專利名稱：用于分析丙型肝炎病毒(hcv)基因型的寡核苷酸芯片組合物及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及寡核苷酸芯片組合物及其制造方法，特別的，涉及一種分析丙型肝炎病毒(HCV)基因型的寡核苷酸芯片組合物及其檢測方法。
背景技術：
一般而言，丙型肝炎病毒(下文稱之為‘HCV’)，一種肝炎病毒，是導致嚴重疾病例如肝炎包括急性肝炎和慢性肝炎的主要因素，其可能會發(fā)展成為肝硬化和肝細胞瘤。HCV通過輸血和體液傳播(Choo等，Science 244，359-362，1989)。據(jù)估計全世界大約有4億人感染有HCV0.2-2％的人在發(fā)達國家例如歐洲、北美和日本；2-5％在南美和亞洲；超過5％在非洲；1.6％在韓國(Park等，J.Viral Hepat.2，195-202，1995)。對于人類健康，HCV是非常危險的病毒，而且不同于乙型肝炎病毒(HBV)，它不是漸愈性的。50-85％被感染的人患有慢性肝炎。因為HCV是RNA病毒，科學家還沒有開發(fā)出任何合適的藥物和疫苗，不過更少有關于HCV的基礎研究。由于診斷方法隨著分子生物學的發(fā)展而完善，人們能夠避免因輸血而引起的傳染的可能性。然而，因為傳染路徑仍然不明朗，傳染的可能性依然存在。
HCV是陽性單鏈線狀RNA病毒，包括大約9,500個堿基和大約3,000個氨基酸，大小為50nm，為Choo等于1989年在獲自黑猩猩的非-A或非-B(NANB)型肝炎病毒中發(fā)現(xiàn)的。HCV基本上由產(chǎn)生結構蛋白核心、核殼體和包膜糖蛋白以及非結構蛋白螺旋酶、病毒蛋白水解酶、RNA-依賴性RNA聚合酶、轉錄酶和調節(jié)多肽的可讀框組成(Chou等，Jpn.J.Med.Sci.Biol.4，147-157，1991)。ORF的兩端分別具有5’-非翻譯區(qū)(5’UTR)和3’UTR。5’UTR，HCV基因中最保守的部分之一，具有大約340bp和一個莖環(huán)結構(Han等，Proc.Natl.Acac.Sci.U.S.A.88，1711-1715，1991)。
由于HCV的高突變率，每年產(chǎn)生(1.44-1.92)×10-3的HCV堿基置換。HCV基因的5’UTR和衣殼是最保守的。突變最頻繁的發(fā)生在E1和E2(Ogata等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88，3392-3396，1991)。由于這種特性，HCV表現(xiàn)出高度的基因多態(tài)性。因此，迄今HCV被分為6型，并且亞型的范圍從數(shù)個到數(shù)十個不等(Simmonds等，J.Gen.Virol.74，2391-2399，1993；Cha等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，7144-7148，1992)。因為沒有對這些類型分類的標準方法，研究者運用不同的分類法，但是Simmond的分類法是普遍應用的。這種分類法對基因型加上數(shù)字(1，2，3，...)并對亞型加上字母(a，b，c，...)表示。根據(jù)該分類法，HCV表現(xiàn)出31-35％的基因型間差異，20-23％的亞型間差異，以及1-10％的甚至是同一亞型內的差異(Simmonds等，J.Gen.Virol.74，661-668，1993)。
分析HCV基因型的方法被用于鑒定HCV感染和預測感染路徑以及IFN-α的治療效果(Hino等，J.Med，Virol.42，299-305，1994)。而且這種分析基因型的方法被用于調查分布和疫苗的開發(fā)，因為它根據(jù)地區(qū)和種族表現(xiàn)出不同的分布(Greene等，J.Gen.Virol.76，211-215，1995)。IFN-α是治療HCV最常見的抗病毒劑。IFN-α對50％的病人有效。不過，僅有25％的病人可能恢復正常行使功能的肝臟并且血清中沒有HCV。這里，根據(jù)對IFN-α治療效果和HCV類型之間的關系的研究，IFN-α在基因型1a、2、3和5中表現(xiàn)出極好的治療效果，但在基因型1b和4中治療效果微弱(Yoshioka等，Hepatology16，293-299，1992)。另外，基因型1b和4迅速的轉變成慢性肝炎而基因型1a和2a轉為較好的癥狀(Lopez-Labrador，等，J.Hepatol.27，959-965，1997)。
