專(zhuān)利名稱(chēng)：瓊脂糖酶及其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在高溫下具有瓊脂糖酶活性的新型瓊脂糖酶及其生產(chǎn)方法和應(yīng)用。本發(fā)明也涉及在高溫下具有瓊脂糖酶活性的多肽和編碼所述多肽的基因。此外，本發(fā)明涉及利用所述基因通過(guò)基因工程生產(chǎn)在高溫下具有瓊脂糖酶活性的多肽的方法。
具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及可用于從瓊脂糖生產(chǎn)具有各種生理活性的低聚合度瓊脂寡糖、在高溫下具有瓊脂糖酶活性的α-瓊脂糖酶、以及所述酶的生產(chǎn)方法和應(yīng)用。本發(fā)明也涉及在高溫下具有可用于在瓊脂糖凝膠電泳之后從瓊脂糖凝膠提取核酸等的活性的β-瓊脂糖酶及其生產(chǎn)方法、所述酶的應(yīng)用以及用所述酶從瓊脂糖凝膠提取核酸等的方法。
背景技術(shù)：
瓊脂糖是瓊脂的主要組分。瓊脂糖是一種其結(jié)構(gòu)為D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖通過(guò)α-1，3鍵和β-1，4鍵交替連接在一起的多糖。為了從瓊脂生產(chǎn)寡糖，人們必須將瓊脂糖降解為更小的分子。為此，傳統(tǒng)上已知化學(xué)降解瓊脂糖的方法和酶促消化瓊脂糖的方法。在化學(xué)降解法中，可以用酸水解瓊脂糖。在這種情況下，主要切割α-1，3鍵。已知有兩種類(lèi)型的酶消化瓊脂糖，即切割瓊脂糖中β-1，4鍵的β-瓊脂糖酶和切割瓊脂糖中α-1，3鍵的α-瓊脂糖酶。
通過(guò)在β-1，4鍵切割瓊脂糖獲得的寡糖稱(chēng)為新瓊脂寡糖。新瓊脂寡糖在其還原末端具有D-半乳糖，其聚合度以平均數(shù)表示。另一方面，通過(guò)在α-1，3鍵切割瓊脂糖獲得的寡糖稱(chēng)為瓊脂寡糖。瓊脂寡糖在其還原末端具有3，6-脫水-L-半乳糖，其聚合度以平均數(shù)表示。最近，已表明在其還原末端具有3，6-脫水-L-半乳糖的瓊脂寡糖具有諸如以下的生理活性細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性、制癌活性、各種抗氧化活性、免疫調(diào)節(jié)活性、抗變態(tài)反應(yīng)活性、抗炎活性和抑制α-糖苷酶的活性(WO99/24447，日本專(zhuān)利申請(qǐng)11-11646號(hào))?；谏砘钚裕梢蕴峁┖兴霏傊烟亲鳛槠溆行С煞值乃幱媒M合物和功能食品或飲料。
在化學(xué)降解瓊脂糖的方法中控制所生產(chǎn)的寡糖的大小是困難的。具體地說(shuō)，選擇性生產(chǎn)具有低聚合度的較小的寡糖相當(dāng)困難(例如T.Tokunaga等，Bioscience & Industry，49734(1991))。如果使用β-瓊脂糖酶，由于這種酶僅切割β-1，4鍵，所以?xún)H可以獲得不具有上述生理活性的新瓊脂寡糖。
預(yù)期使用具有切割α-1，3鍵的活性的α-瓊脂糖酶，生產(chǎn)具有生理活性的瓊脂寡糖。已知的α-瓊脂糖酶包括由海洋革蘭氏陰性菌菌株GJ1B產(chǎn)生的酶(Carbohydrate Research，66207-212(1978)；在EuropeanJournal of Biochemistry，214599-607(1993)中提出該菌株為解瓊脂交替單胞菌(Alteromonas agarlyticus)GJ1B)，以及由弧菌屬(Vibrio)細(xì)菌生產(chǎn)的酶(JP-A 7-322878；菌株JT0107-L4)。然而，利用解瓊脂交替單胞菌GJ1B來(lái)源的α-瓊脂糖酶，不可能生產(chǎn)具有重要的生理活性瓊脂二糖，因?yàn)檫@種酶不能消化己糖或更短的寡糖。此外，所述弧菌屬細(xì)菌來(lái)源的α-瓊脂糖酶不能用來(lái)用瓊脂糖作為原料生產(chǎn)瓊脂寡糖，因?yàn)樵撁竷H對(duì)己糖和更短的寡糖表現(xiàn)出其活性，而對(duì)瓊脂糖根本不起作用。
本發(fā)明人進(jìn)行深入的研究，以便獲得切割瓊脂糖中α-1，3鍵并且產(chǎn)生具有重要生理活性的瓊脂寡糖的酶，發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)生具有適合于此目的的特性的酶的兩種微生物。分離由這些微生物產(chǎn)生的酶，并且指明其理化特性以及酶特性。此外，本發(fā)明人還分離出所述兩種酶的基因，發(fā)現(xiàn)了用所述基因(WO 00/50578)通過(guò)基因工程便捷地生產(chǎn)具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的方法。如果人們想通過(guò)用所述兩種α-瓊脂糖酶之一處理溶解的瓊脂糖而獲得瓊脂寡糖，則反應(yīng)溫度需要低于約40℃，因?yàn)樗雒傅淖钸m反應(yīng)溫度約為40℃。在這種情況下，如果瓊脂糖濃度高，則瓊脂糖可能固化，可能妨礙所述酶促反應(yīng)。因此，如果使用這樣一種酶，則需要用低濃度的瓊脂糖進(jìn)行所述處理。因而不能處理高濃度的瓊脂糖，瓊脂寡糖的生產(chǎn)率低。因此，需要在即使瓊脂糖以高濃度溶解時(shí)瓊脂糖也不會(huì)固化的高溫下具有活性的熱穩(wěn)定α-瓊脂糖酶。
另一方面，在基因工程領(lǐng)域廣泛進(jìn)行在瓊脂糖凝膠電泳之后從瓊脂糖中提取已經(jīng)過(guò)限制性酶處理或者擴(kuò)增反應(yīng)的核酸等。對(duì)于所述程序，常規(guī)上使用最適溫度約37℃的β-瓊脂糖酶。又是在這種情況下，根據(jù)所述酶的最適溫度，需要降低反應(yīng)溫度，并且必須通過(guò)將含有待處理核酸等的瓊脂糖凝膠溶于大體積的水中降低瓊脂糖濃度，以防止瓊脂糖固化。這樣，待回收的核酸等的濃度也不可避免地被降低。濃度的降低產(chǎn)生問(wèn)題，因?yàn)檫@導(dǎo)致回收率降低、瓊脂糖消化效率降低和程序延長(zhǎng)。為了解決這些問(wèn)題，可以在高于常規(guī)溫度的溫度下進(jìn)行反應(yīng)所用的瓊脂糖酶是必不可少的。美國(guó)專(zhuān)利第5,869,310號(hào)中描述的黃桿菌(Flavobacterium sp.)菌株NR19來(lái)源的β-瓊脂糖酶可以被認(rèn)為是這樣一種瓊脂糖酶，雖然其最適溫度并不是如此高，并且熱穩(wěn)定性不足。因此，需要在高濃度的瓊脂糖不會(huì)固化的高溫下具有活性的熱穩(wěn)定β-瓊脂糖酶。
如上所述，現(xiàn)有技術(shù)在瓊脂寡糖生產(chǎn)和從瓊脂糖凝膠提取諸如核酸的物質(zhì)方面存在問(wèn)題。
發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是提供具有瓊脂糖酶活性、可以用于有效生產(chǎn)瓊脂寡糖、從瓊脂糖凝膠有效提取諸如核酸的物質(zhì)等的多肽；所述多肽的氨基酸序列；編碼所述多肽的基因；生產(chǎn)所述多肽的方法；生產(chǎn)瓊脂寡糖的方法以及從瓊脂糖凝膠提取諸如核酸的物質(zhì)的方法。
發(fā)明概述鑒于上述問(wèn)題，本發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了深入的研究和探索，以便獲得在高溫下切割瓊脂糖中α-1，3鍵并且可用于生產(chǎn)具有重要生理活性的瓊脂寡糖的酶、以及在高溫下切割瓊脂糖中β-1，4鍵并且可用于從瓊脂糖凝膠有效提取核酸等的酶。結(jié)果，本發(fā)明人成功地發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)生具有適合于所述相應(yīng)目的的特性的兩種酶的微生物。從所述微生物中分離出所述酶，并且指出其理化特性和酶特性。
此外，本發(fā)明人成功地分離出編碼所述酶的基因，并且發(fā)現(xiàn)了用所述基因通過(guò)基因工程便捷地生產(chǎn)本發(fā)明的具有α-瓊脂糖酶活性的多肽和具有β-瓊脂糖酶活性的多肽的方法。因而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明概述如下。本發(fā)明的第一方面涉及新型瓊脂糖酶，所述瓊脂糖酶含有選自以下的氨基酸序列或者在所述氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列(1)由SEQ ID NO22的氨基酸序列中第21號(hào)氨基酸至第437號(hào)氨基酸的417個(gè)殘基組成的氨基酸序列；或者(2)由SEQ ID NO23的氨基酸序列中第318號(hào)氨基酸至第1089號(hào)氨基酸的772個(gè)殘基組成的氨基酸序列。
所述瓊脂糖酶的示例為具有水解D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的β-1，4鍵的活性的酶、或者具有水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵的活性的酶。
本發(fā)明的第二方面涉及編碼具有瓊脂糖酶活性的多肽的基因。所述基因編碼第一方面的瓊脂糖酶。所述基因的示例為含有由SEQ IDNO20的核苷酸序列中第61號(hào)核苷酸至第1311號(hào)核苷酸的1251個(gè)核苷酸組成的核苷酸序列或者在所述由1251個(gè)核苷酸組成的核苷酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸被取代、缺失、添加和/或插入的核苷酸序列的基因、或者含有由SEQ ID NO21的核苷酸序列中第952號(hào)核苷酸至第3267號(hào)核苷酸的2316個(gè)核苷酸組成的核苷酸序列或者在所述由2316個(gè)核苷酸組成的核苷酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸被取代、缺失、添加和/或插入的核苷酸序列的基因。
本發(fā)明的第三方面涉及在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與第二方面的基因雜交并且編碼第一方面的具有瓊脂糖酶活性的多肽的基因。
本發(fā)明的第四方面涉及含有第二或第三方面的基因的重組DNA分子。
本發(fā)明的第五方面涉及帶有第四方面的重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子。
本發(fā)明的第六方面涉及具有瓊脂糖酶活性的多肽的生產(chǎn)方法，所述方法包括培養(yǎng)能夠產(chǎn)生瓊脂糖酶的微生物(例如屬于微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)所屬屬的微生物)，并且從培養(yǎng)物中收集第一方面的瓊脂糖酶。
本發(fā)明的第七方面涉及具有瓊脂糖酶活性的多肽的生產(chǎn)方法，所述方法包括培養(yǎng)第五方面的轉(zhuǎn)化子，并且從培養(yǎng)物中收集第一方面的瓊脂糖酶。
本發(fā)明的第八方面涉及瓊脂寡糖的生產(chǎn)方法，所述方法包括用第一方面的瓊脂糖酶消化瓊脂糖，并且從消化物中收集瓊脂寡糖。
本發(fā)明的第九方面涉及從瓊脂糖凝膠中提取物質(zhì)的方法，所述方法包括用第一方面的瓊脂糖酶消化瓊脂糖凝膠。
本發(fā)明的第十方面涉及用于第九方面的從瓊脂糖凝膠提取物質(zhì)的方法的試劑盒，所述試劑盒含有第一方面的瓊脂糖酶。
本發(fā)明的第十一方面涉及改進(jìn)第一方面的瓊脂糖酶熱穩(wěn)定性的方法，所述方法包括從N末端缺失構(gòu)成所述瓊脂糖酶的至多30％的多肽。
發(fā)明詳述此中所用的寡糖是指由2個(gè)或2個(gè)以上、10個(gè)或10個(gè)以下的單體組成的糖。瓊脂寡糖是指其結(jié)構(gòu)為D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖通過(guò)α-1，3鍵和β-1，4鍵交替連接在一起并且在其還原末端具有3，6-脫水-L-半乳糖的寡糖。新瓊脂寡糖是指其結(jié)構(gòu)為D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖通過(guò)α-1，3鍵和β-1，4鍵交替連接在一起并且在其非還原末端具有3，6-脫水-L-半乳糖的寡糖。
多糖是指除單糖和寡糖之外的糖類(lèi)。
本發(fā)明的瓊脂糖酶是含有由SEQ ID NO22的氨基酸序列中第21號(hào)氨基酸至第437號(hào)氨基酸的417個(gè)殘基組成的氨基酸序列、或者含有由SEQ ID NO23的氨基酸序列中第318號(hào)氨基酸至第1089號(hào)氨基酸的772個(gè)殘基組成的氨基酸序列的瓊脂糖酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，它是一種含有在上述氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列的多肽。例如，包括具有與所述氨基酸序列至少70％或更高、優(yōu)選80％或更高、更優(yōu)選90％或更高的同源性的區(qū)的多肽?？梢砸勒找阎椒?，利用用于這類(lèi)計(jì)算的任何計(jì)算機(jī)程序如DNASIS(Takara Shuzo)來(lái)計(jì)算同源性。
本發(fā)明的瓊脂糖酶既可以作用于多糖(例如瓊脂糖)，也可以作用于寡糖(例如瓊脂寡糖和新瓊脂寡糖)。例如，最適反應(yīng)溫度為45℃或更高。對(duì)于本發(fā)明的酶并無(wú)具體限制，只要它們具有這樣的特性。其實(shí)例包括由海洋微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)生產(chǎn)的瓊脂糖酶。
對(duì)于本發(fā)明的瓊脂糖酶的切割模式并無(wú)具體限制。例如，所述瓊脂糖酶可以是水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵的α-瓊脂糖酶，或者是水解D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的β-1，4鍵的β-瓊脂糖酶。
本發(fā)明的α-瓊脂糖酶是水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵并且既可以作用于多糖(例如瓊脂糖)也可以作用于寡糖(例如瓊脂己糖)的酶。對(duì)于本發(fā)明的所述酶并無(wú)具體限制，只要它具有這樣的特性。其實(shí)例包括瓊脂糖酶II，即由海洋微生物NAB2-1-1(FERMBP-7855)生產(chǎn)的α-瓊脂糖酶。
由微生物NAB2-1-1生產(chǎn)的瓊脂糖酶II是一種水解多糖或寡糖中3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵的酶。所述酶作用于瓊脂糖、瓊脂己糖和比瓊脂己糖長(zhǎng)的瓊脂寡糖(例如瓊脂辛糖)以及新瓊脂己糖和比新瓊脂己糖長(zhǎng)的新瓊脂寡糖。
本發(fā)明的β-瓊脂糖酶是水解D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的β-1，4鍵并且既可以作用于多糖(例如瓊脂糖)也可以作用于寡糖(例如瓊脂己糖)的酶。對(duì)于本發(fā)明的所述酶并無(wú)具體限制，只要它具有這樣的特性。其實(shí)例包括瓊脂糖酶I，即由海洋微生物NAB2-1-1(FERMBP-7855)生產(chǎn)的β-瓊脂糖酶。
由微生物NAB2-1-1生產(chǎn)的瓊脂糖酶I是一種水解多糖或寡糖中D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的β-1，4鍵的酶。所述酶作用于瓊脂糖、新瓊脂己糖和比新瓊脂己糖長(zhǎng)的新瓊脂寡糖(例如新瓊脂辛糖)以及瓊脂己糖和比瓊脂己糖長(zhǎng)的瓊脂寡糖。
以下描述測(cè)定上述酶的活性以及所述酶的理化特性和酶特性的方法。
(1)酶學(xué)測(cè)定方法通過(guò)用Agarose LO3(Takara Shuzo)作為底物進(jìn)行酶促反應(yīng)，然后用高效液相色譜定量測(cè)定所得的瓊脂四糖或新瓊脂四糖，測(cè)定本發(fā)明瓊脂糖酶的活性。具體地說(shuō)，此中所用的用于測(cè)定純化酶制劑的活性或者純化過(guò)程中酶的活性的酶活性測(cè)定方法如下。
制備在含有10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2)(就瓊脂糖酶I而言)中或者在含有10mM氯化鈣和10mM氯化鈉的20mMTris-HCl緩沖液(pH7.2)(就瓊脂糖酶II而言)中含有0.2％(w/v)或0.5％(w/v)濃度的瓊脂糖的溶液。將作為底物的180μl該溶液與20μl酶溶液混合。讓混合物于50℃反應(yīng)5-30分鐘，優(yōu)選反應(yīng)10分鐘，然后在沸水中或于75℃加熱1分鐘以終止反應(yīng)。讓30μl所述反應(yīng)混合物經(jīng)過(guò)TSKgelα-2500柱(內(nèi)徑7.8mm；長(zhǎng)度300mm；Tosoh)。用70％乙腈溶液作為洗脫液，以0.8ml/分鐘的流速，定量測(cè)定以約25分鐘的保留時(shí)間洗脫出的瓊脂四糖或者以約24分鐘的保留時(shí)間洗脫出的新瓊脂四糖。一個(gè)單位(1U)定義為在10分鐘內(nèi)產(chǎn)生1μmol瓊脂四糖的酶量。
(2)最適pH讓酶作用于用乙酸緩沖液(pH4.5)、蘋(píng)果酸緩沖液(pH5.5)、乙酸緩沖液(pH6.0、6.5)或Tris-HCl緩沖液(pH7.0、7.5、8.8)制備的反應(yīng)混合物中作為底物的瓊脂糖。結(jié)果，證明瓊脂糖酶I和瓊脂糖酶II都在弱酸性至弱堿性條件下表現(xiàn)出其消化瓊脂糖的活性。
(3)最適溫度本發(fā)明的瓊脂糖酶II在范圍為45-55℃的溫度下表現(xiàn)出高酶活性，在約50℃下表現(xiàn)出最高活性。本發(fā)明的瓊脂糖酶I在范圍為45-70℃的溫度下表現(xiàn)出高酶活性，在約55-65℃下表現(xiàn)出最高活性。
(4)熱穩(wěn)定性在48℃、50℃、55℃、60℃或65℃下處理給定的時(shí)間之后，測(cè)定酶制劑的剩余活性。結(jié)果，瓊脂糖酶II在55℃處理10分鐘之后表現(xiàn)出40％的其活性。瓊脂糖酶I在60℃處理10分鐘之后，表現(xiàn)出100％的其活性；在60℃處理20分鐘之后，表現(xiàn)出100％的其活性；在60℃處理30分鐘之后，表現(xiàn)出98％的其活性；在65℃處理10分鐘之后，表現(xiàn)出100％的其活性；在65℃處理20分鐘之后，表現(xiàn)出95％的其活性；在65℃處理30分鐘之后，表現(xiàn)出90％的其活性；而在65℃處理60分鐘之后，表現(xiàn)出90％的其活性。
(5)鈣離子需求已知的瓊脂糖酶需要鈣以表現(xiàn)出其活性。檢查本發(fā)明的相應(yīng)瓊脂糖酶的鈣離子需求。結(jié)果，在無(wú)鈣離子時(shí)，瓊脂糖酶II的活性為存在鈣離子時(shí)所表現(xiàn)出的活性的60％。在無(wú)鈣離子時(shí)，瓊脂糖酶I的活性為存在鈣離子時(shí)所表現(xiàn)出的活性的100％。因此，瓊脂糖酶II和瓊脂糖酶I在不加入鈣離子的情況下都表現(xiàn)出其活性。
本發(fā)明的瓊脂糖酶II在CaCl2存在下被穩(wěn)定化，而它不受錳離子或鎂離子的影響。
(6)分子量用10-20％聚丙烯酰胺梯度凝膠，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測(cè)定，估計(jì)瓊脂糖酶II和瓊脂糖酶I的分子量分別為約117,000和約48,000。
(7)依照Edman降解法測(cè)定氨基酸序列依照Edman降解法測(cè)定的瓊脂糖II和瓊脂糖酶I的N末端氨基酸序列分別為Glu-Thr-Ile-Val-Leu-Gln-Ala-Glu-Ser-Phe和Ala-Asp-Xaa-Asp-Gly-Val-Pro-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly。瓊脂糖酶II和瓊脂糖酶I的N末端氨基酸序列分別示于SEQ ID NO2和SEQ ID NO1。
