專利名稱：核苷酸多態(tài)性的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于檢測基因中堿基置換的核苷酸(供本發(fā)明方法用的寡核苷酸)、使用所述核苷酸檢測基因中堿基置換的方法、以及用于所述方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
已知屬于同一物種的生物個體基因組中所含的遺傳密碼相互并不相同，在堿基序列中存在差異，被稱為多態(tài)性。其中一個至數(shù)十個堿基缺失或插入的堿基序列、其中特定堿基序列被復(fù)制的堿基序列等都被稱為多態(tài)性。其中一個堿基被另一堿基取代的堿基序列被稱為單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
據(jù)說單核苷酸多態(tài)性以約1/100-1/1000堿基的速率存在。因此，人類基因組上存在的SNP數(shù)目估計是3-10×106。注意到SNP作為用于搜索與疾病相關(guān)的基因的指標(biāo)，或者作為用于獲得有關(guān)對疾病的感病性或?qū)λ幬锏拿舾行?作用或副作用)方面差異的信息的指標(biāo)。用于檢測SNP的方法正在研究之中。
用于檢測SNP的常規(guī)方法一般分為基于雜交的方法、基于引物延伸的方法和應(yīng)用酶的底物專一性的方法。
在雜交方法中，通過探針與核酸樣品的雜交來檢測堿基置換的存在。按照所述方法，必需確定探針和雜交條件，以便使雜交可受僅一個堿基差別的影響。因此，難以建立高度可再現(xiàn)的檢測系統(tǒng)。
例舉應(yīng)用如美國專利第5,660,988號中所述的循環(huán)探針反應(yīng)來檢測突變的方法。在所述方法中，將具有可容易切割的鍵合的核酸探針與目標(biāo)核酸分子雜交。如果目標(biāo)核酸分子沒有堿基置換，則探針被切割，反之，如果所述核酸分子有堿基置換，則探針不被切割。堿基置換則通過檢測從被切割探針釋放的片段的產(chǎn)生程度并對其進行定量來檢測。然而，如果依照此方法檢測痕量的靶核酸，則可能需要相當(dāng)長的時間來達到所述方法可以檢測到來自探針的切割產(chǎn)物的水平，因為切割產(chǎn)物的量很少。
應(yīng)用如美國專利第5,210,015號和第5,487,972號中所述的TaqMan方法來檢測突變的方法是另一方法的例子。在該方法中使用與熒光染料和猝滅劑連接的TaqMan探針。使用兩種探針(一種含有堿基置換，而另一種不含堿基置換)作為TaqMan探針。所述探針與目標(biāo)核酸分子雜交，并且引物從上游開始延伸。只有當(dāng)目標(biāo)核酸分子不含堿基置換時，所述探針才由于DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性而被切割。堿基置換則通過檢測發(fā)射的熒光來檢測。然而，所述方法有問題，因為所述方法需要具有5’→3’外切核酸酶活性的聚合酶、使用3’末端被封閉的標(biāo)記核苷酸以及嚴格的溫度調(diào)節(jié)的PCR，因而檢測需要的時間長。
其中使用酶的方法包括其中使用DNA聚合酶的方法。這樣的方法還分為如下三組(1)其中使用3’末端退火至待檢測堿基置換的堿基部分的引物，基于引物延伸反應(yīng)的存在檢測堿基置換的方法，如美國專利第5,137,806號中所述；(2)其中使用其中待檢測的堿基置換位點位于從3’末端起第二個核苷酸上的引物，基于引物延伸反應(yīng)的存在檢測堿基置換的方法，如WO 01/42498中所述；和(3)其中使用3’末端退火至鄰近待檢測堿基置換的堿基的3’堿基上的引物，通過鑒別摻入到引物中的堿基，測定在目標(biāo)位點上存在突變和所述位點上的堿基的方法。
其中使用DNA連接酶的方法是已知的，按照所述方法，堿基置換基于探針與相鄰探針連接的存在進行檢測。所述探針的末端部分對應(yīng)于待檢測堿基置換的堿基部分。
其中使用DNA聚合酶或DNA連接酶的方法可能不能夠精確檢測出由于堿基置換引起的引物(或探針)和靶核酸之間的錯配。具體地說，即使引物或探針有錯配，這樣的酶也可以起始酶促反應(yīng)，從而提供錯誤結(jié)果。
因為由于靶核酸和引物之間的錯誤退火引起的可能的假陽性或者由于所使用的連接酶或聚合酶造成的錯誤，所以必需非常嚴格地控制反應(yīng)條件(特別是反應(yīng)溫度)等，因而有涉及可再現(xiàn)性的問題。
最后，包括其中使用具有識別和切割雙鏈核酸中特定結(jié)構(gòu)的活性的酶的方法，例如在美國專利笫5,846,717號中所述的侵入者(invader)方法。切割酶已知是這樣的酶。通過檢查探針的切割來檢測堿基置換是可行的。設(shè)計所述探針使其形成為所述酶所識別的結(jié)構(gòu)，如果堿基置換存在(或不存在)的話。然而，其中使用具有識別和切割雙鏈核酸中特定結(jié)構(gòu)的活性的酶的方法就其靈敏度而論有問題。具體地說，按照所述方法，由于從不同的靶核酸分子產(chǎn)生一種信號，所以不可能從痕量的核酸樣品中獲得足以檢測出堿基置換的信號。自然，有可能通過重復(fù)探針切割反應(yīng)來增強所述信號，雖然必需預(yù)先擴增靶核酸，以便獲得強的信號。因此，如果依照此方法檢測痕量的靶核酸，則可能需要相當(dāng)長的時間來達到可以檢測到來自探針的切割產(chǎn)物的水平，因為切割產(chǎn)物的量很少。
由于所述方法有如上所述的幾個問題，因此一直需要可以用來精確檢測堿基置換的方法。
發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是解決上述問題，并且提供即使使用痕量的核酸樣品也能精確而極好再現(xiàn)性地檢測堿基置換(例如SNP)的方法。
發(fā)明概述為了解決如上所述的問題，需要可以用來精確檢測堿基置換并且獲得作為強信號的結(jié)果的方法。
本發(fā)明人制備了一種核苷酸。所述核苷酸能夠退火至待檢測堿基置換的靶核酸上。通過DNA聚合酶從其3’末端的DNA延伸反應(yīng)當(dāng)所述核苷酸處于完整狀態(tài)時則不被起始。核酸酶對所述核苷酸的切割受退火的模板鏈的堿基序列的影響。此外，本發(fā)明人建立了使用所述核苷酸可以用來精確而高靈敏度地檢測靶核酸中堿基置換的方法。因而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明概述如下。本發(fā)明的第一個方面涉及一種用于檢測靶核酸中特定堿基上存在堿基置換的方法，所述方法包括(1)將含有靶核酸的樣品與一種核苷酸混合，其中所述核苷酸(A)在3’末端被修飾，致使不發(fā)生由DNA聚合酶從所述末端開始的延伸；(B)具有能夠退火至所述靶核酸中含有特定堿基的區(qū)上的堿基序列；和(C)含有這樣的序列其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中在所述特定堿基和在所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間有錯配，則所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定堿基和在所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間沒有錯配，則所述核苷酸被核酸酶切割，產(chǎn)生一個新的3’末端；(2)用所述核酸酶和所述DNA聚合酶處理所述混合物；且(3)檢測所述核酸酶有無切割所述核苷酸。
以下方法作為第一方面的用來檢測堿基置換的方法的例子；其中所述核酸酶為核糖核酸酶H，并且所述核苷酸在含對應(yīng)于所述特定堿基的堿基的區(qū)中含有一個核糖核苷酸的方法；以及其中所述核酸酶為限制性酶，并且所述核苷酸在含對應(yīng)于所述特定堿基的堿基的區(qū)中含有一個限制性酶的識別序列的方法。
本發(fā)明的第二個方面涉及一種用于檢測靶核酸中堿基置換的方法，所述方法包括(1)將含有靶核酸的樣品與一種核苷酸混合，其中所述核苷酸
(A)在3’末端被修飾，致使不發(fā)生由DNA聚合酶從所述末端開始的延伸；(B)具有能夠退火至所述靶核酸中含有特定堿基的區(qū)上的堿基序列；和(C)含有這樣的序列其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中在所述特定堿基與所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間沒有錯配，則所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定堿基與所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間有錯配，則所述核苷酸被核酸酶切割，產(chǎn)生一個新的3’末端；(2)用所述核酸酶和所述DNA聚合酶處理所述混合物；且(3)檢測所述核酸酶有無切割所述核苷酸。
其中所述核酸酶是一種錯配特異性核酸酶的方法為第二個方面的檢測方法的例子。
在第一個或第二個方面的檢測方法中所使用的所述核苷酸可以具有這樣的序列其中如果在所述靶核酸中沒有堿基置換，則在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中不產(chǎn)生錯配，或者它可以具有這樣的序列其中如果在所述靶核酸中有堿基置換，則在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中不產(chǎn)生錯配。
以下方法例證了第一個或第二個方面的實施方案其中堿基置換的存在基于通過所述DNA聚合酶的作用產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物的存在來測定的方法；和其中堿基置換的存在基于通過所述核酸酶的作用產(chǎn)生的從所述核苷酸釋放的3’部分的片段的存在來測定的方法。此外，延伸產(chǎn)物或所述核苷酸3’部分的片段可以利用與所述核苷酸連接的標(biāo)記來檢測。可以用熒光物質(zhì)作為標(biāo)記。此外，可以使用與熒光物質(zhì)和能夠猝滅熒光的物質(zhì)連接的核苷酸，其中當(dāng)核酸酶進行切割或切割后DNA延伸時發(fā)射熒光。在其中使用熒光標(biāo)記的核苷酸的實施方案中，可以使用熒光偏振法進行檢測。
就在第一個或第二個方面用于檢測堿基置換的方法中所使用的所述核苷酸而論，在3’端對所述核苷酸進行修飾的例子為修飾核糖3-位上的羥基。在本發(fā)明用于檢測堿基置換的方法中所使用的所述核苷酸可以含有核苷酸類似物和/或經(jīng)修飾的核苷酸。雖然并不打算限制本發(fā)明，但是例如可以優(yōu)選使用脫氧核糖肌苷核苷酸、脫氧核糖尿嘧啶核苷酸等作為核苷酸類似物，而可以優(yōu)選使用(α-S)核糖核苷酸作為經(jīng)修飾的核糖核苷酸。此外，第一個或第二個方面的方法還可以包括一個核酸擴增步驟，其中用通過所述DNA聚合酶的作用產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物作為模板。
本發(fā)明的第三個方面涉及一種用于分析等位基因的基因型的方法，所述方法包括按照第一個或第二個方面的方法檢測堿基置換。
本發(fā)明的第四個方面涉及一種用于檢測靶核酸中特定堿基上堿基置換的核苷酸，所述核苷酸(A)在3’末端被修飾，致使不發(fā)生由DNA聚合酶從所述末端開始的延伸；(B)具有能夠退火至所述靶核酸中含有特定堿基的區(qū)上的堿基序列；和(C)含有這樣的序列其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中在所述特定堿基與所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間有錯配，則所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定堿基與所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間沒有錯配，則所述核苷酸被核酸酶切割，產(chǎn)生一個新的3’末端。
以下核苷酸為第四個方面的核苷酸的例子在所述靶核酸中含有對應(yīng)于所述特定堿基的堿基的區(qū)中含有核糖核苷酸的核苷酸，其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中在所述特定堿基與所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間沒有錯配，則所述核苷酸被核糖核酸酶H切割；以及在所述靶核酸中含對應(yīng)于所述特定堿基的堿基的區(qū)中含有限制性酶識別序列的核苷酸，其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中在所述特定堿基與所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間沒有錯配，則所述核苷酸被所述限制性酶切割。
本發(fā)明的第五個方面涉及一種用于檢測靶核酸中特定堿基上堿基置換的核苷酸，所述核苷酸(A)在3’末端被修飾，致使不發(fā)生由DNA聚合酶從所述末端開始的延伸；(B)具有能夠退火至所述靶核酸中含有特定堿基的區(qū)上的堿基序列；和(C)含有這樣的序列其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中在所述特定堿基與所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間沒有錯配，則所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定堿基與所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間有錯配，則所述核苷酸被核酸酶切割，產(chǎn)生一個新的3’末端。
其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中在所述核苷酸和所述靶核酸之間有錯配、則所述核苷酸被錯配特異性核酸酶切割的核苷酸是第五個方面的核苷酸的例子。
第四個或第五個方面的核苷酸可以具有這樣的序列其中如果在所述靶核酸中沒有堿基置換，則在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中不產(chǎn)生錯配；或者它可以具有這樣的序列其中如果在所述靶核酸中有堿基置換，則在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中不產(chǎn)生錯配。
第四個或第五個方面的核苷酸可以具有連接的標(biāo)記化合物。其位置可以位于所述核酸酶切割位點3’或5’的部分。例如，可以使用熒光物質(zhì)作為標(biāo)記化合物。通過進一步連接能夠猝滅熒光的物質(zhì)，可以制備當(dāng)所述核酸酶進行切割或者所述切割后DNA延伸時發(fā)射熒光的核苷酸。