分析HCV基因型的一般方法如下。第一，SSP-PCR方法利用對HCV基因型具有特異性的PCR引物。該方法是通過重組對各種基因型核心區(qū)域特異的PCR引物進行RT-PCR。該方法具有可在RT-PCR結束后立即獲得結果的優(yōu)點，但該方法具有如果在引物的識別位點周圍發(fā)生突變就無法分析新的類型的缺點。因此，SSP-PCR方法在分析具有變化多樣的突變的HCV基因型中不令人滿意。第二，PCR-RFLP方法通過RT-PCR擴增5’UTR區(qū)并利用限制性內切酶(Park等，J.Med.Microbiol.47，1998)。PCR-RFLP方法具有結果可容易并清楚地獲得的優(yōu)點，但是除非所用的限制性內切酶識別突變區(qū)域，否則不能分析HCV基因型。第三，一種通過RT-PCR擴增5’UTR區(qū)并與硝化纖維(NC)膜上HCV基因型特異性的寡核苷酸探針雜交的方法。根據(jù)該方法，精確的結果可通過數(shù)種探針獲得，但是在NC膜上固定許多探針具有一定的限度。另外，該方法花費大量的時間和勞動處理和分析各種樣本，因為只有一個人的一種基因型可以在該NC膜上分析。

發(fā)明內容
因此，為了克服前述的問題，本發(fā)明的一個目的是提供一種改進的組合物用于分析HCV基因型。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種改進的方法利用該組合物分析HCV基因型。
為了實現(xiàn)前述的目的，本發(fā)明提供了包含序列ID NO1到14中所示的堿基序列的多元寡核苷酸探針組合物。
本發(fā)明的寡核苷酸探針是用于測定HCV基因型的探針并且固定在底物上。
本發(fā)明提供了序列ID NO15到20中所示的初級或次級引物序列用于檢測探針與靶基因的結合。
序列ID NO18所示的次級引物中的一個反義引物是耦合生物素的，序列ID NO19所示的次級引物中的一個反義引物與熒光探針相互作用，而序列ID NO20中所示的熒光探針是耦合花色素苷的。
本發(fā)明提供了一種分析HCV基因型的方法，包含步驟從血漿或血清中制備HCV RNA；利用所制備的RNA進行初級RT-PCR；在初級PCR之后進行次級不對稱PCR；將探針與次級不對稱PCR的副產(chǎn)物雜交；以及檢測雜交結果。
在本發(fā)明分析HCV基因型的方法中，雜交結果利用抗生蛋白鏈菌素-堿性磷酸酶和四唑氮藍氯化物/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽(NBT-BCIP)聯(lián)合生物素或微矩陣掃描儀來鑒定。
在本發(fā)明中，開發(fā)了一種HCV寡核苷酸芯片利用最新發(fā)展的DNA微矩陣技術在一個載片上同時分析4個人的樣本。該芯片比現(xiàn)存的寡核苷酸芯片更為改善。為了測定HCV基因型，本發(fā)明制備了可與6種類型、11種亞型、53個種的HCV 5’UTR進行反應的14個寡核苷酸。這些材料整合于一個含有用于4個人的4個小室的乙醛玻璃載片上。RT-PCR擴增的HCV基因與PCR副產(chǎn)物和整合于該載片上的寡核苷酸探針進行雜交。雜交探針利用發(fā)色反應或熒光反應進行分析，并且確定了HCV的6種基因型和11種基因亞型。


圖1顯示了HCV寡核苷酸芯片完整的外形照片。具有如所標數(shù)字顯示的4個小室，可在一個載片上同時分析4個人的HCV基因型。表5中所示的可辨別HCV基因型的12個探針兩次固定于該載片上，而作為陽性和陰性對照的2個探針固定四次，總計32個探針。HCV寡核苷酸芯片通過將coverwell灌注小室(Sigma Cat#Z37916-6，美國)加在探針之上而造成。
圖2顯示了該HCV寡核苷酸芯片上關于HCV 1b型的發(fā)色反應結果照片。該照片是圖1載片4個小室中的一個所產(chǎn)生的反應的放大圖像。該照片顯示了頻繁感染韓國人的HCV 1b型。照片中反應在如表5“反應的HCV類型”所示的14個探針中的探針1和2中同時發(fā)生。探針13是一個在所有反應中呈現(xiàn)的陽性對照，而探針14是一個在所有反應中均不呈現(xiàn)的陰性對照，從而確保實驗的精確性。固定了同一探針的兩個相同的樣斑以使反應更為精確。探針13和14兩次分別固定在最頂部和最底部以確定陽性和陰性對照及其位置。
圖3顯示了該HCV寡核苷酸芯片上關于HCV 1b型的熒光反應結果照片。其與探針的反應和圖2中的反應相同。但它不同于圖2中的反應因為雜交反應和PCR反應中利用了熒光引物和探針，并且掃描儀(GenePiX4000，Axon instruments，美國)被用來分析反應。
具體實施例方式
本發(fā)明將以參照伴隨附圖詳細描述示范性實施方式的方式予以說明，其僅僅是用于解釋而不是限制本發(fā)明。
