專利名稱：基于野兔痘的載體疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在非易感宿主中野兔痘病毒載體疫苗的用途和活的、重組野兔痘病毒。
已經(jīng)介紹過(guò)基于正痘和禽痘病毒的載體疫苗及其在疫苗中作為重組病毒載體的潛力。美國(guó)專利5759841介紹的重組疫苗病毒在疫苗病毒基因組的非必須區(qū)域含有編碼至少一個(gè)糖蛋白和一個(gè)DNA表達(dá)的啟動(dòng)子的麻疹病毒DNA。該重組疫苗可以在犬體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)麻疹病毒的免疫反應(yīng)。然而包括人在內(nèi)的大量不同物種能夠許可這種重組疫苗載體，所以所述疫苗載體病毒在接種的宿主中有引起失控性感染或者從接種的宿主轉(zhuǎn)移到未接種宿主的潛在危險(xiǎn)。
專利WO9527780介紹了重組禽痘病毒，該病毒的優(yōu)點(diǎn)是它的宿主范圍有限，因此減少了對(duì)非鳥類宿主的毒性。該重組禽痘病毒在病毒基因組的非必須區(qū)域內(nèi)含有外源DNA，該外源DNA編碼至少一個(gè)犬瘟熱病毒(CDV)抗原，或者麻疹病毒(MV)M或者N抗原。在犬類和其它食肉動(dòng)物以及在人類中，這些病毒可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原性反應(yīng)或者免疫反應(yīng)。該重組禽痘載體病毒限制在其天然宿主范圍內(nèi)，在非鳥類動(dòng)物中接種該載體病毒后，只引起外源抗原表達(dá)，而不會(huì)產(chǎn)生病毒的生產(chǎn)性復(fù)制。不過(guò)，用禽痘病毒載體接種后，外源抗原表達(dá)水平始終較低。因此需要提高外源抗原的表達(dá)水平。此外，用禽痘病毒載體免疫后不是總會(huì)產(chǎn)生足夠的針對(duì)外源抗原的中和性抗體。用基于金絲雀痘的FeLV載體疫苗對(duì)貓進(jìn)行接種不會(huì)產(chǎn)生中和性的抗FeLV抗體(J.Tartaglia等，1993，J.Virol.67，p.2370-2375)。新生的小貓很容易發(fā)生FeLV感染。因?yàn)樗鼈冊(cè)诔錾蟮牡谝恢軆?nèi)不具有成熟的免疫系統(tǒng)，新生小貓必須依賴來(lái)自母親的抗體防護(hù)FeLV感染。如果疫苗不能為母親提供中和性抗體，小貓將無(wú)法得到抵抗FeLV的防護(hù)并且將會(huì)感染。
令人吃驚的是，在正常情況下不會(huì)被野兔痘病毒復(fù)制性感染的宿主中，即野兔痘病毒在所述宿主中復(fù)制后就不能進(jìn)一步復(fù)制，可用活的含有編碼至少一個(gè)抗原的外源基因的重組野兔痘病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原性或者免疫原性反應(yīng)。野兔痘病毒的生產(chǎn)性感染僅限于兔類動(dòng)物。因此，野兔痘病毒感染非兔類動(dòng)物后不會(huì)發(fā)生野兔痘病毒的復(fù)制。因此，令人驚訝的是，活的重組野兔痘病毒能夠感染這些非易感宿主并且在上述非易感宿主中不發(fā)生生產(chǎn)性復(fù)制而表達(dá)所述抗原，認(rèn)如證據(jù)所表明的，病毒載體不會(huì)傳播到其它接觸的動(dòng)物中。更令人驚訝的是，用所說(shuō)的野兔痘病毒載體感染非兔種宿主后，即使在宿主中觀察不到病毒的生產(chǎn)性復(fù)制，卻導(dǎo)致外源DNA編碼的抗原的高水平表達(dá)。在某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中，病毒載體確實(shí)可以在體外生長(zhǎng)，并且，因?yàn)樵谶@種非易感型宿主中野兔痘病毒載體不進(jìn)行生產(chǎn)性復(fù)制，所以野兔痘病毒對(duì)非兔種動(dòng)物沒有致病性，這使得該病毒載體更適于用作疫苗。
在專利FR-A-2736358中介紹了包含外源DNA的重組粘液瘤病毒疫苗，這種重組粘液瘤病毒使兔子對(duì)粘液瘤病和其它兔子病原體引起的感染性疾病免疫。在專利FR-A-2736358中沒有提到使用活的、重組粘液瘤病毒作為病毒載體來(lái)誘發(fā)非易感宿主產(chǎn)生抗原性反應(yīng)或免疫原性反應(yīng)，尤其是在非兔類宿主中。