就第四個或第五個方面的核苷酸而論，在3’端對所述核苷酸進行修飾的例子為修飾核糖3-位上的羥基。本發(fā)明的核苷酸可以含有核苷酸類似物和/或經(jīng)修飾的核苷酸。雖然并不打算限制本發(fā)明，但是例如可以優(yōu)選使用脫氧核糖肌苷核苷酸、脫氧核糖尿嘧啶核苷酸等作為核苷酸類似物，而可以優(yōu)選使用(α-S)核糖核苷酸作為經(jīng)修飾的核糖核苷酸。
本發(fā)明的第六個方面涉及一種用于檢測靶核酸中堿基置換的試劑盒，所述試劑盒含有第四個或第五個方面的所述核苷酸。
以下試劑盒是第六個方面的試劑盒的例子含有核酸酶和/或DNA聚合酶的試劑盒；還含有用于檢測DNA延伸物存在的試劑的試劑盒；和還含有用于實施核酸擴增法的試劑的試劑盒。
附圖簡述

圖1圖示說明依照本發(fā)明用于檢測堿基置換的方法來檢測人類基因中堿基置換的結(jié)果。
圖2圖示說明依照本發(fā)明用于檢測堿基置換的方法來檢測人類基因中堿基置換的結(jié)果。
圖3圖示說明依照本發(fā)明用于檢測堿基置換的方法來檢測人類基因中堿基置換的結(jié)果。
圖4圖示說明依照本發(fā)明用于檢測堿基置換的方法來檢測人類基因中堿基置換的結(jié)果。
圖5是一幅曲線圖，圖示說明依照本發(fā)明用于檢測堿基置換的方法來檢測人類基因中堿基置換的結(jié)果。
圖6圖示說明依照本發(fā)明用于檢測堿基置換的方法來檢測人類基因中堿基置換的結(jié)果。
圖7圖示說明依照本發(fā)明用于檢測堿基置換的方法來檢測人類基因中堿基置換的結(jié)果。
圖8圖示說明依照本發(fā)明用于檢測堿基置換的方法來檢測人類基因中堿基置換的結(jié)果。
發(fā)明詳述此中所用的“堿基置換”是指核酸中特定位點上的堿基被另一堿基取代。堿基置換導(dǎo)致在生物個體中遺傳信息方面的差別。遺傳信息方面的差別被稱為多態(tài)性或變異。此中所用的堿基置換包括多態(tài)性和變異方面的堿基置換。所述堿基置換也包括人工引入核酸中的堿基置換。
對于所述堿基置換中被置換堿基的數(shù)目并無具體限制?？梢杂幸粋€或多個置換。
本發(fā)明特別適用于檢測基因組多態(tài)性或變異，尤其是基因中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
在下文，將詳細描述本發(fā)明。
(1)本發(fā)明的核苷酸本發(fā)明的核苷酸具有能夠退火至靶核酸中含有待檢測堿基置換的位點的區(qū)上的堿基序列。所述核苷酸如果它處于完整狀態(tài)則不充當(dāng)通過DNA聚合酶延伸DNA的引物，而只有當(dāng)它被核酸酶切割時它才可以充當(dāng)引物。對于所述核苷酸的長度并無具體限制，只要它具有如上所述的特性。按照本發(fā)明既可以使用寡核苷酸，也可以使用多核苷酸。使用通常8-50個堿基、優(yōu)選10-40個堿基、更優(yōu)選12-30個堿基的寡核苷酸作為本發(fā)明的核苷酸。
通常，本發(fā)明的核苷酸是一種含有脫氧核糖核苷酸的寡核苷酸。任選的是，它可以含有核糖核苷酸、或者核苷酸的類似物或衍生物(修飾物)。例如，具有諸如肌苷或7-脫氮鳥嘌呤的堿基作為其堿基部分的核苷酸類似物或者具有核糖衍生物的核苷酸類似物可以用作核苷酸類似物。經(jīng)修飾的核苷酸的實例包括其中與磷酸基團連接的氧原子被硫原子取代的(α-S)核苷酸以及連接了標(biāo)記化合物的核苷酸。此外，本發(fā)明的核苷酸可以含有如PNA；Nature，365566-568(1993)中所述的肽核酸。雖然并不打算限制本發(fā)明，但是所述核苷酸類似物或衍生物優(yōu)選摻入在所述摻入并不影響所用核酸酶作用的位點上。將核苷酸類似物摻入到本發(fā)明的核苷酸中對于抑制所述核苷酸自身高級結(jié)構(gòu)的形成以及所述核苷酸退火至靶核酸上的穩(wěn)定性是有效的。因此，所述核苷酸可以含有核苷酸類似物和/或經(jīng)修飾的核苷酸，只要在本發(fā)明用于檢測堿基置換的方法中可以使用的核苷酸的功能得以保留。
按照本發(fā)明使用的所述核苷酸具有供檢測靶核酸中特定堿基上的堿基置換用的以下特性(A)在3’末端被修飾，致使不發(fā)生由DNA聚合酶從所述末端開始的延伸；(B)具有能夠退火至所述靶核酸中含有特定堿基的區(qū)上的堿基序列；和(C)含有這樣的序列其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中在所述特定堿基與所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基(即在所述特定堿基之間形成氫鍵)的堿基之間有錯配(或者如果沒有錯配的話)，則所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定堿基與所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間沒有錯配(或者如果有錯配的話)，則所述核苷酸被核酸酶切割，產(chǎn)生一個新的3’末端。
所述核苷酸被核酸酶切割后的5’部分的片段仍可以退火至靶核酸上。由于在所述核苷酸5’部分的片段的3’末端上的核糖或脫氧核糖的3-位上存在一個羥基，因此DNA可以由DNA聚合酶從所述末端開始延伸。因而，所述核苷酸如果具有可被核酸酶切割的堿基序列，則充當(dāng)引物的前體。
如上所述，本發(fā)明的核苷酸在3’末端被修飾，致使它不能用于通過DNA聚合酶的DNA延伸反應(yīng)中。對于修飾方法并無具體限制，只要可以達到上述目的。其實例包括在雙脫氧核苷酸的3’末端添加一個在核糖3-位上的羥基上修飾的核苷酸或者添加一個具有由于空間位阻而干擾DNA聚合酶延伸的修飾的核苷酸。可以使用烷基化或其它已知的修飾方法作為修飾核苷酸的核糖3-位上的羥基的方法。例如，DNA延伸反應(yīng)可以為氨基烷基化所阻止。
本發(fā)明的核苷酸具有能夠在所用條件下退火至靶核酸中待檢測堿基置換的區(qū)的堿基序列。所述核苷酸具有與靶核酸基本互補的序列，并且不必具有與所述靶核酸完全互補的堿基序列，只要對目標(biāo)堿基上置換的檢測不受干擾。
當(dāng)本發(fā)明的核苷酸退火至靶核酸上并且在合適的核酸酶和合適的DNA聚合酶的存在下保溫時，所述核苷酸的切割受到靶核酸中存在堿基置換即在于由所述核苷酸退火至靶核酸上所形成的雙鏈核酸中存在錯配的位點的影響。用所述靶核酸作為模板的DNA延伸僅當(dāng)所述核苷酸被切割而產(chǎn)生一個新的3’末端時才發(fā)生。因此，人們可以根據(jù)DNA延伸的存在而獲得有關(guān)存在錯配或者存在堿基置換的信息。
按照本發(fā)明，制備所述核苷酸致使如果存在待檢測的堿基置換則產(chǎn)生錯配是可能的，并且制備所述核苷酸致使如果存在堿基置換則不產(chǎn)生錯配也是可能的。此外，人們可以如下獲得有關(guān)存在堿基置換的信息，并且同時獲得置換堿基類型的信息制備四種類型的核苷酸，它們分別具有置于對應(yīng)于目標(biāo)堿基的位置上的四種類型堿基的其中一種；然后檢查導(dǎo)致延伸的引物中所含的堿基的類型。
如上所述，本發(fā)明的核苷酸由于被核酸酶切割而轉(zhuǎn)變成能夠進行DNA延伸的引物。所述核苷酸中位于所述核酸酶切割位點5’的部分充當(dāng)進行DNA延伸的引物。對于所述核酸酶并無具有限制，只要它根據(jù)在由于所述核苷酸退火至靶核酸上而形成的雙鏈核酸中存在錯配而切割(或者不切割)所述核苷酸。其實例包括核糖核酸酶H、限制性酶和錯配特異性核酸酶。
核糖核酸酶H(RNA酶H)是一種識別由DNA和RNA組成的雙鏈核酸并且選擇性地切割RNA鏈的酶。通過將核糖核苷酸置于核苷酸中對應(yīng)于待檢測置換的堿基的位點上，可以制備僅當(dāng)沒有錯配時才被核糖核酸酶H切割的核苷酸。
關(guān)于按照本發(fā)明使用的核糖核酸酶并無具體限制，只要它具有識別由含核糖核苷酸的本發(fā)明核苷酸和與其互補的DNA組成的雙鏈核酸并且在核糖核苷酸部分選擇性地切割的活性。例如，來自大腸桿菌(Escherichia coli)的核糖核酸酶H或者來自屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)嗜熱菌、屬于棲熱菌屬(Thermus)細菌、屬于熱球菌屬(Pyrococcus)細菌、屬于棲熱袍菌屬(Thermotoga)細菌或?qū)儆诠派蚓鷮?Archaeoglobus)細菌的核糖核酸酶H優(yōu)選作為這樣的酶使用。雖然并不打算限制本發(fā)明，但是所述核糖核酸酶H優(yōu)選在與同時使用的DNA聚合酶的相同反應(yīng)條件下表現(xiàn)出高活性。如果本發(fā)明的核苷酸與核酸擴增反應(yīng)聯(lián)合使用，則優(yōu)選使用在進行所述反應(yīng)的條件下表現(xiàn)出其活性的核糖核酸酶H。例如，如果使用包括在高溫下反應(yīng)或處理的核酸擴增反應(yīng)(例如PCR)，則最好使用耐熱性核糖核酸酶H。例如，來自熱堅芽孢桿菌(Bacillus caldotenax)、激烈熱球菌(Pyrococcusfuriosus)、Pyrococcus horikoshii、Thermococcus litoralis、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)、閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)或詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannashi)的核糖核酸酶H可以作為耐熱性核糖核酸酶H使用。
限制性酶是一種識別DNA中特定堿基序列(4-8個堿基)并且在所述序列內(nèi)或其周圍的位置進行切割的酶。如果待檢測置換的堿基部分與限制性酶的識別序列重疊，則制備用以包括所述序列的核苷酸可以用來檢測堿基置換。如果在核苷酸和靶核酸之間產(chǎn)生錯配，則不發(fā)生限制性酶的切割。人們可以根據(jù)所述結(jié)果獲得有關(guān)存在堿基置換的信息。如果使用這樣的核苷酸，則必需制備對所述限制性酶的切割不敏感的靶核酸。例如，通過使用對應(yīng)于所用限制性酶的修飾性甲基化酶，使所述特定堿基甲基化，而特異性地給靶核酸賦予對限制性酶的抗性是可行的。
可以使用識別靶核酸和核苷酸之間的錯配并且進行切割、并且與上述兩種類型的核酸酶不同的酶。Mut H或類似的酶可以作為這樣的酶使用。
本發(fā)明的核苷酸被所述核酸酸酶切割，產(chǎn)生一個新的3’末端，然后從所述末端起始DNA延伸。對于該步驟中所使用的DNA聚合酶并無具體限制，只要它能夠根據(jù)作為模板的DNA的序列，從引物的3’末端進行DNA延伸。其實例包括大腸桿菌DNA聚合酶I、Klenow片段、T7 DNA聚合酶、來自屬于芽孢桿菌屬嗜熱菌的DNA聚合酶(BstDNA聚合酶、BcaDNA聚合酶)、來自棲熱菌屬細菌的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶等)和來自嗜熱古細菌的α-型DNA聚合酶(Pfu DNA聚合酶等)。
如果本發(fā)明的核苷酸與基因擴增反應(yīng)結(jié)合使用，則選擇適合于基因擴增反應(yīng)的DNA聚合酶來使用。
由于被核酸酶切割而產(chǎn)生的本發(fā)明核苷酸3’部分的片段仍可以退火至靶核酸上(如果它足夠長的話)，雖然它可以從所述靶核酸中釋放出來(如果它短的話)。如果使用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，則所述片段當(dāng)通過所述DNA聚合酶進行DNA延伸時與所述靶核酸解離。如果使用具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶，則所述片段被所述DNA聚合酶降解。
雖然并不打算限制本發(fā)明，但是例如在使用核糖核酸酶H作為核酸酶的情況下，具有由以下通式表示的結(jié)構(gòu)的寡核苷酸可以用作本發(fā)明的核苷酸通式5’-dNa-Nb-dNc-N’-3’(a11或11以上的整數(shù)；b1或1以上的整數(shù)；c0或者1或1以上的整數(shù)；dN脫氧核糖核苷酸；N核糖核苷酸；N’經(jīng)修飾致使不發(fā)生由DNA聚合酶進行延伸的核苷酸)。
在所述通式中由Nb表示的部分含有與作為置換檢測研究對象的堿基相對應(yīng)的堿基。此外，所述核苷酸可以含有核苷酸類似物或衍生物(經(jīng)修飾的核苷酸)，只要不消除所述核苷酸的功能。
實例為作為由所述通式表示的嵌合寡核苷酸的核苷酸，其中N’是經(jīng)修飾的脫氧核糖核苷酸，a是11或11以上的整數(shù)，b＝1-3，c＝0-2。對于與作為堿基置換檢測對象的堿基相對應(yīng)的堿基并無具體限制，只要它位于由Nb表示的部分中。在本發(fā)明的一個實施方案中，例如，可以優(yōu)選使用一種這樣的核苷酸其中由(dNc-N’)表示的部分的長度為3個堿基，而與待檢測堿基置換的堿基相對應(yīng)的堿基位于由Nb表示的部分的3’末端。這樣的核苷酸在檢測堿基置換方面表現(xiàn)出良好的特異性。
可以促進通過用核酸酶進行切割從本發(fā)明的核苷酸釋放的或者通過切割后DNA延伸反應(yīng)時產(chǎn)生的產(chǎn)物(延伸產(chǎn)物)釋放的3’部分的片段的檢測，并且堿基置換的存在可以方便地通過適當(dāng)標(biāo)記所述核苷酸加以證實。
對于標(biāo)記核苷酸的方法并無具體限制。例如，可以使用放射性同位素(32P等)、染料、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、各種配體(生物素、洋地黃毒苷等)和酶。來源于標(biāo)記核苷酸的產(chǎn)物的存在可以用適用于該標(biāo)記的檢測方法加以證實。不能直接檢測的配體，可以與具有可檢測標(biāo)記的配體結(jié)合物質(zhì)結(jié)合使用。例如，通過聯(lián)合使用來自配體標(biāo)記的核苷酸的產(chǎn)物和酶標(biāo)記的抗配體抗體并且擴增該信號，可以高靈敏度地檢測靶核酸。
熒光標(biāo)記的核苷酸的實施方案的實例包括用熒光物質(zhì)和具有適當(dāng)間隔的猝滅所述熒光物質(zhì)所發(fā)射熒光的作用的物質(zhì)標(biāo)記的核苷酸。這樣的引物如果它處于完整狀態(tài)則不發(fā)射熒光。然而，如果它被核酸酶切割并且使熒光物質(zhì)和猝滅物質(zhì)相距一定距離，則它發(fā)射熒光。由于這樣的核苷酸在與DNA延伸反應(yīng)起始的同時發(fā)射熒光，因此人們可以通過直接觀察反應(yīng)期間的反應(yīng)混合物而獲得有關(guān)存在堿基置換的信息。
