù)防和/或治療例如由真菌病原體引起的疾病，這些真菌病原體例如是曲霉(Aspergillis)、芽生菌(Blastomyces)、念珠菌(Candida)、Coccidiodes、隱球菌(Cryptococcus)和組織胞漿菌(Histoplasma)。
另外，其它合適的免疫原涉及預(yù)防和/或治療例如由寄生蟲引起的疾病，這些寄生蟲例如是利什曼原蟲(Leishmania major)，回蟲(Ascaris)，鞭蟲(Trichuris)，賈第蟲(Giardia)，血吸蟲(Schistosoma)，Cryptosporidium，毛滴蟲(Trichomonas)，弓形蟲(Toxoplasma gondii)和肺囊蟲(Pneumocystis carinii)。
另外，希望的免疫原包括在脊椎動(dòng)物宿主中引發(fā)治療性或預(yù)防性抗癌效果的那些免疫原，例如但不局限于，利用癌抗原或腫瘤相關(guān)抗原(包括但不局限于前列腺特異性抗原、癌胚抗原、MUC-1、Her2、CA-125和MAGE-3)的那些免疫原。
下列例子具體描述了本發(fā)明方法和組合物的優(yōu)點(diǎn)，其利用重組猿猴腺病毒載體來表達(dá)狂犬病的免疫原性肽(糖蛋白G)或人1型免疫缺陷病毒(修飾的gag蛋白)。另一理想的方案采用了攜帶人乳頭瘤病毒的免疫原性肽的猿猴腺病毒。然而本發(fā)明并不局限于這些免疫原來源。
B.調(diào)控元件需要轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或表達(dá)以便在細(xì)胞和宿主中獲得所需基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因或其它核酸序列的設(shè)計(jì)可包括與感興趣的編碼序列操作性相連的合適序列，以促進(jìn)編碼產(chǎn)物的表達(dá)?！安僮餍韵噙B”的序列包括與感興趣的核酸序列毗連的表達(dá)控制序列以及反式或隔一定距離起作用來控制感興趣的核酸序列的表達(dá)控制序列。
表達(dá)控制序列包括合適的轉(zhuǎn)錄起始、終止、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列；有效的RNA加工信號(hào)如剪接和聚腺苷酸化信號(hào)；使細(xì)胞質(zhì)mRNA穩(wěn)定的序列；增強(qiáng)翻譯效率的序列(即，Kozak共有序列)；增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；以及當(dāng)需要時(shí)，增強(qiáng)蛋白質(zhì)分泌的序列。眾多表達(dá)控制序列(天然的、組成型的、可誘導(dǎo)的和/或組織特異性的)是本領(lǐng)域所已知的，它們可用來驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)，這取決于所希望的表達(dá)類型。對(duì)于真核細(xì)胞，表達(dá)控制序列通常包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子，(如從免疫球蛋白基因、SV40、巨細(xì)胞病毒等獲得的)，以及聚腺苷酸化序列(包括剪接供體和受體位點(diǎn))。聚腺苷酸化(polyA)序列通常插在轉(zhuǎn)基因序列之后和3′腺病毒ITR序列之前。在一個(gè)方案中，選用牛生長(zhǎng)激素polyA。本發(fā)明的猿猴腺病毒還可含有內(nèi)含子，其理想地是位于啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列與轉(zhuǎn)基因之間。一種可能的內(nèi)含子序列也可衍生自SV-40，稱為SV-40 T內(nèi)含子序列。另一可用于載體的元件是內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。IRES序列用來從單個(gè)基因轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生多個(gè)多肽。IRES序列用來產(chǎn)生含有多個(gè)多肽鏈的蛋白質(zhì)。這些元件以及其它常見載體元件的選擇是常規(guī)的，許多這樣的序列是可以獲得的(例如見Sambrook等，及其中引用的參考文獻(xiàn)，例如3.18-3.26頁(yè)和16.17-16.27頁(yè)，以及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，1989)。
在一個(gè)例子中，希望有高水平的組成型表達(dá)。有用的組成型啟動(dòng)子的例子包括，但不局限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒Rous肉瘤病毒(RSV)LTR啟動(dòng)子(任選的具有RSV增強(qiáng)子)，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子(任選地具有CMV增強(qiáng)子)(例如見Boshart等人，Cell，41521-530(1985)，SV40啟動(dòng)子，二氫葉酸還原酶啟動(dòng)子，β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，磷酸甘油激酶(PGK)啟動(dòng)子和EF1α啟動(dòng)子(Invitrogen)。由外來提供的化合物所調(diào)控的可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子也是有用的，其包括鋅可誘導(dǎo)的羊金屬硫蛋白(MT)啟動(dòng)子、地塞米松(Dex)-可誘導(dǎo)的小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子、T7聚合酶啟動(dòng)子系統(tǒng)(WO98/10088)；蛻皮激素昆蟲啟動(dòng)子(No等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 933346-3351(1996))、四環(huán)素可阻遏的系統(tǒng)(Gossen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，895547-5551(1992))、四環(huán)素可誘導(dǎo)的系統(tǒng)(Gossen等人，Science，2681766-1769(1995))，另見Harvey等人，Curr.Opin.Chem.Biol.，2512-518(1998))，RU486可誘導(dǎo)的系統(tǒng)(Wang等人，Nat.Biotech.，15239-243(1997)和Wang等人，Gene Ther.，4432-441(1997))以及雷帕霉素可誘導(dǎo)的系統(tǒng)(Magari等人，J.Clin.Invest.，1002865-2872(1997))?？捎糜诒疚牡钠渌愋偷目烧T導(dǎo)啟動(dòng)子是那些受特定生理狀況(如溫度、急性相(acute phase)、細(xì)胞的特定分化階段(或僅在復(fù)制性細(xì)胞中)來調(diào)控的那些啟動(dòng)子。
在另一方案中，采用轉(zhuǎn)基因的天然啟動(dòng)子。當(dāng)希望轉(zhuǎn)基因的表達(dá)模擬其天然表達(dá)時(shí)，天然啟動(dòng)子是較佳的。當(dāng)暫時(shí)或發(fā)育時(shí)或以組織特異性方式或在對(duì)具體轉(zhuǎn)錄刺激反應(yīng)時(shí)必須調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)，可采用天然的啟動(dòng)子。在另一方案中，也可其它天然的表達(dá)控制元件如增強(qiáng)子元件、聚腺苷酸化位點(diǎn)或Kozak共有序列來模擬天然表達(dá)。
轉(zhuǎn)基因的另一方案包括將轉(zhuǎn)基因與組織特異性啟動(dòng)子操作性相連。例如，如果希望在骨骼肌中表達(dá)，則應(yīng)使用在肌肉中有活性的啟動(dòng)子。這些包括來自編碼骨骼α-肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白輕鏈2A、肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白、肌肉肌酸激酶的基因的啟動(dòng)子，以及活性比天然存在的啟動(dòng)子更高的合成性肌肉啟動(dòng)子(見Li等人，Nat.Biotech.，17241-245(1999))。對(duì)于肝(白蛋白，Miyatake等人，J.Virol.，715124-32(1997)；乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子，Sandig等人，Gene Ther.，31002-9(1996)；α-鐵蛋白(AFP)，Arbuthnot等人，Hum.Gene Ther.，71503-14(1996))，骨鈣蛋白(Stein等人，Mol.Biol.Rep.，24185-96(1997))；骨唾液蛋白(Chen等人，J.Bone.Miner.Res.，11654-64(1996))，淋巴細(xì)胞(CD2，Hansal等人.，J.Immunol.，1611063-8(1998)；免疫球蛋白重鏈；T細(xì)胞受體α鏈)，神經(jīng)元如神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)啟動(dòng)子(Andersen等人.Cell.Mol.Neurobiol.，13503-15(1993))，神經(jīng)絲輕鏈基因(Piccioli等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，885611-5(1991))，和神經(jīng)元特異性vgf基因(Piccioli等人.，Neuron，15373-84(1995))，其組織特異性啟動(dòng)子的例子是已知的。
當(dāng)然，并非所有的表達(dá)控制序列對(duì)表達(dá)本發(fā)明所有的轉(zhuǎn)基因?qū)l(fā)揮相同的作用。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在不脫離本發(fā)明范圍內(nèi)在這些表達(dá)控制序列中進(jìn)行選擇。本領(lǐng)域技術(shù)人員可用本申請(qǐng)?zhí)峁┑闹笇?dǎo)來選擇合適的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列。這種選擇是一種常規(guī)的方式，而非是對(duì)該分子或構(gòu)建物的限制。例如，可選擇一個(gè)或多個(gè)表達(dá)控制序列與感興趣的編碼序列操作性相連，將其插入轉(zhuǎn)基因、小基因以及本發(fā)明的轉(zhuǎn)移病毒中。在實(shí)施如本說明書或現(xiàn)有技術(shù)所述包裝猿猴腺病毒方法之一后，可在體內(nèi)或體外感染合適的細(xì)胞。細(xì)胞中的小基因拷貝數(shù)可用Southern印跡或定量PCR來監(jiān)測(cè)。RNA表達(dá)的水平可用Northern印跡或定量RT-PCR監(jiān)控。表達(dá)水平可用Western印跡、免疫組織化學(xué)、ELISA、RIA或通過基因產(chǎn)物生物活性試驗(yàn)來監(jiān)控。因此，很容易確定具體的表達(dá)控制序列是否適合轉(zhuǎn)基因所編碼的特定產(chǎn)物并選擇最適合的表達(dá)控制序列?；蛘?，當(dāng)輸送的分子不需要表達(dá)時(shí)(如碳水化合物、多肽、肽等)，表達(dá)控制序列不必構(gòu)成重組猿猴腺病毒或其它分子的一部分。
III.輸送病毒的制劑重組猿猴腺病毒宜懸浮于生理相容的載體中給予人或非人哺乳動(dòng)物患者。根據(jù)轉(zhuǎn)移的病毒所針對(duì)的適應(yīng)癥，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易選擇合適的載體。例如，一種合適的載體是鹽水，它可用各種緩沖液(如磷酸緩沖鹽溶液)來配制。其它典型的載體包括無菌鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、葡聚糖、瓊脂、果膠、花生油、芝麻油和水。
本發(fā)明不局限于載體的選擇。
除重組猿猴腺病毒和載體外，本發(fā)明的組合物可任選地含有其它常規(guī)藥用組分，如防腐劑、化學(xué)穩(wěn)定劑或用于疫苗用途的佐劑。合適的典型防腐劑包括氯丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對(duì)羥基苯甲酸、乙基香草醛、甘油、苯酚和對(duì)氯苯酚。合適的化學(xué)穩(wěn)定劑包括明膠和白蛋白。合適的佐劑包括免疫刺激的復(fù)合物(ISCOMS)、LPS類似物(包括3-O-去?；膯瘟字珹(Ribi Immunochem Research，Inc.；Hamilton，MT)，礦物油和水、氫氧化鋁、Amphigen、Avirdine、L121/鯊烯、胞壁酰肽和皂苷如Quil A。
IV.輸送重組病毒進(jìn)行治療和/或預(yù)防將復(fù)制缺陷型重組腺病毒以藥物有效量給予，即，該重組腺病毒用量使得在給藥途徑中能有效地轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞，并為所選基因提供了足夠的表達(dá)水平，從而提供了治療性或疫苗性免疫反應(yīng)(例如有可測(cè)定水平的保護(hù)性免疫力)。
常規(guī)的和藥學(xué)上可接受的給藥途徑包括，但不局限于，肌內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)、直腸、口服和其它粘膜和腸胃外給藥途徑。本文所用的粘膜給藥途徑包括輸送給粘膜組織的那些給藥途徑，包括但不局限于，吸入、口服、鼻內(nèi)、陰道和直腸途徑。如果需要，給藥途徑可以組合，或根據(jù)免疫原或疾病作調(diào)節(jié)。例如，在預(yù)防狂犬病時(shí)，皮下、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)和口服途徑是較佳的。給藥途徑主要取決于待治療的疾病性質(zhì)。