因此，本發(fā)明關(guān)于含有外源DNA的活的、重組野兔痘病毒在制備用于治療或預(yù)防非兔種動(dòng)物的感染性疾病的載體疫苗中的用途，此外源DNA操作性連接至少一個(gè)表達(dá)控制元件并且被整合到病毒基因組的非必須區(qū)域中。優(yōu)選將包含外源DNA的、活的、重組粘液瘤病毒用于制備治療或預(yù)防非兔種動(dòng)物的感染性疾病的載體疫苗，此外源DNA操作性連接至少一個(gè)表達(dá)控制元件并且被整合到病毒基因組的非必須區(qū)域中。更具體地，本發(fā)明涉及上述活的、重組的野兔痘病毒在制備用于治療或預(yù)防禽、貓、犬、豬、羊、牛、馬和人類感染性疾病的載體疫苗中的用途。優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的活的重組野兔痘病毒用于制備治療犬類和貓科動(dòng)物的感染性疾病的載體疫苗。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包含外源DNA的、活的重組野兔痘病毒，此外源DNA操作性連接至少一個(gè)表達(dá)控制元件，此外源DNA至少編碼一種導(dǎo)致非兔類宿主患感染性疾病的病原體抗原。更具體地，此外源DNA至少編碼一種導(dǎo)致人、牛、禽、貓、犬、豬、馬或羊類動(dòng)物的感染性疾病的病原體抗原。優(yōu)選此外源DNA編碼一種貓或犬的病原體抗原。根據(jù)本發(fā)明，該病原體根據(jù)接種動(dòng)物所針對(duì)的不同疾病種類，可以是病毒、細(xì)菌或寄生蟲。如果病原體的基因組是RNA，那么目的抗原可由基因所對(duì)應(yīng)的cDNA編碼。外源DNA可以編碼兩種或更多的抗原，這些抗原可以來(lái)自相同的病原體或來(lái)自不同的病原體。
用于重組野兔痘病毒的適當(dāng)?shù)耐庠椿騼?yōu)選編碼病毒糖蛋白、病毒包膜蛋白、病毒基質(zhì)蛋白、細(xì)菌外膜蛋白、細(xì)菌腸毒素、細(xì)菌傘毛或者寄生蛋白。該外源DNA更具體地編碼貓白血病病毒(FeLV)包膜蛋白(Stewart等(1986)J.Virol.58pp.825-834)或者基質(zhì)蛋白(Donahue等.，1988，J.Virol.62，p.722-731)、貓或者羊衣原體主要外膜蛋白(GenBank Accession No.分別是CPFPNMOMP和CHTMOMPX)、貓傳染性粒細(xì)胞缺乏癥(panleukopenia)病毒(FPV)VP2蛋白(Carlson，J.等人，1985，J.Virol.55，p.574-582)、貓杯狀病毒衣殼蛋白(M.J.Carter等人1992，J.Arch.Virol.122，P.223-235)，貓免疫缺陷病毒(FIV)Gag，Pol，Rev，Tat或Vif蛋白(R.I.Talbot等人1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86.p5743-5747；T.R.Philips等人1990，J.Virol.64，p.4605-4613；K.MLockridge，等人1999，J.Virol.261，p.25-30)，貓感染性腹膜炎病毒(FIPV)膜-、核衣殼-或刺突蛋白(R.J.de Groot等人1987，J.Gen.Virol.68，p.2639-2646；H.Vennema，等人1991，Virology，181，p.327-335)，犬瘟熱病毒Env，HA，融合或核衣殼蛋白(M.Sidhu，等人1993，Virology 193，p 66-72；U.Gassen等人，2000，J.Virol.74，p.10737-10744)，犬細(xì)小病毒VP2蛋白(Reed，P.等人，1988，J.Virol.62，p.266-276)，狂犬病病毒糖蛋白G(T.J.Wiktor等.1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，p.7194-7198)、犬冠狀病毒刺突蛋白(B.Horsburgh等，2000，J.Gen，Virol.73，p.2849-2862)。除了編碼非兔類病原體的免疫原性蛋白基因之外，外源DNA還包括編碼細(xì)胞因子的基因，如INFγ(GenBank Acc.No.D30619)、IL-1β(GenBankAcc.No.D92060)、IL-2/15(GenBank Acc.No.AF054601)、IL-4、IL-5(GenBank Acc.NoAF025436.)