如下所述，分離出編碼瓊脂糖酶II的基因和編碼瓊脂糖酶I的基因。也測(cè)定了由這些基因所編碼的氨基酸序列。由瓊脂糖酶II基因和瓊脂糖酶I基因編碼的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO23和SEQ IDNO22。由SEQ ID NO23的氨基酸序列中第318號(hào)氨基酸至第1089號(hào)氨基酸的772個(gè)氨基酸組成的多肽表現(xiàn)出本發(fā)明的α-瓊脂糖酶的活性，而由SEQ ID NO22的氨基酸序列中第21號(hào)氨基酸至第437號(hào)氨基酸的417個(gè)氨基酸組成的多肽表現(xiàn)出本發(fā)明的β-瓊脂糖酶的活性。
可以從通過(guò)培養(yǎng)微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)所獲得的培養(yǎng)物中，純化本發(fā)明的瓊脂糖酶。NAB2-1-1從海水中作為同化瓊脂的細(xì)菌分離出。它具有以下微生物學(xué)特性。
(1)形態(tài)學(xué)制備人工海水(商品名Jamarin S；Jamarin Laboratory)。向其中加入0.3％(w/v)濃度的蛋白胨(Difco)和0.02％(w/v)濃度的酵母膏(Difco)。然后用3M碳酸鈉將pH調(diào)至7.8。向其中加入0.1％(w/v)濃度的AgaroseLO3(Takara Shuzo)。在高壓滅菌器中滅菌后，將上述微生物接種到所述混合物中，于37℃以120rpm培養(yǎng)過(guò)夜。在所述培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的微生物是革蘭氏陰性桿菌，所述桿菌為游動(dòng)的，有極生鞭毛，為需氧菌，并且需要鹽。
(2)生長(zhǎng)制備人工海水(商品名Jamarin S；Jamarin Laboratory)。向其中加入0.3％(w/v)濃度的蛋白胨(Difco)和0.02％(w/v)濃度的酵母膏(Difco)。然后用3M碳酸鈉將pH調(diào)至7.8。向其中加入1.5％(w/v)濃度的瓊脂(Nacalai Tesque)。將混合物高壓滅菌，制備平板。當(dāng)將上述微生物接種到平板上時(shí)，表明(i)它在30-40℃下生長(zhǎng)良好；(ii)當(dāng)所述細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)瓊脂凝膠液化；和(iii)它在pH6.0-8.0下生長(zhǎng)良好。
NAB2-1-1于2001年1月10日(原始保藏日)保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(International Patent OrganismDepositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan)，保藏號(hào)為FERM BP-7855。
可以通過(guò)分析編碼16S核糖體RNA(16S rRNA)的基因的核苷酸序列，獲得關(guān)于上述微生物的分類(lèi)學(xué)位置的信息。已知16S rRNA基因的核苷酸序列對(duì)于每種微生物菌株是特異性的。具體地說(shuō)，從微生物NAB2-1-1提取染色體DNA。用可以用來(lái)擴(kuò)增所述基因中一個(gè)區(qū)或其部分的引物進(jìn)行PCR。測(cè)定所擴(kuò)增的DNA片段的核苷酸序列。針對(duì)已測(cè)定的序列，利用GanBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性搜索。則可以了解在所述區(qū)中具有相似核苷酸序列的微生物，即分類(lèi)學(xué)上密切的微生物。
依照Bulletin of Japanese Society of Microbial Ecology，1031-42(1995)中描述的方法，擴(kuò)增來(lái)源于微生物NAB2-1-1的16S核糖體RNA基因的DNA片段。使用在所述文獻(xiàn)中描述的引物27f和1492r進(jìn)行PCR(引物27f和1492r的核苷酸序列分別示于SEQ ID NO32和33)。分析所得的DNA擴(kuò)增片段的核苷酸序列。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了分別與產(chǎn)生本發(fā)明的瓊脂糖酶的所述微生物在上述區(qū)中具有最高約90％同源性的以下微生物Pseudoalteromonas sp.KT0812A舒氏氣單胞菌(Aeromonas schubertii)可以從NAB2-1-1以及NAB2-1-1的自發(fā)或人工突變體、或者從屬于NAB2-1-1所屬屬并且能夠產(chǎn)生本發(fā)明瓊脂糖酶的微生物中，獲得本發(fā)明的瓊脂糖酶。
可以依照已知的方法，例如輻射、紫外線(xiàn)照射或用誘變劑處理，獲得人工突變體。
已知屬于同一屬的微生物的16S rRNA基因的核苷酸序列之間的同源性一般為約99％或更高。因此，可以同本發(fā)明的微生物NAB2-1-1一樣，使用其16S rRNA基因的核苷酸序列與微生物NAB2-1-1的所述基因的核苷酸序列具有99％或更高同源性的微生物。
可以使用含有所述微生物可以利用的氮源、無(wú)機(jī)物質(zhì)等以及用瓊脂、瓊脂糖等作為碳源的培養(yǎng)基，作為所述微生物培養(yǎng)用的培養(yǎng)基?？梢允褂檬惺鄣沫傊颦傊恰５吹膶?shí)例包括肉膏、酵母膏、酪蛋白水解物、胰胨和蛋白胨。優(yōu)選使用酵母膏和蛋白胨。這樣的氮源也可以用作除瓊脂或瓊脂糖之外的碳源。此外，氯化鈉、檸檬酸鐵、氯化鎂、硫酸鈉、氯化鈣、氯化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、溴化鉀、氯化鍶、硼酸鈉、硅酸鈉、氟化鈉、硝酸銨、磷酸氫二鈉等可以聯(lián)合用作鹽。
特別是，優(yōu)選使用通過(guò)向由人工海水Jamarin S組成的培養(yǎng)基中加入蛋白胨、酵母膏和瓊脂或瓊脂糖制備的培養(yǎng)基。優(yōu)選加入0.1-2.0％濃度的瓊脂或瓊脂糖。通過(guò)適當(dāng)改變瓊脂或瓊脂糖的濃度，可以制備固體或液體培養(yǎng)基。為了生產(chǎn)酶，優(yōu)選使用0.1-0.3％濃度的液體培養(yǎng)物，而為了保存細(xì)胞，則優(yōu)選使用1.2-2.0％濃度的固體培養(yǎng)物。如果使用低熔點(diǎn)瓊脂糖進(jìn)行液體培養(yǎng)，則它可以以0.1-1.0％的濃度使用。
例如，培養(yǎng)溫度為30-40℃，培養(yǎng)基的pH為6.0-8.0，而培養(yǎng)時(shí)間為12-48小時(shí)，雖然根據(jù)培養(yǎng)基的組成，可以或多或少地改變培養(yǎng)條件。
在如上所述的培養(yǎng)期間所產(chǎn)生的本發(fā)明的α-瓊脂糖酶和/或β-瓊脂糖酶被分泌到細(xì)胞外。然后在培養(yǎng)后通過(guò)離心、過(guò)濾等除去細(xì)胞，獲得培養(yǎng)上清液。
可以運(yùn)用真空濃縮或超濾來(lái)濃縮所得的培養(yǎng)上清液，以制備液體酶?；蛘?，可以將培養(yǎng)上清液通過(guò)凍干、噴霧干燥等轉(zhuǎn)變?yōu)榉蹱蠲?，以制備粗制酶制劑。可以采用常?guī)純化方法，例如用硫酸銨鹽析或溶劑沉淀，部分純化本發(fā)明的α-瓊脂糖酶和/或β-瓊脂糖酶。此外，聯(lián)合運(yùn)用已知的純化方法，例如柱色譜(例如離子交換柱和凝膠過(guò)濾柱)，可以獲得在電泳時(shí)產(chǎn)生單一條帶的純化酶制劑。
通過(guò)將如此獲得的培養(yǎng)物或不同純化程度的本發(fā)明的α-瓊脂糖酶，與作為底物的紅藻中所含有的多糖(例如瓊脂或瓊脂糖)反應(yīng)，可以生產(chǎn)瓊脂寡糖，例如瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂己糖。
瓊脂糖是一種其結(jié)構(gòu)為D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖通過(guò)α-1，3鍵和β-1，4鍵交替連接在一起的多糖。β-瓊脂糖酶是水解瓊脂糖中β-1，4鍵的酶。通過(guò)該酶的作用產(chǎn)生的在其還原末端具有D-半乳糖的寡糖稱(chēng)為新瓊脂寡糖，它不表現(xiàn)出諸如用瓊脂寡糖所觀察到的生理活性。如果使用切割瓊脂糖中α-1，3鍵的α-瓊脂糖酶，則可以產(chǎn)生在其還原末端具有3，6-脫水-L-半乳糖的瓊脂寡糖。來(lái)源于解瓊脂交替單胞菌GJ1B和弧菌屬細(xì)菌(菌株JT0107-L4)的兩種酶已知是α-瓊脂糖酶。然而，由解瓊脂交替單胞菌GJ1B產(chǎn)生的α-瓊脂糖酶不能作用于瓊脂己糖或更短的瓊脂寡糖而所述弧菌屬細(xì)菌來(lái)源的α-瓊脂糖酶不能消化瓊脂糖。因此，用這樣的α-瓊脂糖酶從原料-瓊脂糖有效生產(chǎn)瓊脂二糖或瓊脂四糖是不可能的。
本發(fā)明人先前發(fā)現(xiàn)的WO 00/50578中所述的α-瓊脂糖酶是作用于瓊脂糖、瓊脂己糖和比瓊脂己糖長(zhǎng)的瓊脂寡糖的酶。因此，它們作用于瓊脂糖，產(chǎn)生瓊脂寡糖。此外，它們還可以切割由于所述作用而產(chǎn)生的瓊脂己糖中的單一α-1，3鍵。利用所述酶，有可能生產(chǎn)瓊脂二糖和瓊脂四糖，它們是依照常規(guī)方法幾乎不能生產(chǎn)的二糖和四糖。這些酶的最適反應(yīng)溫度為約40℃。瓊脂糖通常以1％(w/v)的濃度使用。在這一濃度下，它于50℃不固化，但于40℃固化。也就是說(shuō)，如果使用常規(guī)的酶，則高濃度的瓊脂糖在所述酶的最適反應(yīng)溫度下固化，因此可能妨礙所述酶促反應(yīng)。因此，難以有效地生產(chǎn)瓊脂二糖或瓊脂四糖。
另一方面，由于本發(fā)明的α-瓊脂糖酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，因此，可以將其用于在瓊脂糖不固化的溫度下進(jìn)行反應(yīng)。因此，這使得能夠有效地生產(chǎn)瓊脂寡糖。
由上述理化特性可見(jiàn)，本發(fā)明的α-瓊脂糖酶是作用于瓊脂糖、瓊脂己糖和比瓊脂己糖長(zhǎng)的瓊脂寡糖的酶。因此，它作用于瓊脂糖，產(chǎn)生瓊脂寡糖。此外，它可以切割由于所述作用而產(chǎn)生的瓊脂寡糖中的α-1，3鍵，產(chǎn)生諸如瓊脂二糖和瓊脂四糖的更小的瓊脂寡糖。另外，其最適溫度高，并且熱穩(wěn)定性非常好。因此，運(yùn)用本發(fā)明的α-瓊脂糖酶，有可能大量獲得依照常規(guī)方法一直難以生產(chǎn)的二糖和四糖-瓊脂二糖和瓊脂四糖，而不會(huì)由于瓊脂糖固化而妨礙反應(yīng)。
常規(guī)α-瓊脂糖酶和本發(fā)明的α-瓊脂糖酶的底物特異性示于表1。在該表中，符號(hào)+和-分別代表所述酶能夠和不能消化所述底物。
表1底物瓊脂糖瓊脂己糖瓊脂四糖解瓊脂交替單胞菌 + --GJ1B弧菌屬細(xì)菌(JT0107-L4)- ++瓊脂糖酶1-7和+ +-瓊脂糖酶4-3瓊脂糖酶II + +-運(yùn)用本發(fā)明的α-瓊脂糖酶所產(chǎn)生的瓊脂寡糖含有瓊脂二糖和瓊脂四糖。所述瓊脂寡糖可以含有瓊脂己糖或比瓊脂己糖長(zhǎng)的瓊脂寡糖，只要其存在不干擾應(yīng)用目的。例如，可以用瓊脂、瓊脂糖或者來(lái)源于瓊脂或瓊脂糖的瓊脂寡糖作為原料，來(lái)用本發(fā)明的α-瓊脂糖酶生產(chǎn)瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂己糖。所述α-瓊脂糖酶作用所用的條件并無(wú)具體限制，只要所述酶在所用的條件下表現(xiàn)出其活性。例如，優(yōu)選讓瓊脂糖酶II于pH6.0-8.0、45-55℃下作用。對(duì)于所述反應(yīng)混合物的組成并無(wú)具體限制，只要它適合于所述酶的作用。
如上所述，運(yùn)用本發(fā)明的α-瓊脂糖酶所產(chǎn)生的寡糖主要是低聚合度的己糖或更短的寡糖。然而，通過(guò)適當(dāng)選擇反應(yīng)條件等，有可能任選地產(chǎn)生具有不同聚合度的寡糖。通過(guò)分離和純化如此獲得的寡糖，也有可能獨(dú)立地獲得瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂己糖。
通過(guò)讓如上所述獲得的培養(yǎng)物或不同純化程度的本發(fā)明β-瓊脂糖酶作用于在紅藻中所含有的多糖(例如瓊脂或瓊脂糖)，可以將瓊脂或瓊脂糖消化為瓊脂寡糖，例如新瓊脂二糖、新瓊脂四糖和新瓊脂己糖。
弧菌JT0107-1，4(JP-A 8-38172)和Pseudomonas altantica(Morrice，L.M.等，Eur.J.Biochem.，135，553-558(1983))來(lái)源的酶已知是β-瓊脂糖酶。其最適反應(yīng)溫度為約30℃。如果用這樣一種酶從瓊脂糖凝膠中提取核酸等，則由于瓊脂糖在所述酶表現(xiàn)出其活性的溫度固化，而妨礙了所述反應(yīng)。因此，它不能得到實(shí)際應(yīng)用。已知黃桿菌菌株NR19(美國(guó)專(zhuān)利第5,869,310號(hào))、假單胞菌(Pseudomonas sp.)N-7(JP-B 7-97987)和弧菌(Vibrio sp.)PO-303(JP-A 8-294389)來(lái)源的酶的最適反應(yīng)溫度高于上述酶。然而，由于其最適溫度(55℃或更低)低于低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠的熔點(diǎn)(65℃)，因此對(duì)于實(shí)際應(yīng)用仍有問(wèn)題。
另一方面，本發(fā)明的β-瓊脂糖酶在寬范圍的溫度(50-70℃)下表現(xiàn)出高活性，并且在55-65℃表現(xiàn)出最高活性。因此，它使得其中瓊脂糖凝膠完全熔化的反應(yīng)得以進(jìn)行。此外，本發(fā)明的β-瓊脂糖酶的98％的活性在于65℃處理30分鐘后仍得以保留，表明它的熱穩(wěn)定性非常好。因此，應(yīng)用本發(fā)明的β-瓊脂糖酶使得能夠從瓊脂糖凝膠中有效地提取核酸等，而不會(huì)由于瓊脂糖固化受到妨礙。這樣的提取依照常規(guī)方法是困難的。
本發(fā)明的α-瓊脂糖酶基因是編碼具有上述α-瓊脂糖酶活性的多肽的基因。因此，它是指含有編碼具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸。本發(fā)明的α-瓊脂糖酶基因的實(shí)例包括含有來(lái)源于微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)的編碼瓊脂糖酶II的核苷酸序列的基因。編碼瓊脂糖酶II的基因的示例為具有編碼由SEQ IDNO23中第318號(hào)氨基酸至第1089號(hào)氨基酸的772個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽的核苷酸序列的基因。
本發(fā)明的α-瓊脂糖酶基因也包括含有編碼具有在上述氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、添加或插入的氨基酸序列并且具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。
另外，本發(fā)明的所述基因包括具有由SEQ ID NO21中第952號(hào)核苷酸至第3267號(hào)核苷酸的2316個(gè)核苷酸組成的核苷酸序列的基因。本發(fā)明的所述基因也包括含有具有在上述核苷酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸被取代、缺失、添加或插入的核苷酸序列并且編碼具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。
此外，本發(fā)明的基因包括含有在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與上述基因雜交并且編碼具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。可以依照例如T.Maniatis等(編著)，Molecular CloningA Laboratory Manual 2nd ed.，1989，Cold Spring Harbor Laboratory中所述的方法進(jìn)行雜交。所述嚴(yán)謹(jǐn)條件的示例為與探針于65℃在含有6×SSC(1×SSC0.15M氯化鈉、0.015M檸檬酸鈉，pH7.0)、0.5％SDS、5×Denhardt氏液和100mg/ml鯡精DNA的溶液中保溫過(guò)夜。
本發(fā)明的β-瓊脂糖酶基因是編碼具有上述β-瓊脂糖酶活性的多肽的基因。因此，它是指含有編碼具有β-瓊脂糖酶活性的多肽的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸。本發(fā)明的β-瓊脂糖酶基因的實(shí)例包括含有來(lái)源于微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)的編碼瓊脂糖酶I的核苷酸序列的基因。編碼瓊脂糖酶I的基因的示例為具有編碼由SEQ IDNO22中第21號(hào)氨基酸至第437號(hào)氨基酸的417個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的多肽的核苷酸序列的基因。
本發(fā)明的β-瓊脂糖酶基因也包括含有編碼具有在上述氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、添加或插入的氨基酸序列并且具有β-瓊脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。
另外，本發(fā)明的所述基因包括具有由SEQ ID NO20中第61號(hào)核苷酸至第1311號(hào)核苷酸的1251個(gè)核苷酸組成的核苷酸序列的基因。本發(fā)明的所述基因也包括含有在上述核苷酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸被取代、缺失、添加和/或插入的核苷酸序列并且編碼具有β-瓊脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。
此外，本發(fā)明的所述基因包括含有在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與上述基因雜交并且編碼具有β-瓊脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。所述嚴(yán)謹(jǐn)條件的示例為如上所述的那些條件。
例如，本發(fā)明的瓊脂糖酶基因可以如下克隆。
從產(chǎn)生瓊脂糖酶的微生物中制備基因組DNA?？梢砸勒蘸线m的已知方法，制備基因組DNA。例如，可以聯(lián)合使用已知方法，例如溶菌酶處理、蛋白酶處理、RNA酶處理、苯酚處理和乙醇沉淀，制備基因組DNA。采用合適的已知方法，例如超聲處理或用限制性酶消化，降解如此獲得的基因組DNA。依照構(gòu)建重組DNA分子的常規(guī)方法，將所得的DNA片段摻入到載體(例如質(zhì)粒載體)中。然后將所述重組DNA分子導(dǎo)入合適的宿主(例如大腸桿菌)中，獲得轉(zhuǎn)化子?？梢詮某Ｒ?guī)方法中選擇適用于待使用的載體和宿主的用于構(gòu)建重組DNA分子、轉(zhuǎn)化等的方法，例如在Molecular CloningA Laboratory Manual 2nd ed.中描述的那些方法。因此，獲得含有帶有瓊脂糖酶基因的轉(zhuǎn)化子的基因組文庫(kù)。