復(fù)制缺陷型重組腺病毒的劑量或有效量主要取決于以下因素病癥、所選基因、動(dòng)物的年齡、體重和健康程度，因此各動(dòng)物之間可有不同。
病毒載體的劑量主要取決于以下因素待治療的病癥，患者的年齡、體重和健康程度，因此各哺乳動(dòng)物(包括人)患者之間可有不同。較佳的是，本發(fā)明的重組猿(例如黑猩猩)腺病毒的出人意料的效力使得其能以顯著較低的重組黑猩猩腺病毒用量來提供誘導(dǎo)所需免疫原性效應(yīng)的有效量(例如誘導(dǎo)預(yù)定水平的CD8+T細(xì)胞)。例如，104pfu和106pfu的黑猩猩腺病毒能提供有效劑量的重組猿猴腺病毒。然而，根據(jù)所選的輸送途徑，很容易選擇更高的劑量。例如，病毒載體的輸送量在大約100微升至100毫升(更佳的在大約1毫升至10毫升之間)的載體溶液，其濃度范圍約為1×104噬斑形成單位(pfu)至1×1013pfu病毒/毫升，以及1×109至1×1011pfu/毫升病毒(以80千克成人體重計(jì)算)。較佳的劑量估計(jì)約為2×1010pfu/ml的50毫升鹽水溶液。在上述濃度下，較佳的劑量約為1-10毫升載體(例如鹽水溶液)?？蓪?duì)所選基因的治療水平或免疫力水平進(jìn)行監(jiān)控，以確定是否需要加強(qiáng)。在測(cè)定CD8+T細(xì)胞應(yīng)答或血清中的抗體滴度后，可能需要進(jìn)行增強(qiáng)免疫。重組猿猴腺病毒可任選地用接觸-強(qiáng)化方案來輸送。各種此類方案已在現(xiàn)有技術(shù)中有所描述，很容易進(jìn)行選擇。一個(gè)特別希望的方法在2000年3月2日公開的WO00/11140中有所描述，該出版物納入本文作為參考。
在一個(gè)較佳的方案中，本發(fā)明提供了一種在對(duì)象內(nèi)優(yōu)先誘導(dǎo)出針對(duì)人免疫缺陷病毒的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的方法，該方法是輸送含有修飾的gag蛋白的重組猿猴腺病毒。以下實(shí)施例中描述的經(jīng)修飾的gag蛋白已如美國(guó)專利5,972,596中所述那樣進(jìn)行了優(yōu)化。其編碼序列和蛋白質(zhì)序列在本文中表示為SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。另見G.Meyers等編，Human retroviruses and AIDS.A compilation and analysis of nucleic acidand amino acid sequences(Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，MN 1991)。然而，各種提高gag蛋白或本文所述的其它所選免疫原或抗原表達(dá)的方法，例如HIV-1gag密碼子序列的人化、除去HIV-1 gag剪接位點(diǎn)、在HIV-1 gag編碼序列上游插入額外的引導(dǎo)序列，在HIV-1 gag編碼序列的上游插入Kozak序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并可采用。本發(fā)明并不局限于優(yōu)化方法的選擇。或者，本發(fā)明的方法可用來將攜帶HIV包膜蛋白或HIV pol的重組猿猴腺病毒輸送給對(duì)象。一種希望的HIV包膜蛋白是HIV糖蛋白120，其序列可從GenBank獲得。然而，可用其它合適的病毒包膜蛋白。HIV-1 pol的序列以及各種修飾的pol序列是已知的。例如參見美國(guó)專利5,972,596和R.Scheider等人.，J.Virol，71(7)4829-4903(1997年7月)。
在另一理想的方案中，本發(fā)明提供了一種優(yōu)先誘導(dǎo)出針對(duì)所選惡性腫瘤的腫瘤相關(guān)蛋白的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的方法，該方法是向?qū)ο筝斔桶[瘤相關(guān)蛋白的重組猿猴腺病毒。該蛋白包括細(xì)胞致癌基因如突變的ras或p53。
在另一方案中，本發(fā)明提供了一種優(yōu)先誘導(dǎo)出針對(duì)所選惡性腫瘤的特異性腫瘤相關(guān)蛋白的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的方法，方法是將含有腫瘤相關(guān)蛋白的重組猿猴腺病毒輸送給對(duì)象。
還有一個(gè)理想的方案涉及輸送含有人乳頭瘤病毒衍生蛋白的重組猿猴腺病毒，以防止人乳頭瘤病毒感染并治療和預(yù)防相關(guān)的病癥。例如，蛋白可選自E6、E7和/或L1(Seedorf，K.等人，Virol，145181-185(1985))。當(dāng)病癥是呼吸道合胞病毒感染時(shí)，蛋白選自糖蛋白(G)和融合蛋白(F)，它們的序列從GenBank獲得。
提供下列實(shí)施例以便描述本發(fā)明，但本發(fā)明范圍不局限于這些例子。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，盡管下列例子中列舉了具體的試劑和條件，但是可在本發(fā)明的思路和范圍內(nèi)進(jìn)行修改。
實(shí)施例1-基于黑猩猩腺病毒C68的E1缺失載體的制備分離得到C68的復(fù)制缺陷型用于基因轉(zhuǎn)移。獲得E1缺失的重組體的典型策略是通過在E1表達(dá)的細(xì)胞系中進(jìn)行同源重組。第一步是產(chǎn)生一個(gè)質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有m.u.0至1.3，其后加入一最小基因，該基因表達(dá)CMV啟動(dòng)子下的增強(qiáng)綠色熒光蛋白(GFP)和跨接9-16.7m.u.的C68序列。該線性化質(zhì)粒和SspI消化的C68質(zhì)粒(SspI在3.6m.u處切割，留下4644bp進(jìn)行同源重組)共轉(zhuǎn)染入表達(dá)E1的細(xì)胞系中。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)用攜帶人Ad5 E1的293細(xì)胞進(jìn)行，希望這足以實(shí)現(xiàn)反式互補(bǔ)。事實(shí)上，形成的噬斑提供了所需的重組體。所得載體命名為C68-CMV-GFP。
改進(jìn)重組體產(chǎn)生的策略，以便有效地迅速地分離重組體。首先，用由lacZ的原核啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的原核GFP基因代替最初穿梭載體中的堿性磷酸酶DNA。這可使在試圖將所需的真核RNA pol II轉(zhuǎn)錄單元摻入穿梭載體中時(shí)能有效的篩選轉(zhuǎn)化細(xì)菌?？赏ㄟ^GFP表達(dá)來篩選產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化菌。白色菌落是重組體，而綠色菌落是殘余的親代質(zhì)粒。
綠色—白色選擇已被用于篩選共轉(zhuǎn)染產(chǎn)物來分離人Ad5重組體(A.R.Davis等人，Gene Thera，51148-1152(1998))。將其改用于C68系統(tǒng)。將最初的穿梭載體改為含有來自9至26MU的延伸的3’序列。將該載體與來自最初的C68-CMV-GFP分離物的病毒DNA共轉(zhuǎn)染，該病毒DNA已經(jīng)XbaI限制性酶切成MU16.5，使得有9.5Kb的重疊區(qū)進(jìn)行同源重組。在相差熒光顯微鏡下篩選所得噬斑中不發(fā)熒光的分離物，其代表了所需的重組體。與基于結(jié)構(gòu)或轉(zhuǎn)基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)方法相比，這大大簡(jiǎn)化了篩選。
A穿梭質(zhì)粒為了構(gòu)建產(chǎn)生重組C68病毒的質(zhì)粒穿梭載體，對(duì)質(zhì)粒pSP72(Promega，Madison，WI)進(jìn)行變化，用BglII消化，然后用Klenow酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)填平末端，用合成的12bp PacI接頭(New England Biolabs，Beverly，MA)連接，產(chǎn)生pSP72-Pac。從含有C68基因組的BamHI E片段的pNEB-BamE質(zhì)粒中分離出跨越C68基因組的圖譜單位(m.u.或MU)0-1.3的456bp的PacI/SnaBI片段，克隆到經(jīng)PacI和EcoR V處理的pSP72-Pac中，產(chǎn)生pSP-C68-MU0-1.3。從pCMVβ(Clontech，Palo Alto，CA)分離出最小基因盒，該基因盒由驅(qū)動(dòng)lacZ的巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子和SV40 poly A信號(hào)組成，它是4.5kb的EcoR I/Sal I片段，將其與經(jīng)同樣酶限制性消化的pSP-C68-MU0-1.3相連接，獲得pSP-C68-MU0-1.3-CMVLacZ。
作為分離C68的9-16.7MU區(qū)域的初始步驟，用BamHI和SphI酶雙消化pGEM-3Z(Promega，Madison，MI)和pB S-C68-BamF。然后，將來自pBS-C68-BamF的293bp片段與pGEM-3Z的主鏈相連接，形成pGEM-C68-MU 9-9.8。在XbaI消化、填平和BamHI處理后，從pBS-C68 BamHB克隆獲得含有C68 MU 9.8-16.7的2.4kb片段，然后將其克隆到經(jīng)BamHI/SmaI雙消化的pGEM-C68-MU 9-9.8中，產(chǎn)生pGEM-C68-MU 9-16.7。通過EcoRI消化、用Klenow酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)填平末端，與合成的12bpHindIII接頭(NEB)連接以及用HindIII消化，從pGEM-C68-MU 9-16.7分離得到C68 9-16.7m.u.區(qū)域。將跨越C68 MU9-16.7的2.7kb片段克隆到pSP-C68-MU 0-1.3-CMVLacZ的HindIII位點(diǎn)中，形成最終的穿梭質(zhì)粒pC68-CMV-LacZ。另外，從pAdCMVALP(K.J.Fisher，等人，J.Virol.，70520-532(1996))分離出820bp堿性磷酸酶(AP)cDNA片段，使其在pC68-CMV-LacZ的Not I位點(diǎn)與lacZ交換，獲得pC68-CMV-AP。
B.重組病毒的構(gòu)建為了構(gòu)建E1缺失的重組C68-CMVEGFP載體，首先構(gòu)建pC68-CMV-EGFP穿梭質(zhì)粒，用增強(qiáng)綠色熒光蛋白(GFP)基因代替pC68-CMV-LacZ中的lacZ轉(zhuǎn)基因。替代克隆方法如下。通過BamHI消化，填平反應(yīng)和連接8bp合成的NotI接頭(NEB)，在pEGFP-1(Clontech，Palo Alto，CA)中的EGFP編碼序列的5’端導(dǎo)入額外的NotI限制性位點(diǎn)。在對(duì)兩個(gè)構(gòu)建物進(jìn)行NotI限制性消化后，從修飾的pEGFP-1中分離出EGFP序列，用來替換pC68-CMV-lacZ中的lacZ基因。將pC68-CMVEGFP構(gòu)建物(3微克)與SspI消化的C68基因組DNA(1微克)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，如前所述(G.Gao，等人，J.Virol，708934-8943(1996))進(jìn)行同源重組。分離熒光顯微鏡顯示的綠色噬斑，進(jìn)行2輪噬斑純化，擴(kuò)增并用CsCl梯度沉降純化(G.Gao，等人，同上)。
在試圖將方便的綠色/白色選擇方法(A.R.Davis，等人，Gene Thera，51184-1152(1998))用于重組C68載體的構(gòu)建時(shí)，通過AgeI和BsiwI限制性內(nèi)切酶處理，從pBSC68-BamB質(zhì)粒中分離出跨越9至36MU的7.2kb片段，將其克隆到pC68-CMV-AP穿梭質(zhì)粒的Asp718和AgeI位點(diǎn)，獲得新的質(zhì)粒命名為pC68CMV-AP-MU36。通過Eco47III和NruI消化從pC68CMV-AP-MU36中除去26至36MU，進(jìn)行進(jìn)一步的修飾。新的穿梭質(zhì)粒命名為pC68CMV-AP-MU26，它在最小基因的3’端具有更短的同源重組區(qū)域(即16.7-26MU)。為了制造重組C68載體，用感興趣的基因代替堿性磷酸酶(AP)。所得pC68CMV-Nugene-MU26構(gòu)建物和XbaI(16.5MU)限制性消化的C68-CMVGFP病毒DNA共轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞，然后進(jìn)行頂部瓊脂鋪層。通過pC68CMV-Nugene構(gòu)建物和C68病毒主鏈之間共有的16.7-26MU區(qū)域的同源重組，產(chǎn)生了重組病毒噬斑(白色)。從未切割的C68-CMVGFP病毒的綠色噬斑中選出形成白色噬斑的重組體。
白色/綠色選擇機(jī)制也被引入將感興趣基因克隆到pC68穿梭質(zhì)粒的方法中。用分離自pGFPMU31(Clontech，Palo Alto，CA)的由lacZ啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的原核GFP基因表達(dá)盒代替pC68CMV-AP-MU36和pC68CMV-AP-MU26中的AP基因。這樣，細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的白色菌落將含有該重組質(zhì)粒。該白色/綠色選擇細(xì)菌菌落的方法避免了制備和特征鑒定大量微量制備的DNA的需要，從而進(jìn)一步增強(qiáng)了產(chǎn)生重組C68載體的效率。