(2)本發(fā)明用于檢測堿基置換的方法將如以上(1)中所述的本發(fā)明核苷酸用于本發(fā)明用于檢測堿基置換的方法中，所述方法包括
(1)將含有靶核酸的樣品與所述核苷酸混合；(2)用核酸酶和DNA聚合酶處理所述混合物；且(3)檢測所述核酸酶有無切割所述核苷酸。按照如以上(1)中所述的本發(fā)明核苷酸的特征，根據(jù)核苷酸被核酸酶切割的存在，確定堿基置換的存在。
在本發(fā)明用于檢測堿基置換的方法中，可以使用單鏈或雙鏈核酸(DNA或RNA)作為靶核酸。根據(jù)所使用的核酸酶，可能難以使用RNA作為靶核酸。在這種情況下，可以通過用RNA作為模板制備cDNA并且使用cDNA作為靶核酸，檢測所述RNA中的堿基置換。
按照本發(fā)明，可以使用含有靶核酸的樣品進行檢測反應(yīng)。
可以使用可能含有核酸的任何樣品或生物體，例如不但限于細胞、組織(活檢樣品等)、全血、血清、腦脊髓液、精液、唾液、痰、尿液、糞便、毛發(fā)和細胞培養(yǎng)物。雖然并不打算限制本發(fā)明，但是可以對試樣實施本發(fā)明的方法，優(yōu)選在將其適當(dāng)加工后，例如在將其轉(zhuǎn)化為人們可以使用DNA聚合酶進行反應(yīng)的形式之后。這樣的加工包括裂解細胞以及從樣品中提取并純化核酸。
依照本發(fā)明用于檢測堿基置換的方法，根據(jù)待用核苷酸被切割的存在及切割后DNA延伸反應(yīng)的存在，測定堿基置換的存在。對于所述測定方法并無具體限制，可以使用分析核酸的已知方法。用于測定DNA延伸反應(yīng)存在的方法的實例包括以下方法其中分離所產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物以通過凝膠電泳(瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等)或毛細管電泳加以證實的方法；和其中通過質(zhì)譜法測量延伸產(chǎn)物的長度增加的方法。在另一個實施方案中，例子為其中測定將核苷酸摻入延伸產(chǎn)物中的方法。在該方法中，人們可以獲得作為在大分子延伸產(chǎn)物中摻入的合適標(biāo)記的三磷酸核苷酸的量的、有關(guān)已合成延伸產(chǎn)物的量的信息?？梢詼y定所產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物的量，例如，在通過酸沉淀或凝膠電泳從未反應(yīng)的核苷酸中分離所述產(chǎn)物之后測定。此外，可以使用其中通過酶促方法檢測DNA延伸反應(yīng)時產(chǎn)生的焦磷酸的方法。
按照本發(fā)明的檢測方法，可以采用已知的核酸擴增反應(yīng)，進一步擴增所述延伸產(chǎn)物。鑒于高靈敏度地檢測堿基置換，這樣的實施方案是有用的。
可以使用其中用具有與作為模板的核酸互補的序列的引物的各種核酸擴增法作為核酸擴增反應(yīng)，但不限于此。例如，可以使用已知的擴增法，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR，美國專利第4,683,195號、第4,683,202號和第4,800,159號)、鏈置換擴增(SDA，JP-B7-114718)、自動維持序列擴增(3SR)、基于核酸序列的擴增(NASBA，日本專利第2650159號)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增(TMA)以及核酸的等溫嵌合引物起始的擴增(ICAN，WO 00/56877)。在這樣的方法中，可以通過用本發(fā)明的核苷酸作為引物來合成與作為模板的DNA鏈互補的DNA，檢測靶核酸中的堿基置換。
如果采用上述核酸擴增法來實施本發(fā)明用于檢測堿基置換的方法，則使用本發(fā)明的核苷酸作為在所述方法中所使用的引物中的至少一種，在所述反應(yīng)系統(tǒng)中包括適用于所述核苷酸的核酸酶。
按照采用如上所述的核酸擴增反應(yīng)來檢測堿基置換，可以根據(jù)通過所述反應(yīng)的特異性擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生，測定堿基置換的存在。雖然并不打算限制本發(fā)明，但是對于所產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物，可以使用例如凝膠電泳、使用具有與擴增產(chǎn)物互補的序列的探針的雜交、使用熒光標(biāo)記核苷酸的熒光偏振法、TaqMan法等。另外，也可以使用適用于相應(yīng)基因擴增法的檢測反應(yīng)。
當(dāng)使用本發(fā)明的檢測方法在基因組水平上分析堿基置換時，可以使得反應(yīng)系統(tǒng)的體積更小且可以結(jié)合使用提高集成程度的裝置，以便分析大量的堿基序列。其中通過使用最近的超精細加工技術(shù)集成了本發(fā)明的檢測方法或分析方法的基本過程(例如從細胞提取DNA、核酸擴增反應(yīng)、目標(biāo)DNA的檢測等)的幾平方厘米至指尖大小的微芯片可以結(jié)合使用作為這樣的裝置。任選的是，可以結(jié)合凝膠電泳或毛細管電泳及與檢測探針的雜交的過程。這樣一種系統(tǒng)被稱為微芯片—毛細管電泳(CE)微芯片或納米芯片。
任何核酸擴增反應(yīng)都可以用于這樣的系統(tǒng)，只要目標(biāo)DNA片段使用所述反應(yīng)來擴增。雖然并不打算限制本發(fā)明，但是例如可以優(yōu)選使用可以用來在等溫條件下擴增核酸的方法，例如ICAN法。由于聯(lián)合使用這樣一種方法可以簡化所述系統(tǒng)，因而所述方法非常優(yōu)選用于如上所述的集成系統(tǒng)。此外，利用按照本發(fā)明的技術(shù)，可以構(gòu)建更高度集成的系統(tǒng)。
通過在本發(fā)明的核苷酸中包括經(jīng)修飾的核苷酸和/或通過在本發(fā)明的方法中適當(dāng)調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度，可以改進檢測堿基置換的特異性。
具有標(biāo)記的如以上(1)中所述的本發(fā)明核苷酸可以促進證實DNA延伸反應(yīng)的存在，并且可用于本發(fā)明用于檢測堿基置換的方法中。在這種情況下，延伸反應(yīng)的存在通過適用于標(biāo)記的如上所述的方法檢測來源于所述核苷酸的標(biāo)記物質(zhì)加以證實。
例如，如果使用連接了熒光物質(zhì)的本發(fā)明核苷酸并且如果將所述標(biāo)記與用作引物的部分連接，則可以利用熒光檢測延伸產(chǎn)物。如果將標(biāo)記連接于位于核苷酸中的核酸酶切割位點3’的部分，則由于DNA聚合酶或類似酶的5’→3’外切核酸酶活性，而將所述片段轉(zhuǎn)變?yōu)楦〉姆肿拥龋鶕?jù)3’片段與靶核酸的解離，可以檢測延伸反應(yīng)的存在。對于涉及熒光標(biāo)記核苷酸分子量變化的這樣的實施方案，優(yōu)選使用熒光偏振法。
如果使用通過連接熒光物質(zhì)和具有猝滅來自熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光的作用致使不發(fā)射熒光的物質(zhì)而標(biāo)記本發(fā)明的核苷酸，則在延伸反應(yīng)起始的同時發(fā)射熒光。因此，可以非常容易地檢測堿基置換。
在上述相應(yīng)的實施方案中，通過利用在對應(yīng)于待檢測堿基置換的位點的位置上分別具有腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)以及可辨別的不同標(biāo)記的核苷酸，人們可以獲得有關(guān)存在堿基置換的信息，并且同時獲得置換堿基類型的信息。
本發(fā)明的核苷酸可以用于PCR中，以檢測堿基置換。在這種情況下，用本發(fā)明的核苷酸取代PCR引物的其中一種，還將適用于所述核苷酸的核酸酶加入到正常反應(yīng)混合物中，供PCR用。通過選擇在所述條件下不失活的核酸酶進行PCR，可以高靈敏度地檢測堿基置換。
包括人在內(nèi)的高等動物的細胞通常都是具有一對染色體的二倍體。因此，當(dāng)染色體上的特定堿基可能存在堿基置換時，則有如下的三種可能的情況純合子(純合型)，其中細胞的兩條染色體均沒有堿基置換；純合子(純合型)，其中兩條染色體上均存在堿基置換；和雜合子(雜合型)，其中僅一條染色體具有堿基置換。
通過將本發(fā)明用于檢測堿基置換的方法用于從二倍體細胞制備的核酸樣品，檢查所述二倍體細胞或具有所述細胞的個體的基因型對于基因中的特定堿基是純合型還是雜合型是可能的。雖然并不打算限制本發(fā)明，但是例如當(dāng)用對應(yīng)于四種類型的堿基并且如果沒有錯配則被切割的核苷酸實施本發(fā)明的方法時，對于來源于基因型為雜合型的細胞的核酸樣品，核苷酸由于核苷酸被切割而檢測到兩種核苷酸的信號。另一方面，對于來源于基因型為純合型的細胞的核酸樣品，僅檢測到一種核苷酸的信號。另外，同時測定所述純合型有無堿基置換是可能的。如上所述，本發(fā)明的方法可用來檢測等位基因中的堿基置換。
(3)本發(fā)明用于檢測堿基置換的試劑盒本發(fā)明提供用于如上所述按照本發(fā)明檢測堿基置換的試劑盒。在一個實施方案中，所述試劑盒含有本發(fā)明的核苷酸。它可以含有一組分別含有四種類型的堿基之一的核苷酸，所述核苷酸可以用來測定堿基置換的存在，并且同時測定被置換堿基的類型。此外，所述試劑盒可以含有適用于所述核苷酸的核酸酶、DNA聚合酶、DNA聚合酶的底物(dNTP)、適用于反應(yīng)的緩沖液等?；蛘?，所述試劑盒可以含有用于檢測引物-延伸產(chǎn)物的試劑。優(yōu)選含有用于制備核酸擴增法中所使用的反應(yīng)混合物的試劑的試劑盒，作為用于結(jié)合核酸擴增法檢測堿基置換的試劑盒。
實施例以下實施例更詳細地說明本發(fā)明，但不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。
參比實施例1激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)RNA酶HII基因的克隆(1)從激烈熱球菌制備基因組DNA將含有1％胰蛋白胨(Difco Laboratories)、0.5％酵母膏(DifcoLaboratories)、1％可溶性淀粉(Nacalai Tesque)、3.5％Jmarine S Solid(Jmarine Laboratory)、0.5％Jmarine S Liquid(Jamarine Laboratory)、0.003％MgSO4、0.001％NaCl、0.0001％FeSO4·7H2O、0.0001％CoSO4、0.0001％CaCl2·7H2O、0.0001％ZnSO4、0.1ppm CuSO4·5H2O、0.1ppmKAl(SO4)2、0.1ppm H3BO4、0.1ppm Na2MoO4·2H2O和0.25ppmNiCl2·6H2O的2L培養(yǎng)基置于2 L培養(yǎng)瓶中，于120℃滅菌20分鐘，通入氮氣，以除去溶解氧。然后在培養(yǎng)基中接種激烈熱球菌(從德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Microorganismen)購買；DSM3638)，于95℃不振蕩培養(yǎng)16小時。培養(yǎng)后，通過離心收集細胞。
然后將所得細胞懸浮于4ml 25％蔗糖、50mM Tris-HCl(pH8.0)中。向其中加入0.4ml 10mg/ml氯化溶菌酶(lysozyme chloride)(NacalaiTesque)的水溶液。讓混合物于20℃反應(yīng)1小時。反應(yīng)后，向反應(yīng)混合物中加入含有150mM NaCl、1mM EDTA和20mM Tris-HCl(pH8.0)的24ml混合物、0.2ml 20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)和2ml 10％十二烷基硫酸鈉水溶液。將混合物于37℃溫育1小時。
反應(yīng)后，混合物經(jīng)過苯酚-氯仿抽提，然后乙醇沉淀，制備約1mg基因組DNA。
(2)RNA酶HII基因的克隆Pyrococcus horikoshii的完整基因組序列已經(jīng)發(fā)表[DNA Research，555-76(1998)]。已知在基因組中存在一個編碼RNA酶HII同源物的基因(PH1650)(SEQ ID NO1，National Institute of Technology andEvaluation: http://www/nite.gojp/的主頁)。
搜索了PH1650基因(SEQ ID NO1)和激烈熱球菌的部分發(fā)表的基因組序列(University of Utah，Utah Genome Centerhttp://www.genome.utah.edu/sequence.html的主頁)之間的同源性。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)一個高度同源的序列。
根據(jù)所述同源序列，合成引物1650Nde(SEQ ID NO2)和1650Bam(SEQ ID NO3)。
用參比實施例1-(1)中獲得的200ng激烈熱球菌DNA作為模板，用20pmol 1650Nde和20pmol 1650Bam作為引物，在100μl體積中進行PCR。用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)作為DNA聚合酶，按照所附的方案進行PCR。如下進行PCR94℃30秒、55℃30秒和72℃1分鐘，進行30個循環(huán)。約0.7kb的擴增DNA片段用NdeI和BamHI(都得自Takara Shuzo)消化。將所得的DNA片段插入到質(zhì)粒載體pET3a(Novagen)的NdeI位點和BamHI位點之間，制備質(zhì)粒pPFU220。
(3)含RNA酶HII基因的DNA片段的堿基序列的測定按照雙脫氧法，測定在參比實施例1-(2)中獲得的插入到pPFU220中的所述DNA片段的堿基序列。
所測定的堿基序列的分析表明，存在一個推定編碼RNA酶HII的可讀框。所述可讀框的堿基序列示于SEQ ID NO4中。從所述堿基序列導(dǎo)出的RNA酶HII的氨基酸序列示于SEQ ID NO5中。
用質(zhì)粒pPFU220轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109被命名和指定為大腸桿菌JM109/pPFU220，并且于2000年9月5日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(International Patent OrganismDepository，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，Japan，保藏號為FERM P-18020以及以保藏號FERM BP-7654保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心，(轉(zhuǎn)至國際保藏機構(gòu)的日期2001年7月9日)。