實施例1HCV引物的人工合成以及堿基序列通過分析與6型5’UTR共同反應的位點，如表1中所示的HCV PCR引物被用于RT-PCR。用于次級不對稱PCR的反義引物根據(jù)鑒定方法被分成兩類。第一類，引物被連接到生物素上以通過雜交發(fā)應鑒定發(fā)色反應。第二類，花色素苷被用來通過雜交反應鑒定熒光反應。在次級PCR反義引物的5’端額外人工合成了25bp堿基(SP6)，并且合成了連接于花色素苷的與該位點互補的堿基。引物根據(jù)發(fā)明人的預定由MWG-biotech公司(德國)合成，并且引物用《分子克隆》第三版10.42節(jié)所寫的合成寡核苷酸的方法合成(Sambrook和Rusell，冷泉港實驗室出版，紐約，美國，2001)。
表1.分析HCV基因型的引物堿基序列

實施例2HCV RNA的制備、反轉錄-初級PCR和次級PCR反應1)混合5ul HCV RNA抽提緩沖液(1ml中DEPC-DW 860ul、Taq 10×buffer100ul、1M DTT 20ul、10％NP40 20ul)和10ul血漿或血清。
2)將裝有該混合血清的試管在PCR設備中于92℃加熱2分鐘，然后迅速在冰上輕輕敲打試管3)試管離心5-10秒4)繼而如表2所示在GeneAmp PCR system 9600熱循環(huán)儀(Perkin ElmerCetus，U.S.A)中進行反轉錄和初級PCR反應5)如表3所示用2ul初級PCR產(chǎn)物進行次級不對稱PCR反應6)在將1ul凝膠上樣緩沖液(0.25％溴酚藍、0.25％二甲苯苯胺FF、15％非可聚蔗糖400)混合至5ul次級不對稱PCR產(chǎn)物中、并用含1μg/ml溴乙錠(EtBr)的2％瓊脂糖凝膠進行電泳之后，用配備有紫外透射儀的圖像分析儀(Vilber Lourmat，法國)鑒定236bp或261bp的條帶。
表2.HCV反轉錄和初級PCR反應條件

表3.HCV次級PCR反應條件

實施例3用于制備HCV寡核苷酸芯片的探針的合成和堿基序列所有探針的5’端加上了氨基連接用于共價鍵連接到乙醛玻璃。10-20個寡聚(dT)連到探針上以易化雜交反應。然后，表5所示的堿基序列被連到氨基連接-寡聚(dT)10-20。簡短的表示，具有“氨基連接-寡聚(dT)10-20-探針堿基序列”排列次序的引物根據(jù)發(fā)明人的預定在MWG-biotech公司(德國)合成。所鑒定的HCV基因型的堿基序列通過分析如表4所示的所有屬于6種類型的53個種的HCV基因來鑒定。
表4.HCV基因型和類別的分析

在表5所示的堿基序列中，中間的以大寫字母表示的堿基是最重要的部分。以該堿基為中心，確定62℃左右的Tm值合成了15-25bp左右的探針。
表5.用于測定HCV基因型的探針堿基序列

實施例4HCV寡核苷酸芯片的制備1)Telechem公司生產(chǎn)的優(yōu)等乙醛玻璃載片被用于制備寡核苷酸芯片。連有100pmole氨基的探針與100pmole的DMSO混合。混合的探針用納米-繪圖儀(NP 1.2，GeSiM，德國)固定于載片上。載片用0.2％的SDS洗滌兩次各5分鐘，隨后用蒸餾水洗滌兩次各5分鐘。在用加熱的蒸餾水95℃ 2分鐘洗滌一次后，載片于室溫下用蒸餾水洗滌一次。
2)在載片與硼氫化鈉(1.3g NaBH4，375ml PBS，125ml 100％ EtOH)反應5分鐘后，載片用0.2％的SDS洗滌三次各1分鐘，用蒸餾水1分鐘洗滌一次，然后室溫干燥。
3)為在載片上分別分析4個樣本，4個小室通過將Sigma公司生產(chǎn)的灌注小室(4個小室)加到載片上而分隔開。上述完工的HCV寡核苷酸芯片室溫保存于黑暗處備用。
實施例5與HCV PCR產(chǎn)物的雜交反應1)20-200ul的預雜交緩沖液(1％BSA，5×SSC，0.1％ SDS)滴到結合有寡核苷酸的載片上，接著載片于42℃反應30-60分鐘。載片用蒸餾水洗滌5次，以異丙醇清洗，于室溫干燥，然后在80℃干燥2小時。
2)在發(fā)色反應中，結合有生物素的HCV PCR產(chǎn)物于95℃變性3分鐘，然后按照1∶3的比率與雜交液(4×SSC，0.3％ SDS)混合。在熒光發(fā)應中，結合有SP6的HCV PCR產(chǎn)物于95℃變性3分鐘，然后分別與等體積的花色素苷-探針和雜交液(6×SSC，0.5％ SDS)混合。
3)在小室覆蓋的情況下，向載片上的小室填充50-200ul的雜交緩沖液，然后在63℃反應1-3小時。
4)載片用1×SSC，0.2％ SDS室溫洗滌5-10分鐘，用0.1×SSC，0.2％ SDS在63℃洗滌5-10分鐘，用0.1×SSC洗滌5-10分鐘，然后室溫干燥。