實(shí)施例2-抗原在經(jīng)猿猴腺病毒疫苗構(gòu)建物感染的TK細(xì)胞中的表達(dá)(Gag分泌)如實(shí)施例1和Z.Q.Xiang，等人，Virol.219，200(196)所述，構(gòu)建重組黑猩猩腺病毒株68(Adchimp68)和人腺病毒株5(Adhu5)，兩者攜帶了經(jīng)修飾的HIV-1 clade B的截短型gag基因的核苷酸序列。HIV-1的結(jié)構(gòu)蛋白(包括gag)的轉(zhuǎn)錄本含有遺傳不穩(wěn)定元件，需要rev蛋白的存在以便輸出胞核和在細(xì)胞質(zhì)中有效表達(dá)(S.Schwartz等人，J Virol 66，7176(1992)；S.Schwartz等人，J Virol 66，150-159(1992)；G.Nasioulas等人，J Virol 68，2986(1994))。腺病毒依靠核轉(zhuǎn)錄，因此需要rev來表達(dá)HIV-1蛋白。為了避免對(duì)Rev的依賴性，通過定點(diǎn)誘變除去了密碼子修飾的gag序列中的遺傳不穩(wěn)定性元件(R.Schneider等人，J Virol 71，4892(1997)；S.Schwartz等人，J Virol 66，7176(1992)；S.Schwartz等人，J Virol 66，150(1992))，將其插入腺病毒載體中。該導(dǎo)入的基因編碼截短的p37gag蛋白(p17和p24區(qū)域)。截短的gag蛋白不形成病毒顆粒，其部分分泌到轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞的上清液中(R.Schneider等人，J Virol 71，4892(1997))。突變的gag構(gòu)建物已被用于疫苗實(shí)驗(yàn)，并在小鼠和靈長(zhǎng)動(dòng)物中產(chǎn)生了細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)(J.T.Qiu等人，J Virol 73，9145(1999))。
在用人腺病毒株5的E1轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中產(chǎn)生并繁殖Adchimp68和Adhu5重組體。發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，該異源E1適合補(bǔ)充E1缺失的Adchimp68重組病毒，從而減少了重組和回復(fù)成有復(fù)制能力的野生型病毒的危險(xiǎn)性。
通過Western印跡，用針對(duì)gag的小鼠單克隆抗體分析了TK培養(yǎng)物上清中g(shù)ag蛋白的存在。TK細(xì)胞(1×106)用Adhu5gag37或Adchimp68gag37病毒感染48小時(shí)(每細(xì)胞10pfu)。其它的TK細(xì)胞用表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的Adhu5或Adchimp68構(gòu)建物感染。培養(yǎng)上清中的蛋白用12％變性聚丙烯酰胺凝膠分離，通過電印跡轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。印跡用針對(duì)HIV-1 p24的單克隆抗體183-H12-5C(B.Chelsebro，等人，J.Virol.666547(1992))染色。
如Western印跡分析所示，兩個(gè)攜帶該gag修飾序列的重組腺病毒克隆(Adhu5gag37，Adchimp68gag37)表達(dá)了相當(dāng)水平的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。在用10個(gè)噬斑形成單位(pfu)的腺病毒gag重組體之一感染的TK細(xì)胞上清液中，均檢測(cè)到了預(yù)計(jì)大小(37kDa)的與抗HIV-1 gag單克隆抗體結(jié)合的蛋白。經(jīng)表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的Adhu5或Adchimp68重組體(Adhu5rab.gp和Adchimp68.gp)感染的對(duì)照細(xì)胞沒有產(chǎn)生該蛋白。
實(shí)施例3-用猿猴腺病毒在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)對(duì)gag的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答下列實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)肌內(nèi)注射Adhu5gag37或Adchimp68gag37重組體的小鼠脾細(xì)胞通過細(xì)胞因子(即干擾素(IFN)-γ)釋放以及靶細(xì)胞溶解而對(duì)gag蛋白的免疫優(yōu)勢(shì)表位(B.Doe和C.M.Walker，AIDS 10，793(1996))產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)。
A.細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)每組3只Balb/c小鼠用2×105、2×106或2×107pfu的Adchimp68gag37病毒，2×106pfu的Adhu5L1病毒(H.C.J.Ertl，等人，J Virol，632885(1989))，2×106pfu的Adhu5gag37病毒，或2×107pfu的VVgag病毒肌內(nèi)免疫。10天后測(cè)試脾細(xì)胞對(duì)gag10的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。為了測(cè)定細(xì)胞因子(IFN-γ)產(chǎn)生，在96孔圓底微量滴定板孔中，在補(bǔ)充了2％胎牛血清(FBS)和10-6M 2-巰基乙醇的Dulbeccos改進(jìn)的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)中，用3微克/毫升AMQMLKETI肽(SEQ ID NO1，它攜帶了H-2d單體型(haplotype)的免疫優(yōu)勢(shì)CD8+T細(xì)胞表位)和1微克/毫升Brefeldin A(GolgiPlug，PharMingen，San Diego，CA)37℃培養(yǎng)脾細(xì)胞(1×106/樣品)5小時(shí)。用PBS洗滌細(xì)胞，用FITC標(biāo)記的抗小鼠CD8抗體于4℃培育30分鐘。洗滌細(xì)胞，并以1XCytofix/Cytoperm(PharMingen)4℃滲透20分鐘。用Perm/Wash(PharMingen)洗滌細(xì)胞3次，在同一緩沖液中與PE標(biāo)記的抗鼠IFN-γ抗體一起于4℃下培育30分鐘。洗滌后，用雙色流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢查細(xì)胞，用WinmDi軟件分析數(shù)據(jù)。右手角落的數(shù)字表示在所有CD8+T細(xì)胞中IFN-γ染色呈陽(yáng)性的CD8+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
單次免疫后7-10天，全部脾CD8+T細(xì)胞群中有相當(dāng)大的部分在對(duì)gag肽的反應(yīng)中產(chǎn)生了IFN-γ。未經(jīng)體外擴(kuò)增而測(cè)定的原代脾細(xì)胞溶解了預(yù)先用gag肽處理的H-2相容性靶細(xì)胞。在用Adchimp68構(gòu)建物免疫后，gag特異性CD8+T細(xì)胞活性非常高，抗gag的CD8+T細(xì)胞的頻率占整個(gè)脾CD8+T細(xì)胞群的16-19％。如Adchimp68gag37病毒所示，此反應(yīng)是劑量依賴型的，2×105pfu的低劑量仍然誘導(dǎo)了接近10％的頻率。Adhu5gag37重組體在2×106pfu下誘導(dǎo)出約為9％的最優(yōu)頻率。在增加該疫苗劑量后這些頻率沒有顯著增加(數(shù)據(jù)未顯示)。根據(jù)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，表達(dá)全長(zhǎng)gag(VVgag，稱為VDK1，S.Chacrabarti等人，Mol.Cell.Biol.5，3403(1985))的重組疫苗病毒刺激的CD8+T細(xì)胞頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)較低。
B.靶細(xì)胞的溶解在5小時(shí)的51Cr釋放試驗(yàn)中，以不同的效靶細(xì)胞比例下，在1×104P815細(xì)胞上對(duì)小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試，小鼠在10天前用單劑重組腺病毒免疫(如A所述)，或用兩劑VVgag重組體，在肌內(nèi)給予第一次注射后2周腹膜內(nèi)注射第二劑，其中P815細(xì)胞用對(duì)gag的肽(實(shí)心方塊)或?qū)φ针?1D(X)(根據(jù)狂犬病病毒核蛋白的序列描繪(H.C.J.Ertl等人，J.Virol.632885(1989))室溫處理16-24小時(shí)。需要VVgag疫苗兩次免疫來誘導(dǎo)可檢測(cè)的T細(xì)胞介導(dǎo)的gag-特異性原代細(xì)胞裂解。
C.CD8+T細(xì)胞對(duì)gag的應(yīng)答反應(yīng)動(dòng)力學(xué)用5×106pfu的Adhu5gag37或Adchimp68gag37病毒免疫每組4只Balb/c小鼠。6-12天后如上所述收獲脾細(xì)胞，測(cè)試IFN-γ產(chǎn)生和靶細(xì)胞溶解。兩種重組腺病毒誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞對(duì)gag的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)不同。Adhu5gag37病毒產(chǎn)生的對(duì)gag反應(yīng)的峰值比CD8+T細(xì)胞對(duì)Adchimp68gag37重組體的反應(yīng)早2-4天。
實(shí)施例4-先接觸人腺病毒對(duì)猿猴腺病毒疫苗的影響為了研究先前暴露于常見人5型腺病毒株的影響，用表達(dá)無關(guān)抗原(人乳頭瘤病毒L1)的Adhu5重組體單劑免疫小鼠。兩周后，用Adhu5gag37或Adchimp68gag37疫苗給小鼠接種。
更具體地說，給小鼠肌內(nèi)免疫接種108pfu的Adhu5L1疫苗。兩周后，給經(jīng)Adhu5免疫的小鼠和原初小鼠注射2×106或2×107pfu的Adhu5gag37或Adchimp68gag37重組體(每組4-5只小鼠)。另外的Adhu5L1免疫或原初小鼠組用2×106pfu的Adhu5gag37或Adchimp68gag37病毒免疫。9天后，給小鼠腹膜內(nèi)注射106pfu的表達(dá)全長(zhǎng)gag的重組疫苗病毒。注射病毒疫苗后5天處死小鼠。
先經(jīng)Adhu5病毒免疫的小鼠用Adhu5gag37疫苗接種后不能對(duì)gag產(chǎn)生反應(yīng)。它們顯示的CD8+gag特異性T細(xì)胞的頻率與對(duì)照小鼠中所見相似，相應(yīng)地，它們的脾細(xì)胞不能使表達(dá)gag的靶細(xì)胞溶解。相反，Adhu5免疫的小鼠接種Adchimp68gag37構(gòu)建物疫苗后，CD8+T細(xì)胞對(duì)gag的反應(yīng)只有稍稍地下降。比較不同的效靶細(xì)胞比，CD8+T細(xì)胞對(duì)gag反應(yīng)的頻率僅減少約30％，脾細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性減少約50％。
因此，兩種重組腺病毒誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞對(duì)gag反應(yīng)的頻率超過了以前描述的疫苗(如裸DNA或痘病毒重組體(S.Schwartz，等人，J Virol 66，150-159(1992))所引發(fā)的頻率。該頻率也比通常在慢性感染個(gè)體中所見的頻率高(D.H.Barouch等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 97，4192(2000)；T.U.Vogel等人，J.Immunol.164，4968(2000)；P.A.Goepfert等人，J.Virol.74，10249(2000)；C.R.Rinaldo Jr. AIDS Res & Hum.Retr..141423(1998))。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了重組腺病毒疫苗的效力。
實(shí)施例5-引導(dǎo)和強(qiáng)化對(duì)CD8+T細(xì)胞對(duì)抗原的效應(yīng)將經(jīng)2×107pfu的Adhu5gag37或Adchimp68gag37病毒免疫的原初或Adhu5免疫的小鼠原代脾細(xì)胞，與經(jīng)2×106pfu Adhu5gag37或Adchimp68gag37病毒免疫然后用106pfu VVgag病毒加強(qiáng)注射的原初或Adhu5小鼠的原代脾細(xì)胞相比較。5天后分析脾細(xì)胞的CD8和胞內(nèi)IFN-γ。這些試驗(yàn)基本上如上所述那樣進(jìn)行，只是在5小時(shí)51Cr釋放試驗(yàn)中不進(jìn)一步進(jìn)行體外培養(yǎng)使經(jīng)gag肽或?qū)φ针?1D處理的P815細(xì)胞溶解。
用異源疫苗構(gòu)建物VVgag重組體進(jìn)行初次或加強(qiáng)免疫沒有使Adhu5重組疫苗產(chǎn)生的對(duì)gag的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答恢復(fù)。盡管用Adhu5疫苗接種的用Adhu5gagp37和Vvgag加強(qiáng)注射的動(dòng)物表現(xiàn)出多達(dá)7.1％的脾CD8+T細(xì)胞在對(duì)gag反應(yīng)中產(chǎn)生了IFN-γ，但這些CD8+T細(xì)胞缺乏對(duì)產(chǎn)生gag的靶細(xì)胞的溶細(xì)胞活性。這些結(jié)果表明，預(yù)先接觸疫苗載體抗原對(duì)CD8+T細(xì)胞對(duì)重組腺病毒轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的應(yīng)答不僅有定性而且有定量的影響。用Adchimp68gag37疫苗接種的Adhu5免疫小鼠中CD8+T細(xì)胞對(duì)gag的反應(yīng)表明了VVgag免疫后加強(qiáng)免疫的效果類似于原初小鼠中所見的效果。