(4)經(jīng)純化的RNA酶HII制劑的制備用參比實施例1-(2)中獲得的pPFU220轉(zhuǎn)化大腸桿菌HMS174(DE3)(Novagen)。將所得的帶有pPFU220的大腸桿菌HMS174(DE3)接種到含有100μg/ml氨芐青霉素的2L LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)16小時。培養(yǎng)后，將經(jīng)離心收集的細胞懸浮于66.0ml超聲處理緩沖液[50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mM苯基甲磺酰氟]中，進行超聲處理。將通過超聲處理懸浮液以12,000rpm離心10分鐘而獲得的上清液于60℃加熱15分鐘。然后再次以12,000rpm離心10分鐘，以收集上清液。從而獲得61.5ml熱處理上清液。
將所述熱處理上清液經(jīng)過用緩沖液A[50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡的RESOURSE Q柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech)進行色譜分離。結(jié)果，RNA酶HII流過RESOURSE Q柱。
將60.0ml所述流通RNA酶HII流分經(jīng)過用緩沖液A平衡的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系統(tǒng)，以0-500mM NaCl線性梯度洗脫。獲得用約150mM NaCl洗脫出的含RNA酶HII的流分。
用Centricon-10(Amicon)，通過超濾濃縮2.0ml所述RNA酶HII流分。將250μl所述濃縮液經(jīng)過用含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM Tris-HCl(pH8.0)平衡的Superdex 200凝膠過濾柱(AmershamPharmacia Biotech)，用同一種緩沖液洗脫。結(jié)果，RNA酶HII在相當(dāng)于17千道爾頓分子量的位置洗脫出來。這一分子量對應(yīng)于單體形式的RNA酶HII的分子量。
將洗脫出的RNA酶HII用作PfuRNA酶HII制劑。如下測定如此獲得的Pfu RNA酶HII制劑的RNA酶H活性。
將10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM二硫蘇糖醇(Nacalai Tesque)、0.003％牛血清白蛋白(fraction V，Sigma)、4％甘油、20μg/ml poly(dT)(Amersham Pharmacia Biotech)和30μg/ml poly(rA)(AmershamPharmacia Biotech)混合在一起。讓混合物于37℃保溫10分鐘，用作供測量RNA酶H活性用的底物溶液。
加入1μl 1M MnCl2至100μl底物溶液中。讓混合物于40℃保溫。加入適當(dāng)稀釋的PfuRNA酶HII制劑至所述混合物中，以起始反應(yīng)。于40℃反應(yīng)30分鐘后，加入10μl 0.5M EDTA以終止反應(yīng)。然后測量260nm的吸光度。
結(jié)果，加入Pfu RNA酶HII制劑的反應(yīng)混合物的260nm的吸光度值，高于在加入Pfu RNA酶HII制劑之前加入10μl 0.5M EDTA的反應(yīng)混合物的吸光度值。因此，表明該制劑具有RNA酶H活性。
(5)經(jīng)純化的RNA酶H活性的測量(a)所用試劑溶液的制備供測定活性用的反應(yīng)混合物在無菌水中含有指定終濃度的以下物質(zhì)40mM Tris-HCl(pH7.7，37℃)、4mM氯化鎂、1mM DTT、0.003％BSA、4％甘油和24μM poly(dT)。
Poly[8-3H]腺苷酸溶液將370 kBq Poly[8-3H]腺苷酸溶液溶于200μl無菌水中。
聚腺苷酸溶液用無菌超純水將聚腺苷酸稀釋至3mM的濃度。
酶稀釋液在無菌水中含有指定終濃度的以下物質(zhì)25mMTris-HCl(pH7.5，37℃)、5mM 2-巰基乙醇、0.5mM EDTA(pH7.5，37℃)、30mM氯化鈉和50％甘油。
熱變性小牛胸腺DNA的制備將200mg小牛胸腺DNA懸浮于100ml TE緩沖液中并讓其溶脹?；谠赨V 260nm下測量的吸光度，用無菌超純水將溶液稀釋至1mg/ml的濃度。將所述稀釋液于100℃加熱10分鐘，然后在冰浴中快速冷卻。
(b)用于測量活性的方法加入7μl Poly[8-3H]腺苷酸溶液至以上(a)中制備的測定活性用的985μl反應(yīng)混合物中。讓混合物于37℃保溫10分鐘。加入8μl聚腺苷酸至混合物中，使終濃度為24μM。再讓混合物于37℃保溫5分鐘。如此制備了1000μl Poly[8-3H]rA-poly-dT反應(yīng)混合物。然后將200μl反應(yīng)混合物于30℃保溫5分鐘。向其中加入1μl酶溶液的適當(dāng)連續(xù)稀釋液。在規(guī)定時間內(nèi)從反應(yīng)混合物中取出每種樣品50μl，用于隨后的測量。將按分鐘計從加入酶至取樣的時間定義為Y。加入1μl所述酶稀釋液以取代酶溶液，制備總CPM或空白的50μl反應(yīng)混合物。向樣品中加入100μl 100mM焦磷酸鈉、50μl熱變性小牛胸腺DNA溶液和300μl 10％三氯乙酸(對于測量總CPM，300μl超純水)。讓混合物于0℃保溫5分鐘，然后以10000rpm離心10分鐘。離心后，將250μl所得上清液置于小瓶中。向其中加入10ml Aqausol-2(NEN Life ScienceProducts)。在液體閃爍計數(shù)器中測量CPM。
(c)單位的計算按照以下公式計算每種酶的單位值單位/ml＝{(測量的CPM-空白CPM)×1.2*×20×1000×稀釋率}200(μl)/(總CPM×Y(min)×50(μl)×9**)1.2*每50μl總CPM中所含有的Poly[8-3H]rA-poly-dT量(nmol)9**校正系數(shù)。
參比實施例2得自閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)的RNA酶HII基因的克隆(1)從閃爍古生球菌制備基因組DNA將從8ml培養(yǎng)物收集的閃爍古生球菌(從德意志微生物和細胞保藏中心購買；DSM4139)細胞懸浮于100μl 25％蔗糖、50mM Tris-HCl(pH8.0)中。加入20μl 0.5M EDTA和10μl 10mg/ml氯化溶菌酶(Nacalai Tesque)的水溶液。讓混合物于20℃反應(yīng)1小時。反應(yīng)后，向反應(yīng)混合物中加入含有150mM NaCl、1mM EDTA和20mM Tris-HCl(pH8.0)的800μl混合物、10μl 20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)和50μl 10％十二烷基硫酸鈉水溶液。將混合物于37℃溫育1小時。反應(yīng)后，混合物經(jīng)過苯酚-氯仿抽提，然后乙醇沉淀并風(fēng)干，然后溶于50μl TE中，獲得基因組DNA溶液。
(2)RNA酶HII基因的克隆閃爍古生球菌的完整基因組序列已經(jīng)發(fā)表[Klenk，H.P.等，Nature，390364-370(1997)]。已知存在一個編碼RNA酶HII同源物的基因(AF0621)(SEQ ID NO13，http://www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.htlm)。
根據(jù)AF0621基因(SEQ ID NO13)的序列，合成引物AfuNde(SEQID NO14)和AfuBam(SEQ ID NO15)。
用參比實施例2-(1)中制備的30ng閃爍古生球菌基因組DNA作為模板，用AfuNde和AfuBam各20pmol作為引物，在100μl體積中進行PCR。用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)作為DNA聚合酶，按照所附的方案進行PCR。如下進行PCR94℃30秒、55℃30秒和72℃1分鐘，進行40個循環(huán)。約0.6kb擴增DNA片段用NdeI和BamHI(都得自Takara Shuzo)消化。然后將所得的DNA片段插入到質(zhì)粒載體pTV119Nd(一種其中pTV119N的NcoI位點被轉(zhuǎn)變?yōu)镹deI位點的質(zhì)粒)的NdeI位點和BamHI位點之間，構(gòu)建質(zhì)粒pAFU204。
(3)含RNA酶HII基因的DNA片段的堿基序列的測定按照雙脫氧法，測定在參比實施例2-(2)中獲得的插入到pAFU204中的所述DNA片段的堿基序列。
所測定的堿基序列的分析揭示出一個推定編碼RNA酶HII的可讀框。所述可讀框的堿基序列示于SEQ ID NO16中。從所述堿基序列導(dǎo)出的RNA酶HII的氨基酸序列示于SEQ ID NO17中。
用質(zhì)粒pAFU204轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109被命名和指定為大腸桿菌JM109/pAFU204，并且于2001年2月22日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，Japan，保藏號為FERM P-18221以及以保藏號FERM BP-7691保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(轉(zhuǎn)至國際保藏機構(gòu)的日期2001年8月2日)。
(4)經(jīng)純化的RNA酶HII制劑的制備用參比實施例2-(2)中獲得的pAFU204轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。將所得的帶有pAFU204的大腸桿菌JM109接種到含有100μg/ml氨芐青霉素的2L LB培養(yǎng)基中，于37.℃振蕩培養(yǎng)16小時。培養(yǎng)后，將經(jīng)離心收集的細胞懸浮于37.1ml超聲處理緩沖液[50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mM苯基甲磺酰氟]中，進行超聲處理。將通過超聲處理懸浮液以12,000rpm離心10分鐘而獲得的上清液于70℃加熱15分鐘。然后再次以12,000rpm離心10分鐘，以收集上清液。從而獲得40.3ml熱處理上清液。
將所述熱處理上清液經(jīng)過用緩沖液A[50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡的RESOURSE Q柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech)進行色譜分離。結(jié)果，RNA酶HII流過RESOURSE Q柱。
所述流通RNA酶HII流分經(jīng)過用緩沖液A平衡的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系統(tǒng)(Amersham PharmaciaBiotech)進行色譜分離。結(jié)果，RNA酶HII流過所述RESOURSE S柱。
將40.0ml所述流通RNA酶HII流分用2L含有50mM NaCl的緩沖液B[50mM Tris-HCl(pH7.0)、1mM EDTA]透析3次，每次透析2小時。將40.2ml透析過的酶溶液經(jīng)過用含有50mM NaCl的緩沖液B平衡的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系統(tǒng)，以50-550mM NaCl線性梯度洗脫。結(jié)果，獲得用約240mM NaCl洗脫出的含RNA酶HII的流分。
用Centricon-10(Amicon)，通過超濾濃縮7.8ml所述RNA酶HII流分。將從約600μl所述濃縮液分離出的4個部分分別經(jīng)過用含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM Tris-HCl(pH7.0)平衡的Superose6凝膠過濾柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用同一種緩沖液洗脫。結(jié)果，RNA酶HII在相當(dāng)于30.0千道爾頓分子量的位置洗脫出來。這一分子量對應(yīng)于單體形式的RNA酶HII的分子量。
將如上所述洗脫出的RNA酶HII用作Afu RNA酶HII制劑。
按照參比實施例1-(5)中所述的方法，用如此獲得的Afu RNA酶HII制劑測定酶活性。結(jié)果，觀察到所述Afu RNA酶HII制劑的RNA酶H活性。
如下計算以下實施例中耐熱性RNA酶H的單位值。
將1mg poly(rA)或poly(dT)(都得自Amersham Pharmacia Biotech)溶于含有1mM EDTA的1ml 40mM Tris-HCl(pH7.7)中，制備poly(rA)溶液和poly(dT)溶液。
然后加入poly(rA)溶液(至終濃度為20μg/ml)和poly(dT)溶液(至終濃度為30μg/ml)至含有4mM MgCl2、1mM DTT、0.003％BSA和4％甘油的40mM Tris-HCl(pH7.7)中。讓混合物于37℃反應(yīng)10分鐘，然后冷卻至4℃，制備poly(rA)-poly(dT)溶液。加入1μl適當(dāng)稀釋的酶溶液至100μl所述poly(rA)-poly(dT)溶液中。讓混合物于40℃反應(yīng)10分鐘。向其中加入10μl 0.5M EDTA，以終止反應(yīng)。然后測量260nm的吸光度。作為對照，加入10μl 0.5M EDTA至反應(yīng)混合物中，讓所得混合物于40℃反應(yīng)10分鐘，然后測量吸光度。通過從無EDTA時反應(yīng)物的吸光度中減去對照的吸光度，獲得一個數(shù)值(吸光度之差)。因此，基于所述吸光度之差，測量由于所述酶促反應(yīng)從poly(rA)-poly(dT)雜合體中釋放的核苷酸的濃度。一個單位的RNA酶H定義為按照以下公式計算、增加相當(dāng)于在10分鐘內(nèi)釋放1nmol核糖核苷酸的A260的酶量單位＝[吸光度之差×反應(yīng)體積(ml)/0.0152×(110/100)×稀釋率]實施例1人c-Ki-ras基因中堿基置換的檢測(1)模板的制備制備分別具有人c-Ki-ras外顯子1中12號密碼子的序列GGT(Gly)、CGT(Arg)、TGT(Cys)或AGT(Ser)的DNA片段。簡而言之，將使用對應(yīng)于ras Mutant Set c-Ki-ras 12號密碼子(Takara Shuzo)和rasGene Primer Set c-Ki-ras/12(Takara Shuzo)中的上述密碼子的模板DNA通過PCR獲得的擴增產(chǎn)物，克隆到載體pT7-Blue(Novagen)中。用如此獲得的重組質(zhì)粒作為模板，使用M13引物M4和RV(都得自TakaraShuzo)，進行PCR?；厥账玫臄U增片段，分別命名為模板12G、12R、12C和12S。