接著，篩選基因組文庫(kù)，以選擇帶有所述瓊脂糖酶基因的轉(zhuǎn)化子。從可以所述轉(zhuǎn)化子中分離出所述瓊脂糖酶基因。篩選方法的實(shí)例如下。
(1)用瓊脂糖酶活性的表達(dá)作為指標(biāo)進(jìn)行篩選讓基因組文庫(kù)在瓊脂平板上生長(zhǎng)。帶有瓊脂糖酶基因的轉(zhuǎn)化子表達(dá)具有瓊脂糖酶活性的多肽。所述多肽通過(guò)其瓊脂糖酶活性的作用，溶解瓊脂凝膠。因此，選擇在瓊脂平板溶解瓊脂凝膠的菌落或噬斑。
(2)用抗體進(jìn)行篩選如上所述制備粗制、部分純化或純化的瓊脂糖酶酶制劑。用所述制劑作為抗原，依照常規(guī)方法制備抗瓊脂糖酶抗體。
讓基因組文庫(kù)在平板上生長(zhǎng)。將生長(zhǎng)的菌落或噬斑轉(zhuǎn)移到尼龍濾膜或硝化纖維素濾膜上。已表達(dá)的重組蛋白與所述菌落或噬斑一起被轉(zhuǎn)移到所述濾膜上。讓濾膜上的重組蛋白與所述抗瓊脂糖酶抗體反應(yīng)，以鑒定與所述抗體反應(yīng)的克隆。
可以依照已知方法，例如通過(guò)使過(guò)氧化物酶綴合第二抗體與已經(jīng)與所述抗瓊脂糖酶抗體反應(yīng)的濾膜反應(yīng)，讓所述濾膜與顯色底物一起保溫，然后檢測(cè)所顯現(xiàn)出的顏色，可以鑒定與所述抗體反應(yīng)的克隆。
如果使用導(dǎo)致在所述載體中所摻入的DNA中的基因高表達(dá)的表達(dá)載體，來(lái)構(gòu)建在上述方法(1)或(2)中使用的基因組文庫(kù)，則可以容易地選擇帶有目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化子。
(3)通過(guò)用DNA探針雜交進(jìn)行篩選讓基因組文庫(kù)在平板上生長(zhǎng)。將生長(zhǎng)的菌落或噬斑轉(zhuǎn)移到尼龍濾膜或硝化纖維素濾膜上。將DNA通過(guò)變性固定化到所述濾膜上。依照常規(guī)方法，讓濾膜上的DNA與標(biāo)記探針雜交，以鑒定與所述探針雜交的克隆。
用于這種篩選的探針包括基于上述瓊脂糖酶的氨基酸序列的信息制備的寡核苷酸、基于另一氨基酸序列的信息制備的寡核苷酸、和用基于這樣的氨基酸序列的信息制備的引物所擴(kuò)增的PCR片段。用于所述探針的標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于放射性同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、洋地黃毒苷標(biāo)記和生物素標(biāo)記。
富集了如下制備的帶有瓊脂糖酶基因的轉(zhuǎn)化子的基因組文庫(kù)，可以用作供所述篩選用的基因組文庫(kù)。
依照常規(guī)方法，從產(chǎn)生瓊脂糖酶的微生物中制備基因組DNA，用合適的限制性酶消化，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)印到尼龍濾膜或硝化纖維素濾膜上。依照常規(guī)方法，讓濾膜上的DNA與上述標(biāo)記探針雜交，以檢測(cè)與所述探針雜交的DNA片段。從所述瓊脂糖凝膠中提取和純化對(duì)應(yīng)于所述信號(hào)的DNA片段。
依照常規(guī)方法，將如此獲得的DNA片段摻入到載體(例如質(zhì)粒載體)中，構(gòu)建重組DNA分子。然后將所述重組DNA分子導(dǎo)入合適的宿主(例如大腸桿菌)中，獲得轉(zhuǎn)化子?？梢詮某Ｒ?guī)方法中選擇適用于待使用的載體的轉(zhuǎn)化方法，例如在Molecular CloningA LaboratoryManual 2nd ed.中描述的那些方法。因此，獲得富集了帶有瓊脂糖酶基因的轉(zhuǎn)化子的基因組文庫(kù)。
使用這樣一種基因組文庫(kù)，可以更有效地進(jìn)行篩選。
可以在如上所述的方法(1)-(3)中篩選轉(zhuǎn)化子，克隆目標(biāo)基因。通過(guò)運(yùn)用PCR，可以在體外進(jìn)行克隆，而無(wú)需利用轉(zhuǎn)化子。
從產(chǎn)生瓊脂糖酶的微生物中制備基因組DNA。用基因組DNA作為模板，使用基于所述瓊脂糖酶的氨基酸序列的信息制備的一對(duì)引物，進(jìn)行PCR。因此，可以獲得含有瓊脂糖酶基因的DNA片段。此外，例如通過(guò)用所述片段作為探針進(jìn)行雜交，或者用基于所述片段的核苷酸序列制備的引物進(jìn)行PCR，可以獲得全長(zhǎng)瓊脂糖酶基因?？梢砸勒找阎椒?，測(cè)定如上所述獲得的基因的核苷酸序列。如果所述克隆不編碼完整的瓊脂糖酶多肽，則通過(guò)重復(fù)包括基于所述已測(cè)定核苷酸序列制備新探針和用所述探針篩選基因組文庫(kù)獲得新克隆的程序，揭示所述瓊脂糖酶的完整可讀框(ORF)。例如，基于如此獲得的信息，可以制備含有編碼所述瓊脂糖酶的完整ORF的克隆。
通過(guò)基因工程，通過(guò)將如上所述獲得的編碼所述瓊脂糖酶的基因與合適的表達(dá)載體連接，可以大量生產(chǎn)具有瓊脂糖酶活性的多肽。
以下簡(jiǎn)述用于獲得本發(fā)明的基因的方法。
用溶菌酶裂解通過(guò)培養(yǎng)微生物NAB2-1-1而獲得的細(xì)胞，然后除去蛋白質(zhì)、經(jīng)過(guò)乙醇沉淀等，獲得染色體DNA。NAB2-1-1染色體DNA用限制性酶完全消化。將對(duì)應(yīng)于所述限制性酶的連接物與已消化的DNA連接。用所得的染色體DNA作為模板，使用基于本發(fā)明的瓊脂糖酶I或II的N末端氨基酸序列或內(nèi)部氨基酸序列制備的引物以及對(duì)應(yīng)于所述連接物的核苷酸序列的引物，進(jìn)行PCR。
通過(guò)分析如上所述獲得的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列，可以確定編碼本發(fā)明的瓊脂糖酶的核苷酸序列。如果不能測(cè)定所述完整序列，則可以重復(fù)上述程序。或者，用染色體DNA作為模板，可以進(jìn)行引物步查。
基于所述瓊脂糖酶的氨基酸序列設(shè)計(jì)的引物可以是混合引物?；蛘撸没谒鯪末端氨基酸序列和內(nèi)部氨基酸序列制備的引物，用NAB2-1-1染色體DNA作為模板，通過(guò)PCR獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，可以使用基于所述擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列制備的新引物。
如此獲得的編碼瓊脂糖酶II的基因具有編碼由1089個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽的ORF。所述ORF的核苷酸序列示于SEQ ID NO21。由所述ORF的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO23。在所述基因的核苷酸序列中，發(fā)現(xiàn)了對(duì)應(yīng)于P2(瓊脂糖酶II的N末端氨基酸序列)的核苷酸序列、編碼具有信號(hào)肽樣序列的26個(gè)氨基酸的上游核苷酸序列、和更上游區(qū)中的SD樣序列。
因此，SEQ ID NO23的氨基酸序列是本發(fā)明α-瓊脂糖酶的一個(gè)實(shí)例。該氨基酸序列與先前測(cè)定的瓊脂糖酶II的N末端氨基酸序列的比較表明，瓊脂糖酶II是一種由SEQ ID NO23的氨基酸序列中第27號(hào)氨基酸至第1089號(hào)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的多肽，并且所述氨基酸序列由SEQ ID NO21的核苷酸序列中第79號(hào)核苷酸至第3270號(hào)核苷酸(包括終止密碼子)的核苷酸序列所編碼。
在所述ORF中發(fā)現(xiàn)了三個(gè)推定的鈣結(jié)合區(qū)(171-184、271-283和987-999)。
所述編碼瓊脂糖酶I的基因有一個(gè)編碼由438個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽的ORF。所述ORF的核苷酸序列示于SEQ ID NO20。由所述ORF的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO22。在所述基因的核苷酸序列中，發(fā)現(xiàn)了對(duì)應(yīng)于P1(瓊脂糖酶I的N末端氨基酸序列)的核苷酸序列、編碼20個(gè)氨基酸的上游核苷酸序列、和更上游區(qū)中的SD樣序列。
因此，SEQ ID NO22的氨基酸序列是本發(fā)明的瓊脂糖酶的一個(gè)實(shí)例。該氨基酸序列與先前測(cè)定的瓊脂糖酶I的N末端氨基酸序列的比較表明，瓊脂糖酶I是一種由SEQ ID NO22的氨基酸序列中第21號(hào)氨基酸至第438號(hào)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的多肽，并且所述氨基酸序列由SEQ ID NO20的核苷酸序列中第61號(hào)核苷酸至第1314號(hào)核苷酸(包括終止密碼子)的核苷酸序列所編碼。
如上所述獲得的瓊脂糖酶I的氨基酸序列與得自黃桿菌菌株NR19的已知β-瓊脂糖酶的氨基酸序列僅有33％的同源性。因此，認(rèn)為本發(fā)明的瓊脂糖酶I具有絕對(duì)新穎的序列。
通過(guò)將編碼本發(fā)明的瓊脂糖酶的基因(例如編碼瓊脂糖酶I或瓊脂糖酶II的基因)與合適的載體連接，可以構(gòu)建重組DNA分子。此外，通過(guò)將所述重組DNA分子導(dǎo)入合適的宿主中，可以制備轉(zhuǎn)化子。用通過(guò)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化子所獲得的培養(yǎng)物，生產(chǎn)本發(fā)明的瓊脂糖酶。因此，有可能用所述轉(zhuǎn)化子大量生產(chǎn)本發(fā)明的瓊脂糖酶(例如瓊脂糖酶I或瓊脂糖酶II)。
通過(guò)依照已知方法，在編碼瓊脂糖酶的基因中引入突變，可以產(chǎn)生突變型瓊脂糖酶?？梢允褂玫挠糜谝胪蛔兊姆椒ǖ膶?shí)例包括但不限于寡核苷酸雙琥珀法(Hashimoto-Gotoh，T.等，Gene，152271-275(1995))、帶缺口的雙鏈體法(the gapped duplex method)(Kramer，W.等，Nucl.Acids Res.，129441(1984)；Kramer，W.等，Methods in Enzymology，154350(1987))和Kunkel法(Kunkel，T.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488(1985)；Kunkel，T.A.，Methods in Enzymology，154367(1987))。
通過(guò)表達(dá)編碼在待表達(dá)的瓊脂糖酶的N末端添加信號(hào)序列的多肽的基因，可以使目標(biāo)瓊脂糖酶分泌到轉(zhuǎn)化子外。所述信號(hào)序列并不限于具體的信號(hào)序列，其示例為由SEQ ID NO22中第1號(hào)氨基酸至第20號(hào)氨基酸所示的瓊脂糖酶I的信號(hào)序列。這一信號(hào)序列由SEQ IDNO22中的第1號(hào)核苷酸至第60號(hào)核苷酸的核苷酸序列編碼?；蛘撸鲂盘?hào)序列的示例為由SEQ ID NO23中第1號(hào)氨基酸至第26號(hào)氨基酸所示的瓊脂糖酶I的信號(hào)序列。這一信號(hào)序列由SEQ ID NO21中的第1號(hào)核苷酸至第78號(hào)核苷酸的核苷酸序列編碼。
可以用來(lái)構(gòu)建重組DNA分子的載體的示例包括但不限于質(zhì)粒載體、噬菌體載體和病毒載體?？梢愿鶕?jù)使用所述重組DNA的目的，選擇合適的載體。如果構(gòu)建重組DNA分子以生產(chǎn)瓊脂糖酶，則優(yōu)選含啟動(dòng)子和/或供表達(dá)控制用的其它區(qū)的載體。這樣的質(zhì)粒載體的實(shí)例包括但不限于pKF19k、pT7BlueT和pET16b?？梢杂糜谥苽滢D(zhuǎn)化子的宿主包括但不限于諸如細(xì)菌、酵母和絲狀真菌的微生物以及哺乳動(dòng)物、魚(yú)類(lèi)、昆蟲(chóng)等的培養(yǎng)細(xì)胞。用適合于所述宿主的載體構(gòu)建的重組DNA分子來(lái)構(gòu)建轉(zhuǎn)化子。
以下簡(jiǎn)述通過(guò)基因工程生產(chǎn)瓊脂糖酶I的方法。
將含有編碼具有例如始于SEQ ID NO22的第21號(hào)氨基酸的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的DNA片段，插入到合適的質(zhì)粒載體(例如pKF19k(Takara Shuzo)、pT7BlueT(Takara Shuzo)或pET16b(TakaraShuzo)中，構(gòu)建質(zhì)粒。在合適的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)用這樣的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(例如大腸桿菌JM109或BL21(DE3)pLysS)。如有需要，用IPTG等進(jìn)行誘導(dǎo)。讓所述質(zhì)粒中所插入的DNA片段所編碼的多肽表達(dá)。單位體積的培養(yǎng)物中由這種轉(zhuǎn)化子表達(dá)的β-瓊脂糖酶活性通常高于用NAB2-1-1培養(yǎng)物所觀察到的所述活性。
對(duì)于瓊脂糖酶II，用編碼具有例如始于SEQ ID NO23的第27、181或318號(hào)氨基酸的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的DNA片段，通過(guò)如上關(guān)于瓊脂糖酶I所述的基因工程，可以制備表達(dá)瓊脂糖酶II的轉(zhuǎn)化子。所得的轉(zhuǎn)化子表達(dá)α-瓊脂糖酶活性，單位體積的培養(yǎng)物中的所述活性通常高于用NAB2-1-1培養(yǎng)物所觀察到的所述活性。
如上所述通過(guò)基因工程生產(chǎn)的本發(fā)明的瓊脂糖酶，可以通過(guò)常規(guī)純化方法例如用硫酸銨鹽析或溶劑沉淀進(jìn)行部分純化。此外，聯(lián)合運(yùn)用已知的純化方法，例如柱色譜(例如陰離子交換柱或凝膠過(guò)濾柱)，可以獲得電泳時(shí)產(chǎn)生單一條帶的純化酶制劑。
如果通過(guò)基因工程生產(chǎn)的本發(fā)明的瓊脂糖酶不溶解，則可以依照已知方法將其溶解并回收。
通過(guò)讓如此獲得的不同純化程度的本發(fā)明重組α-瓊脂糖酶與作為底物的紅藻中所含有的多糖(例如瓊脂或瓊脂糖)反應(yīng)，可以生產(chǎn)瓊脂寡糖，例如瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂己糖和瓊脂辛糖。
例如，通過(guò)用1％(w/v)瓊脂糖作為底物，于50℃反應(yīng)16小時(shí)，可以生產(chǎn)所述瓊脂寡糖。
同樣，通過(guò)讓如此獲得的不同純化程度的本發(fā)明的重組β-瓊脂糖酶作用于已經(jīng)經(jīng)過(guò)核酸等電泳的瓊脂糖凝膠，可以有效地提取瓊脂糖凝膠中的物質(zhì)(例如核酸)。
例如，在于1％(w/v)或3％(w/v)瓊脂糖凝膠上電泳的情況下，通過(guò)讓本發(fā)明的重組β-瓊脂糖酶于67℃作用于含有目標(biāo)物質(zhì)的瓊脂糖凝膠達(dá)10分鐘，可以有效地提取所述凝膠中的物質(zhì)。
通過(guò)從N末端缺失所述ORF的至多30％，可以改進(jìn)本發(fā)明的瓊脂糖酶的熱穩(wěn)定性。待缺失區(qū)并無(wú)具體限制，只要它至多為所述ORF的30％(例如10％、20％等)。例如，通過(guò)從N末端缺失瓊脂糖酶II的29.1％(即317個(gè)氨基酸)，可以改進(jìn)瓊脂糖酶II的熱穩(wěn)定性。在鈣存在下觀察到特別顯著的熱穩(wěn)定性的改進(jìn)。
對(duì)于用于缺失N末端部分以改進(jìn)熱穩(wěn)定性的方法并無(wú)具體限制。它可以通過(guò)用蛋白酶處理或者通過(guò)用基因工程技術(shù)來(lái)進(jìn)行。
實(shí)施例以下實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1活性測(cè)定方法當(dāng)純化本發(fā)明的瓊脂糖酶時(shí)，通過(guò)用Agarose LO3(Takara Shuzo)作為底物進(jìn)行酶促反應(yīng)，然后用高效液相色譜定量測(cè)定所得的瓊脂四糖或新瓊脂四糖，測(cè)定純化的或者部分純化的所述酶制劑的活性。以下詳細(xì)描述所述程序。
制備在含有10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2)(就瓊脂糖酶I而言)中或者在含有10mM氯化鈣和10mM氯化鈉的20mMTris-HCl緩沖液(pH7.2)(就瓊脂糖酶II而言)中含有0.2％(w/v)或0.5％(w/v)濃度的瓊脂糖的溶液。將作為底物的180μl該溶液與20μl酶溶液混合。讓混合物于50℃反應(yīng)5-30分鐘，優(yōu)選反應(yīng)10分鐘，然后在沸水中或于75℃加熱1分鐘以終止反應(yīng)。讓30μl所述反應(yīng)混合物經(jīng)過(guò)TSKgel α-2500柱(內(nèi)徑7.8mm；長(zhǎng)度300mm；Tosoh)。用70％乙腈溶液作為洗脫液，以0.8ml/分鐘的流速進(jìn)行洗脫。定量測(cè)定由于酶促反應(yīng)產(chǎn)生的以約25分鐘的保留時(shí)間洗脫出的瓊脂四糖或者以約24分鐘的保留時(shí)間洗脫出的新瓊脂四糖。一個(gè)單位(1U)定義為在10分鐘內(nèi)產(chǎn)生1μmol瓊脂四糖或新瓊脂四糖的酶量。
實(shí)施例2從NAB2-1-1生產(chǎn)瓊脂糖酶制備100ml人工海水(商品名Jamarin S；Jamarin Laboratory)。向其中加入濃度分別為0.3％(w/v)和0.02％(w/v)的蛋白胨(Difco)和酵母膏(Difco)。然后用3M碳酸鈉將pH調(diào)至7.8。將所得的混合物轉(zhuǎn)移到500ml錐形瓶中。向其中加入0.4g NuSieve GTG Agarose(Takara Shuzo)。用高壓滅菌器滅菌后，將NAB2-1-1接種到所述混合物中，于37℃以120rpm培養(yǎng)過(guò)夜。所得的培養(yǎng)物用作預(yù)培養(yǎng)物。
如下進(jìn)行主培養(yǎng)。在5,000ml小型發(fā)酵容器中制備3,000ml人工海水(商品名Jamarin S；Jamarin Laboratory)。向其中加入濃度分別為0.3％(w/v)和0.02％(w/v)的蛋白胨(Difco)和酵母膏(Difco)。然后將pH調(diào)至7.8。向其中加入12g NuSieve GTG Agarose(Takara Shuzo)?；旌衔镉酶邏簻缇鳒缇?。將30ml預(yù)培養(yǎng)物接種到所述混合物中，于37℃以250rpm培養(yǎng)18小時(shí)。然后將培養(yǎng)物以8,000×g離心20分鐘，收集約3,000ml已經(jīng)除去了細(xì)胞的上清液。
以下操作于4℃或4℃以下進(jìn)行。
將上清液置于透析膜(Sanko Junyaku)中，于約500g聚乙二醇中浸泡兩夜，以將其濃縮約10倍。將300ml濃縮液對(duì)緩沖液I(含有10mM氯化鈣和10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2))透析以便脫鹽。
將透析液上樣至已經(jīng)用所述緩沖液平衡的填充陰離子交換樹(shù)脂DEAE Toyopearl 650M(Tosoh)的柱(2.0cm×12cm)上。柱子用約120ml緩沖液I洗滌。收集不吸附流分和洗滌流分(約400ml)，將其合并作為瓊脂糖酶I級(jí)分。用10mM至1,000mM氯化鈉的線(xiàn)性梯度(總洗脫體積400ml)進(jìn)行洗脫。收集在300mM-600mM氯化鈉濃度洗脫出的約160ml的流分，作為瓊脂糖酶II級(jí)分。