CD8+T細(xì)胞對(duì)gag反應(yīng)的頻率以及原代靶細(xì)胞的溶解可通過異源疫苗載體(如VVgag重組體)來初免(未顯示)或加強(qiáng)接種來提高。重組腺病毒肌內(nèi)初次免疫9天后，用VVgag作腹膜內(nèi)強(qiáng)化免疫，初免后5天后分析，CD8+gag特異性T細(xì)胞占全部脾CD8+T細(xì)胞群的大約40％。
已有的針對(duì)Adhu5的免疫力嚴(yán)重地降低了Adhu5gag37疫苗的效力，但僅稍稍損傷了CD8+T細(xì)胞對(duì)Adchimp68gag37病毒的反應(yīng)。以前已經(jīng)報(bào)道，經(jīng)Adhu5病毒免疫的小鼠發(fā)生了經(jīng)Adhu5疫苗接種對(duì)狂犬病病毒的B細(xì)胞應(yīng)答降低。增加疫苗劑量或用表達(dá)相同狂犬病病毒抗原的DNA疫苗能很容易地避免預(yù)先接觸Adhu5病毒的不利影響(Z.Q.Xiang，等人，J.Immunol.162，6716(1999))。
相反，在Adhu5免疫小鼠中，針對(duì)Adhu5重組疫苗所提供的gag的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答卻消失了，而且用針對(duì)gag的異源疫苗再次免疫只能部分恢復(fù)。這可能表明，與刺激B細(xì)胞相比，CD8+T細(xì)胞的誘導(dǎo)更容易受循環(huán)性病毒中和性抗體的干擾。
實(shí)施例6-含有狂犬病病毒糖蛋白的重組腺病毒的產(chǎn)生繁殖人血清型2、4、5、7、12型和黑猩猩血清型68型腺病毒，并在人293上滴定?；诒磉_(dá)狂犬病病毒ERA血清型的糖蛋白或人乳頭瘤病毒(HPV)-16的L1蛋白的人血清型5型的重組腺病毒已有描述(Z.Q.Xiang，等人，Virology 219220-227(1996)；D.W.Kowalcyk，等人，(2001)Vaccine regimen for prevention of sexuallytransmitted infections with human papillomativur type 16.Vaccine)。已開發(fā)了基于黑猩猩血清型68型腺病毒的表達(dá)系統(tǒng)，見實(shí)施例1所述。
使腺病毒在E1(從人血清型5型衍生獲得)-轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞(F.L.Graham，等人，J.Gen.Virol.3659-74(1977))上繁殖。通過凍融細(xì)胞收獲病毒。對(duì)于一些實(shí)驗(yàn)，通過CsCl梯度純化來純化病毒。對(duì)于其它實(shí)驗(yàn)，采用經(jīng)三輪凍融而壞死的受感染細(xì)胞的澄清上清。在293細(xì)胞上滴定病毒，以確定噬斑形成單位(pfu)。
如本實(shí)施例詳細(xì)描述的那樣，在經(jīng)人血清型5型腺病毒的E1轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中產(chǎn)生表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的黑猩猩血清型68型重組腺病毒(命名為Adchimp68rab.gp)。病毒克隆用間接免疫熒光和針對(duì)狂犬病病毒糖蛋白的構(gòu)型依賴性表位的單克隆抗體509-6來進(jìn)行初步篩選。在選出穩(wěn)定的腺病毒亞克隆后，如下實(shí)施例所述，通過免疫沉淀確認(rèn)Adchimp68rab.gp病毒在受感染TK細(xì)胞中表達(dá)了全長(zhǎng)狂犬病病毒的糖蛋白。
實(shí)施例7-重組腺病毒表達(dá)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物本實(shí)施例表明，Adhu5病毒在TK-細(xì)胞中獲得了比Adchimp68構(gòu)建物水平高得多的狂犬病病毒糖蛋白表達(dá)。該轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄本水平與蛋白表達(dá)水平相當(dāng)，表明該差別與翻譯后修飾的差別無關(guān)。TK-細(xì)胞是CAR陽(yáng)性，因此，此血清型病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)率應(yīng)是相當(dāng)?shù)摹?br> 用于這些實(shí)驗(yàn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，即幼倉(cāng)鼠腎(BHK)-21細(xì)胞、E1-轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞和TK-細(xì)胞，在補(bǔ)加了谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、HEPES緩沖液、抗生素和10％胎牛血清(FBS)的Dulbeccos改進(jìn)的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)中繁殖。
A.免疫沉淀用5pfu/細(xì)胞的表達(dá)狂犬病毒糖蛋白的重組腺病毒或表達(dá)不相關(guān)病毒抗原的對(duì)照構(gòu)建物感染TK-細(xì)胞(106/樣品)。48小時(shí)后，用無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細(xì)胞兩次，然后在無血清培養(yǎng)基中培育90分鐘，然后加入20微升35S標(biāo)記的半胱氨酸和甲硫氨酸(Promix，NEN，Boston，MA)。培育4小時(shí)后，用PBS洗滌細(xì)胞，然后用1毫升含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液處理20分鐘。除去孔中的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，稍稍漩渦振蕩，12.000rpm離心2分鐘。使上清和15微升/毫升含509-6單克隆抗體(針對(duì)狂犬病毒糖蛋白)的腹水4℃培育90分鐘。每份樣品加入75微升Protein Sepharose G，在輕微攪拌下4℃培育30分鐘。通過離心使樣品沉淀，用RIPA緩沖液洗滌4次。將沉淀重懸于80微升加樣緩沖液中，使其沸騰4分鐘。然后使樣品在12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)上分離，并與分子量標(biāo)準(zhǔn)品比較。在濾紙上干燥凝膠，然后曝光到KodakScientific成象膠片(X-Omat Blue XB-1)48小時(shí)。
Adchimp68rab.gp重組體表達(dá)了預(yù)計(jì)大小的與509-6抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)。經(jīng)Adhu5rab.gp病毒感染的TK-細(xì)胞的沉淀物顯示出相同大小的條帶，該條帶在表達(dá)不相關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的重組腺病毒感染的細(xì)胞裂解液中沒有出現(xiàn)。在經(jīng)Adhu5rab.gp構(gòu)建物感染的細(xì)胞中，狂犬病病毒糖蛋白的表達(dá)更為明顯。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的表達(dá)的差異可能反映了翻譯之前的活動(dòng)，如病毒攝取、轉(zhuǎn)錄速度或轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性的差異?；蛘?，翻譯或翻譯后差異(如不同的側(cè)鏈修飾)可能導(dǎo)致血清學(xué)上可檢測(cè)的蛋白質(zhì)有定量的差別。
為了進(jìn)一步區(qū)分這兩個(gè)可能性，從分離感染的重組腺病毒之一的TK-細(xì)胞的總RNA。通過部分B所述的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增狂犬病病毒糖蛋白和管家基因的逆轉(zhuǎn)錄mRNA。
B.實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)用10pfu的兩種重組腺病毒之一感染一式兩份樣品中的鋪滿TK-細(xì)胞單層。24小時(shí)后分離細(xì)胞，根據(jù)生產(chǎn)商(Mol.Res.Center，Cincinnati，OH)說明書用TRI試劑提取RNA。用不含RNA酶的DNA酶處理RNA，用苯酚提取純化，然后調(diào)節(jié)至每份樣品含50毫微克RNA。用Light Cycler-RNA擴(kuò)增試劑盒SYBR green(Roche，Mannheim，Germany；Z.He，等人，Virology 270146-1617(2000))逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增RNA，采用針對(duì)狂犬病病毒糖蛋白的引物、(SEQ ID NO2 5’AAGCATTTCCGCCCAACAC；SEQ ID NO3 3’GGTTAGTGGAGCAGTAGGTAGA)和針對(duì)管家基因戊二醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的引物(SEQ ID NO45’GGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTT；SEQ IDNO53’AATGCCAAAGTTGTCATGGATGACC)。
表1中的數(shù)據(jù)提供了結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示了一式兩份測(cè)定值的平均值±SD。
表1

如上述數(shù)據(jù)所示，將轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄物調(diào)整成管家基因的轉(zhuǎn)錄物顯示了與血清學(xué)可檢測(cè)的蛋白質(zhì)相當(dāng)?shù)牧康牟町悺?br> 在本實(shí)施例未提供的數(shù)據(jù)中，將表達(dá)綠色熒光蛋白和密碼子經(jīng)修飾的截短的人免疫缺陷病毒-1的gag蛋白的其它兩個(gè)Adchimp68重組體與表達(dá)相同轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的Adhu5重組體(它們?cè)赥K-細(xì)胞中顯示出相同的蛋白質(zhì)表達(dá)水平)相比較。因此得出結(jié)論，Adchimp68病毒表達(dá)的狂犬病病毒糖蛋白減少反映了既非病毒攝取又非轉(zhuǎn)錄速度的差別(在兩個(gè)構(gòu)建物中病毒攝取和轉(zhuǎn)錄速度受相同的控制元件調(diào)控)。
實(shí)施例8-用狂犬病病毒抗原免疫小鼠在近交和遠(yuǎn)交小鼠品系中比較了對(duì)Ad.chimp68rab.gp病毒和對(duì)Adhu5rab.gp病毒的狂犬病病毒特異性抗體反應(yīng)。通過皮下或鼻內(nèi)(i.n)給小鼠注射任一重組體的系列稀釋液。14天后收獲血清，用ELISA和病毒中和試驗(yàn)測(cè)定針對(duì)狂犬病病毒糖蛋白的抗體。用表達(dá)無關(guān)轉(zhuǎn)基因(即HIV-1的gag)的重組腺病毒(在上述實(shí)施例中有所描述)作為對(duì)照。這些重組體均不能誘導(dǎo)可被二試驗(yàn)之一檢測(cè)的針對(duì)狂犬病病毒的抗體應(yīng)答。下面是關(guān)于該研究的更詳細(xì)的討論和結(jié)果。
從Jackson Laboratory，Bar Harbor Maine購(gòu)入6-8周齡的C3H/He和C57B1/6雌鼠。遠(yuǎn)交的ICR小鼠購(gòu)自Charles River(Wilmington，MA)。
用不同劑量的腺病毒或重組腺病毒皮下(s.c，在100微升鹽水中)或鼻內(nèi)(i.n.，在50微升鹽水中)注射小鼠。用狂犬病病毒CVS-11株，以10倍的平均致死劑量(LD50)腦內(nèi)給予小鼠進(jìn)行攻擊。
將Evelyn Rokitniki-Abelseth(ERA)的狂犬病病毒和標(biāo)準(zhǔn)的攻擊病毒(ChanllengeVirus Standard)(CVS)-11株在BHK-21細(xì)胞上繁殖。用蔗糖梯度純化ERA病毒，通過β丙酮酰內(nèi)酯處理滅活，并調(diào)節(jié)至蛋白濃度為0.1毫克/毫升。CVS-11病毒在BHK-21細(xì)胞上滴定，然后通過腦內(nèi)注射給予成年ICR小鼠(Z.Q.Xiang，Z.Q.& H.C.Ertl，J.Virol.Meth.47103-16(1994))。在受攻擊后，每隔24-48小時(shí)檢查小鼠，至少21天。一旦它們產(chǎn)生了完全的后肢癱瘓(表明晚期狂犬病病毒腦炎)，使它們安樂死。
血清學(xué)試驗(yàn)包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、抗體的同種型分布測(cè)定和病毒中和試驗(yàn)。
A.ELISA在免疫的不同時(shí)間間隔，通過后眼窩穿刺取血。制備血清，在包被有0.1微克/孔滅活狂犬病病毒的平板上測(cè)定抗狂犬病病毒的抗體。在包被了0.1微克/孔的純化的E1缺失型針對(duì)人血清型5型或黑猩猩血清學(xué)68型的重組腺病毒的平板上，測(cè)試血清中的抗腺病毒抗體。ELISA基本上按照以前所述(Z.Q.Xiang，等人，Virology 219，220-227(1996))那樣進(jìn)行。包被平板過夜。然后用含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS封閉24小時(shí)。洗滌后，加入用PBS-3％BAS稀釋的血清培育60分鐘。洗滌后，加入1∶100稀釋的堿性磷酸酶偶聯(lián)山羊抗小鼠Ig(Cappel)，在冰上放置1小時(shí)。洗滌后，加入底物在室溫下放置20-30分鐘。讀取405nm下的光密度。