(2)堿基置換的檢測基于人c-Ki-ras外顯子1的堿基序列，合成了具有SEQ ID NO7-9的堿基序列、作為正向核苷酸供特異性地檢測模板12G用的三種嵌合寡核苷酸。每種嵌合寡核苷酸3’端核苷酸的核糖部分3-位上的羥基用氨基己基修飾。每種所述核苷酸都具有與人c-Ki-ras外顯子1的堿基序列互補的序列，其中12號密碼子編碼Gly。合成了具有SEQ IDNO6的堿基序列的寡核苷酸作為反義引物，供核酸擴增用。
制備含有正向核苷酸和反義引物各50pmol、1μl 0.25％丙二胺水溶液和1pg模板12G、12C、12R和12S之一作為模板的5μl總體積的反應(yīng)混合物。通過在Thermal Cycler Personal(Takara Shuzo)中于98℃加熱2分鐘，然后于53℃加熱，使正向核苷酸和反義引物退火至所述模板上。向所述熱處理混合物中加入20μl含有0.625mM dNTP混合物、40mM Hepes-KOH緩沖液(pH7.8)、125mM乙酸鉀、5mM乙酸鎂、0.0125％牛血清白蛋白、1.25％二甲基亞砜、16U在參比實施例1中描述的Pfu RNA酶HII、5.5U BcaBest DNA聚合酶(Takara Shuzo)和無菌水的混合物，使終體積為25μl。讓反應(yīng)混合物于53℃保溫1小時。反應(yīng)后，將每種反應(yīng)混合物5μl在3.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳。結(jié)果示于圖1中。如圖1-1、圖1-2和圖1-3所示，將使用模板12G、12C、12R和12S的反應(yīng)混合物分別上樣至所述瓊脂糖凝膠中的第1-4泳道。圖1-1、圖1-2和圖1-3分別顯示在反應(yīng)中使用SEQ ID NO7、8和9的核苷酸的反應(yīng)結(jié)果。
如圖1所示，使用SEQ ID NO7-9的核苷酸，僅當(dāng)使用模板12G時才觀察到擴增產(chǎn)物，換句話說，當(dāng)靶核酸的12號密碼子編碼Gly時才觀察到擴增產(chǎn)物。這些結(jié)果表明，通過使用本發(fā)明的核苷酸，可以鑒別靶核酸中的堿基置換。此外，證明特異性擴增可以通過使用含有肌甘的核苷酸得到改進。
實施例2c-Ki-ras 12號密碼子的其它等位基因的檢測根據(jù)實施例1的結(jié)果，合成了具有SEQ ID NO10-12的堿基序列的嵌合寡核苷酸，作為能夠特異性地鑒別實施例1-(1)中制備的12R、12C和12S中12號密碼子的堿基的核苷酸。SEQ ID NO10、11和12分別顯示對應(yīng)于其中12號密碼子編碼Cys、Arg和Ser的等位基因的堿基序列。每種核苷酸3’端核苷酸的核糖部分3-位上的羥基用氨基己基修飾。使用這些核苷酸和SEQ ID NO6的反義引物，在實施例1-(2)中描述的反應(yīng)條件下進行反應(yīng)。反應(yīng)后，將每種反應(yīng)混合物5μl在3.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳。結(jié)果示于圖2中。如圖2-1、圖2-2和圖2-3所示，將使用模板12G、12C、12R和12S的反應(yīng)混合物分別上樣至所述瓊脂糖凝膠中的第1-4泳道。圖2-1、圖2-2和圖2-3分別顯示在反應(yīng)中使用SEQ ID NO10、11和12的核苷酸的反應(yīng)結(jié)果。
如圖2所示，分別僅當(dāng)結(jié)合使用SEQ ID NO10、11和12的核苷酸和模板12C、12R和12S時才觀察到特異性擴增產(chǎn)物。因而，本發(fā)明的核苷酸可以精確鑒別目標(biāo)堿基。此外，證明特異性擴增可以通過使用含有肌甘的寡核苷酸得到改進。
實施例3基因組DNA的等位基因特異性DNA擴增在如以上(2)中描述的條件下進行反應(yīng)。在反應(yīng)中，使用150ng或30ng人類基因組DNA(Clontech)(對其已經(jīng)證實c-Ki-ras外顯子1中的12號密碼子編碼Gly(GGT))、SEQ ID NO7、10、11和12的核苷酸(分別對應(yīng)于12號密碼子的Gly、Cys、Arg和Ser)(在實施例1和實施例2中，已經(jīng)證明所述核苷酸能夠特異性地檢測12號密碼子的四個等位基因)以及SEQ ID NO6的反義引物。反應(yīng)后，將每種反應(yīng)混合物5μl在3.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳。結(jié)果示于圖3中。
如圖3-1、圖3-2和圖3-3所示，將使用SEQ ID NO7、10、11和12的核苷酸的反應(yīng)混合物，分別上樣至所述瓊脂糖凝膠中的第1-4泳道。圖3-1和圖3-2分別顯示在反應(yīng)中使用150ng和30ng人類基因組DNA的反應(yīng)結(jié)果。
如圖3所示，僅當(dāng)使用SEQ ID NO7的核苷酸時才觀察到DNA片段的擴增，與人類基因組DNA的量無關(guān)，而使用其它核苷酸沒有觀察到DNA片段的擴增。這些結(jié)果證明，本發(fā)明用于檢測堿基置換的方法可以用于檢測基因組DNA中的特定等位基因。
實施例4使用不同RNA酶H的檢測檢查在如實施例1中描述的檢測堿基置換中使用不同RNA酶H。
具體地說，使用如參比實施例2中描述的Afu RNA酶HII或MjaRNA酶HII取代Pfu RNA酶HII，Mja RNA酶HII得自詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannashi)，如Structure，8897-904中所述的方法制備。使用SEQ ID NO7的核苷酸作為正向核苷酸，用SEQ ID NO6的寡核苷酸作為反義引物，在如實施例1中描述的條件下進行反應(yīng)。反應(yīng)后，將每種反應(yīng)混合物5μl在3.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳。結(jié)果示于圖4中。如圖4-1和圖4-2所示，將使用模板12G、12C、12R和12S的反應(yīng)混合物分別上樣至所述瓊脂糖凝膠中的第1-4泳道。圖4-1和圖4-2分別顯示在反應(yīng)中使用Afu RNA酶HII和Mja RNA酶HII的反應(yīng)結(jié)果。
如圖4所示，使用Afu RNA酶HII和Mja RNA酶HII，僅當(dāng)使用模板12G時才觀察到擴增產(chǎn)物，換句話說，當(dāng)所述靶核酸的12號密碼子編碼Gly時才觀察到擴增產(chǎn)物。這些結(jié)果表明，靶核酸中的堿基置換可以用這些RNA酶H來鑒別。
實施例5用需要變性步驟的DNA擴增反應(yīng)系統(tǒng)(PCR)檢測SNP用需要變性步驟的DNA擴增反應(yīng)系統(tǒng)檢查本發(fā)明的方法。基于人c-Ki-ras外顯子1的堿基序列，合成了SEQ ID NO25的嵌合寡核苷酸作為有義核苷酸，供特異性地檢測模板12G用。所述核苷酸3’端核苷酸的核糖部分3-位上的羥基用氨基己基修飾。也合成了具有SEQ IDNO18的堿基序列的引物作為反義引物。制備含有所述合成核苷酸和引物(有義核苷酸和反義引物)各50pmol、2.5μl Ex Taq緩沖液(TakaraShuzo)、2μl 2.5mM dNTP混合物、50U Afu RNA酶HII和0.625U ExTaq DNA聚合酶(Takara Shuzo)的24μl總體積的反應(yīng)混合物。向反應(yīng)混合物中加入實施例1中制備的1μl 10ng/μl模板12G、12C、12R或12S的溶液。采用Thermal Cycler(Takara Shuzo)，如下進行PCR94℃5秒、59℃2分鐘和72℃5秒，進行25個或30個循環(huán)。在反應(yīng)后，采用Agilent 2100 Bioanalyzer(Hewlett-Packard)，分析1μl每種反應(yīng)混合物。結(jié)果示于圖5中。圖5是一幅曲線圖，圖示說明相應(yīng)模板的目標(biāo)擴增產(chǎn)物的量。縱軸代表目標(biāo)擴增產(chǎn)物的量，橫軸代表PCR循環(huán)數(shù)。如圖5所示，僅當(dāng)使用等位基因與檢測用引物相符的模板12G時才觀察到目標(biāo)DNA的特異性擴增。因而，證明本發(fā)明的方法對于需要使作為模板的核酸變性的步驟的DNA擴增反應(yīng)系統(tǒng)而言也是有效的。
實施例6K-ras 61號密碼子的等位基因特異性檢測檢查另一堿基置換的檢測。具體地說，將分別具有使用SEQ IDNO19和20的DNA引物通過PCR擴增的人c-Ki-ras外顯子2中61號密碼子的序列CAA(Glu)、AAA(Lys)或GAA(Gln)的DNA片段克隆到載體pT7-Blue中。按照常規(guī)方法純化克隆了DNA片段的載體，分別命名為61Q、61K和61E。根據(jù)實施例1-(2)的結(jié)果，基于人c-Ki-ras外顯子2的堿基序列，合成了SEQ ID NO21、22和23的嵌合寡核苷酸，作為供特異性地檢測相應(yīng)載體61Q、61K和61E用的核苷酸。每種核苷酸3’端核苷酸的核糖部分3-位上的羥基都用氨基己基修飾。用所述核苷酸作為有義引物，用SEQ ID NO24的引物作為反義引物，進行以下的反應(yīng)。制備含有所述合成寡核苷酸引物(有義引物和反義引物)各50pmol、1μl 0.05％丙二胺水溶液和10pg模板DNA 61Q、61K和61E之一的5μl總體積的反應(yīng)混合物。通過在Thermal Cycler Personal(Takara Shuzo)中于98℃加熱2分鐘，然后于53℃加熱，使所述引物退火至所述模板上。向所述熱處理混合物中加入20μl含有0.625mMdNTP混合物、40mM Hepes-KOH緩沖液(pH7.8)、125mM乙酸鉀、5mM乙酸鎂、0.0125％牛血清白蛋白、1.25％二甲基亞砜、11 UAfuRNA酶HII(Takara Shuzo)、5.5UBcaBest DNA聚合酶(Takara Shuzo)和無菌水的混合物，使終體積為25μl。讓反應(yīng)混合物于58℃保溫1小時。反應(yīng)后，將每種反應(yīng)混合物5μl在3.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳。結(jié)果示于圖6中。圖6A是一幅電泳譜圖，代表用SEQ ID NO21的檢測61Q用引物進行檢測的結(jié)果。第1、2和3泳道分別代表用模板61Q、61K和61E作為模板獲得的結(jié)果。圖6B是一幅電泳譜圖，代表用SEQ IDNO22的檢測61K用引物進行檢測的結(jié)果。第1、2和3泳道分別代表使用模板61Q、61K和61E獲得的結(jié)果。圖6C是一幅電泳譜圖，代表用SEQ ID NO23的引物檢測61E的檢測結(jié)果。第1、2和3泳道分別代表用模板61Q、61K和61E獲得的結(jié)果。
如圖6A、圖6B和圖6C所示，證明使用SEQ ID NO21、22和23，以等位基因特異性方式，通過ICAN反應(yīng)獲得目標(biāo)DNA擴增產(chǎn)物。因而，證明本發(fā)明的方法當(dāng)改變目的堿基置換時也是有效的。
實施例7CYP2C19(636)的等位基因特異性檢測(1)檢查區(qū)分基因純合型和雜合型的檢測方法。選擇人CYP2C19中第636號堿基的等位基因作為研究對象。首先，將使用SEQ ID NO26和27的DNA引物通過PCR擴增的、人CYP2C19中第636號堿基為G或A的DNA片段克隆到載體pT7-Blue中。按照常規(guī)方法純化克隆這些DNA片段的質(zhì)粒，命名為636G和636A。
用質(zhì)粒636G和636A以及通過將質(zhì)粒636G和636A以1:1混合而制備的質(zhì)粒636G/A作為模板。質(zhì)粒636G和636A用作基因純合型的模型，而質(zhì)粒636G/A用作基因雜合型的模型。接著，合成了SEQ IDNO28和29的核苷酸，分別作為供特異性地檢測636G和636A用的核苷酸。用所述核苷酸作為有義引物，用SEQ ID NO30的引物作為反義引物，進行以下的反應(yīng)。制備含有所述合成寡核苷酸引物(有義引物和反義引物)各50pmol、1μl 0.05％丙二胺水溶液和1pg質(zhì)粒636G、636A和636G/A之一作為模板DNA的5μl總體積的反應(yīng)混合物。通過在Thermal Cycler Personal(Takara Shuzo)中于98℃加熱2分鐘，然后于53℃加熱，使所述引物退火至所述模板上。向所述熱處理混合物中加入20μl含有0.625mM dNTP混合物、40mM Hepes-KOH緩沖液(pH7.8)、125mM乙酸鉀、5mM乙酸鎂、0.0125％牛血清白蛋白、1.25％二甲基亞砜、11U Afu RNA酶HII、5.5UBcaBest DNA聚合酶和無菌水的混合物，使終體積為25μl。讓反應(yīng)混合物于53℃保溫1小時。反應(yīng)后，將每種反應(yīng)混合物5μl在3.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳。結(jié)果示于圖7A和7B中。圖7A是一幅電泳譜圖，代表使用核苷酸636G進行檢測的結(jié)果。第1、2和3泳道分別代表用質(zhì)粒636G、636A和636G/A作為模板獲得的結(jié)果。
圖7B是一幅電泳譜圖，代表使用核苷酸636A進行檢測的結(jié)果。第1、2和3泳道分別代表用質(zhì)粒636G、636A和636G/A作為模板獲得的結(jié)果。如圖7A和圖7B所示，證明可以使用所述核苷酸以等位基因特異性方式進行檢測。