將瓊脂糖酶I級(jí)分和瓊脂糖酶II級(jí)分對(duì)緩沖液II(含有10mM氯化鈣、10mM氯化鈉、5％甘油和1mM PMSF的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2))透析以便脫鹽。
如下對(duì)瓊脂糖酶II級(jí)分進(jìn)行進(jìn)一步純化。將經(jīng)透析的瓊脂糖酶II級(jí)分上樣至填充25ml QAE Toyopearl 550C(Tosoh)的柱(2.0cm×8.0cm)上。在這種情況下，用10mM至800mM氯化鈉的線(xiàn)性梯度(總洗脫體積250ml)進(jìn)行洗脫。獲得于約500mM洗脫出的約70ml的流分。將該流分對(duì)緩沖液II透析，用離心超濾膜CENTRIPREP-10(Amicon)濃縮至約1ml。用以緩沖液II平衡的填充Sephadex G-100(Pharmacia)的柱(0.8cm×50cm)對(duì)濃縮液進(jìn)行凝膠過(guò)濾。獲得約20ml的瓊脂糖酶II級(jí)分。再次用超濾膜將該級(jí)分濃縮至約1ml的體積。
經(jīng)純化的蛋白在含十二烷基硫酸鈉(SDS)的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，表明所述蛋白被純化至幾乎均質(zhì)?？偦钚约s為150U。
如下對(duì)瓊脂糖酶I級(jí)分進(jìn)行進(jìn)一步純化。
讓經(jīng)透析的瓊脂糖酶I級(jí)分(約400ml)吸附到已經(jīng)用緩沖液II平衡的填充CM Toyopearl 650(Tosoh)的柱(2.0cm×9.5cm)上。用10mM至1,000mM氯化鈉的線(xiàn)性梯度(總洗脫體積300ml)進(jìn)行洗脫。收集在至多300mM氯化鈉濃度洗脫出的約90ml的瓊脂糖酶I級(jí)分。將該級(jí)分對(duì)含有1.0M硫酸銨的緩沖液II透析過(guò)夜，上樣至用同一緩沖液平衡的填充30ml Butyl Toyopearl 650M(Tosoh)的柱(2.0cm×9.5cm)上。用1.0M至0M硫酸銨的梯度(總洗脫體積300ml)進(jìn)行洗脫?；厥?00mM至0M濃度下洗脫出的瓊脂糖酶I級(jí)分(約60ml)。同瓊脂糖酶II一樣，將所述級(jí)分對(duì)緩沖液II透析，用離心超濾膜CENTRIPREP-10(Amicon)濃縮至約1ml的體積。
經(jīng)純化的蛋白在含十二烷基硫酸鈉(SDS)的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，表明所述蛋白被純化至幾乎均質(zhì)?？偦钚约s為310U。
實(shí)施例3酶的各種特性的檢查[與瓊脂糖酶I和瓊脂糖酶II反應(yīng)的產(chǎn)物的鑒定]用瓊脂糖酶I或瓊脂糖酶II的純化酶，對(duì)20μl在含有10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2)(就瓊脂糖酶I而言)中或者在含有10mM氯化鈣和10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2)(就瓊脂糖酶II而言)中含有0.5％(w/v)濃度的瓊脂糖的溶液進(jìn)行消化。讓消化產(chǎn)物經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾柱(Tosoh，TSKgel α-2500)，用70％乙腈作為洗脫液。結(jié)果，在約24分鐘和約28分鐘處觀察到瓊脂糖酶I的主峰?；谒^測(cè)到的標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，認(rèn)為這些峰分別對(duì)應(yīng)于新瓊脂四糖和新瓊脂己糖。對(duì)于使用瓊脂糖酶II的消化產(chǎn)物，在約22分鐘、約25分鐘和約29分鐘的保留時(shí)間處觀察到主峰?；谒^測(cè)到的標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，認(rèn)為這些峰分別對(duì)應(yīng)于瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂己糖。通過(guò)對(duì)其進(jìn)行薄層色譜，使用組成為氯仿∶甲醇∶乙酸＝3∶3∶1的展開(kāi)劑進(jìn)行兩輪展層，證實(shí)了所述反應(yīng)產(chǎn)物。三種瓊脂寡糖即瓊脂二糖(Rf值＝0.76)、瓊脂四糖(Rf值＝0.50)和瓊脂己糖(Rf值＝0.33)以及兩種新瓊脂寡糖即新瓊脂四糖(Rf值＝0.59)和新瓊脂己糖(Rf值＝0.41)用作對(duì)照。結(jié)果，用苔黑酚-硫酸，在對(duì)應(yīng)于用瓊脂糖酶I獲得的反應(yīng)產(chǎn)物的新瓊脂寡糖的位置上，觀測(cè)到顯色物質(zhì)。在對(duì)應(yīng)于用瓊脂糖酶II獲得的反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂寡糖的位置上，觀測(cè)到顯色物質(zhì)。這些結(jié)果表明，瓊脂糖酶I是一種水解瓊脂糖分子中D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的β-1，4鍵產(chǎn)生新瓊脂寡糖的β-瓊脂糖酶，而瓊脂糖酶II是一種水解瓊脂糖分子中的α-1，3鍵產(chǎn)生瓊脂寡糖的α-瓊脂糖酶。
將瓊脂糖酶I溶液和瓊脂糖酶II溶液對(duì)無(wú)鈣緩沖液(含有10mM氯化鈉和1mM EDTA的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2))透析過(guò)夜。向其中加入在含有10mM氯化鈉和1mM EDTA的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2)中含有0.2％(w/v)濃度的瓊脂糖的溶液。讓混合物于50℃反應(yīng)10分鐘。通過(guò)在沸水中加熱1分鐘(就瓊脂糖酶I而言)或于75℃加熱1分鐘(就瓊脂糖酶II而言)終止反應(yīng)。然后，測(cè)量活性。將用含鈣的常規(guī)緩沖液進(jìn)行反應(yīng)時(shí)所觀測(cè)到的活性定義為100％。結(jié)果，瓊脂糖酶I和瓊脂糖酶II分別表現(xiàn)出約100％和約60％的其活性。
酶失活受到抑制并且對(duì)于瓊脂糖酶I和瓊脂糖酶II而言反應(yīng)容易進(jìn)行的溫度分別是50-65℃和45-55℃。
將所述酶溶液于48℃、50℃、55℃、60℃或65℃加熱給定時(shí)間。然后，向所述經(jīng)加熱的溶液中加入在含有10mM氯化鈉的20mMTris-HCl緩沖液(pH7.2)(就瓊脂糖酶I而言)中或者在含有10mM氯化鈣和10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2)(就瓊脂糖酶II而言)中含有0.2％(w/v)濃度的瓊脂糖的溶液。讓混合物于50℃反應(yīng)10分鐘。通過(guò)在沸水中加熱1分鐘(就瓊脂糖酶I而言)或于75℃加熱1分鐘(就瓊脂糖酶II而言)終止反應(yīng)。然后，測(cè)量活性。將于50℃常規(guī)反應(yīng)10分鐘時(shí)所觀測(cè)到的活性定義為100％。結(jié)果，瓊脂糖酶I在于65℃處理60分鐘之后表現(xiàn)出其活性的約85％，瓊脂糖酶II在于55℃處理10分鐘后表現(xiàn)出其活性的約40％。
用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定分子量。依照常規(guī)方法，用含有SDS的10-20％聚丙烯酰胺梯度凝膠和分子量標(biāo)記(Bio-Rad，肌球蛋白(MW 200,000)、β-半乳糖苷酶(MW 116,250)、磷酸化酶b(MW97,400)、牛血清白蛋白(MW 66,200)、卵清蛋白(MW 45,000)、碳酸酐酶(MW 31,000)、胰蛋白酶抑制劑(MW 21,500)、溶菌酶(MW 14,400))，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。根據(jù)遷移率測(cè)定，瓊脂糖酶I和瓊脂糖酶II的分子量分別為約48,000和約117,000。
依照Edman降解法，測(cè)定瓊脂糖I和瓊脂糖酶II的氨基末端氨基酸序列。用10-20％聚丙烯酰胺梯度凝膠，對(duì)含有對(duì)應(yīng)于約10pmol酶蛋白的瓊脂糖酶I或瓊脂糖酶II的純化酶制劑溶液進(jìn)行SDS-PAGE。電泳后，將凝膠上分離的酶轉(zhuǎn)印到膜ProBlot(Applied Biosystems)。用蛋白測(cè)序儀G1000A(Hewlett Packard)，分析所述膜中已經(jīng)吸附有所述酶的部分。結(jié)果，所測(cè)定的瓊脂糖酶I的氨基末端氨基酸序列(P1；SEQID NO1)和瓊脂糖酶II的氨基末端氨基酸序列(P2；SEQ ID NO2)分別為Ala-Asp-Xaa-Asp-Gly-Val-Pro-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly和Glu-Thr-Ile-Val-Leu-Gln-Ala-Glu-Ser-Phe。
用2mmol純化的瓊脂糖酶I或II，進(jìn)行半胱氨酸殘基的羧甲基化。用HPLC從通過(guò)用賴(lài)氨酰內(nèi)肽酶消化所獲得的消化產(chǎn)物中，分離和純化肽片段。對(duì)于所述柱使用μBondasphare C8(Waters)，用溶液A(0.1％TFA)和溶液B(含0.1％TFA的80％乙腈)進(jìn)行洗脫。通過(guò)將溶液B的比率在50分鐘內(nèi)以線(xiàn)性方式從0％提高至100％，以0.5ml/分鐘的流速進(jìn)行洗脫。于214nm進(jìn)行檢測(cè)，以便收集流分。對(duì)相應(yīng)的肽流分進(jìn)行氨基酸序列分析。對(duì)于瓊脂糖酶I，測(cè)定部分氨基酸序列PI3(SEQ IDNO3)和PI4(SEQ ID NO4)。對(duì)于瓊脂糖酶II，測(cè)定部分氨基酸序列PII5(SEQ ID NO5)、PII6(SEQ ID NO6)和PII7(SEQ ID NO7)。
實(shí)施例4瓊脂寡糖的生產(chǎn)向2ml反應(yīng)用緩沖液(含有10mM氯化鈣和10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2))中加入Agarose LO3，終濃度為1.0％(w/v)。再向其中加入約1.0U瓊脂糖酶II的純化制劑。讓混合物于50℃反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)后，反應(yīng)混合物通過(guò)0.22μm濾膜(Millipore)過(guò)濾。用高效液相色譜，在與實(shí)施例1中測(cè)量本發(fā)明所述酶的活性所用條件相同的條件下，分析經(jīng)過(guò)濾的反應(yīng)混合物，以測(cè)定所產(chǎn)生的瓊脂寡糖。結(jié)果，在反應(yīng)混合物中檢測(cè)到瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂己糖。因此，證明上述酶促反應(yīng)產(chǎn)生這些較小的瓊脂寡糖。
實(shí)施例5新瓊脂寡糖的生產(chǎn)向2ml反應(yīng)用緩沖液(含有10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2))中加入Agarose LO3，終濃度為1.0％(w/v)。再向其中加入約1.0U瓊脂糖酶I的純化制劑。讓混合物于65℃反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)后，反應(yīng)混合物通過(guò)0.22μm濾膜(Millipore)過(guò)濾。用高效液相色譜，在與實(shí)施例1中測(cè)量本發(fā)明所述酶的活性所用條件相同的條件下，分析經(jīng)過(guò)濾的反應(yīng)混合物，以測(cè)定所產(chǎn)生的新瓊脂寡糖。結(jié)果，在反應(yīng)混合物中檢測(cè)到新瓊脂四糖和新瓊脂己糖。因此，證明上述酶促反應(yīng)產(chǎn)生這些較小的新瓊脂寡糖。
實(shí)施例6用瓊脂糖酶I從瓊脂糖凝膠中回收核酸用1μg DNA分子量標(biāo)記-λHindIII(Takara Shuzo)在1.0％(w/v)SeaPlaque GTG瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。切割含有分離的大小約4.4kbp和約6.6kbp的DNA片段的凝膠，將其置于1.5ml Eppendorf管中。向其中加入1ml反應(yīng)緩沖液(含50mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2))。讓混合物于室溫靜置10分鐘。然后棄去緩沖液，將凝膠留在管中。將管于67℃保溫5分鐘，以熔化凝膠。向其中加入1.0U純化的瓊脂糖酶I。將混合物于室溫保溫10分鐘。將Eppendorf管置于冰上，以證實(shí)瓊脂糖酶凝膠完全溶解。然后依照常規(guī)方法進(jìn)行乙醇沉淀，回收所述DNA片段。同樣，對(duì)DNA分子量標(biāo)記-100bp分子量梯式標(biāo)記(Ladder Marker)(Takara Shuzo)進(jìn)行從3.0％(w/v)NuSieveGTG瓊脂糖凝膠回收DNA。在這種情況下，回收了400bp和500bp的DNA片段。所述DNA回收率與Pseudoaltermonas atlantica(TakaraShuzo)來(lái)源的市售β-瓊脂糖酶的回收率的比較結(jié)果示于表2中。
如果使用所述市售β-瓊脂糖酶，則在加入所述酶之前，應(yīng)該將溫度從熔化瓊脂糖凝膠所用的溫度降至所述酶可以作用的溫度。由于反應(yīng)溫度低，因此需要的反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，延長(zhǎng)所述程序所用的時(shí)間。
另一方面，如果使用本發(fā)明的瓊脂糖酶I，則可以在熔化瓊脂糖凝膠之后立即加入所述酶。由于反應(yīng)可以在高溫下進(jìn)行而無(wú)需降低溫度，所以所述程序僅需要短時(shí)間。
表2回收率(％)*標(biāo)記 所回收的DNA 瓊脂糖酶Iβ-瓊脂糖酶片段的大小(市售的)λ-HindIII 4.4kbp 78 516.6kbp 86 55100bp分子量梯 400bp84 32500bp81 45所需時(shí)間**約30分鐘 約3小時(shí)*DNA回收量/DNA上樣量×100。
**直至乙醇沉淀所需的時(shí)間。
實(shí)施例7從NAB2-1-1制備染色體DNA制備1升人工海水(商品名Jamarin S；Jamarin Laboratory)。向其中加入濃度分別為0.3％(w/v)和0.02％(w/v)的蛋白胨(Difco)和酵母膏(Difco)。然后用3M碳酸鈉將pH調(diào)至7.8。向其中加入0.1％(w/v)濃度的瓊脂(Nacalai Tesque)。用高壓滅菌器將混合物滅菌。將10μl產(chǎn)瓊脂糖酶的菌株NAB2-1-1的甘油儲(chǔ)液接種到2ml所述培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將1ml所述培養(yǎng)物接種到100ml同一種培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。以8,000×g離心10分鐘收集細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮于10ml緩沖液A(含有100mM NaCl和10mM EDTA(pH8.0)的100mMTris-HCl緩沖液(pH8.0))中。向其中加入0.25ml的溶菌酶溶液(20mg/ml)。讓混合物于37℃保溫1小時(shí)。然后向其中加入含有5.0％濃度的SDS的2.5ml緩沖液A。讓所得混合物于60℃在振蕩下保溫20分鐘。向其中加入1.5ml蛋白酶K溶液(20mg/ml)。讓混合物于37℃保溫過(guò)夜。然后向混合物中加入幾乎等體積的苯酚，將所得的混合物于室溫溫和振蕩約10分鐘。將混合物以2,000×g離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到冷乙醇中。用玻璃棒纏繞染色體DNA。向從中纏繞了染色體DNA的溶液中加入幾乎等體積的苯酚，進(jìn)行同樣的程序，以再次纏繞染色體DNA。將染色體DNA懸浮于10μl緩沖液A中。向其中加入50μl RNA酶A溶液(10mg/ml)，讓混合物于37℃保溫10分鐘。通過(guò)乙醇沉淀從溶液中回收染色體DNA，將其懸浮于5ml緩沖液B(含有140mM NaCl和1mM EDTA(pH7.5)的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5))中。將懸浮液對(duì)同一種緩沖液透析過(guò)夜。則獲得約5.0mg染色體DNA。根據(jù)OD260nm/280nm，測(cè)定所述DNA的純度。在每種情況下所述數(shù)值都是約1.8。用所述染色體DNA如下所述克隆瓊脂糖酶I和瓊脂糖酶II。
實(shí)施例8瓊脂糖酶I基因的克隆依然實(shí)施例3中所述測(cè)定的瓊脂糖酶I的N末端氨基酸序列P1(SEQ ID NO1)，設(shè)計(jì)混合引物1和2(SEQ ID NO8和9)，用DNA合成儀合成，并進(jìn)行純化。具體地說(shuō)，SEQ ID NO8和9所示的混合引物1和2分別對(duì)應(yīng)于氨基酸序列P1中第4-10號(hào)和第4-13號(hào)氨基酸的氨基酸序列。用這些引物和LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)進(jìn)行所述瓊脂糖酶I基因的克隆。
如下進(jìn)行初次PCR。在實(shí)施例7中制備的染色體DNA用限制性酶BamHI完全消化。用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo)，將BamHI連接物連接到所述經(jīng)消化的DNA的末端。將其一部分置于0.5ml PCR用試管中。向其中加入5μl 10×LA PCR緩沖液、8μl dNTP混合物、1μl混合引物1、1μl引物C1(LA PCR體外克隆試劑盒(TaKaRa Shuzo)所附的引物)、0.5μl TaKaRa LA Taq和無(wú)菌水至50μl。在溶液上鋪上50μl礦物油之后，用自動(dòng)基因擴(kuò)增儀器熱循環(huán)儀(Takara Shuzo)使所述試管進(jìn)行反應(yīng)。于94℃變性2分鐘之后，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR。每個(gè)循環(huán)由94℃變性1分鐘、引物于50℃退火2分鐘和于72℃合成反應(yīng)2分鐘組成。
接著，用所述反應(yīng)混合物作為模板進(jìn)行二次PCR。除用通過(guò)初次PCR獲得的1μl反應(yīng)混合物作為模板以及使用混合引物2和引物C2(LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)所附的引物)組合之外，在與初次PCR所用條件相同的條件下進(jìn)行PCR。在PCR之后，除去礦物油上層，用5μl反應(yīng)混合物在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳，然后所述DNA用溴化乙錠染色，以證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果，觀察到約0.8kb的DNA片段。所述DNA片段被命名為βN。