B.抗體同種型狂犬病病毒的抗體同種型的測(cè)定在包被滅活ERA病毒的平板上用ELISA法，采用Calbiochem Hybridoma Subisotyping(Lajolla，CA)試劑盒，并如前所述(Xiang，Virol，1996，同上)作一些小改進(jìn)。
兩種腺病毒疫苗皮下免疫時(shí)抗體同種型分布(profile)也不同，但是在鼻內(nèi)免疫時(shí)相當(dāng)。兩種重組體在用這二種接種途徑之一輸送后均引發(fā)了抗狂犬病病毒抗原的IgG2a抗體。
兩重組體在鼻內(nèi)免疫后和Adhu5rab.gp疫苗皮下給藥后誘導(dǎo)了顯著的IgG1應(yīng)答反應(yīng)(表明為Th2輔助)，而對(duì)皮下給予Ad.Chimp68rab.gp構(gòu)建物的應(yīng)答反應(yīng)中卻沒有該抗體。
C.中和性抗體測(cè)試血清中抗CVS-11狂犬病病毒株(該病毒株在抗原性上與ERA病毒株密切相關(guān)(Z.Q.Xiang，等人，Virology.214398-404(1996)))的中和性抗體。用WHO參照血清來進(jìn)行比較。滴度以國(guó)際單位表示。
皮下給予Adchimp68rab.gp病毒誘導(dǎo)的B細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的應(yīng)答強(qiáng)度比Adhu5rab.gp構(gòu)建物低。所有測(cè)試時(shí)間點(diǎn)觀察到的抗體應(yīng)答程度的差異取決于小鼠品系，遠(yuǎn)交ICR小鼠不如近交C3H/He小鼠明顯。相反，在鼻內(nèi)免疫后，經(jīng)ELISA和病毒中和試驗(yàn)測(cè)定，兩種疫苗均誘導(dǎo)了相當(dāng)?shù)目贵w滴度。
皮下免疫后針對(duì)Adchimp68rab.gp重組體的Th1應(yīng)答明顯，此與注射Adhu5rab.gp后更為平衡的Th1/Th2反應(yīng)相反，這支持了佐劑性能不同的觀點(diǎn)。在通過氣道施加后，Adhu5病毒以及假定Adchimp68病毒的天然感染途徑誘導(dǎo)了針對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的抗體滴度，兩者在幅度和同種型分布上相當(dāng)。這提示假定的嗜性和/或佐劑性能的差異是組織依賴性的，即與皮下相比，氣道給予沒有差異或不明顯。
實(shí)施例9-用黑猩猩重組腺病毒優(yōu)先誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)疫苗誘導(dǎo)的針對(duì)狂犬病毒的保護(hù)作用與病毒中和性抗體(VNAs，F(xiàn).L.Graham，等人，J.Gen.Virol.36，59-74(1977))有關(guān)。因此，狂犬病蛋白的研究側(cè)重于刺激免疫系統(tǒng)的這一免疫枝(arm)。在所有的實(shí)驗(yàn)中，小鼠用Adchimph68rab.gp病毒免疫，并平行地用以前描述的基于人血清型5型的Adrab.gp病毒免疫。在此項(xiàng)應(yīng)用中，該重組體指Adhu5rab.gp病毒。
兩種重組腺病毒均誘導(dǎo)出了對(duì)狂犬病病毒攻擊的保護(hù)作用。當(dāng)用10倍平均致死劑量(LD50)的CVS株狂犬病毒攻擊3周后，經(jīng)5×106pfu的兩種重組腺病毒之一免疫(皮下給予)的C3H/He小鼠仍然沒有患病。CVS株狂犬病病毒株抗原性與ERA病毒株密切相關(guān)，但在嚙齒類動(dòng)物中更具有毒力。在5×105pfu的較低疫苗劑量時(shí)，Adhu5rab.gp病毒仍然提供了完全的保護(hù)作用，而少數(shù)經(jīng)Adchimp68rab.gp免疫的小鼠受到感染。進(jìn)一步降低疫苗劑量，結(jié)果導(dǎo)致Adchimp68rab.gp疫苗喪失效力。在鼻內(nèi)免疫后，兩種疫苗均提供了完全的保護(hù)作用(如果給予5×105pfu)。在5×104pfu的較低劑量時(shí)，Adhu5rab.gp疫苗免疫的小鼠有50％產(chǎn)生了漸進(jìn)性疾病，而用該劑量Adchimp68rab.gp重組體免疫的那些小鼠受到保護(hù)。經(jīng)表達(dá)無關(guān)抗原的兩種血清型重組腺病毒或5×103pfu的任一重組腺病毒(表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白)免疫的所有小鼠均產(chǎn)生了致命的狂犬病腦炎。
實(shí)施例10-針對(duì)不同人腺病毒血清型的已有免疫力對(duì)于抗狂犬病病毒抗體應(yīng)答反應(yīng)的影響為了測(cè)試以前接觸任一種常見的人腺病毒血清型(例如人血清型2、3、4、7和12型)是否會(huì)抑制對(duì)Adchimp68rab.gp疫苗的抗體反應(yīng)，用4×108pfu的有復(fù)制能力的人血清型2、4、5、7或12型腺病毒或黑猩猩血清型68型腺病毒(后一血清型是E1缺失的)免疫C3H/He小鼠組。兩周后，用Adhu5rab.gp或Adchimp68rab.gp病毒疫苗皮下接種小鼠。Adhu5rab.gp重組體所用劑量為2×105pfu/小鼠，而Adchimp68rab.gp在該低劑量皮下給予后在C3H/He小鼠中僅誘導(dǎo)出少量抗體應(yīng)答，因而以2×107pfu/小鼠的劑量注射。2周后收獲血清，用ELISA測(cè)試抗狂犬病病毒糖蛋白的抗體。在原初小鼠中，對(duì)Adhu5rab.gp的狂犬病毒特異性反應(yīng)稍稍高于針對(duì)Adchimp68病毒引發(fā)的反應(yīng)。在經(jīng)Adhu5預(yù)先免疫的小鼠中，針對(duì)Adhu5rab.gp病毒的反應(yīng)完全被抑制。在經(jīng)人血清型4、2、7和12型腺病毒預(yù)先免疫的小鼠，也見到了有一些下降。在先前接觸過Adchimp68病毒的小鼠中，此反應(yīng)未受影響。在經(jīng)同源病毒預(yù)先免疫的小鼠中，對(duì)Adchimp68rab.gp病毒的反應(yīng)受到強(qiáng)烈抑制。先前曾遭遇人血清型2型腺病毒的小鼠顯示對(duì)Adchimp68疫苗提供的狂犬病病毒抗原的抗體反應(yīng)稍有下降。經(jīng)任一其它血清型人腺病毒接種的小鼠在經(jīng)Adchimp68rab.gp病毒免疫后，產(chǎn)生的抗狂犬病病毒的抗體滴度與接種前的原初小鼠相似或數(shù)量級(jí)有所增加。具體地說，經(jīng)Adhu5病毒預(yù)先免疫的小鼠在用Adchimp68rab.gp構(gòu)建物接種后產(chǎn)生了更高的抗體滴度，這可能反映了存在交叉反應(yīng)性T輔助細(xì)胞促進(jìn)了對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的B細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)。
為了進(jìn)一步確定在相同的疫苗劑量下，Adchimp68rab.gp疫苗是否能在經(jīng)Adhu5病毒預(yù)先免疫的小鼠中誘導(dǎo)出比Adhu5rab.gp病毒更高的抗體滴度，進(jìn)行疫苗滴度實(shí)驗(yàn)。用4×108pfu的E1缺失型重組腺病毒給C3H/He小鼠組皮下免疫HPV-16的L1抗原。接種2周后，以不同劑量皮下給予小鼠Adhu5rab.gp或Adchimp68rab.gp病毒。2周后取小鼠血，用ELISA(結(jié)果未顯示)和病毒中和試驗(yàn)測(cè)定針對(duì)狂犬病病毒的血清抗體滴度。兩個(gè)試驗(yàn)均未顯示出Adhu5免疫小鼠中抗Adchimp68rab.gp構(gòu)建物的抗體反應(yīng)有明顯降低。Adhu5構(gòu)建物在經(jīng)同源病毒預(yù)先免疫的小鼠中表現(xiàn)出的抗狂犬病病毒抗體滴度嚴(yán)重降低取決于疫苗的劑量。對(duì)低劑量疫苗的抗體反應(yīng)比對(duì)于高劑量疫苗更受影響。VNA滴度下降比ELISA滴度下降大得多。在預(yù)先經(jīng)Adhu5免疫的小鼠中，最高劑量疫苗的VNA滴度減半，而在兩個(gè)較低劑量疫苗下，滴度降低超過20倍。在任一測(cè)試的劑量下，Adchimp68rab.gp重組體在經(jīng)Adhu5預(yù)先免疫的小鼠中誘導(dǎo)出了比相同劑量的Adhu5rab.gp疫苗所得滴度更高的抗狂犬病的VNA滴度。在一個(gè)保護(hù)性實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步證明，預(yù)先存在的針對(duì)Adhu5的免疫力對(duì)Adhu5疫苗的效力有不利影響。經(jīng)2×105pfu的Adhu5rab.gp或Adchimp68rab.gp病毒免疫的原初小鼠在經(jīng)CVS-11病毒攻擊時(shí)得到完全的保護(hù)。大多數(shù)(65％)經(jīng)Adhu5預(yù)先免疫的小鼠經(jīng)該劑量的Adhu5rab.gp疫苗免疫后受到狂犬病病毒感染，而經(jīng)相同劑量Adchimp68rab.gp病毒接種的那些小鼠受到保護(hù)。使每只小鼠的Adhu5rab.gp病毒劑量增加至2×106pfu恢復(fù)了疫苗的效力。
對(duì)常見人腺病毒血清型的預(yù)先免疫力抑制了對(duì)相應(yīng)的人血清型5型重組病毒的應(yīng)答，但不影響對(duì)Adchimp68重組體表達(dá)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的抗體應(yīng)答。在用有復(fù)制能力的病毒預(yù)先免疫后，Adhu5預(yù)先免疫的小鼠中的針對(duì)Adhu5rab.gp疫苗的免疫應(yīng)答受到破壞，而在經(jīng)其它人血清型腺病毒(如2型和4型)預(yù)先免疫的小鼠中，該免疫反應(yīng)有所減弱。在同源病毒預(yù)先免疫的小鼠中，針對(duì)Adchimp68重組體的反應(yīng)如預(yù)計(jì)的那樣被抑制。這不具有臨床意義，因?yàn)锳dchimp68病毒在人群中不循環(huán)，而常見的人血清型和Adchimp68病毒不共有中和性表位。
預(yù)先接觸復(fù)制缺陷型Adhu5也降低了針對(duì)Adhu5重組體所提供的狂犬病病毒糖蛋白的抗體反應(yīng)，但是，該影響不如預(yù)先感染了有復(fù)制能力病毒的小鼠那樣嚴(yán)重。預(yù)先經(jīng)復(fù)制缺陷型Adhu5病毒免疫的小鼠在用Adhu5rab.gp疫苗免疫后，其血清產(chǎn)生了減少的但容易檢測(cè)的針對(duì)狂犬病病毒的抗體。增加Adhu5rab.gp構(gòu)建物的劑量能部分防止預(yù)先存在的免疫力的影響。疫苗誘導(dǎo)的針對(duì)狂犬病病毒的保護(hù)作用需要VNA。Adhu5疫苗預(yù)先免疫小鼠不能有效地誘導(dǎo)出VNA，尤其當(dāng)采用較低劑量時(shí)。在Adhu5預(yù)先免疫的小鼠中，針對(duì)Adchimp68rab.gp構(gòu)建物的VNA反應(yīng)在所有測(cè)試劑量下均高于Adhu5疫苗，因此，不是對(duì)該疫苗在皮下免疫時(shí)效力較低的補(bǔ)償。
因此，Adchimp68重組體提供了一種有吸引力的人用疫苗載體替換物。如本文所示，甚至當(dāng)通過非侵入性給藥途徑(如通過上氣道)以2×105pfu的低劑量給予時(shí)，它們也是有效的。鼻內(nèi)給予的粘膜免疫還有其它優(yōu)點(diǎn)，它有利于誘導(dǎo)常見的粘膜免疫系統(tǒng)應(yīng)答(與注射疫苗所靶向的中央免疫系統(tǒng)相關(guān)但又有區(qū)別)。
實(shí)施例11-黑猩猩C68病毒原種和復(fù)制下列實(shí)施例11至15提供了黑猩猩C68的其它特征鑒定。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，該信息能很容易地用于構(gòu)建新的重組黑猩猩腺病毒構(gòu)建物。
C68病毒原種得自ATCC(Rockville，MD)，使其在用添加了10％胎牛血清(FCS；Sigma或Hyclone，Logan，UT)和1％青霉素-鏈霉素(Sigma)的DMEM(Sigma，St.Louis，MO)培養(yǎng)的293細(xì)胞(ATCC)中繁殖。在添加了2％FCS的DMEM中進(jìn)行293細(xì)胞感染24小時(shí)，然后加入FCS使其最終濃度為10％。當(dāng)100％的細(xì)胞表現(xiàn)出病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)后，收獲感染的細(xì)胞，收集并離心濃縮。將細(xì)胞沉淀重懸于10mMTris(Ph8.0)中，通過3輪凍融裂解。在2次氯化銫密度梯度超離心后獲得病毒制備物，將病毒原種以10mM Tris/100mM NaCl/50％甘油稀釋至1×1012顆粒/毫升，儲(chǔ)存于-70℃。
實(shí)施例12-病毒基因組DNA的克隆和測(cè)序用標(biāo)準(zhǔn)方法分離純化的病毒制備物的基因組DNA，根據(jù)生產(chǎn)商說明書用一組16個(gè)限制性酶消化。除非另有所述，所有限制性和修飾性酶均購(gòu)自Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN。用BamHI，PstI，SalI，HindIII或XbaI消化基因組DNA，將片段亞克隆到質(zhì)粒中(K.L.Berkner和P.A.Sharp，Nucl.Acids Res.，116003-20(1983))。除去蛋白質(zhì)后，用PacI和BamHI或PstI雙消化合成的10bp PacI接頭(New England Biolabs，Beverly，MA)。
從C68產(chǎn)生的PstI，BamHI和HindIII克隆分別如圖1、部分C、D和E所述。帶陰影的方框表示的片段沒有被克隆，但是通過對(duì)重疊的克隆和病毒DNA直接測(cè)序(無陰影的方框)，確定了整個(gè)基因組的序列?？寺〉钠稳绫?所述。
表2.C68質(zhì)?？寺『筒迦胛锎笮?