5)鑒定結果A.發(fā)色反應(生物素方法)載片與30-120ul封閉緩沖液室溫反應30分鐘，然后與稀釋為1/2,000的30-120ul抗生蛋白鏈菌素-堿性磷酸酶反應30分鐘。在與稀釋為1/50的四唑氮藍氯化物/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽(NBT-BCIP)黑暗中室溫下反應1小時后，載片小心的用蒸餾水洗滌。HCV基因型通過顯色分析。
B.熒光反應(花色素苷方法)熒光HCV基因型用掃描儀分析(GenePiX4000，Axon instruments，美國)。
如上所述，為了分析HCV基因型，本發(fā)明人發(fā)明了通過PCR和分析取決于類型而表現(xiàn)出不同結果的堿基來擴增HCV 5’UTR的方法。由于5’UTR的堿基變化在特定區(qū)域是被限定的(Okamoto等，Jpn.J.Exp.Med.60，215-222，1990)，分析5’UTR HCV基因型的方法具有引物容易選擇并使得關于突變或新型的RT-PCR反應成為可能的優(yōu)點。此外，由于利用5’UTR的HCV基因分型的分析結果與那些核心、NS3和NS5的結果完全相同(Karachristos等，J.Med.Microbiol.42，367-371，1995)，本發(fā)明利用5’UTR區(qū)域分析HCV的基因型。
如早先所討論的，在本發(fā)明中，開發(fā)了一種通過分析HCV 5’UTR基因用于診斷基因型的寡核苷酸芯片。在本發(fā)明的HCV寡核苷酸芯片中，解決了常規(guī)芯片的缺點。修飾了兩個常規(guī)探針并且加入了兩個新的探針。結果，有可能額外的鑒定1c和2c并更精確地分析4a和5a。利用這些探針對HCV基因型的分析可用來鑒定HCV感染和感染路徑，并預測IFN-α的治療效果。此外，提起基因型的分布，這種分析可用于開發(fā)適合地區(qū)和種族的HCV疫苗，并且它可有助于研究慢性肝炎、肝硬化和肝細胞瘤。
序列表<110>株式會社生物核心<120>用于分析丙型肝炎病毒(HCV)基因型的寡核苷酸芯片組合物及其檢測方法<150>KR2001-19648<151>2001-04-12<150>KR2002-997<151>2002-01-08<160>20<170>Kopatentln 1.71<210>1<211>25<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于分析HCV基因類型的探針<400>1gaattgccag gacgaccggg tcctt25<210>2<211>17<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于分析HCV基因類型的探針<400>2gcccccgcga gactgct 17
<210>3<211>25<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于分析HCV基因類型的探針<400>3cctttcttgg attaacccgc tcaat 25<210>4<211>25<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于分析HCV基因類型的探針<400>4ttggataaac ccactctatg cccgg 25<210>5<211>23<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于分析HCV基因類型的探針<400>5aattgccggg aagactgggt cct 23
<210>6<211>25<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于分析HCV基因類型的探針<400>6acccactcta tgtccggtca tttgg 25<210>7<211>21<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于分析HCV基因類型的探針<400>7ctctatgccc agccatttgg g 21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于分析HCV基因類型的探針<400>8aatcgctggg gtgaccgggt c 21
<210>9<211>21<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于分析HCV基因類型的探針<400>9cccgcgagat cactagccga g 21<210>10<211>25<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于分析HCV基因類型的探針<400>10tagtatgagt gttgtacagc ctcca 25<210>11<211>25<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于分析HCV基因類型的探針<400>11gtatgagtgt cgaacagcct ccagg 25