、IL-6、IL-12(GenBank Acc.No.U83184和U83185)、IL-16(GenBank Acc.No.AF003701)、或者IL-18(GenBank Acc.No.ABO46211)或者趨化性細(xì)胞因子如α-趨化因子IL-8(GenBank Acc.No.XM003501)、GROα、GROβ、NAP-2、PF-4、IP10、CTAP-III、β-TG和β-趨化因子MCP-1(GenBankAcc.No.NM002982)、MIP-1α、MIP-1β、RANTES(GenBankAcc.No.XM012656)、MCP-2(GenBank Acc.No.AJ251190)、MCP-3(GenBank Acc.No.NM006273)、MCP-4(GenBankAcc.No.AJ251191)。優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的編碼適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子的基因源自將接種該疫苗的同樣種屬的動(dòng)物。
外源DNA操作性連接至少一個(gè)表達(dá)調(diào)控元件，此元件控制和調(diào)節(jié)此外源DNA的表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，外源DNA中的每個(gè)基因都受控于單獨(dú)的不同的表達(dá)調(diào)控元件。表達(dá)調(diào)控元件為本領(lǐng)域內(nèi)熟知并包括啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明中用于外源DNA表達(dá)的適合的啟動(dòng)子是病毒或者合成的啟動(dòng)子，此啟動(dòng)子能夠調(diào)節(jié)蛋白在胞質(zhì)中的表達(dá)。用于本發(fā)明中的啟動(dòng)子是痘病毒啟動(dòng)子，優(yōu)選牛痘啟動(dòng)子(見DE-A-19627193；Mackett等人，“DNA Cloning Volume III”ed.D.M.Glover，1985，IRL公司出版)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的啟動(dòng)子是合成的啟動(dòng)子，更優(yōu)選合成的早期或者早/晚期啟動(dòng)子。在Chakrabati等人在Bio Techniques 23，vol.6，pp.1094-1097，1997.的文章中介紹了合成的牛痘病毒早/晚期啟動(dòng)子?？刹捎帽绢I(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成此啟動(dòng)子，例如見上1997，Chakrabate等人介紹的合成此啟動(dòng)子的實(shí)例。
本發(fā)明可以使用的適當(dāng)?shù)囊巴枚徊《景ǖ遣痪窒抻谡骋毫霾《净蛘咄美w維瘤病毒。適當(dāng)?shù)恼骋毫霾《局臧↙ausanne株(來(lái)自ATCC)、SG33(Mainil，M.D.等人，2000，J.Comp.Pathol.122，p.115-122)、Borghi和Boerlage(Fenner & Fantini，“Biological control of Vertebrate pests”，CABI出版1999，ISBN0851993230和其中的參考文獻(xiàn))。適當(dāng)?shù)耐美w維瘤病毒株包括Original A株(ATCC，編號(hào)VR-112)和Kasza株(ATCC，編號(hào)VR-364)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的活的重組野兔痘病毒來(lái)自于粘液瘤病毒。由于它的宿主限于兔類動(dòng)物，在非兔類宿主中野兔痘沒有病毒性。不過(guò)，優(yōu)選用減毒的野兔痘病毒生成本發(fā)明的活的重組病毒。對(duì)于本發(fā)明的目的，減毒的野兔痘病毒被定義為在兔子宿主中能夠進(jìn)行生產(chǎn)性復(fù)制但不會(huì)引發(fā)疾病的野兔痘病毒。通過(guò)病毒株的系列傳代或者刪除一或者多個(gè)非病毒復(fù)制所必需的毒性基因而得到減毒的野兔痘病毒株。在Cameron等Virology 264，p.298-318(1999)中公布了野兔痘病毒的基因組完整DNA序列、它的基因組結(jié)構(gòu)和所有開放閱讀框架(ORF’s)的位置。Willer等人在Virology 264，p.319-343，(1999)中公布了兔纖維瘤病毒基因組的完整DNA序列、它基因組結(jié)構(gòu)和所有開放閱讀框架(ORF’s)的位置。