pBS＝pBluescript SK+克隆pNEB＝pNEB193克隆pBR＝pBR322克隆沒有前綴＝未克隆的片段黑猩猩腺病毒C68得自ATCC并在人293細(xì)胞上繁殖。病毒基因組DNA用已建立的步驟(A.R.Davis，等人，Gene Thera，51148-1152(1998))從純化的毒粒中分離得到，并用一組限制性酶消化；數(shù)據(jù)與以前的研究(數(shù)據(jù)未顯示)(G.R.Kitchingman，Gene，20205-210(1982)；Q.Li和G.Wadell，Arch Virol.10165-77(1998)；R.Wigand，等人，Intervirology.301-9(1989))相符。將跨越C68整個(gè)基因組的限制性片段亞克隆到質(zhì)粒中。C68基因組的示意圖如圖1A所示，克隆到質(zhì)粒載體中的Pst-I、BamHI和HindIII片段用無陰影的方框分別表示在圖1B，1C和1D中?？寺〉钠巍⑵未笮『突蚪M位置也列在表2中。兩個(gè)質(zhì)?？寺『突蚪MDNA用作測(cè)序模板。通過在兩個(gè)方向上的引物前進(jìn)(primer walking)對(duì)基因組進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)堿基包括在平均約四個(gè)反應(yīng)中。
C68基因組長(zhǎng)度為36521bp(見美國(guó)專利6,083,716)。與GenBank序列的初步比較表明，其在病毒基因組的整個(gè)長(zhǎng)度上與其它人和動(dòng)物腺病毒有不同程度的相似性。在C68基因組中發(fā)現(xiàn)了與所有前述腺病毒遺傳單位(早期區(qū)域1-4和主要晚期基因)同源的區(qū)域(圖1A)。根據(jù)C68和人腺病毒(已經(jīng)完成測(cè)序)、Ad2(NC001405)、Ad5(NC001405)、AD12(NC001460)、AD17(NC002067)和Ad40(NC01464)之間的DNA同源性來定制克隆。測(cè)定開放讀框(ORF)，根據(jù)與其它人腺病毒的同源性來鑒定基因。C68中存在所有的主要腺病毒早期和晚期基因。末端反向重復(fù)序列(ITR)的長(zhǎng)度為130bp。
實(shí)施例13-C68序列的分析篩選GenBank登錄的所有Mastadenovirus屬的每個(gè)成員(包括不同種屬的分離物)的全部核苷酸序列與C68的相同性。從下列GenBank序列裝配出Ad4最小基因組右手ITR(J01964)；E1A區(qū)域(M14918)；DNA pol和pTP(X74508，74672)；VA RNA-I，II(U10682)；52，55K(U52535)；pVII(U70921)；六鄰體(X84646)；內(nèi)切蛋白酶(M16692)；DNA-結(jié)合蛋白(M12407)；尾絲(X76547)；右手ITR(J01965)。從下列序列產(chǎn)生Ad7復(fù)合基因組Mu 3-21(X03000)；VA RNA-I，II，pTP & 52，55K(U52574)；五鄰體(AD001675)；pVI，六鄰體和內(nèi)切蛋白酶(AF065065)；DNA-結(jié)合蛋白(K02530)；E3和尾絲區(qū)域(AF104384)；右手ITR(V0037)。
氨基酸序列對(duì)比用Clustal X產(chǎn)生，用Jalview(http//www.ebi.ac.uk/～michele/jalview/)編輯，用Boxshade(http//www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)分析。先對(duì)公眾可獲得的所有人腺病毒血清型的六鄰體蛋白質(zhì)序列進(jìn)行對(duì)比，以鑒定顯示與C68最高同源性的系列。
將C68基因組中的所有的明顯的開放讀框的核苷酸序列和預(yù)計(jì)的氨基酸序列與已知的DNA和蛋白質(zhì)序列相比較。將C68的核苷酸序列與Ad2，4，5，7，12，17和40的序列相比較。與以前的限制性分析(Kitchingman，同上；Li和Wadell，同上)一樣，C68與人Ad4(亞E型)最相似。
C68的E1A區(qū)域從nt480的TATA盒延伸到1521位的poly A。共有的剪接供體和受體位點(diǎn)在人Ad對(duì)應(yīng)物的類似位置中，28.2K和24.8K的蛋白與人Ad蛋白的大小相似。C68的最小E1A蛋白的ORF預(yù)計(jì)編碼101個(gè)殘基(與其它腺病毒的約60個(gè)氨基酸不同)。C68的60位殘基有TTA密碼子，而其它腺病毒通常具有TGA終止密碼子。C68 E1A 100R蛋白的前60個(gè)殘基與AD4同源物有85％的相同性。
C68基因組編碼了四個(gè)E1B蛋白(20.5K，54.7K，10.1K和18.5K)以及pIX的基因。這五個(gè)C68編碼蛋白的大小與其它AdE1B和pIX蛋白相似。E1B 21K蛋白的Ad4同源物只有142個(gè)氨基酸，而C68具有186個(gè)殘基，其它人腺病毒有163-178個(gè)殘基。C68和Ad4蛋白質(zhì)在前134個(gè)氨基酸中有95％的相同性，然后相似性終止，Ad4蛋白質(zhì)終止于142個(gè)氨基酸處。
C68基因組編碼E2A 55K DNA結(jié)合蛋白的同源物和Iva2成熟蛋白以及E2B末端蛋白和DNA聚合酶。所有的E2區(qū)域蛋白大小與其人Ad對(duì)應(yīng)物相似，E2B蛋白是尤其保守的。預(yù)計(jì)C68 E2B 123.6K DNA聚合酶有1124個(gè)殘基，而預(yù)計(jì)Ad4有1193個(gè)，而具它人腺病毒有更小的聚合酶。Ad4聚合酶的殘基1-71與其它任何Ad聚合酶沒有相似性，該蛋白實(shí)際上可能起始于內(nèi)部的ATG密碼子。從氨基酸72-1193，Ad4和C68聚合酶具有有96％的氨基酸相同性。
已測(cè)序的人腺病毒E3區(qū)域迄今表現(xiàn)出有相當(dāng)大的序列和編碼能力變異。Ad40有5個(gè)E3區(qū)域基因，Ad12有6個(gè)，C68和Ad5有7個(gè)，Ad38有8個(gè)，Ad3和Ad7(B亞型人腺病毒)有9個(gè)推定的E3區(qū)域基因。Ad4 E3區(qū)域至今還未測(cè)序。與Ad35的E3區(qū)域相比，在C68基因組中鑒定到所有7個(gè)E3基因同源物(C.F.Basler和M.S.Horwitz，Virology，215165-177(1996))。
C68 E4區(qū)域有6個(gè)ORF，每一個(gè)均與人Ad5，12和40 E4區(qū)域中的蛋白質(zhì)同源。E4的命名混亂，因?yàn)镃68、Ad12和Ad40的ORF2同源物約為130個(gè)殘基，而在Ad5中有兩個(gè)ORF編碼64和67個(gè)殘基的蛋白質(zhì)，它們分別與較大的ORF2蛋白的氨基端和羧基端同源。在我們的命名中，省略了ORF5，因?yàn)镋4區(qū)域中的第五個(gè)ORF與廣泛研究的人Ad5的ORF6蛋白同源。
對(duì)C68基因中的主要晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)引導(dǎo)序列進(jìn)行定位。對(duì)可能編碼15個(gè)主要晚期蛋白的ORF進(jìn)行了定位。所有的C68晚期蛋白的大小與其人Ad對(duì)應(yīng)物相似。黑猩猩和人Ad晚期蛋白之間的氨基酸相同性百分?jǐn)?shù)變化很大。預(yù)計(jì)C68尾絲蛋白與Ad4蛋白有90％的氨基酸相同性，而與其它人Ad尾絲蛋白的相似性低得多。C68的尾絲節(jié)中存在CAR結(jié)合位點(diǎn)。
實(shí)施例14-病毒中和性抗體試驗(yàn)進(jìn)行幾個(gè)研究以確定C68和人腺病毒的類型特異性抗血清之間是否有交叉反應(yīng)性。血清的中和活性測(cè)試如下。用293細(xì)胞作為指示細(xì)胞系，評(píng)價(jià)從正常人對(duì)象(N＝52)、獼猴(N＝52)和黑猩猩(N＝20)獲得的各組血清抗Ad5和C68為基礎(chǔ)的載體的中和性抗體。將從人、獼猴或黑猩猩個(gè)體收集到的血清56℃滅活30分鐘。將各樣品的系列稀釋液(1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，在100微升含10％FCS的DMEM中)加入等量H5.010CMVEGFP(100PFU/孔)或C68CMVEGFP病毒中，4℃培育兩小時(shí)。將150微升混合物轉(zhuǎn)移到96孔平底版中的2×104293細(xì)胞上。對(duì)照孔用等量病毒感染(不加入血清)。樣品在5％CO2、37℃培育48小時(shí)，在熒光顯微鏡下檢查。將與受感染對(duì)照相比綠色熒光聚焦減少50％以下的樣品稀釋度記錄為中和性抗體陽(yáng)性。
如所預(yù)計(jì)的那樣，約35％正常人顯示有抗Ad5中和性抗體，該頻率比在獼猴和黑猩猩血清中所見的頻率要高得多。在80％的黑猩猩中發(fā)現(xiàn)有抗C68中和性抗體，而在僅僅2％的正常人或獼猴中發(fā)現(xiàn)有該抗體。非靶種類動(dòng)物中的中和性抗體滴度通常很低。
為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)C68和人腺病毒載體的交叉反應(yīng)性，用2×107噬斑形成單位(pfu)的Ad2，4，5，7和12以及C68免疫小鼠。2周后收獲血清，測(cè)試中和Ad5或C68載體的抗體?？笰d5載體的中和抗體僅在經(jīng)Ad5免疫的動(dòng)物中被檢測(cè)到。重要的是，具有抗C68載體的中和性抗體的動(dòng)物僅僅是經(jīng)C68載體免疫的那些動(dòng)物；沒有一種測(cè)試的人血清型(包括Ad4)在小鼠中產(chǎn)生體外中和C68的抗體。
對(duì)于C68載體在人試驗(yàn)中的用途，重要的是人群中缺乏中和性抗體。在我們的研究中，用顯示50％以上黑猩猩有中和性抗體的相同試驗(yàn)對(duì)50個(gè)正常人進(jìn)行篩選，結(jié)果沒有檢測(cè)到任何顯著的中和性抗體(＞1∶10)。另外，經(jīng)多種人Ad血清型(包括Ad4)免疫的小鼠血清不能中和C68感染。
在另一研究中，給一組10至20個(gè)ICR小鼠皮下(s.c.)、鼻內(nèi)(i.n)或口服(os)接種不同劑量的Adhu5rab.gp或AdC68rab.gp疫苗。21天后取小鼠血，測(cè)定病毒中和性抗體(VNA)并表示成國(guó)際單位。接種4周后用10倍平均致死劑量的CVS-24病毒直接加入中樞神經(jīng)系統(tǒng)來攻擊小鼠。
病毒中和抗體滴度(攻擊后存活百分?jǐn)?shù))疫苗劑量5×1075×1065×1055×104Adhu5rab.gp，s.c. 972(100) 324(100) 108(100) 12(100)AdC68rab.gp，s.c. 240(100) 36(100)12(30) 8(80)Adhu5rab.gp，i.n. nt162(100) 162(100) 18(50)AdC68rab.gp，i.n. nt54(100)162(100) 18(50)2×1072×1062×1052×104Adhu5rab.gp，os 108(100) 54(88) 18(80) 4(30)AdC68rab.gp，os 108(100) 36(78) 12(55) 0.2(0)這些數(shù)據(jù)證明AdC68構(gòu)建物在低劑量鼻內(nèi)給藥時(shí)出人意料地誘導(dǎo)了比人5型更好的保護(hù)性抗體應(yīng)答。
實(shí)施例15-六鄰體蛋白的結(jié)構(gòu)分析C68和人血清型之間缺少中和性抗體迫使我們更小心地評(píng)價(jià)推測(cè)攜帶類型特異性表位的六鄰體區(qū)域的結(jié)構(gòu)差異。以前的研究提示，這些表位位于Crawford-Miksza和Schnurr(J.Virol，701836-1844(1996))所測(cè)定的六鄰體的7個(gè)超變區(qū)中。圖2顯示了C68以及幾種人腺病毒之間的六鄰體蛋白的氨基酸序列比較。實(shí)際上，C68在這些超變序列的顯著區(qū)域中基本上是不相似的。進(jìn)行了更詳細(xì)的C68六鄰體三維結(jié)構(gòu)模型設(shè)計(jì)，以描繪其獨(dú)特的序列。根據(jù)Ad2和Ad5的六鄰體的x-射線晶體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了C68和Ad4的六鄰體結(jié)構(gòu)模型。
對(duì)Ad5六鄰體的X-射線晶體結(jié)構(gòu)(Protein Data Bank identifier 1RUX)(J.J.Rux和R.M.Burnett，Mol.Ther.118-30(2000))以及Ad2的六鄰體的X-射線晶體結(jié)構(gòu)(F.K.Athappilly，等人，J.Mol.Biol.，242430-455(1994))進(jìn)一步精細(xì)化，產(chǎn)生得到目前的六鄰體模型(Rux和Burnett，待發(fā)表)。先用Swiss-PdbViewer蛋白模型環(huán)境(N.Guez和M.C.Peitsch，Electrophoresis，182714-2723(1997))產(chǎn)生同源性C68和Ad4六鄰體的模型。用自動(dòng)化步驟將C68和Ad4六鄰體氨基酸序列與Ad2和Ad5六鄰體晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比。用序列對(duì)比來指導(dǎo)將模型序列穿在已知的分子結(jié)構(gòu)上。從一個(gè)側(cè)鏈啟動(dòng)子(side chainpromoter)文庫(kù)中選出已知結(jié)構(gòu)中未見的殘基的側(cè)鏈位置。然后，通過將空隙移到外露的可變區(qū)中和優(yōu)化側(cè)鏈的包裝來人工調(diào)節(jié)這些初始分子模型，以改進(jìn)自動(dòng)化序列對(duì)比。從已知的環(huán)結(jié)構(gòu)文庫(kù)選出Ad2和Ad5模板結(jié)構(gòu)中未觀察到的外部環(huán)節(jié)段位置，或進(jìn)行人工擬合。用分子機(jī)制程序CHARMM(B.R.Brooks，等人，J.Comp.Chem.，4187-217(1983))通過能量最小化來進(jìn)一步精細(xì)化各模型的構(gòu)型。然后排列對(duì)比C68和Ad4六鄰體模型的結(jié)構(gòu)，計(jì)算新的序列排列對(duì)比。將兩個(gè)經(jīng)結(jié)構(gòu)排列的對(duì)比六鄰體序列之間的差異用于同源模型的彩色圖象。輸出Swiss-PdbViewer程序中形成的圖象，并用Vision Ray Tracer程序(POV-Ray 2000，3.1g版)的Persistence值表示。
雖然整個(gè)C68序列與Ad4六鄰體非常相似，但是此兩個(gè)序列之間的差別主要集中在DE1和FG1環(huán)，而這些區(qū)域含有所有7個(gè)超變區(qū)。分別來自不同亞基的DE1、FG1和FG2環(huán)與在三聚物分子頂部形成塔形結(jié)構(gòu)域(tower domain)密切相關(guān)。六鄰體塔形成了病毒粒子外表面的大部分，并且是抗體的結(jié)合位點(diǎn)。由于六鄰體的側(cè)面和底部和衣殼包裝在一起，這些區(qū)域被屏蔽而不和抗體結(jié)合，它們的序列是保守的。相反，C68和Ad4的序列在六鄰體塔中有很大的不同。這直接解釋了為何抗兩種病毒之一的抗體不發(fā)生交叉反應(yīng)的原因。
本說明書引述的所有出版物以及序列表均納入本文作為參考。盡管本發(fā)明參照特別佳的方案進(jìn)行了描述，但可以理解，可不脫離本發(fā)明精神而對(duì)本發(fā)明作改動(dòng)。這些改變均被認(rèn)為在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
序列表<110>威斯特解剖及生物研究所(The Wistar Institute of Anatomy and Biology)賓夕法尼亞州立大學(xué)托管會(huì)(The Trustees of The University of Pennsylvania)H.C.J.埃特爾(ERTL，Hildegund，C.，J.)J.M.威爾遜(WILSON，James，M.)<120>誘導(dǎo)細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答的方法和用于該方法的重組猿猴腺病毒組合物<130>WST104A/UPNN2628A<150>US60/300,131<151>2001-06-22<150>US60/304,843<151>2001-07-12<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽，攜帶H-2d單體型免疫優(yōu)勢(shì)CD8+T細(xì)胞表位<400>1Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile1 5<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>狂犬病病毒糖蛋白的5′引物<400>2aagcatttcc gcccaacac 19
<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>狂犬病病毒糖蛋白的3’引物<400>3ggttagtgga gcagtaggta ga22<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>戊二醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的5’引物<400>4ggtgaaggtc ggtgtgaacg gattt 25<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GAPDH的3’引物<400>5aatgccaaag ttgtcatgga tgacc 25<210>6<211>7228<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>修飾的HIV-1 gag序列
<220>
<221>CDS<222>(729)..(1820)<223>