將從瓊脂糖凝膠上切取的擴(kuò)增片段βN與載體pT7Blue連接，用來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。依照雙脫氧鏈終止法，用轉(zhuǎn)化子測(cè)定擴(kuò)增片段βN的所述末端區(qū)的核苷酸序列。根據(jù)所述N末端區(qū)的序列，設(shè)計(jì)引物3和4(SEQ ID NO10和11)。根據(jù)除所述N末端區(qū)之外的末端區(qū)的序列，設(shè)計(jì)引物5和6(SEQ ID NO12和13)。用DNA合成儀合成所述引物，然后純化。運(yùn)用這些引物和LA PCR體外克隆試劑盒(TakaraShuzo)，以相似的方式克隆βN上游和下游的DNA片段。在這種情況下，引物于55℃退火1分鐘。
對(duì)于上游區(qū)，用引物3和4獲得約0.6kb的DNA片段，將其命名為βUN。對(duì)于βN下游的區(qū)，用引物5和6獲得約1.3kb的DNA片段，將其命名為βC。將βUN和βC兩者與載體pT7Blue(Novagen)連接。依照雙脫氧鏈終止法，測(cè)定核苷酸序列。分析DNA片段βN、βUN和βC的核苷酸序列，并進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個(gè)編碼由438個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白的ORF。
所述ORF的核苷酸序列和由所述ORF的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO20和22。發(fā)現(xiàn)在βUN中，存在一個(gè)氨基酸序列P1的核苷酸序列、一個(gè)編碼氨基酸序列P1上游的20個(gè)氨基酸的核苷酸序列和更上游區(qū)中的一個(gè)SD樣序列。
在實(shí)施例3中測(cè)定的N末端氨基酸序列P1對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO22中第21-33號(hào)氨基酸的序列。在實(shí)施例3中測(cè)定的部分氨基酸序列PI3(SEQ ID NO3)和PI4(SEQ ID NO4)分別與SEQ ID NO22中的第265-272號(hào)氨基酸和第367-376號(hào)氨基酸的序列匹配。
實(shí)施例9瓊脂糖酶II基因的克隆根據(jù)如實(shí)施例3中所述測(cè)定的瓊脂糖酶II的N末端氨基酸序列P2(SEQ ID NO2)和PII6(SEQ ID NO6)，設(shè)計(jì)混合引物7和8(SEQ IDNO14和15)。它們與相互不同的鏈雜交。用DNA合成儀合成所述混合引物，并進(jìn)行純化。
具體地說(shuō)，SEQ ID NO14所示的混合引物7對(duì)應(yīng)于氨基酸序列P2的第1-8號(hào)氨基酸，SEQ ID NO15所示的混合引物8對(duì)應(yīng)于編碼氨基酸序列PII6中第2-10號(hào)氨基酸的DNA的互補(bǔ)鏈。
用這些引物和LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)進(jìn)行所述瓊脂糖酶II基因的克隆。
如下進(jìn)行初次PCR。將在實(shí)施例7中制備的10ng NAB2-1-1染色體DNA置于0.5ml PCR用試管中。向其中加入5μl 10×LA PCR緩沖液、8μl dNTP混合物、混合引物7和8各40pmol、0.5μl TaKaRa LATaq和無(wú)菌水至50μl。在溶液上鋪上50μl礦物油之后，用自動(dòng)基因擴(kuò)增儀器熱循環(huán)儀(Takara Shuzo)使所述試管進(jìn)行反應(yīng)。于94℃變性2分鐘之后，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR。每個(gè)循環(huán)由94℃變性1分鐘、引物于50℃退火2分鐘和于72℃合成反應(yīng)2分鐘組成。除去礦物油上層，用5μl反應(yīng)混合物在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳，然后所述DNA用溴化乙錠染色，以證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果，觀察到約600bp的DNA片段。所述DNA片段被命名為αN。
將從瓊脂糖凝膠上切取的擴(kuò)增片段αN與載體pT7Blue連接，用來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。依照雙脫氧鏈終止法，用轉(zhuǎn)化子測(cè)定擴(kuò)增片段αN的所述末端區(qū)的核苷酸序列。根據(jù)N末端區(qū)的序列，設(shè)計(jì)引物9和10(SEQ ID NO16和17)。根據(jù)除所述N末端區(qū)之外的末端區(qū)的序列，設(shè)計(jì)引物11和12(SEQ ID NO18和19)。用DNA合成儀合成所述引物，然后純化。運(yùn)用這些引物和LA PCR體外克隆試劑盒(TakaraShuzo)，以相似的方式克隆αN上游和下游的DNA片段。
在這種情況下，如下進(jìn)行PCR。在實(shí)施例7中制備的NAB2-1-1染色體DNA用限制性酶BamHI完全消化。用DNA連接試劑盒(TakaraShuzo)，將BamHI連接物連接到所述經(jīng)消化的DNA的末端。將其一部分置于0.5ml PCR用試管中。向其中加入5μl 10×LA PCR緩沖液、8μl dNTP混合物、1μl混合引物9、1μl引物C1、0.5μl TaKaRa LA Taq和無(wú)菌水至50μl。在溶液上鋪上50μl礦物油之后，用自動(dòng)基因擴(kuò)增儀器熱循環(huán)儀(Takara Shuzo)使所述試管進(jìn)行反應(yīng)。于94℃變性2分鐘之后，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR。每個(gè)循環(huán)由94℃變性1分鐘、引物于50℃退火2分鐘和于72℃合成反應(yīng)3分鐘組成。
接著，用所述反應(yīng)混合物作為模板進(jìn)行二次PCR。除用通過(guò)初次PCR獲得的1μl反應(yīng)混合物作為模板以及使用引物10和引物C2組合之外，在與初次PCR所用條件相同的條件下進(jìn)行PCR。除去礦物油上層，用5μl反應(yīng)混合物在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳，然后所述DNA用溴化乙錠染色，以證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果，觀察到約500bp的DNA片段。所述DNA片段被命名為αUN。
同樣，用引物11和12獲得αN下游的約2kb的DNA片段，將其命名為αC。將αUN和αC兩者與載體pT7Blue(Novagen)連接。依照雙脫氧鏈終止法，測(cè)定核苷酸序列。分析DNA片段αN、αUN和αC的核苷酸序列，并進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個(gè)編碼由1089個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白的ORF。
所述ORF的核苷酸序列和由所述ORF的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO21和23。發(fā)現(xiàn)在αUN中，存在一個(gè)氨基酸序列P2的核苷酸序列、一個(gè)編碼氨基酸序列P2上游的具有信號(hào)肽樣序列的26個(gè)氨基酸的核苷酸序列和更上游區(qū)中的一個(gè)SD樣序列。
所述氨基酸序列P2對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO23中第27-36號(hào)氨基酸的序列。在實(shí)施例3中測(cè)定的部分氨基酸序列PII5(SEQ ID NO5)、PII6(SEQ ID NO6)和PII7(SEQ ID NO7)分別與SEQ ID NO23中的第129-138號(hào)氨基酸、第640-649號(hào)氨基酸和第738-747號(hào)氨基酸的序列匹配。
此外，發(fā)現(xiàn)三個(gè)推定的鈣結(jié)合區(qū)(SEQ ID NO23中的171-184、271-283和987-999)。
實(shí)施例10瓊脂糖酶I表達(dá)用質(zhì)粒的構(gòu)建引物13(SEQ ID NO24)是一種合成DNA，它在第12-17號(hào)核苷酸處具有一個(gè)限制性酶EcoRI的識(shí)別序列，在第19-38號(hào)核苷酸處具有一個(gè)對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO22的氨基酸序列中第21-27號(hào)氨基酸的核苷酸序列。用引物13和引物14(SEQ ID NO25)如下進(jìn)行PCR，引物14在第11-16號(hào)核苷酸處具有一個(gè)限制性酶PstI的識(shí)別序列，并且與染色體上的瓊脂糖酶I讀框下游約300bp的部分互補(bǔ)的鏈雜交。向0.5mlPCR用試管中，加入引物13和14各10pmol、10ng作為模板的得自NAB2-1-1的染色體DNA、5μl 10×ExTaq緩沖液、8μl dNTP混合物、0.5μl TaKaRa ExTaq和無(wú)菌水至50μl。將試管置于自動(dòng)基因擴(kuò)增儀器熱循環(huán)儀(Takara Shuzo)中。于94℃變性2分鐘之后，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的PCR。每個(gè)循環(huán)由94℃1分鐘、55℃2分鐘和72℃2分鐘組成。通過(guò)乙醇沉淀將PCR產(chǎn)物濃縮和脫鹽，用限制性酶EcoRI(Takara Shuzo)和PstI(Takara Shuzo)雙重消化，然后在1.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。對(duì)EcoRI-PstI消化物進(jìn)行提取和純化。將經(jīng)純化的產(chǎn)物與已經(jīng)用相同酶消化的pUC18(Takara Shuzo)混合，用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo)進(jìn)行連接。用10μl連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。讓轉(zhuǎn)化子在含有濃度為1.5％(w/v)的瓊脂和濃度為50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。從白色菌落制備質(zhì)粒，進(jìn)行DNA測(cè)序。選擇正確插入所述PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒，將其命名為pNB101。pNB101是一種編碼瓊脂糖酶I的氨基酸序列(SEQ ID NO22)中第21-437號(hào)氨基酸的氨基酸序列的質(zhì)粒。用質(zhì)粒pNB101轉(zhuǎn)化的大腸桿菌被命名為大腸桿菌JM109/pNB101，于2001年1月10日(原始保藏日)保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(International PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higasshi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan)，保藏號(hào)為FERM BP-7854。
將導(dǎo)入了pNB101的轉(zhuǎn)化子接種到含有50μg/ml氨芐青霉素的2.5ml LB肉湯中，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將一部分培養(yǎng)物接種到2.5ml相同的新鮮培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)直至其達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期。此時(shí)，向其中加入IPTG，終濃度為1.0mM。再于20℃繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，以誘導(dǎo)所述目標(biāo)蛋白的表達(dá)。然后離心收集細(xì)胞，將其重懸于150μl細(xì)胞破碎溶液(含有10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2))中。通過(guò)超聲處理破碎細(xì)胞。通過(guò)離心將作為上清液的提取物和沉淀相互分離，用作用瓊脂糖作為底物測(cè)量β-瓊脂糖酶活性用的樣品。然后，觀察作為上清液的提取物的活性。在100ml所述培養(yǎng)物中所含有的活性為野生型菌株NAB2-1-1的活性的約25倍。
實(shí)施例11利用pET16b的瓊脂糖酶I的表達(dá)系統(tǒng)用引物15(SEQ ID NO26)和引物16(SEQ ID NO27)，用NAB2-1-1染色體DNA作為模板，在實(shí)施例10中所述的條件下進(jìn)行PCR。引物15是一種在第20-39號(hào)核苷酸處具有一個(gè)對(duì)應(yīng)于瓊脂糖酶I氨基酸序列(SEQ ID NO22)中第21-27號(hào)氨基酸的核苷酸序列以及在第14-19號(hào)核苷酸處具有一個(gè)限制性酶NdeI的識(shí)別序列的引物。引物16是一種在第12-17號(hào)核苷酸處具有一個(gè)限制性酶XhoI的識(shí)別序列并且與染色體上瓊脂糖酶I讀框下游約300bp的一個(gè)部分互補(bǔ)的鏈雜交的引物。通過(guò)乙醇沉淀濃縮所述擴(kuò)增片段，用NdeI(Takara Shuzo)和XhoI(Takara Shuzo)消化，進(jìn)行提取和純化。將所述產(chǎn)物與已經(jīng)用相同的酶消化的pET16b(Takara Shuzo)連接。所得的質(zhì)粒被命名為pNB201。pNB201是一種編碼瓊脂糖酶I氨基酸序列(SEQ ID NO22)中第21-437號(hào)氨基酸的氨基酸序列的質(zhì)粒。
用pNB201轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，用所得的轉(zhuǎn)化子，如以上實(shí)施例10中所述測(cè)定β-瓊脂糖酶活性。然后，觀察所述提取物的活性。在100ml所述培養(yǎng)物中所含有的活性約NAB2-1-1的活性的約50倍。
實(shí)施例12瓊脂糖酶II表達(dá)用質(zhì)粒的構(gòu)建引物17(SEQ ID NO28)是一種合成DNA，它在第10-15號(hào)核苷酸處具有一個(gè)限制性酶EcoRI的識(shí)別序列，在第17-37號(hào)核苷酸處具有一個(gè)對(duì)應(yīng)于瓊脂糖酶II氨基酸序列(SEQ ID NO23)中第27-33號(hào)氨基酸的核苷酸序列。用引物17和引物18(SEQ ID NO29)如下進(jìn)行PCR，引物18在第11-16號(hào)核苷酸處具有一個(gè)限制性酶BamHI的識(shí)別序列，并且與染色體上的瓊脂糖酶II讀框下游約250bp的部分雜交。在采用ExTaq的反應(yīng)系統(tǒng)(Takara Shuzo)中，使用引物17和18各10pmol以及10ng得自野生型菌株NAB2-1-1的染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR。于94℃變性2分鐘之后，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR。每個(gè)循環(huán)由94℃1分鐘、50℃2分鐘和72℃3分鐘組成。通過(guò)乙醇沉淀濃縮PCR產(chǎn)物，用限制性酶EcoRI(Takara Shuzo)和BamHI(Takara Shuzo)雙重消化，然后在1.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。對(duì)EcoRI-BamHI消化物進(jìn)行提取和純化。如實(shí)施例10中所述，用pUC18構(gòu)建雜種質(zhì)粒，用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。所述雜種質(zhì)粒被命名為pNA101。pNB101是一種編碼瓊脂糖酶II的氨基酸序列(SEQ ID NO23)中第27-1089號(hào)氨基酸的氨基酸序列的質(zhì)粒。
用質(zhì)粒pNA101轉(zhuǎn)化的大腸桿菌被命名為大腸桿菌JM109/pNA101，于2001年1月10日(原始保藏日)保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(International PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan)，保藏號(hào)為FERM BP-7853。
除了在細(xì)胞破碎產(chǎn)物中包含10mM氯化鈣之外，如實(shí)施例10中所述，對(duì)導(dǎo)入了pNA101的轉(zhuǎn)化子測(cè)定α-瓊脂糖酶活性。觀察所述提取物的活性。在100ml所述培養(yǎng)物中所含有的活性為野生型菌株NAB2-1-1的活性的約15倍。
實(shí)施例13具有缺失的瓊脂糖酶II蛋白的活性如下所述，通過(guò)基因工程制備經(jīng)修飾的蛋白。測(cè)定所述經(jīng)修飾的蛋白的α-瓊脂糖酶活性。
引物19(SEQ ID NO30)是一種在第19-40號(hào)核苷酸處具有一個(gè)對(duì)應(yīng)于瓊脂糖酶II氨基酸序列(SEQ ID NO23)中第181-188號(hào)氨基酸的核苷酸序列且在第12-17號(hào)核苷酸處具有一個(gè)限制性酶EcoRI的識(shí)別序列的引物。
用引物19和引物18(SEQ ID NO29)以及用NAB2-1-1的染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR。將產(chǎn)物與pUC18連接，如實(shí)施例12中所述轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。通過(guò)證實(shí)連接位點(diǎn)的DNA序列而獲得的雜種質(zhì)粒被命名為pNA201d。從pNA201d表達(dá)的蛋白是其中瓊脂糖酶II氨基酸序列(SEQ ID NO23)中直至第180號(hào)氨基酸的部分缺失的蛋白。換句話(huà)說(shuō)，pNA201d是一種編碼瓊脂糖酶II的氨基酸序列(SEQ IDNO23)中第181-1089號(hào)氨基酸的氨基酸序列的質(zhì)粒。在用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)之后，如實(shí)施例10中所述進(jìn)行活性的測(cè)量，只是在所述細(xì)胞破碎產(chǎn)物中包含10mM氯化鈣。觀察所述提取物的α-瓊脂糖酶活性。在100ml所述培養(yǎng)物中所含有的活性為NAB2-1-1的活性的約2倍。