根據(jù)本發(fā)明的外源DNA優(yōu)選插入到野兔痘基因組的非必需基因區(qū)域。更優(yōu)選，外源DNA插入的野兔痘基因組的非必需基因區(qū)域涉及野兔痘病毒的毒性。粘液瘤病毒基因組或者兔纖維瘤病毒基因組的適當(dāng)?shù)姆潜匦杌騾^(qū)域是編碼胸腺嘧啶脫氧核苷激酶的TK基因、M11LORF、SERP-1、-2、和-3ORF和MGF ORF(Cameron等，1999，見上文；Willer等，1999，見上文)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)插入外源DNA和啟動(dòng)子刪除一或者多個(gè)非必需病毒基因。特別優(yōu)選至少刪除MGF ORF的一部分，因?yàn)檫@個(gè)ORF編碼毒性因子而且不是病毒在體內(nèi)或者體外生長(zhǎng)所必需的基因(Graham等，Virology191，pp.112-124，1992)。刪除MGF ORF造成野兔痘病毒的毒性降低。
根據(jù)本發(fā)明的活的、重組野兔痘病毒可采用體內(nèi)重組技術(shù)生產(chǎn)。該技術(shù)將外源DNA以位點(diǎn)特異性的重組插入到野兔痘病毒基因組中。可以采用與生產(chǎn)重組牛痘病毒以及重組禽痘病毒相似的辦法來(lái)制備本發(fā)明涉及的重組病毒(見USP 4.603,112；USP 5,093,258；Guo，P.X；J.Virol.634189-4198(1990)；Mackett等“Construction AndCharacterization of Vaccinia Virus Recombinants ExpressingExogenous Genes”在“ DNA Cloning Volume III”。D.M.Glover，1985，IRL公司出版)。通常情況下，可以采用重組母體野兔痘基因組和攜帶受控于至少一個(gè)表達(dá)元件的外源DNA的DNA載體之間的位點(diǎn)特異性重組來(lái)制備根據(jù)本發(fā)明的活的重組野兔痘病毒。適當(dāng)?shù)倪M(jìn)行位點(diǎn)特異性重組的DNA載體可源自任何含有多克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒。此DNA載體含有的外源DNA至少連接一個(gè)表達(dá)調(diào)控元件，而且其兩邊為病毒DNA序列，后者和野兔痘基因組中要插入外源DNA序列的區(qū)域同源。外源DNA側(cè)翼的病毒DNA序列優(yōu)選選自野兔痘病毒復(fù)制的非必須區(qū)域。用于和野兔痘基因組重組的DNA載體可以另外含有受控于痘病毒啟動(dòng)子的選擇性標(biāo)記基因。此附加的基因和啟動(dòng)子序列也都位于源于野兔痘基因組的病毒DNA序列間。將此DNA載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入已經(jīng)被母體野兔痘病毒感染的宿主細(xì)胞中。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞是能夠被野兔痘病毒感染并且可以被DNA載體轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞。這樣的宿主細(xì)胞實(shí)例有兔腎細(xì)胞LLC-RK1和RK13、兔肺細(xì)胞R9ab、兔皮膚細(xì)胞SF1Ep、DRS和RAB-9、兔角膜細(xì)胞SIRC、兔癌細(xì)胞Oc4T/cc、兔皮膚/癌細(xì)胞CTPS、Vero細(xì)胞，所有細(xì)胞均來(lái)自ATCC。
適于產(chǎn)生本發(fā)明的活的重組野兔痘病毒的適當(dāng)?shù)哪阁w野兔痘病毒是粘液瘤病毒株，如Lausanne株(來(lái)自ATCC)、SG33(Mainil，M.D等，2000，J.Comp.Pathol.122，p.115-122)、Borghi和Boerlage(Fenner & Fantini，“Biological control of Vertebrate Pestes”，CABI出版，1999，ISBN 0851993230和其中的參考文獻(xiàn))和兔纖維瘤病毒株，包括Original A株(ATCC編號(hào)VR-112)和Kasza株(ATCC變化VR-364)。優(yōu)選粘液瘤病毒株用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的活的、重組兔病毒。優(yōu)選，母體野兔痘病毒是減毒的病毒，即在它靶向的兔宿主中能夠進(jìn)行生產(chǎn)性復(fù)制但是不會(huì)引發(fā)疾病。通過(guò)病毒株的系列傳代或者刪除一或者多個(gè)病毒復(fù)制所非必需的毒性基因可以得到減毒的野兔痘病毒株(完整的基因組序列和基因位置參見Cameron等1999，見上文，和Willer等，1999，見上文。)。