<400>6tggaagggct aatttggtcc caaaaaagac aagagatcct tgatctgtgg atctaccaca60cacaaggcta cttccctgat tggcagaact acacaccagg gccagggatc agatatccac120tgacctttgg atggtgcttc aagttagtac cagttgaacc agagcaagta gaagaggcca180aataaggaga gaagaacagc ttgttacacc ctatgagcca gcatgggatg gaggacccgg240agggagaagt attagtgtgg aagtttgaca gcctcctagc atttcgtcac atggcccgag300agctgcatcc ggagtactac aaagactgct gacatcgagc tttctacaag ggactttccg360ctggggactt tccagggagg tgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat420gctacatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga480gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct540tgagtgctca aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc600agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag660cgaaagtaaa gccagaggag atctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcgtcg720acagagag atg ggt gcg aga gcg tca gta tta agc ggg gga gaa tta gat 770Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp1 5 10cga tgg gaa aaa att cgg tta agg cca ggg gga aag aag aag tac aag 818Arg Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys15 20 25 30cta aag cac atc gta tgg gca agc agg gag cta gaa cga ttc gca gtt 866Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val35 40 45aat cct ggc ctg tta gaa aca tca gaa ggc tgt aga caa ata ctg gga 914Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly50 55 60cag cta caa cca tcc ctt cag aca gga tca gag gag ctt cga tca cta 962Gln Leu Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu65 70 75tac aac aca gta gca acc ctc tat tgt gtg cac cag cgg atc gag atc 1010Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile Glu Ile80 85 90aag gac acc aag gaa gct tta gac aag ata gag gaa gag caa aac aag 1058Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys95 100 105 110tcc aag aag aag gcc cag cag gca gca gct gac aca gga cac agc aat 1106Ser Lys Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Asn115 120 125cag gtc agc caa aat tac cct ata gtg cag aac atc cag ggg caa atg 1154Gln Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met130 135 140
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atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta4460tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg4520tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac4580gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg4640aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc4700gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg4760ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat4820gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg4880gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg4940atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc5000ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt5060cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct5120cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc5180gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca5240cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct5300cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt5360taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga5420ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca5480aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac5540caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg5600taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag5660gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac5720cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt5780taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg5840agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc5900ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc5960gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc6020acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa6080acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt6140tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg6200ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag6260agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc6320acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc6380tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa6440ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagctcg6500gaattaaccc tcactaaagg gaacaaaagc tgctgcaggg tccctaactg ccaagcccca6560
cagtgtgccc tgaggctgcc ccttccttct agcggctgcc cccactcggc tttgctttcc 6620ctagtttcag ttacttgcgt tcagccaagg tctgaaacta ggtgcgcaca gagcggtaag 6680actgcgagag aaagagacca gctttacagg gggtttatca cagtgcaccc tgacagtcgt 6740cagcctcaca gggggtttat cacattgcac cctgacagtc gtcagcctca cagggggttt 6800atcacagtgc acccttacaa tcattccatt tgattcacaa tttttttagt ctctactgtg 6860cctaacttgt aagttaaatt tgatcagagg tgtgttccca gaggggaaaa cagtatatac 6920agggttcagt actatcgcat ttcaggcctc cacctgggtc ttggaatgtg tcccccgagg 6980ggtgatgact acctcagttg gatctccaca ggtcacagtg acacaagata accaagacac 7040ctcccaaggc taccacaatg ggccgccctc cacgtgcaca tggccggagg aactgccatg 7100tcggaggtgc aagcacacct gcgcatcaga gtccttggtg tggagggagg gaccagcgca 7160gcttccagcc atccacctga tgaacagaac ctagggaaag ccccagttct acttacacca 7220ggaaaggc 7228<210>7<211>363<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>修飾的HIV-1 gag序列<400>7Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp1 5 10 15Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys20 25 30His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro35 40 45Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu50 55 60Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn65 70 75 80Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile Glu Ile Lys Asp85 90 95Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys100 105 110
Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Asn Gln Val115 120 125Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His130 135 140Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu145 150 155 160Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser165 170 175Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly180 185 190Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu195 200 205Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala210 215 220Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr225 230 235 240Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile245 250 255Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys260 265 270Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly275 280 285Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu290 295 300Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr305 310 315 320Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala325 330 335Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly340 345 350Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu355 360<210>8<211>311<212>PRT
<213>黑猩猩型腺病毒<400>8Asn Thr Cys Gln Trp Thr Tyr Lys Ala Asp Gly Glu Thr Ala Thr Glu1 5 10 15Lys Thr Tyr Thr Tyr Gly Asn Ala Pro Val Gln Gly Ile Asn Ile Thr20 25 30Lys Asp Gly Ile Gln Leu Gly Thr Asp Thr Asp Asp Gln Pro Ile Tyr35 40 45Ala Asp Lys Thr Tyr Gln Pro Glu Pro Gln Val Gly Asp Ala Glu Trp50 55 60His Asp Ile Thr Gly Thr Asp Glu Lys Tyr Gly Gly Arg Ala Leu Lys65 70 75 80Pro Asp Thr Lys Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Phe Ala Lys Pro Thr85 90 95Asn Lys Glu Gly Gly Gln Ala Asn Val Lys Thr Gly Thr Gly Thr Thr100 105 110Lys Glu Tyr Asp Ile Asp Met Ala Phe Phe Asp Asn Arg Ser Ala Ala115 120 125Ala Ala Gly Leu Ala Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Val Asp130 135 140Leu Glu Thr Pro Asp Thr His Ile Val Tyr Lys Ala Gly Thr Asp Asp145 150 155 160Ser Ser Ser Ser Ile Asn Leu Gly Gln Gln Ala Met Pro Asn Arg Pro165 170 175Val Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr Asn180 185 190Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu Asn195 200 205Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Leu210 215 220Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn225 230 235 240Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His245 250 255Gly Val Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Asp Ala Val260 265 270
Gly Arg Thr Asp Thr Tyr Gln Gly Ile Lys Ala Asn Gly Thr Asp Gln275 280 285Thr Thr Trp Thr Lys Asp Asp Ser Val Asn Asp Ala Asn Glu Ile Gly290 295 300Lys Gly Asn Pro Phe Ala Met305 310<210>9<211>314<212>PRT<213>人4型腺病毒<400>9Asn Thr Cys Gln Trp Lys Asp Ser Asp Ser Lys Met His Thr Phe Gly15 10 15Ala Ala Ala Met Pro Gly Val Thr Gly Lys Lys Ile Glu Ala Asp Gly20 25 30Leu Pro Ile Arg Ile Asp Ser Thr Ser Gly Thr Asp Thr Val Ile Tyr35 40 45Ala Asp Lys Thr Phe Gln Pro Glu Pro Gln Val Gly Asn Asp Ser Trp50 55 60Val Asp Thr Asn Gly Ala Glu Glu Lys Tyr Gly Gly Arg Ala Leu Lys65 70 75 80Asp Thr Thr Lys Met Asn Pro Cys Tyr Gly Ser Phe Ala Lys Pro Thr85 90 95Asn Lys Glu Gly Gly Gln Ala Asn Leu Lys Asp Ser Glu Pro Ala Ala100 105 110Thr Thr Pro Asn Tyr Asp Ile Asp Leu Ala Phe Phe Asp Ser Lys Thr115 120 125Ile Val Ala Asn Tyr Asp Pro Asp Ile Val Met Tyr Thr Glu Asn Val130 135 140Asp Leu Gln Thr Pro Asp Thr His Ile Val Tyr Lys Pro Gly Thr Glu145 150 155 160Asp Thr Ser Ser Glu Ser Asn Leu Gly Gln Gln Ala Met Pro Asn Arg165 170 175Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr
180 185 190Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu195 200 205Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln210 215 220Leu Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp225 230 235 240Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Ash245 250 255His Gly Val Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Asn Gly260 265 270Val Gly Leu Thr Asp Thr Tyr Gln Gly Val Lys Val Lys Thr Asp Ala275 280 285Glv Ser Glu Lys Trp Asp Lys Asp Asp Thr Thr Val Ser Asn Ala Asn290 295 300Glu Ile His Val Gly Asn Pro Phe Ala Met305 310<210>10<211>318<212>PRT<213>人16型腺病毒<400>10Asn Thr Cys Gln Trp Lys Asp Ser Asp Ser Lys Met His Thr Phe Gly1 5 10 15Val Ala Ala Met Pro Gly Val Thr Gly Lys Lys Ile Glu Ala Asp Gly20 25 30Leu Pro Ile Gly Ile Asp Ser Thr Ser Gly Thr Asp Thr Val Ile Tyr35 40 45Ala Asp Lys Thr Phe Gln Pro Glu Pro Gln Val Gly Asn Ala Ser Trp50 55 60Val Asp Ala Asn Gly Thr Glu Glu Lys Tyr Gly Gly Arg Ala Leu Lys65 70 75 80Asp Thr Thr Lys Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Phe Ala Lys Pro Thr85 90 95Asn Lys Glu Gly Gly Gln Ala Asn Leu Lys Asp Ser Glu Thr Ala Ala