引物20(SEQ ID NO31)在第19-40號(hào)核苷酸處具有一個(gè)對(duì)應(yīng)于瓊脂糖酶II氨基酸序列(SEQ ID NO23)中第318-325號(hào)氨基酸的核苷酸序列，且在第12-17號(hào)核苷酸處具有一個(gè)限制性酶EcoRI的識(shí)別序列。用引物20和引物18(SEQ ID NO29)以及用NAB2-1-1的染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR，用pUC18構(gòu)建一個(gè)雜種質(zhì)粒-pNA301d。從導(dǎo)入了pNA301d的大腸桿菌JM109表達(dá)了一種其中瓊脂糖酶II氨基酸序列(SEQ ID NO23)中直至第317號(hào)氨基酸的肽缺失的蛋白。換句話(huà)說(shuō)，pNA301d是一種編碼瓊脂糖酶II的氨基酸序列(SEQ ID NO23)中第318-1089號(hào)氨基酸的氨基酸序列的質(zhì)粒。如實(shí)施例10中所述進(jìn)行活性的測(cè)量，只是在所述細(xì)胞破碎產(chǎn)物中包含10mM氯化鈣。觀察所述提取物的α-瓊脂糖酶活性。在100ml所述培養(yǎng)物中所含有的活性為NAB2-1-1的活性的約15倍。此外，得自導(dǎo)入了pNA301d的轉(zhuǎn)化子的提取物，對(duì)無(wú)鈣緩沖液(含有10mM氯化鈉和1mM EDTA(pH7.2)的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2))透析，然后與在含有10mM氯化鈉和1mM EDTA(pH7.2)的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2)含有0.2％濃度的瓊脂糖的溶液反應(yīng)。結(jié)果觀察到與用含鈣緩沖液所觀察到的活性相似的消化活性。
實(shí)施例14與AgarACE酶(Promega)的比較[最適溫度]將本發(fā)明的瓊脂糖酶I的酶學(xué)特性與Promega出售的海洋黃桿菌來(lái)源的β-瓊脂糖酶-AgarACE酶的所述特性進(jìn)行比較。
向通過(guò)在20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.3)中加熱溶解的40μl 1.0％(w/v)NuSieve GTG Agarose(FMC)中，加入10μl瓊脂糖酶I或AgarACE酶(Promega；依照所附的數(shù)據(jù)單，相當(dāng)于0.29單位)。讓混合物于45℃、50℃、55℃、60℃或65℃反應(yīng)10分鐘。依照實(shí)施例1中所述的方法，預(yù)先測(cè)量?jī)煞N酶的活性。然后，加入所述酶，使得在各個(gè)反應(yīng)中包括相同的酶活性。反應(yīng)后，如實(shí)施例1中所述計(jì)算酶活性。將最高酶活性定義為100％，以相對(duì)值表示的結(jié)果示于表3中。由所述結(jié)果可見(jiàn)，瓊脂糖酶I的最適溫度是50-65℃，而AgarACE酶的最適溫度是45-50℃。
表3相對(duì)活性(％)45℃50℃55℃60℃65℃70℃瓊脂糖酶I89 97 100 100 100 95AgarACE 100 98 84 25 11 0[熱穩(wěn)定性]將10μl瓊脂糖酶I或AgarACE酶(依照所附的數(shù)據(jù)單，相當(dāng)于0.29單位)于60℃或65℃保溫給定的時(shí)間，然后加入到通過(guò)在20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.3)中加熱溶解的40μl 1.0％(w/v)NuSieve GTGAgarose(FMC)中。如上所述，加入所述酶，使得在各個(gè)反應(yīng)中包括相同的酶活性。讓混合物于55℃反應(yīng)10分鐘(就瓊脂糖酶I而言)或于45℃反應(yīng)10分鐘(就AgarACE酶而言)。如實(shí)施例1中所述計(jì)算酶活性。將未經(jīng)加熱而觀測(cè)到的所述活性定義為100％，以相對(duì)值表示的結(jié)果示于表4中。由所述結(jié)果可見(jiàn)，幾乎100％的瓊脂糖酶I活性在于65℃保溫10分鐘后得以保留，而AgarACE酶在于65℃保溫10分鐘后完全被失活。
表4殘留活性(％)保溫時(shí)間(min) 010 20 30瓊脂糖酶I(60℃) 100 100100 98(65℃) 100 10095 90AgarACE(60℃) 100 81 48 21(65℃) 100 3 00實(shí)施例15鈣引起的酶熱穩(wěn)定性的改變將用pNA101(實(shí)施例11)或pNA301d(實(shí)施例13)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109接種到含有50μg/ml氨芐青霉素的2.5ml LB肉湯中，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將一部分培養(yǎng)物接種到100ml相同培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)直至其達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期。此時(shí)，向其中加入IPTG，終濃度為1.0mM。再于20℃繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，以誘導(dǎo)所述目標(biāo)蛋白的表達(dá)。然后離心收集細(xì)胞，將其懸浮于5ml細(xì)胞破碎溶液(含有10mM氯化鈉和1mM氯化鈣的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2))中。通過(guò)超聲處理破碎細(xì)胞。通過(guò)離心收集上清液。測(cè)量上清液中的α-瓊脂糖酶活性。用細(xì)胞破碎溶液稀釋上清液，使得在單位體積的每種樣品中含有相同的酶活性。將如此獲得的每種酶的提取物對(duì)含鈣的緩沖液A(含有10mM氯化鈉和10mM氯化鈣的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2))或者不含鈣的緩沖液B(含有10mM氯化鈉和1mM EDTA(pH7.2)的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2))透析過(guò)夜。將20μl所述酶溶液于55℃或50℃保溫10分鐘，然后與180μl在含10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2)中含有0.2％濃度的瓊脂糖的溶液反應(yīng)。依照實(shí)施例1中所述的方法，測(cè)定殘留的α-瓊脂糖酶活性。結(jié)果示于表5中。
用得自NAB2-1-1的天然瓊脂糖酶II作為對(duì)照。
表5殘留活性(％)*處理溫度 50℃ 55℃緩沖液A B A B天然瓊脂糖酶II100564210pNA101100604515pNA301d 100587012*每種酶在緩沖液A中于50℃處理后的殘留活性被定義為100。
實(shí)施例16具有缺失的瓊脂糖酶II蛋白的活性如下所述，通過(guò)基因工程制備經(jīng)修飾的蛋白。測(cè)定所述經(jīng)修飾的蛋白的α-瓊脂糖酶活性。
引物21(SEQ ID NO34)在第19-40號(hào)核苷酸處具有一個(gè)對(duì)應(yīng)于瓊脂糖酶II氨基酸序列(SEQ ID NO23)中第290-297號(hào)氨基酸的核苷酸序列，且在第12-17號(hào)核苷酸處具有一個(gè)限制性酶EcoRI的識(shí)別序列。
用引物21和引物18(SEQ ID NO29)以及用NAB2-1-1的染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR，將產(chǎn)物與pUC18連接，如實(shí)施例12中所述轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。通過(guò)證實(shí)連接位點(diǎn)的DNA序列而獲得的雜種質(zhì)粒被命名為pNA401d。從pNA401d表達(dá)的蛋白是其中瓊脂糖酶II氨基酸序列(SEQ ID NO23)中直至第289號(hào)氨基酸的部分缺失的蛋白。換句話(huà)說(shuō)，pNA401d是一種編碼瓊脂糖酶II的氨基酸序列(SEQ IDNO23)中第290-1089號(hào)氨基酸的氨基酸序列的質(zhì)粒。將用實(shí)施例13中獲得的pNA301d或如上所述獲得的pNA401d轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109，接種到含有50μg/ml氨芐青霉素的2.5ml LB肉湯中，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將一部分培養(yǎng)物接種到100ml相同培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)直至其達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期。此時(shí)，向其中加入IPTG，終濃度為1.0mM。再于20℃繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，以誘導(dǎo)所述目標(biāo)蛋白的表達(dá)。然后離心收集細(xì)胞，將其懸浮于5ml細(xì)胞破碎溶液(含有10mM氯化鈉和1mM氯化鈣的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2))中。通過(guò)超聲處理破碎細(xì)胞。通過(guò)離心收集上清液。測(cè)量上清液中的α-瓊脂糖酶活性。用細(xì)胞破碎溶液稀釋上清液，使得在單位體積的每種樣品中含有相同的酶活性。將20μl所述酶溶液于55℃或60℃保溫10分鐘，然后與180μl在含10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2)中含有0.2％濃度的瓊脂糖的溶液反應(yīng)。依照實(shí)施例1中所述的方法，測(cè)定殘留的α-瓊脂糖酶活性。結(jié)果示于表6中。這些結(jié)果表明，pNA401d的產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性等于或高于pNA301d的熱穩(wěn)定性。
用得自NAB2-1-1的天然瓊脂糖酶II作為對(duì)照。
表6殘留活性(％)*處理溫度 55℃ 60℃天然瓊脂糖酶II 42 0PNA301d 70 31PNA401d 79 39*每種酶于50℃處理后的殘留活性被定義為100。
此外，在用IPTG于37℃誘導(dǎo)過(guò)夜后，通過(guò)離心收集上清液，然后如上所述通過(guò)超聲處理破碎細(xì)胞。定量測(cè)定上清液的蛋白含量。對(duì)上清液進(jìn)行SDS-PAGE，使得蛋白的上樣量相同。另外，將收集上清液時(shí)獲得的沉淀懸浮于細(xì)胞破碎溶液中，以相似的方式進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的用pNA401d獲得的上清液中目標(biāo)蛋白的量高于用天然型或pNA301d獲得的上清液中的目標(biāo)蛋白的量。因此，表明通過(guò)誘導(dǎo)從用pNA401d轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109表達(dá)的突變型α-瓊脂糖酶容易被溶解。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明提供了新型瓊脂糖酶。本發(fā)明的瓊脂糖酶的最適溫度高于常規(guī)瓊脂糖酶的最適溫度，并且所述瓊脂糖酶的熱穩(wěn)定性非常好。因此，它可以用來(lái)在高溫下進(jìn)行反應(yīng)。因而，本發(fā)明的瓊脂糖酶非常有效，因?yàn)樗軌蚴狗磻?yīng)在存在高濃度瓊脂糖時(shí)在不固化的情況下反應(yīng)。
利用本發(fā)明的瓊脂糖酶，可以有效地從瓊脂糖直接有效地生產(chǎn)具有低聚合度、在其還原末端具有3，6-脫水-L-半乳糖的瓊脂寡糖(例如瓊脂二糖和瓊脂四糖)或者在其非還原末端具有3，6-脫水-L-半乳糖的新瓊脂寡糖(例如新瓊脂二糖和新瓊脂四糖)。
利用本發(fā)明的瓊脂糖酶，可以從瓊脂糖凝膠中有效地提取核酸等。
用本發(fā)明的瓊脂糖酶生產(chǎn)的瓊脂寡糖具有生理活性，例如細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性、制癌活性、各種抗氧化活性、免疫調(diào)節(jié)活性和抗變態(tài)反應(yīng)活性。因此，它們可用于藥用組合物、食品和飲料領(lǐng)域。
本發(fā)明首次公開(kāi)了所述瓊脂糖酶的氨基酸序列和核苷酸序列。因此，有可能提供具有瓊脂糖酶活性的多肽的編碼基因。本發(fā)明也提供一種用于利用所述基因通過(guò)基因工程生產(chǎn)具有瓊脂糖酶活性的多肽的工業(yè)上有利的方法。
此外，在利用所述基因通過(guò)基因工程的所述生產(chǎn)方法中，并不需要向培養(yǎng)基中加入瓊脂糖來(lái)誘導(dǎo)所述瓊脂糖酶的產(chǎn)生。因此，認(rèn)為在培養(yǎng)時(shí)節(jié)省了工作量，并且容易純化所述酶。
另外，基于本發(fā)明首次提供所述瓊脂糖酶基因這一事實(shí)，本發(fā)明基于所述基因的信息，提供了由所述基因編碼的重組多肽、與所述多肽或其片段特異性結(jié)合的抗體、以及與所述瓊脂糖酶特異性雜交的探針或引物。
序列表的獨(dú)立文本SEQ ID NO1瓊脂糖酶I的N末端氨基酸序列。
SEQ ID NO2瓊脂糖酶II的N末端氨基酸序列。
SEQ ID NO3瓊脂糖酶I的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO4瓊脂糖酶I的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO5瓊脂糖酶II的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO6瓊脂糖酶II的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO7瓊脂糖酶II的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO8PCR引物1SEQ ID NO9PCR引物2SEQ ID NO10PCR引物3SEQ ID NO11PCR引物4SEQ ID NO12PCR引物5SEQ ID NO13PCR引物6SEQ ID NO14PCR引物7SEQ ID NO15PCR引物8SEQ ID NO16PCR引物9SEQ ID NO17PCR引物10SEQ ID NO18PCR引物11SEQ ID NO19PCR引物12SEQ ID NO20瓊脂糖酶I中ORF的核苷酸序列。
SEQ ID NO21瓊脂糖酶II中ORF的核苷酸序列。
SEQ ID NO22瓊脂糖酶I的氨基酸序列。
SEQ ID NO23瓊脂糖酶II的氨基酸序列。
SEQ ID NO24PCR引物13SEQ ID NO25PCR引物14SEQ ID NO26PCR引物15SEQ ID NO27PCR引物16
SEQ ID NO28PCR引物17SEQ ID NO29PCR引物18SEQ ID NO30PCR引物19SEQ ID NO31PCR引物20SEQ ID NO32設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從16S核糖體擴(kuò)增DNA片段SEQ ID NO33設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從16S核糖體擴(kuò)增DNA片段SEQ ID NO34PCR引物21
序列表<110>寶酒造株式會(huì)社(Takara Shuzo Co.，Ltd.)<120>瓊脂糖酶及其基因<130>663033<150>JP 2001-052315<151>2001-02-27<150>JP 2001-325796<151>2001-10-24<160>34<210>1<211>13<212>PRT<213>未知<220>
<223>瓊脂糖酶I的N末端氨基酸序列<400>1Ala Asp Xaa Asp Gly Val Pro Ile Pro Ala Pro Ala Gly1 5 10<210>2<211>10<212>PRT<213>未知<220>
<223>瓊脂糖酶II的N末端氨基酸序列
<400>2Glu Thr Ile Val Leu Gln Ala Glu Ser Phe1 5 10<210>3<211>8<212>PRT<213>未知<220>
<223>瓊脂糖酶I的部分氨基酸序列<400>3Pro Thr Pro Ala Glu Leu Ala Asp1 5<210>4<211>10<212>PRT<213>未知<220>
<223>瓊脂糖酶I的部分氨基酸序列<400>4Ala Thr Ser Asn Gly Ala Asn Ile Val Gln1 5 10<210>5<211>10<212>PRT<213>未知<220>
<223>瓊脂糖酶II的部分氨基酸序列<400>5
Pro Ser His Ser Val Thr Leu Pro Ala Gly1 5 10<210>6<211>10<212>PRT<213>未知<220>
<223>瓊脂糖酶II的部分氨基酸序列<400>6Leu Met Phe Asp Thr Gln Thr Asn Ser Thr1 5 10<210>7<211>10<212>PRT<213>未知<220>
<223>瓊脂糖酶II的部分氨基酸序列<400>7Phe Gly Glu Val Leu Asp Tyr Ile Arg Gln1 5 10<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物1<400>8gayggngtnc cnathccngc
<210>9<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物2<400>9gayggngtnc cnathccngc nccngcngg 29<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物3<400>10gcattgatat aactatcgtt ccaacg 26<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物4<400>11cgtctgatat ggattgcaat tgcc 24<210>12<211>26<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>PCR引物5<400>12gccgctgcac attattattg atatgg 26<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物6<400>13caacaccagc tgagcttgca gaccc25<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物7<400>14garacnathg tnytncargc nga 23<210>15<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物8
<400>15gtnswrttng tytgngtrtc raacat 26<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物9<400>16ctcaatgtca tattcccccc cttcagcg 28<210>17<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物10<400>17cgcgttttgt ccatttacgc tgtatatcg 29<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物11<400>18acccgcagcc gcattatgtg caaacac27