<210>12<211>24<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于分析HCV基因類型的探針<400>12ccgggtcctttccattggat caaa24<210>13<211>25<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于分析HCV基因類型的探針<400>13agtggtctgc ggaaccggtg agtac 25<210>14<211>19<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于分析HCV基因類型的探針<400>14ggtctgcggg accggtgag 19
<210>15<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于分析HCV基因類型的引物<400>15ctgtgaggaa ctactgtctt 20<210>16<211>21<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于分析HCV基因類型的引物<400>16actcgcaagc accctatcag g21<210>17<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于分析HCV基因類型的引物<400>17ttcacgcaga aagcgtctag 20
<210>18<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于分析HCV基因類型的引物<400>18tatcaggcag taccacaagg 20<210>19<211>45<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于分析HCV基因類型的引物<400>19cgatttaggt gacactatag ggaggtatca ggcagtacca caagg 45<210>20<211>35<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>用于分析HCV基因類型的引物<400>20ccttgtggta ctgcctgata cctccctata gtgtc 3權利要求
1.一種包含序列ID NO1到14中所示的堿基序列的多元寡核苷酸探針組合物。
2.根據(jù)權利要求1的寡核苷酸探針組合物，其中每個寡核苷酸探針是用于鑒定HCV基因型的探針。
3.根據(jù)權利要求1或2的寡核苷酸探針組合物，其中的寡核苷酸探針固定在基質上。
4.序列ID NO15到20中所示的用于檢測權利要求1或2的探針與靶基因之間的雜交反應的初級或次級引物。
5.根據(jù)權利要求4的引物，其中序列ID NO18所示的一個反義引物是耦合生物素的。
6.根據(jù)權利要求4的次級引物，其中序列ID NO19所示的一個反義引物與熒光探針相互作用。
7.根據(jù)權利要求6的引物，其中序列ID NO20所示的熒光探針是耦合花色素苷的。
8.一種分析HCV基因型的方法，包括下列步驟(a)從血漿或血清中制備HCV RNA；(b)利用所制備的RNA進行初級RT-PCR；(c)在初級PCR之后進行次級不對稱PCR；(d)將探針與該次級不對稱PCR的副產(chǎn)物結合；以及(e)檢測結合結果。
9.根據(jù)權利要求6的分析HCV基因型的方法，其中步驟(e)中的結合用抗生物素蛋白-堿性磷酸酶和NBT-BCIP聯(lián)合生物素或微矩陣掃描儀來鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過從血漿和血清中提取RNA、進行丙型肝炎病毒(HCV)RT－PCR、然后使其在寡核苷酸芯片上進行反應來分析HCV基因型的方法。本發(fā)明還提供了一種在一個載片上簡單并精確的檢測對4個人的HCV基因型進行的分析的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1535319SQ02808051
公開日2004年10月6日 申請日期2002年4月10日 優(yōu)先權日2001年4月12日
發(fā)明者樸榮石, 樸宰贊, 金銀夏 申請人:株式會社生物核心