100 105 110Thr Thr Pro Asn Tyr Asp Ile Asp Leu Ala Phe Phe Asp Asn Lys Asn115 120 125Ile Ala Ala Asn Tyr Asp Pro Asp Ile Val Met Tyr Thr Glu Asn Val130 135 140Asp Leu Gln Thr Pro Asp Thr His Ile Val Tyr Lys Pro Gly Thr Glu145 150 155 160Asp Thr Ser Ser Glu Ser Asn Leu Gly Gln Gln Ala Met Pro Asn Arg165 170 175Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr180 185 190Asn Ser Thr Gly Ash Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu195 200 205Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln210 215 220Leu Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp225 230 235 240Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn245 250 255His Gly Val Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Asn Gly260 265 270Val Gly Phe Thr Asp Thr Tyr Gln Gly Val Lys Val Lys Thr Asp Ala275 280 285Val Ala Gly Thr Ser Gly Thr Gln Trp Asp Lys Asp Asp Thr Thr Val290 295 300Ser Thr Ala Asn Glu Ile His Gly Gly Asn Pro Phe Ala Met305 310 315<210>11<211>323<212>PRT<213>人3型腺病毒<400>11Asn Thr Ser Gln Trp Ile Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr1 5 10 15Thr Thr Thr Asn Thr Phe Gly Ile Ala Ser Met Lys Gly Gly Asn Ile
20 25 30Thr Lys Glu Gly Leu Gln Ile Gly Lys Asp Ile Thr Thr Thr Glu Gly35 40 45Glu Glu Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Thr Tyr Gln Pro Glu Pro Gln50 55 60Val Gly Glu Glu Ser Trp Thr Asp Thr Asp Gly Thr Asn Glu Lys Phe65 70 75 80Gly Gly Arg Ala Leu Lys Pro Ala Thr Asn Met Lys Pro Cys Tyr Gly85 90 95Ser Phe Ala Arg Pro Thr Asn Ile Lys Gly Gly Gln Ala Lys Asn Arg100 105 110Lys Val Lys Pro Thr Thr Glu Gly Gly Val Glu Thr Glu Glu Pro Asp115 120 125Ile Asp Met Glu Phe Phe Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu130 135 140Ala Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Val Asn Leu Glu Thr Pro145 150 155 160Asp Ser His Val Val Tyr Lys Pro Glu Thr Ser Asn Asn Ser His Ala165 170 175Asn Leu Gly Gln Gln Ala Met Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Gly Phe180 185 190Arg Asp Asn Phe Val Gly Leu Met Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met195 200 205Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu Asn Ala Val Val Asp Leu210 215 220Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Asp Ser Leu225 230 235 240Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser245 250 255Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Ile Glu Asp Glu260 265 270Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Asn Gly Ile Gly Pro Gly His Thr275 280 285Tyr Gln Gly Ile Lys Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly Trp Glu290 295 300
Lys Asp Ala Asn Val Ala Pro Ala Asn Glu Ile Thr Ile Gly Asn Asn305 310 315 320Leu Ala Met<210>12<211>315<212>PRT<213>人7型腺病毒<400>12Asn Thr Ser Gln Trp Ile Val Thr Ala Gly Glu Glu Arg Ala Val Thr1 5 10 15Thr Thr Thr Asn Thr Phe Gly Ile Ala Ser Met Lys Gly Asp Asn Ile20 25 30Thr Lys Glu Gly Leu Glu Ile Gly Lys Asp Ile Thr Ala Asp Asn Lys35 40 45Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Thr Tyr Gln Pro Glu Pro Gln Val Gly Glu50 55 60Glu Ser Trp Thr Asp Thr Asp Gly Thr Asn Glu Lys Phe Gly Gly Arg65 70 75 80Ala Leu Lys Pro Ala Thr Lys Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Phe Ala85 90 95Arg Pro Thr Asn Ile Lys Gly Gly Gln Ala Lys Ash Arg Lys Val Lys100 105 110Pro Thr Glu Gly Asp Val Glu Thr Glu Glu Pro Asp Ile Asp Met Glu115 120 125Phe Phe Asp Gly Arg Glu Ala Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu Ile Val130 135 140Leu Tyr Thr Glu Asn Val Asn Leu Glu Thr Pro Asp Ser His Val Val145 150 155 160Tyr Lys Pro Gly Thr Ser Asp Asp Asn Ser His Ala Asn Leu Gly Gln165 170 175Gln Ala Met Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe180 185 190Val Gly Leu Met Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala195 200 205
Gly Gln Ala Ser Gln Leu Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn210 215 220Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr225 230 235 240Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp245 250 255Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Ile Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr260 265 270Cys Phe Pro Leu Asp Gly Ile Gly Pro Ala Lys Thr Tyr Gln Gly IIe275 280 285Lys Ser Lys Asp Asn Gly Trp Glu Lys Asp Asp Asn Val Ser Lys Ser290 295 300Asn Glu Ile Ala Ile Gly Asn Asn Gln Ala Met305 310 315<210>13<211>345<212>PRT<213>人2型腺病毒<400>13Asn Ser Cys Glu Trp Glu Gln Thr Glu Asp Ser Gly Arg Ala Val Ala1 5 10 15Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu20 25 30Gln Asn Ala Arg Asp Gln Ala Thr Lys Lys Thr His Val Tyr Ala Gln35 40 45Ala Pro Leu Ser Gly Glu Thr Leu Thr Lys Ser Gly Leu Gln Ile Gly50 55 60Ser Lys Asn Ala Glu Thr Gln Ala Lys Pro Val Tyr Ala Asp Pro Ser65 70 75 80Tyr Gln Pro Glu Pro Gln Ile Gly Glu Ser Gln Trp Asn Glu Ala Asp85 90 95Ala Asn Ala Ala Gly Gly Arg Val Leu Lys Lys Thr Thr Pro Met Lys100 105 110Pro Tyr Gly Ser Tyr Ala Arg Pro Thr Asn Pro Phe Gly Gly Gln Ser115 120 125
Val Leu Val Pro Asp Glu Lys Gly Val Pro Leu Pro Lys Val Asp Leu130 135 140Gln Phe Phe Ser Asn Thr Thr Ser Leu Asn Asp Arg Gln Gly Asn Ala145 150 155 160Thr Lys Pro Lys Val Val Leu Tyr Ser Glu Asp Val Asn Met Glu Thr165 170 175Pro Asp Thr His Leu Ser Tyr Lys Pro Gly Lys Gly Asp Glu Asn Ser180 185 190Lys Ala Met Leu Gly Gln Gln Ser Met Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile195 200 205Ala Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly210 215 220Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu Asn Ala Val Val225 230 235 240Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Asp245 250 255Ser Ile Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gln Ala Val260 265 270Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Thr Glu275 280 285Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Gly Gly Ile Gly Val Thr290 295 300Asp Thr Tyr Gln Ala Ile Lys Ala Asn Gly Asn Gly Ser Gly Asp Asn305 310 315 320Gly Asp Thr Thr Trp Thr Lys Asp Glu Thr Phe Ala Thr Arg Asn Glu325 330 335Ile Gly Val Gly Asn Asn Phe Ala Met340 34權(quán)利要求
1.重組腺病毒在制備藥物中的用途，該藥物用來在對(duì)象中誘導(dǎo)對(duì)免疫原的T細(xì)胞應(yīng)答，其特征在于，在皮下輸送時(shí)，所述重組猿猴腺病毒優(yōu)先誘導(dǎo)對(duì)免疫原的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，其特征還在于，所述重組腺病毒包含編碼免疫原的核酸分子，該核酸分子在指導(dǎo)免疫原在對(duì)象體內(nèi)表達(dá)的調(diào)控序列的控制之下。
2.重組腺病毒在制備藥物中的用途，該藥物用來在對(duì)象中誘導(dǎo)對(duì)免疫原的抗體應(yīng)答，其特征在于，在低劑量輸送給粘膜時(shí)，所述重組猿猴腺病毒優(yōu)先誘導(dǎo)對(duì)免疫原的抗體應(yīng)答，其特征還在于，所述重組腺病毒包含編碼免疫原的核酸分子，該核酸分子在指導(dǎo)免疫原在對(duì)象體內(nèi)表達(dá)的調(diào)控序列的控制之下。
3.一種在對(duì)象中優(yōu)先誘導(dǎo)對(duì)免疫原的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的方法，所述方法包括向?qū)ο筝斔椭亟M猿猴腺病毒的步驟，所述腺病毒包含編碼免疫原的核酸分子，該核酸分子在指導(dǎo)免疫原在對(duì)象體內(nèi)表達(dá)的調(diào)控序列的控制之下。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述重組猿猴腺病毒通過皮下輸送。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其中所述重組猿猴腺病毒以低劑量輸送。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一所述的方法，其中所述重組猿猴腺病毒以104pfu至106pfu之間的有效劑量輸送。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6任一所述的方法，其中所述重組猿猴腺病毒是重組C68黑猩猩腺病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求3-7任一所述的方法，其中免疫原選自病原性病毒衍生的肽、多肽或蛋白質(zhì)，其中病毒選自人免疫缺陷病毒-1、人乳頭瘤病毒和狂犬病病毒。
9.一種用于誘導(dǎo)針對(duì)人免疫缺陷病毒的細(xì)胞溶解性免疫應(yīng)答的免疫原性組合物，該組合物包含(a)重組猿猴腺病毒，其含有編碼經(jīng)修飾的人免疫缺陷病毒-1的gag蛋白的優(yōu)化的核酸序列；和(b)生理上相容的載體。
10.一種在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)抗人免疫缺陷病毒的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的方法，該方法包括將權(quán)利要求9的組合物給予哺乳動(dòng)物。
11.權(quán)利要求9所述的免疫原性組合物在制備藥物中的用途，該藥物用于在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)抗人免疫缺陷病毒的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
12.一種在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)抗人乳頭瘤病毒的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的方法，該方法包括將重組猿猴腺病毒給予該哺乳動(dòng)物，其中該重組腺病毒編碼人乳頭瘤病毒衍生的免疫原性蛋白。
13.編碼人乳頭瘤病毒衍生的免疫原性蛋白的重組猿猴腺病毒在制備藥物中的用途，該藥物用于在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)抗人乳頭瘤病毒的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
14.編碼狂犬病病毒衍生的免疫原性蛋白的重組猿猴腺病毒在制備藥物中的用途，該藥物用于在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)抗狂犬病中和性抗體應(yīng)答。
15.一種人免疫缺陷病毒疫苗，它包含含有人免疫缺陷病毒-1的抗原的復(fù)制缺陷型重組猿猴腺病毒。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的疫苗，其中抗原選自HIV-1的包膜、pol或gag區(qū)域。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的疫苗，其中抗原包含遺傳不穩(wěn)定成分已被除去的天然抗原。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的疫苗，其中抗原是含有SEQ ID NO6序列的HIV-1gag cDNA。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的疫苗，其中重組腺病毒是E1缺失的黑猩猩68型衍生的腺病毒。
20.一種狂犬病疫苗，它包含復(fù)制缺陷型重組猿猴腺病毒，該病毒包含編碼狂犬病抗原的核酸分子，所述核酸分子在指導(dǎo)狂犬病抗原表達(dá)的調(diào)控序列的控制之下。
21.一種誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答和保護(hù)哺乳動(dòng)物抵抗人免疫缺陷病毒的方法，該方法包括將權(quán)利要求15的疫苗給予哺乳動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)抗所選分子的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的方法，該方法是靠重組猿猴腺病毒來輸送該分子。本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)α干擾素和β干擾素的方法，該方法是將重組猿猴腺病毒輸送給對(duì)象。本發(fā)明的方法和組合物特別適合用于預(yù)防和治療人免疫缺陷病毒、人乳頭瘤病毒感染和癌癥治療。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK1518457SQ02812438
公開日2004年8月4日 申請(qǐng)日期2002年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月22日
發(fā)明者H·C·J·埃特爾, J·M·威爾遜, H C J 埃特爾, 威爾遜 申請(qǐng)人:威斯特解剖及生物研究所, 賓夕法尼亞州立大學(xué)托管會(huì)