(2)在與PCR-RFLP進行比較時用人類基因組DNA作為模板以進行分析。用150ng人類基因組DNA(Clontech)作為模板，如以上(1)中所述的方法進行SNP分型。結(jié)果示于圖7C中。圖7C是一幅電泳譜圖，代表人類基因組DNA SNP分型的結(jié)果。第1和2泳道分別代表使用核苷酸636G和636A獲得的結(jié)果。
如圖7C所示，僅當(dāng)使用核苷酸636G時才檢測到擴增的目標(biāo)DNA。所述基因組DNA的CYP2C19中第636號堿基的等位基因被確定是純合型(636G/G)。
另一方面，使用人類基因組DNA，通過PCR-RFLP進行分型。使用150ng所述基因組DNA以及SEQ ID NO26和27的引物進行PCR。所得PCR擴增產(chǎn)物用BamHI處理，將反應(yīng)混合物在3.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳。結(jié)果示于圖7D中。圖7D是一幅電泳譜圖，代表用人類基因組DNA作為模板通過PCR-RFLP分型的結(jié)果。第1和2泳道分別代表PCR擴增產(chǎn)物和用BamHI消化的PCR擴增產(chǎn)物的結(jié)果。
如圖7D所示，PCR擴增產(chǎn)物被BamHI完全消化。因而，所述基因組DNA的CYP2C19中第636號堿基的等位基因，根據(jù)PCR-RFLP也被確定是純合型(636G/G)。證明采用本發(fā)明用于檢測堿基置換的方法獲得的結(jié)果，與采用常規(guī)的通過PCR-RFLP進行SNP分型獲得的結(jié)果相一致。
(3)使用以上(1)中制備的質(zhì)粒636G、636A和636G/A，檢查假定同源染色體基因型的檢測方法。如下進行反應(yīng)。首先，合成了在5’末端上連接了可相互鑒別的熒光標(biāo)記Rox(ABI)和Fam(ABI)的核苷酸636G和636A。使用含有等量的所述熒光標(biāo)記核 苷酸的混合物。如以上(1)中所述的方法進行檢測。反應(yīng)后，將每種反應(yīng)混合物的一部分在3.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳，使擴增產(chǎn)物和未反應(yīng)的熒光標(biāo)記核苷酸完全分離。電泳后，用FM-BIO II Multi-View(Takara Shuzo)對所述瓊脂糖凝膠進行分析。結(jié)果，當(dāng)用質(zhì)粒636G作為模板時，僅觀察到來自熒光標(biāo)記Rox的熒光信號。當(dāng)用質(zhì)粒636A作為模板時，僅觀察到來自熒光標(biāo)記Fam的熒光信號。此外，當(dāng)用質(zhì)粒636G/A作為模板時，觀察到來自Rox和Fam兩者的熒光信號。根據(jù)這些結(jié)果，證明本發(fā)明的方法可用作可以用來分析同源染色體上基因型(純合型或雜合型)的方法。
實施例8用從全血提取的基因組DNA進行分型在征得同意后從健康個體收集的全血樣品1-6號各200μl，用Dr.GenTLETM(Takara Shuzo)制備基因組DNA。用160ng所制備的基因組DNA作為模板以及用SEQ ID NO28和29的核苷酸作為引物，如實施例7-(1)中所述的方法進行SNP分型，以特異性地檢測等位基因636G和636A。結(jié)果示于圖8A-F中。圖8A-F是電泳譜圖，代表使用從血樣1-6號中提取的基因組DNA作為模板如實施例7-(1)中所述的方法進行分型的結(jié)果。第1和2泳道分別代表用SEQ ID NO28的核苷酸(用于檢測636G)和SEQ ID NO29的核苷酸(用于檢測636G)獲得的結(jié)果?；谌鐖D8A-F所示的擴增產(chǎn)物的譜圖，對于CYP2C19中第636號堿基而言，相應(yīng)血樣的等位基因分型如下(1G/A，2G/G，3G/A，4G/G，5G/G，6G/G)。另一方面，用同一基因組DNA作為模板，如實施例7-(2)中所述的方法通過PCR-RFLP進行分型。結(jié)果示于圖8G中。圖8G是一幅電泳譜圖，代表使用從血樣1-6號中制備的基因組DNA作為模板通過PCR-RFLP進行分型的結(jié)果。第1-6泳道分別代表用從血樣1-6號中提取的基因組DNA作為模板獲得的結(jié)果。圖8G顯示用相應(yīng)的人血樣制備的DNA作為模板獲得的PCR擴增產(chǎn)物的切割譜圖，基于如圖8G所示的電泳結(jié)果，CYP2C19中第636號堿基的等位基因分型如下(1G/A，2G/G，3G/A，4G/G，5G/G，6G/G)，所述結(jié)果與上述結(jié)果相一致。
如上所述，證明本發(fā)明的方法當(dāng)使用實際臨床試樣時也是有效的。
工業(yè)應(yīng)用性如上所述，本發(fā)明的核苷酸和使用所述核苷酸檢測堿基置換的方法可用于檢測天然存在的或人工引入的堿基置換。
按照本發(fā)明，可以便捷而可再現(xiàn)地檢測靶核酸中堿基置換的存在。本發(fā)明的方法可以容易地與已知的核酸擴增法結(jié)合使用，并且可以用來高靈敏度地檢測堿基置換。此外，通過結(jié)合使用具有合適序列的核苷酸，有可能獲得有關(guān)存在堿基置換的信息，并且同時獲得有關(guān)被置換堿基類型的信息。
本發(fā)明可用來檢測或鑒定生物體基因組DNA中所產(chǎn)生的堿基置換(例如SNP)，例如多態(tài)性或變異。因而，本發(fā)明可用于基因組藥物開發(fā)領(lǐng)域和基因組醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，以搜索人類的疾病基因，分析藥物抗性等。
序列表的獨立文本SEQ ID NO1編碼得自Pyrococcus horikoshii、具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO2PCR引物1650Nde，用于從激烈熱球菌克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO3PCR引物1650Bam，用于從激烈熱球菌克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO6嵌合寡核苷酸引物，用于擴增人c-Ki-ras基因的一部分的DNA?！昂塑账?8-20為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO7嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代?！昂塑账?3-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”SEQ ID NO8嵌合寡核苷酸引物前體，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代?！昂塑账?2-15為核糖核苷酸，核苷酸17為肌苷，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”SEQ ID NO9嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。“核苷酸14和15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”SEQ ID NO10嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代?！昂塑账?3-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”SEQ ID NO11嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代?！昂塑账?3-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”SEQ ID NO12嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代?！昂塑账?3-15為核糖核苷酸，核苷酸17為肌苷，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”SEQ ID NO13得自閃爍古生球菌的AF0621基因的堿基序列。
SEQ ID NO14PCR引物AfuNde，用于從閃爍古生球菌克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO15PCR引物AfuBam，用于從閃爍古生球菌克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO16得自閃爍古生球菌的RNA酶HII中ORF的堿基序列。
SEQ ID NO17得自閃爍古生球菌的RNA酶HII的氨基酸序列。
SEQ ID NO18設(shè)計的PCR引物，用于擴增c-Ki-ras癌基因外顯子1的一部分。
SEQ ID NO19設(shè)計的PCR引物，用于擴增人c-Ki-ras癌基因外顯子2的一部分。
SEQ ID NO20設(shè)計的PCR引物，用于擴增人c-Ki-ras癌基因外顯子2的一部分。
SEQ ID NO21嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代?！昂塑账?3-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”
SEQ ID NO22嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代?！昂塑账?3-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”SEQ ID NO23嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代?！昂塑账?3-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”SEQ ID NO24嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。“核苷酸17-19為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO25嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代?！昂塑账?6-18為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”SEQ ID NO26設(shè)計的PCR引物，用于擴增人CYP2C19基因的一部分。
SEQ ID NO27設(shè)計的PCR引物，用于擴增人CYP2C19基因的一部分。
SEQ ID NO28嵌合寡核苷酸，用于檢測人CYP2C19基因上的核苷酸取代?！昂塑账?3-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”SEQ ID NO29嵌合寡核苷酸，用于檢測人CYP2C19基因上的核苷酸取代?！昂塑账?3-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”SEQ ID NO30嵌合寡核苷酸引物，用于擴增人CYP2C19基因上的一部分?！昂塑账?9-21為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”
序列表<110>寶酒造株式會社(Takara Shuzo Co.，Ltd.)<120>核苷酸取代的檢測方法<130>663051<150>JP 2001-39268<151>2001-02-15<150>JP 2001-40721<151>2001-02-16<150>JP 2001-101055<151>2001-03-30<150>JP 2001-177381<151>2001-06-12<150>JP 2001-290384<151>2001-09-25<150>JP 2001-338440<151>2001-11-02<150>JP 2001-368929<151>2001-12-03<160>30<210>1<211>663<212>DNA<213>Pyrococcus horikoshii
<400>1atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt 60ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac 120tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta 180gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg 240aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag 300aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct 360gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata 420gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag 480caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt 540gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc 600gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag 660tga663<210>2<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物1650Nde，用于從激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>2caggaggaga gacatatgaa aataggggga att 33<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物1650Bam，用于從激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>3