<210>19<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物12<400>19gcatgacctt tatgggttac ttgtcgc27<210>20<211>1314<212>DNA<213>未知<220>
<223>瓊脂糖酶I基因中ORF的核苷酸序列<400>20atgcttcaga aaatcacact atgcgcgtct ctagttttaa ctagtacaac tgtttttgcc 60gcagattggg atggcgtacc aatcccagca ccagcgggtc aaaataaaac ttggcaattg120caatccatat cagacgactt taactacaca gcttcagcaa ataacaaacc aagcgctttt180acaagccgtt ggaacgatag ttatatcaat gcatggaaag ggcctggcga tacagaattt240agctcaggtc actcgtacac aaattcaggt aaactggctt tgcaagcagc tgaaaaacct300ggcacagata aggtttatgc aggtattatt tcttcaaaac aaacattcac ttatccgttg360tatatagaag cacgcgcaaa atcgaccaat aatacgatgg ccaatgcagt ttggatgtta420agtgccgatt caacgcaaga attagatgca atggaagctt acggcagtga tagaccgggc480caagaatggt tcgatcgccg tatgcatgta agccatcacg tatttattcg cgaaccattc540caagactatc aacccaaaga tgcgggttct tggatatata atgaacaagc gccttggcgc600gttgcctatc ataactatgg gatgcattgg aaagatcctt ggaatgttga ttactacata660gatggtgtgc ttgttagaag tgtttccggt caacaaatga tcgatccaca caactacacc720aacggtacgg gtgtaaacaa gccgctgcac attattattg atatggaaca ccaagactgg780cgtgatgtta aaccaacacc agctgagctt gcagaccctg cgagaagtat tttttatgta840gattggatcc gagtatacaa gccaactgat tcagcagctt cagcacccac accccctaca900ggtgcaacat ctcttaaggc tagacatagc aacaaatgct tagatttatc tgctggtaat960tctgcgaatg gtgcaaacat gcaacaatgg aattgcaacg cgacgaacac aaaccaagat 1020
ataacctttg tcgccaaagg tgctggttat tacgaaatga aaaccaaaca caataaatgt1080ttagatgttg cgggtaaagc aaccagcaat ggcgcgaata tagtgcagtg gaattgttac1140aacgggacta accagcaatt taaattacta gacaaaggca atggttggtt ccaactacaa1200gcaaaacata gtggcaagtg tttagaaatt gcaaattctg caaccaccaa tggtgccaac1260gtgcaacagt gggcgtgtgg aaatagcaac aatcagcagt ggaaattcca gtaa 1314<210>21<211>3270<212>DNA<213>未知<220>
<223>瓊脂糖酶II基因中ORF的核苷酸序列<400>21atgtttaaaa ctaaacgttc tctgctgagc tctagtattg cgctttcact ggctttactc 60ggcactaaag cgcatgcaga gactatagtc ttgcaagctg aatcgtttga taactccggc120ggtacgtatg atgacggcca acccaaccct gtcacgatat acagcgtaaa tggacaaaac180gcgattaatt ttgttaacgc gggtgatttt gtcgatttta atattaacgc tgaagggggg240gaatatgaca ttgagtattt agtcggcaca agtgtccaat caggtcctag tattgaagtg300ctcgttaata ctaatggtgc atgggaaagc caaggcacag tcgctgtacc gttaaccagt360tgggacgatt tccagcctct caaacccagc cattccgtaa ctttgccagc aggtgcttca420accattcgtt tgcacgcaat tggttcgact tggcaatgga acatggagtc tttttcttta480acacaagttg taccgcttga gccagaaaca cccgttgatg tagacgatat tgttattaac540ctagaaaact ttatctttac agacaaagaa ggagcagcta tttcaggtga taccatcgtc600ggttttggtg taacaaactc aggtataaat tttaatacgg tcggcgatta tgccgactac680acagtaaact ttactgaagc aggtacatac aacgcgacac tggctgctgg ttcacccatg720acaggtcaaa tcggtgcaca aattatcatg gataattcgg ttgccgcgtc atcgttactt780gcatctacag gtggctggga taattatgtc gactttgatc tcagtggcga cattgttata840ccaacgcccg gtacttacac tgtacgatta caaagttatg gtagcgcgaa ttggcagtgg900aacgcagata cactaacgct tagttatata tctggagaaa ccggcgacgg caatccaagt960ccaccacaag aaggtgattt gattgttgaa ttagaagatt tcgttaatac aggtacaacc 1020ggccgcgttg gaggcgatag cgttgaaggc tttggcgcaa cagcaactgg cgtgaactgg 1080gtgaccaatg gtgattatgg tgactacaac ataacctttg cagagcctgg tacctatcgt 1140gcctttttta cctattcagc cgccagtgca ggtagttacg gcgctcgtgt agatgtaaat 1200ggtgaacccg tagcatgggg ctattttgct gaaacaggca gttgggatgt tgcgtctgaa 1260gttgagcttt atggtggata ctttgttatt gaccaagcag gccaagcgaa tttgcgcgta 1320
gaagcaattg gtggatcaga ttggcagtgg ggcggtgata aactgcggat aacccgtgta1380ggtgatgttt catatgtccc tgaacgtcac tataatccga acgatcacta cgtggaagaa1440gttgaaggac cacaaacaca aattacctat ctaaaaccac caattgacat tcctaccaat1500aaaaaagttc taaaatcaga cgtttggtat acgtatccac aaaaccggga actggaaggt1560tttgatgatt ttggcgcaac tggcgcattc tggggacatc cgccagagca tgatttttat1620gaagaaaccg ttattatgga ttgggcagtc aatgtcgttg atacgttcca aagtgaaggt1680tttgagtata ctgctcgcgg cgaatttgac tggggttatg gttggttcac cgagtacgtg1740acaaacccgc agccgcatta tgtgcaaaca cttgacgatc gcaatgtgcg catgaccttt1800atgggttact tgtcgcacaa cggttataat aacaactggt taagtaatca tagtccagca1860tttgtacctt tcatgaaatc acaggttgat caaatattga aagcgtatcc ggacaagctg1920atgtttgata cacaaaccaa ctcaacccgt tcaaccgaca tgcgtacctt tggtggtgac1980ttctcgccat atgccatgga aaacttccgc atttggttag ataaaaaata cagtagtaac2040gagttggcca atatgggtat taataatatt caaacgtttg attacaaaca gcacttgtta2100aatgccggtg tgacacatca atcattcatg aatgcggcag atacattatc tggaaacgta2160ccattacttg aagatttcat ttattttaat cgtgatgtat ggaaccaaaa atttggtgaa2220gtattagatt atattcgcca gcaacgtcca gacatagaaa ttggtgcgag cacacatttg2280tttgaatctc gtggttatat atttaacgag aatatcacct tcttatcagg tgagctcaac2340ttaggtgcga gaaccactat ctctgaacta ccaacgaata tccttgtaca cttaaaaggg2400gcgcaggcag tagataaaac gttagcatac ttcccgtatc cttgggagtt tgacgaactt2460cgtttgcaag acgcaccgcg ttttggccgt ggttgggtcg cgcaagctta tgcttacggt2520ggtttattct cgattccggc taatgtttgg gttggtggtg aagtttggac ttggtctccg2580ggcgctgata actatcgtga tatttaccag tttgtacgag cgcaagcaga cttgttagac2640ggttatacct catattcaaa agtaggtctt gtgcacgcga tgttctcatc gatgaaagcg2700ggctttattg atgggggtaa ccaaattcaa tcaagcgtta aattactgac tgaagataat2760attaactttg atttattggt gtttggtgat gcgggttatc ctgttgtccc acgagctgaa2820gactttgata aattcgaaca tatcttcttc gatggtgatc aacaatactt aaccgctgaa2880caacaagcta tattagatgc acaaggtagc aaagtaagac acattggcca gcgcggtact2940ttaagcggta tcgaaataga tgtcagtatc aatggtagtg tttctaacga aacagtatct3000gcggtatctc gcattcatga aaccaatgca aatgcgccat atgttgtgca cttggttaat3060cgtccatttg caggcggtgt aacgccaaca ttaaatggcg tagaagtggc aattccgcaa3120ggttatttcc cggatacagt aacatcggcg acattacact taccggatgg taccagtacc3180aacttaagtg tttcgacaaa cgccgaaggt gatgctgtcg ttacggtaaa taacttagaa3240gtttggggta ttttagaatt agcgcactaa 3270<210>22<211>437<212>PRT
<213>未知<220>
<223>瓊脂糖酶I的氨基酸序列<400>22Met Leu Gln Lys Ile Thr Leu Cys Ala Ser Leu Val Leu Thr Ser1 5 10 15Thr Thr Val Phe Ala Ala Asp Trp Asp Gly Val Pro Ile Pro Ala20 25 30Pro Ala Gly Gln Asn Lys Thr Trp Gln Leu Gln Ser Ile Ser Asp35 40 45Asp Phe Asn Tyr Thr Ala Ser Ala Asn Asn Lys Pro Ser Ala Phe50 55 60Thr Ser Arg Trp Asn Asp Ser Tyr Ile Asn Ala Trp Lys Gly Pro65 70 75Gly Asp Thr Glu Phe Ser Ser Gly His Ser Tyr Thr Asn Ser Gly80 85 90Lys Leu Ala Leu Gln Ala Ala Glu Lys Pro Gly Thr Asp Lys Val95 100 105Tyr Ala Gly Ile Ile Ser Ser Lys Gln Thr Phe Thr Tyr Pro Leu110 115 120Tyr Ile Glu Ala Arg Ala Lys Ser Thr Asn Asn Thr Met Ala Asn125 130 135Ala Val Trp Met Leu Ser Ala Asp Ser Thr Gln Glu Leu Asp Ala140 145 150Met Glu Ala Tyr Gly Ser Asp Arg Pro Gly Gln Glu Trp Phe Asp155 160 165Arg Arg Met His Val Ser His His Val Phe Ile Arg Glu Pro Phe170 175 180Gln Asp Tyr Gln Pro Lys Asp Ala Gly Ser Trp Ile Tyr Asn Glu185 190 195Gln Ala Pro Trp Arg Val Ala Tyr His Asn Tyr Gly Met His Trp200 205 210Lys Asp Pro Trp Asn Val Asp Tyr Tyr Ile Asp Gly Val Leu Val215 220 225Arg Ser Val Ser Gly Gln Gln Met Ile Asp Pro His Asn Tyr Thr
230 235 240Asn Gly Thr Gly Val Asn Lys Pro Leu His Ile Ile Ile Asp Met245 250 255Glu His Gln Asp Trp Arg Asp Val Lys Pro Thr Pro Ala Glu Leu260 265 270Ala Asp Pro Ala Arg Ser Ile Phe Tyr Val Asp Trp Ile Arg Val275 280 285Tyr Lys Pro Thr Asp Ser Ala Ala Ser Ala Pro Thr Pro Pro Thr290 295 300Gly Ala Thr Ser Leu Lys Ala Arg His Ser Asn Lys Cys Leu Asp305 310 315Leu Ser Ala Gly Asn Ser Ala Asn Gly Ala Asn Met Gln Gln Trp320 325 330Asn Cys Asn Ala Thr Asn Thr Asn Gln Asp Ile Thr Phe Val Ala335 340 345Lys Gly Ala Gly Tyr Tyr Glu Met Lys Thr Lys His Asn Lys Cys350 355 360Leu Asp Val Ala Gly Lys Ala Thr Ser Asn Gly Ala Asn Ile Val365 370 375Gln Trp Asn Cys Tyr Asn Gly Thr Asn Gln Gln Phe Lys Leu Leu380 385 390Asp Lys Gly Asn Gly Trp Phe Gln Leu Gln Ala Lys His Ser Gly395 400 405Lys Cys Leu Glu Ile Ala Asn Ser Ala Thr Thr Asn Gly Ala Asn410 415 420Val Gln Gln Trp Ala Cys Gly Asn Ser Asn Asn Gln Gln Trp Lys425 430 435Phe Gln<210>23<211>1089<212>PRT<213>未知<220>
<223>瓊脂糖酶II的氨基酸序列
<400>23Met Phe Lys Thr Lys Arg Ser Leu Leu Ser Ser Ser Ile Ala Leu1 5 10 15Ser Leu Ala Leu Leu Gly Thr Lys Ala His Ala Glu Thr Ile Val20 25 30Leu Gln Ala Glu Ser Phe Asp Asn Ser Gly Gly Thr Tyr Asp Asp35 40 45Gly Gln Pro Asn Pro Val Thr Ile Tyr Ser Val Asn Gly Gln Asn50 55 60Ala Ile Asn Phe Val Asn Ala Gly Asp Phe Val Asp Phe Asn Ile65 70 75Asn Ala Glu Gly Gly Glu Tyr Asp Ile Glu Tyr Leu Val Gly Thr80 85 90Ser Val Gln Ser Gly Pro Ser Ile Glu Val Leu Val Asn Thr Asn95 100 105Gly Ala Trp Glu Ser Gln Gly Thr Val Ala Val Pro Leu Thr Ser110 115 120Trp Asp Asp Phe Gln Pro Leu Lys Pro Ser His Ser Val Thr Leu125 130 135Pro Ala Gly Ala Ser Thr Ile Arg Leu His Ala Ile Gly Ser Thr140 145 150Trp Gln Trp Asn Met Glu Ser Phe Ser Leu Thr Gln Val Val Pro155 160 165Leu Glu Pro Glu Thr Pro Val Asp Val Asp Asp Ile Val Ile Asn170 175 180Leu Glu Asn Phe Ile Phe Thr Asp Lys Glu Gly Ala Ala Ile Ser185 190 195Gly Asp Thr Ile Val Gly Phe Gly Val Thr Asn Ser Gly Ile Asn200 205 210Phe Asn Thr Val Gly Asp Tyr Ala Asp Tyr Thr Val Asn Phe Thr215 220 225Glu Ala Gly Thr Tyr Asn Ala Thr Leu Ala Ala Gly Ser Pro Met230 235 240Thr Gly Gln Ile Gly Ala Gln Ile Ile Met Asp Asn Ser Val Ala245 250 255Ala Ser Ser Leu Leu Ala Ser Thr Gly Gly Trp Asp Asn Tyr Val260 265 270