gaaggttgtg gatccacttt ctaaggtttc tta 33<210>4<211>672<212>DNA<213>激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)<400>4atgaaaatag ggggaattga cgaagcagga agaggaccag cgatagggcc attagtagta 60gctactgtcg tcgttgatga gaaaaacatt gagaagctca gaaacattgg agtaaaagac 120tccaaacaac taacacccca tgaaaggaag aatttatttt cccagataac ctcaatagcg 180gatgattaca aaatagtgat agtatcccca gaagaaatcg acaatagatc aggaacaatg 240aacgagttag aggtagagaa gtttgctctc gccttaaatt cgcttcagat aaaaccagct 300cttatatacg ctgatgcagc ggatgtagat gccaatagat ttgcaagctt gatagagaga 360agactcaatt ataaggcgaa gattattgcc gaacacaagg ccgatgcaaa gtatccagta 420gtttcagcag cttcaatact tgcaaaggtt gttagggatg aggaaattga aaaattaaaa 480aagcaatatg gagactttgg ctctgggtat ccaagtgatc caaaaaccaa gaaatggctt 540gaagagtact acaaaaaaca caactctttc cctccaatag tcagacgaac ctgggaaact 600gtaagaaaaa tagaggaaag cattaaagcc aaaaaatccc agctaacgct tgataaattc 660tttaagaaac ct 672<210>5<211>224<212>PRT<213>激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)<400>5Met Lys Ile Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile1 5 10 15Gly Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn Ile20 25 30Glu Lys Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr35 40 45Pro His Glu Arg Lys Asn Leu Phe Ser Gln Ile Thr Ser Ile Ala50 55 60Asp Asp Tyr Lys Ile Val Ile Val Ser Pro Glu Glu Ile Asp Asn65 70 75
Arg Ser Gly Thr Met Asn Glu Leu Glu Val Glu Lys Phe Ala Leu80 85 90Ala Leu Asn Ser Leu Gln Ile Lys Pro Ala Leu Ile Tyr Ala Asp95 100 105Ala Ala Asp Val Asp Ala Asn Arg Phe Ala Ser Leu Ile Glu Arg110 115 120Arg Leu Asn Tyr Lys Ala Lys Ile Ile Ala Glu His Lys Ala Asp125 130 135Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala Ser Ile Leu Ala Lys Val140 145 150Val Arg Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Lys Lys Gln Tyr Gly Asp155 160 165Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Lys Thr Lys Lys Trp Leu170 175 180Glu Glu Tyr Tyr Lys Lys His Asn Ser Phe Pro Pro Ile Val Arg185 190 195Arg Thr Trp Glu Thr Val Arg Lys Ile Glu Glu Ser Ile Lys Ala200 205 210Lys Lys Ser Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Phe Lys Lys Pro215 220<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌合寡核苷酸引物，用于擴增人c-Ki-ras基因的一部分的DNA?！昂塑账?8-20為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”<400>6ctattgttgg atcatatucg20<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代?！昂塑账?3-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”<400>7tggtagttgg agcuggtg 18<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代?！昂塑账?2-15為核糖核苷酸，核苷酸17為肌苷，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”<400>8tggtagttgg agcuggng 18<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代?！昂塑账?4和15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”<400>9tggtagttgg agcuggtg 18<210>10<211>18
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。“核苷酸13-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”<400>10tggtagttgg agcuugtg 18<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代?！昂塑账?3-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”<400>11tggtagttgg agcucgtg 18<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代?！昂塑账?3-15為核糖核苷酸，核苷酸17為肌苷，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”<400>12tggtagttgg agcuagng 18
<210>13<211>626<212>DNA<213>閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)<400>13atgaaggcag gcatcgatga ggctggaaag ggctgcgtca tcggcccact ggttgttgca 60ggagtggctt gcagcgatga ggataggctg agaaagcttg gtgtgaaaga ctccaaaaag 120ctaagtcagg ggaggagaga ggaactagcc gaggaaataa ggaaaatctg cagaacggag 180gttttgaaag tttctcccga aaatctcgac gaaaggatgg ctgctaaaac cataaacgag 240attttgaagg agtgctacgc tgaaataatt ctcaggctga agccggaaat tgcttatgtt 300gacagtcctg atgtgattcc cgagagactt tcgagggagc ttgaggagat tacggggttg 360agagttgtgg ccgagcacaa ggcggacgag aagtatcccc tggtagctgc ggcttcaatc 420atcgcaaagg tggaaaggga gcgggagatt gagaggctga aagaaaaatt cggggatttc 480ggcagcggct atgcgagcga tccgaggaca agagaagtgc tgaaggagtg gatagcttca 540ggcagaattc cgagctgcgt gagaatgcgc tggaagacgg tgtcaaatct gaggcagaag 600acgcttgacg atttctaaac gaaacc 626<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物AfuNde，用于從閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>14aagctgggtt tcatatgaag gcaggcatcg 30<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物AfuBam，用于從閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>15tggtaataac ggatccgttt agaaatcgtc 30<210>16<211>638<212>DNA<213>閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)<400>16catatgaagg caggcatcga tgaggctgga aagggctgcg tcatcggccc actggttgtt 60gcaggagtgg cttgcagcga tgaggatagg ctgagaaagc ttggtgtgaa agactccaaa 120aagctaagtc aggggaggag agaggaacta gccgaggaaa taaggaaaat ctgcagaacg 180gaggttttga aagtttctcc cgaaaatctc gacgaaagga tggctgctaa aaccataaac 240gagattttga aggagtgcta cgctgaaata attctcaggc tgaagccgga aattgcttat 300gttgacagtc ctgatgtgat tcccgagaga ctttcgaggg agcttgagga gattacgggg 360ttgagagttg tggccgagca caaggcggac gagaagtatc ccctggtagc tgcggcttca 420atcatcgcaa aggtggaaag ggagcgggag attgagaggc tgaaagaaaa attcggggat 480ttcggcagcg gctatgcgag cgatccgagg acaagagaag tgctgaagga gtggatagct 540tcaggcagaa ttccgagctg cgtgagaatg cgctggaaga cggtgtcaaa tctgaggcag 600aagacgcttg acgatttcta aacggatccc cgggtacc 638<210>17<211>205<212>PRT<213>閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)<400>17Met Lys Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Lys Gly Cys Val Ile Gly1 5 10 15Pro Leu Val Val Ala Gly Val Ala Cys Ser Asp Glu Asp Arg Leu20 25 30Arg Lys Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Ser Gln Gly Arg35 40 45Arg Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Arg Lys Ile Cys Arg Thr Glu50 55 60
Val Leu Lys Val Ser Pro Glu Asn Leu Asp Glu Arg Met Ala Ala65 70 75Lys Thr Ile Asn Glu Ile Leu Lys Glu Cys Tyr Ala Glu Ile Ile80 85 90Leu Arg Leu Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Val Asp Ser Pro Asp Val95 100 105Ile Pro Glu Arg Leu Ser Arg Glu Leu Glu Glu Ile Thr Gly Leu110 115 120Arg Val Val Ala Glu His Lys Ala Asp Glu Lys Tyr Pro Leu Val125 130 135Ala Ala Ala Ser Ile Ile Ala Lys Val Glu Arg Glu Arg Glu Ile140 145 150Glu Arg Leu Lys Glu Lys Phe Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Ala155 160 165Ser Asp Pro Arg Thr Arg Glu Val Leu Lys Glu Trp Ile Ala Ser170 175 180Gly Arg Ile Pro Ser Cys Val Arg Met Arg Trp Lys Thr Val Ser185 190 195Asn Leu Arg Gln Lys Thr Leu Asp Asp Phe200 205<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計的PCR引物，用于擴增c-ki-ras癌基因外顯子1的一部分<400>18ctattgttgg atcatattcg20<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>設(shè)計的PCR引物，用于擴增人c-ki-ras癌基因外顯子2的一部分<400>19ttcctacgga agcaagtag19<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計的PCR引物，用于擴增人c-ki-ras癌基因外顯子2的一部分<400>20cacaaagaaa gccctcccca 20<210>21<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代?！昂塑账?3-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”<400>21tcgacacagc aggucaag 18<210>22<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代?！昂塑账?3-