Asp Phe Asp Leu Ser Gly Asp Ile Val Ile Pro Thr Pro Gly Thr275 280 285Tyr Thr Val Arg Leu Gln Ser Tyr Gly Ser Ala Asn Trp Gln Trp290 295 300Asn Ala Asp Thr Leu Thr Leu Ser Tyr Ile Ser Gly Glu Thr Gly305 310 315Asp Gly Asn Pro Ser Pro Pro Gln Glu Gly Asp Leu Ile Val Glu320 325 330Leu Glu Asp Phe Val Asn Thr Gly Thr Thr Gly Arg Val Gly Gly335 340 345Asp Ser Val Glu Gly Phe Gly Ala Thr Ala Thr Gly Val Asn Trp350 355 360Val Thr Asn Gly Asp Tyr Gly Asp Tyr Asn Ile Thr Phe Ala Glu365 370 375Pro Gly Thr Tyr Arg Ala Phe Phe Thr Tyr Ser Ala Ala Ser Ala380 385 390Gly Ser Tyr Gly Ala Arg Val Asp Val Asn Gly Glu Pro Val Ala395 400 405Trp Gly Tyr Phe Ala Glu Thr Gly Ser Trp Asp Val Ala Ser Glu410 415 420Val Glu Leu Tyr Gly Gly Tyr Phe Val Ile Asp Gln Ala Gly Gln425 430 435Ala Asn Leu Arg Val Glu Ala Ile Gly Gly Ser Asp Trp Gln Trp440 445 450Gly Gly Asp Lys Leu Arg Ile Thr Arg Val Gly Asp Val Ser Tyr455 460 465Val Pro Glu Arg His Tyr Asn Pro Asn Asp His Tyr Val Glu Glu470 475 480Val Glu Gly Pro Gln Thr Gln Ile Thr Tyr Leu Lys Pro Pro Ile485 490 495Asp Ile Pro Thr Asn Lys Lys Val Leu Lys Ser Asp Val Trp Tyr500 505 510Thr Tyr Pro Gln Asn Arg Glu Leu Glu Gly Phe Asp Asp Phe Gly515 520 525Ala Thr Gly Ala Phe Trp Gly His Pro Pro Glu His Asp Phe Tyr530 535 540Glu Glu Thr Val Ile Met Asp Trp Ala Val Asn Val Val Asp Thr
545 550 555Phe Gln Ser Glu Gly Phe Glu Tyr Thr Ala Arg Gly Glu Phe Asp560 565 570Trp Gly Tyr Gly Trp Phe Thr Glu Tyr Val Thr Asn Pro Gln Pro575 580 585His Tyr Val Gln Thr Leu Asp Asp Arg Asn Val Arg Met Thr Phe590 595 600Met Gly Tyr Leu Ser His Asn Gly Tyr Asn Asn Asn Trp Leu Ser605 610 615Asn His Ser Pro Ala Phe Val Pro Phe Met Lys Ser Gln Val Asp620 625 630Gln Ile Leu Lys Ala Tyr Pro Asp Lys Leu Met Phe Asp Thr Gln635 640 645Thr Asn Ser Thr Arg Ser Thr Asp Met Arg Thr Phe Gly Gly Asp650 655 660Phe Ser Pro Tyr Ala Met Glu Asn Phe Arg Ile Trp Leu Asp Lys665 670 675Lys Tyr Ser Ser Asn Glu Leu Ala Asn Met Gly Ile Asn Asn Ile680 685 690Gln Thr Phe Asp Tyr Lys Gln His Leu Leu Asn Ala Gly Val Thr695 700 705His Gln Ser Phe Met Asn Ala Ala Asp Thr Leu Ser Gly Asn Val710 715 720Pro Leu Leu Glu Asp Phe Ile Tyr Phe Asn Arg Asp Val Trp Asn725 730 735Gln Lys Phe Gly Glu Val Leu Asp Tyr Ile Arg Gln Gln Arg Pro740 745 750Asp Ile Glu Ile Gly Ala Ser Thr His Leu Phe Glu Ser Arg Gly755 760 765Tyr Ile Phe Asn Glu Asn Ile Thr Phe Leu Ser Gly Glu Leu Asn770 775 780Leu Gly Ala Arg Thr Thr Ile Ser Glu Leu Pro Thr Asn Ile Leu785 790 795Val His Leu Lys Gly Ala Gln Ala Val Asp Lys Thr Leu Ala Tyr800 805 810Phe Pro Tyr Pro Trp Glu Phe Asp Glu Leu Arg Leu Gln Asp Ala815 820 825
Pro Arg Phe Gly Arg Gly Trp Val Ala Gln Ala Tyr Ala Tyr Gly830 835 840Gly Leu Phe Ser Ile Pro Ala Asn Val Trp Val Gly Gly Glu Val845 850 855Trp Thr Trp Ser Pro Gly Ala Asp Asn Tyr Arg Asp Ile Tyr Gln860 865 870Phe Val Arg Ala Gln Ala Asp Leu Leu Asp Gly Tyr Thr Ser Tyr875 880 885Ser Lys Val Gly Leu Val His Ala Met Phe Ser Ser Met Lys Ala890 895 900Gly Phe Ile Asp Gly Gly Asn Gln Ile Gln Ser Ser Val Lys Leu905 910 915Leu Thr Glu Asp Asn Ile Asn Phe Asp Leu Leu Val Phe Gly Asp920 925 930Ala Gly Tyr Pro Val Val Pro Arg Ala Glu Asp Phe Asp Lys Phe935 940 945Glu His Ile Phe Phe Asp Gly Asp Gln Gln Tyr Leu Thr Ala Glu950 955 960Gln Gln Ala Ile Leu Asp Ala Gln Gly Ser Lys Val Arg His Ile965 970 975Gly Gln Arg Gly Thr Leu Ser Gly Ile Glu Ile Asp Val Ser Ile980 985 990Asn Gly Ser Val Ser Asn Glu Thr Val Ser Ala Val Ser Arg Ile99510001005His Glu Thr Asn Ala Asn Ala Pro Tyr Val Val His Leu Val Asn101010151020Arg Pro Phe Ala Gly Gly Val Thr Pro Thr Leu Asn Gly Val Glu102510301035Val Ala Ile Pro Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Thr Val Thr Ser Ala104010451050Thr Leu His Leu Pro Asp Gly Thr Ser Thr Asn Leu Ser Val Ser105510601065Thr Asn Ala Glu Gly Asp Ala Val Val Thr Val Asn Asn Leu Glu107010751080Val Trp Gly Ile Leu Glu Leu Ala His1085
<210>24<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物13<400>24ctgtttttgc cgaattcggc agattgggat ggcgtacc38<210>25<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物14<400>25gctgaaccct ctgcagtatt caacaacaac tgttgagc38<210>26<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物15<400>26caactgtttt tgccatatgg cagattggga tggcgtacc 39<210>27<211>36<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物16<400>27gctgaaccct cctcgagtat tcaacaacaa ctgttg 36<210>28<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物17<400>28gcgcatgcag aattcggaga ctatagtctt gcaagctg 38<210>29<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物18<400>29ccaaagtatt ggatcctagg ttgttgataa acaacattg39<210>30<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物19
<400>30ttgttattaa cgaattcgct agaaaacttt atctttacag 40<210>31<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物20<400>31ccggcgacgg cgaattcgaa tccaagtcca ccacaagaag 40<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于16S rRNA分析的PCR引物<400>32agagtttgat cctggctcag 20<210>33<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于16S rRNA分析的PCR引物<400>33ggctaccttg ttacgactt 19<210>34
<211>40<212>DNA<213>人工DNA<220>
<223>PCR引物21<400>34acactgtacg agaattcgtt acaaagttat ggtagcgcga 40
權(quán)利要求
1.一種瓊脂糖酶，所述瓊脂糖酶含有由SEQ ID NO22的氨基酸序列中第21號(hào)氨基酸至第437號(hào)氨基酸的417個(gè)殘基組成的氨基酸序列或者在所述氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列，并且具有水解D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的β-1，4鍵的活性。
2.依照權(quán)利要求1的瓊脂糖酶，所述瓊脂糖酶可得自微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)。
3.一種基因，所述基因編碼權(quán)利要求1所限定的瓊脂糖酶。
4.依照權(quán)利要求3的基因，所述基因可得自微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)。
5.依照權(quán)利要求3的基因，所述基因含有由SEQ ID NO20的核苷酸序列中第61號(hào)核苷酸至第1311號(hào)核苷酸的1251個(gè)核苷酸組成的核苷酸序列或者在所述由1251個(gè)核苷酸組成的核苷酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸被取代、缺失、添加和/或插入的核苷酸序列。
6.一種基因，所述基因在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與權(quán)利要求3所限定的基因雜交，并且編碼具有水解D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的β-1，4鍵的活性的瓊脂糖酶。
7.一種重組DNA分子，所述重組DNA分子含有選自以下的基因(a)編碼瓊脂糖酶的基因，所述瓊脂糖酶含有由SEQ ID NO22的氨基酸序列中第21號(hào)氨基酸至第437號(hào)氨基酸的417個(gè)殘基組成的氨基酸序列或者在所述氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列，并且具有水解D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的β-1，4鍵的活性；和(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可(a)的基因雜交并且編碼具有水解D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的β-1，4鍵的活性的瓊脂糖酶的基因。
8.一種轉(zhuǎn)化子，所述轉(zhuǎn)化子帶有權(quán)利要求7所限定的重組DNA分子。
9.一種權(quán)利要求1所限定的瓊脂糖酶的生產(chǎn)方法，所述方法包括培養(yǎng)微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)，并且從所述培養(yǎng)物中收集所述瓊脂糖酶。
10.瓊脂糖酶的生產(chǎn)方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求8所限定的轉(zhuǎn)化子，并且從所述培養(yǎng)物中收集瓊脂糖酶。
11.從瓊脂糖凝膠中提取物質(zhì)的方法，所述方法包括用權(quán)利要求1所限定的瓊脂糖酶消化瓊脂糖凝膠。
12.用于權(quán)利要求11所限定的從瓊脂糖凝膠提取物質(zhì)的方法的試劑盒，所述試劑盒含有權(quán)利要求1所限定的瓊脂糖酶。
13.一種瓊脂糖酶，所述瓊脂糖酶含有由SEQ ID NO23的氨基酸序列中第318號(hào)氨基酸至第1089號(hào)氨基酸的772個(gè)殘基組成的氨基酸序列或者在所述氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列，并且具有水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵的活性。
14.依照權(quán)利要求13的瓊脂糖酶，所述瓊脂糖酶可得自微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)。
15.一種基因，所述基因編碼權(quán)利要求13所限定的瓊脂糖酶。
16.依照權(quán)利要求15的基因，所述基因可得自微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)。
17.依照權(quán)利要求15的基因，所述基因含有由SEQ ID NO21的核苷酸序列中第952號(hào)核苷酸至第3267號(hào)核苷酸的2316個(gè)核苷酸組成的核苷酸序列或者在所述由2316個(gè)核苷酸組成的核苷酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸被取代、缺失、添加和/或插入的核苷酸序列。
18.一種基因，所述基因在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與權(quán)利要求15所限定的基因雜交，并且編碼具有水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵的活性的瓊脂糖酶。
19.一種重組DNA分子，所述重組DNA分子含有選自以下的基因(a)編碼瓊脂糖酶的基因，所述瓊脂糖酶含有由SEQ ID NO23的氨基酸序列中第318號(hào)氨基酸至第1089號(hào)氨基酸的772個(gè)殘基組成的氨基酸序列或者在所述氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列，并且具有水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵的活性；和(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與(a)的基因雜交并且編碼具有水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵的活性的瓊脂糖酶的基因。
20.一種轉(zhuǎn)化子，所述轉(zhuǎn)化子帶有權(quán)利要求19所限定的重組DNA分子。
21.權(quán)利要求13所限定的瓊脂糖酶的生產(chǎn)方法，所述方法包括培養(yǎng)微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)，并且從所述培養(yǎng)物中收集所述瓊脂糖酶。
22.瓊脂糖酶的生產(chǎn)方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求20所限定的轉(zhuǎn)化子，并且從所述培養(yǎng)物中收集瓊脂糖酶。
23.瓊脂寡糖的生產(chǎn)方法，所述方法包括用權(quán)利要求13所限定的瓊脂糖酶消化瓊脂糖，并且從所述消化物中收集瓊脂寡糖。
24.改進(jìn)權(quán)利要求13所限定的瓊脂糖酶的熱穩(wěn)定性的方法，所述方法包括從N末端缺失構(gòu)成所述瓊脂糖酶的至多30％的多肽。
25.依照權(quán)利要求24的方法，其中從N末端缺失構(gòu)成具有SEQ IDNO23氨基酸序列的瓊脂糖酶的至多30％的多肽。
26.一種瓊脂糖酶，所述瓊脂糖酶具有水解D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的β-1，4鍵的活性，并且最適反應(yīng)溫度為55-65℃。
27.一種瓊脂糖酶，所述瓊脂糖酶具有水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵的活性，并且最適反應(yīng)溫度為45-55℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及可用于有效地生產(chǎn)瓊脂寡糖、從瓊脂糖凝膠中有效地提取核酸等物質(zhì)的、具有瓊脂糖酶活性的多肽、所述多肽的氨基酸序列、編碼所述多肽的基因、所述多肽的生產(chǎn)方法以及瓊脂寡糖的生產(chǎn)方法和從瓊脂糖凝膠提取核酸等物質(zhì)的方法。
文檔編號(hào)C12N15/56GK1531595SQ0280891
公開(kāi)日2004年9月22日 申請(qǐng)日期2002年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月27日
發(fā)明者友野潤(rùn), 佐川裕章, 章, 之進(jìn), 加藤郁之進(jìn) 申請(qǐng)人:寶生物工程株式會(huì)社