15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”<400>22tcgacacagc agguaaag 18<210>23<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代。“核苷酸13-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”<400>23tcgacacagc aggugaag 18<210>24<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代?！昂塑账?7-19為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”<400>24acaaagaaag ccctcccca19<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌合寡核苷酸，用于檢測人c-Ki-ras基因上的核苷酸取代?！昂塑账?6-18為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”<400>25ttgtggtagt tggagcuggt g21<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計的PCR引物，用于擴增人CYP2C19基因的一部分<400>26tattatctgt taactaatat ga 22<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計的PCR引物，用于擴增人CYP2C19基因的一部分<400>27acttcagggc ttggtcaata 20<210>28<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌合寡核苷酸，用于檢測人CYP2C19基因上的核苷酸取代。“核苷酸13-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”<400>28gtaagcaccc ccuggatc 18<210>29<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌合寡核苷酸，用于檢測人CYP2C19基因上的核苷酸取代。“核苷酸13-15為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并且3’端核苷酸的3’-OH基團用氨基己基保護”<400>29gtaagcaccc ccugaatc 18<210>30<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌合寡核苷酸引物，用于擴增人CYP2C19基因的-部分。“核苷酸19-21為核糖核苷酸，而其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”<400>30ttggtcaata tagaatttug g 2權(quán)利要求
1.一種用于檢測靶核酸中特定堿基上存在堿基置換的方法，所述方法包括(1)將含有靶核酸的樣品與一種核苷酸混合，其中所述核苷酸(A)在3’末端被修飾，致使不發(fā)生由DNA聚合酶從所述末端開始的延伸；(B)具有能夠退火至所述靶核酸中含有特定堿基的區(qū)上的堿基序列；和(C)含有這樣的序列其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中在所述特定堿基與所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間有錯配，則所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定堿基與所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間沒有錯配，則所述核苷酸被核酸酶切割，產(chǎn)生一個新的3’末端；(2)用所述核酸酶和所述DNA聚合酶處理所述混合物；且(3)檢測所述核酸酶有無切割所述核苷酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸酶是一種核糖核酸酶H，并且所述核苷酸在含有對應(yīng)于所述特定堿基的堿基的區(qū)中含有核糖核苷酸。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸酶是一種限制性酶，并且所述核苷酸在含有對應(yīng)于所述特定堿基的堿基的區(qū)中含有所述限制性酶的識別序列。
4.一種用于檢測靶核酸中特定堿基上存在堿基置換的方法，所述方法包括(1)將含有靶核酸的樣品與一種核苷酸混合，其中所述核苷酸(A)在3’末端被修飾，致使不發(fā)生由DNA聚合酶從所述末端開始的延伸；(B)具有能夠退火至所述靶核酸中含有特定堿基的區(qū)上的堿基序列；和(C)含有這樣的序列其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中在所述特定堿基與所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間有錯配，則所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定堿基與所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間沒有錯配，則所述核苷酸被核酸酶切割，產(chǎn)生一個新的3’末端；(2)用所述核酸酶和所述DNA聚合酶處理所述混合物；且(3)檢測所述核酸酶有無切割所述核苷酸。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述核酸酶是一種錯配特異性核酸酶。
6.權(quán)利要求1或4的方法，其中所述核苷酸具有這樣的序列其中如果在所述靶核酸中沒有堿基置換，則在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中不產(chǎn)生錯配。
7.權(quán)利要求1或4的方法，其中所述核苷酸具有這樣的序列其中如果在所述靶核酸中有堿基置換，則在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中不產(chǎn)生錯配。
8.權(quán)利要求1或4的方法，其中基于通過所述DNA聚合酶的作用產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物的存在，檢測所述核苷酸的切割。
9.權(quán)利要求1或4的方法，其中基于通過所述核酸酶的作用從所述核苷酸釋放的3’部分的片段的存在，檢測所述核苷酸的切割。
10.權(quán)利要求1或4的方法，其中利用與所述核苷酸連接的標(biāo)記化合物，檢測所述核苷酸的切割。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述標(biāo)記化合物連接到所述核苷酸上位于所述核酸酶切割位點3’的部分中。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述標(biāo)記化合物連接到所述核苷酸上位于所述核酸酶切割位點5’的部分中。
13.權(quán)利要求10的方法，其中與所述核苷酸連接的標(biāo)記化合物是一種熒光物質(zhì)。
14.權(quán)利要求13的方法，其中還將能夠猝滅熒光的物質(zhì)與所述核苷酸連接，并且當(dāng)所述核酸酶進行切割時發(fā)射熒光。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述核苷酸的切割通過熒光偏振法來檢測。
16.權(quán)利要求1或4的方法，其中所述核苷酸在3’末端的修飾是修飾核糖3-位上的羥基。
17.權(quán)利要求1或4的方法，其中所述核苷酸含有核苷酸類似物和/或經(jīng)修飾的核苷酸。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述核苷酸類似物是脫氧核糖肌苷核苷酸或脫氧核糖尿嘧啶核苷酸，而所述經(jīng)修飾的核糖核苷酸是(α-S)核糖核苷酸。
19.權(quán)利要求1或4的方法，所述方法還包括一個核酸擴增步驟，其中用通過所述DNA聚合酶的作用產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物作為模板。
20.一種用于分析等位基因的基因型的方法，所述方法包括按照權(quán)利要求19所限定的方法來檢測靶核酸中特定堿基上堿基置換的存在。
21.一種用于檢測靶核酸中特定堿基上堿基置換的核苷酸，所述核苷酸(A)在3’末端被修飾，致使不發(fā)生由DNA聚合酶從所述末端開始的延伸；(B)具有能夠退火至所述靶核酸中含有特定堿基的區(qū)上的堿基序列；和(C)含有這樣的序列其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中在所述特定堿基與所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間有錯配，則所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定堿基與所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間沒有錯配，則所述核苷酸被核酸酶切割，產(chǎn)生一個新的3’末端。
22.權(quán)利要求21的核苷酸，所述核苷酸在含有對應(yīng)于所述特定堿基的堿基的區(qū)中含有核糖核苷酸，其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中在所述特定堿基與所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間沒有錯配，則所述核苷酸被核糖核酸酶H切割。
23.權(quán)利要求21的核苷酸，所述核苷酸在含有對應(yīng)于所述特定堿基的堿基的區(qū)中含有限制性酶的識別序列，其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中在所述特定堿基與所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間沒有錯配，則所述核苷酸被所述限制性酶切割。
24.一種用于檢測靶核酸中特定堿基上存在堿基置換的核苷酸，所述核苷酸(A)在3’末端被修飾，致使不發(fā)生由DNA聚合酶從所述末端開始的延伸；(B)具有能夠退火至所述靶核酸中含有特定堿基的區(qū)上的堿基序列；和(C)含有這樣的序列其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中在所述特定堿基與所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間沒有錯配，則所述核苷酸不被核酸酶切割，而如果在所述特定堿基與所述核苷酸中對應(yīng)于所述特定堿基的堿基之間有錯配，則所述核苷酸被核酸酶切割，產(chǎn)生一個新的3’末端。
25.權(quán)利要求24的核苷酸，其中如果在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中在所述核苷酸和所述靶核酸之間有錯配，則所述核苷酸被錯配特異性核酸酶切割。
26.權(quán)利要求21或24的核苷酸，所述核苷酸具有這樣的序列其中如果在所述靶核酸中沒有堿基置換，則在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中不產(chǎn)生錯配。
27.權(quán)利要求21或24的核苷酸，所述核苷酸具有這樣的序列其中如果在所述靶核酸中有堿基置換，則在由所述核苷酸和所述靶核酸構(gòu)成的復(fù)合物中不產(chǎn)生錯配。
28.權(quán)利要求21或24的核苷酸，所述核苷酸連接了標(biāo)記化合物。
29.權(quán)利要求28的核苷酸，其中所述標(biāo)記化合物連接到所述核苷酸上位于所述核酸酶切割位點3’的部分中。
30.權(quán)利要求28的核苷酸，其中所述標(biāo)記化合物連接到所述核苷酸上位于所述核酸酶切割位點5’的部分中。
31.權(quán)利要求28的核苷酸，其中所述標(biāo)記化合物是一種熒光物質(zhì)。
32.權(quán)利要求31的核苷酸，所述核苷酸還連接了能夠猝滅熒光的物質(zhì)，其中當(dāng)所述核酸酶進行切割或者所述切割后DNA延伸時發(fā)射熒光。
33.權(quán)利要求21或24的核苷酸，其中所述核苷酸在3’末端的修飾是修飾核糖3-位上的羥基。
34.權(quán)利要求21或24的核苷酸，所述核苷酸含有核苷酸類似物和/或經(jīng)修飾的核苷酸。
35.權(quán)利要求34的核苷酸，其中所述核苷酸類似物是脫氧核糖肌苷核苷酸或脫氧核糖尿嘧啶核苷酸，而所述經(jīng)修飾的核糖核苷酸是(α-S)核糖核苷酸。
36.一種用于檢測靶核酸中堿基置換的試劑盒，所述試劑盒含有由權(quán)利要求21或24限定的核苷酸。
37.權(quán)利要求36的試劑盒，所述試劑盒含有核酸酶和/或DNA聚合酶。
38.權(quán)利要求36的試劑盒，所述試劑盒還含有供檢測存在DNA延伸用的試劑。
39.權(quán)利要求36的試劑盒，所述試劑盒還含有供實施核酸擴增法用的試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種可用于檢測基因上核苷酸多態(tài)性的核苷酸；一種使用該核苷酸檢測堿基上核苷酸多態(tài)性的方法；以及用于所述方法的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1524127SQ0280793
公開日2004年8月25日 申請日期2002年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月15日
發(fā)明者佐川裕章, 小林英二, 加藤郁之進, 之進, 二 申請人:寶生物工程株式會社