在DNA載體上的野兔痘DNA序列和母體野兔痘基因組的相應(yīng)DNA間重組的過(guò)程中病毒可以在宿主中復(fù)制。此重組導(dǎo)致連接表達(dá)調(diào)控元件的外源DNA插入在野兔痘基因組中。用本領(lǐng)域內(nèi)公知的標(biāo)準(zhǔn)選擇和篩選方法選擇和純化此重組野兔痘病毒，包括用和該外源DNA同源的探針雜交檢測(cè)整合的外源DNA、檢測(cè)和外源DNA共整合的選擇性標(biāo)記的表達(dá)、和檢測(cè)已經(jīng)整合外源DNA后被刪除的野兔痘基因的表達(dá)產(chǎn)物的缺失?？捎镁酆厦告湻磻?yīng)分析證實(shí)重組野兔痘病毒基因組中的外源DNA的插入。
根據(jù)本發(fā)明的重組野兔痘病毒載體尤其適合用作非兔類動(dòng)物的免疫試劑，因?yàn)榭乖谋磉_(dá)水平在體內(nèi)足以達(dá)到免疫宿主的效果。由于其受限制的宿主范圍，此病毒在非兔宿主中是減毒的，因此不存在野兔痘病毒引發(fā)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。這種宿主限制性更有助于防止本發(fā)明的野兔痘病毒在疫苗接種非靶向的宿主間的擴(kuò)散。這樣，在進(jìn)一步的實(shí)施方案中本發(fā)明提供藥物組合物，更優(yōu)選含有可藥用載體及活的含外源DNA的重組野兔痘病毒的疫苗，此外源DNA操作性連接至少一個(gè)表達(dá)控制元件并且被整合到病毒基因組的非必須區(qū)域中。此外源DNA至少編碼了一種引起非兔類動(dòng)物感染性疾病的病原體抗原。根據(jù)本發(fā)明的疫苗優(yōu)選含有可藥用載體和至少能夠表達(dá)一種非兔病原體的免疫原性蛋白的活的重組粘液瘤病毒。根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)一或者多種免疫原性蛋白的重組野兔痘病毒尤其適合生產(chǎn)多價(jià)疫苗。
可以按照下列標(biāo)準(zhǔn)方法制備根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物。重組野兔痘病毒可以在允許這種病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)，如兔腎細(xì)胞LLC-RK1和RK13、兔肺細(xì)胞R9ab、兔皮膚細(xì)胞SF1Ep、DRS和RAB-9、兔角膜細(xì)胞SIRC、兔癌細(xì)胞Oc4T/cc、兔皮膚/癌細(xì)胞CTPS、Vero細(xì)胞，所有細(xì)胞都來(lái)自于ATCC?？梢酝ㄟ^(guò)收集組織細(xì)胞培養(yǎng)液和/或細(xì)胞獲得如此生長(zhǎng)的病毒?；蛘?，在收獲病毒時(shí)可以采用促進(jìn)感染性顆粒從生長(zhǎng)底物中釋放的技術(shù)來(lái)提高病毒的產(chǎn)量，例如超聲破碎和凍融。活疫苗可以制備成懸浮液或者凍干粉的形式。
適用于根據(jù)本發(fā)明的疫苗的可藥用載體包括無(wú)菌水、鹽、水緩沖液，如PBS等。另外，根據(jù)本發(fā)明的疫苗中可以含有其它添加劑，如佐劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑等。
適宜的穩(wěn)定劑如碳水化合物，包括山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、右旋糖酐和葡萄糖、蛋白質(zhì)及其降解物，包括但不限于白蛋白和酪蛋白、含蛋白制劑，如牛血清或者脫脂奶，和緩沖液，包括但不限于堿性金屬磷酸鹽。在凍干的疫苗組合物中優(yōu)選加入一或者多種穩(wěn)定劑。
適當(dāng)?shù)淖魟┌ǖ幌抻跉溲趸X、磷酸鹽或氧化物、白榴石(amphigen)、維生素E、單磷酸脂A(monophosphenyl lipid A)、胞壁酰二肽、油類乳劑、葡聚糖、卡波姆、嵌段共聚物、細(xì)胞因子和皂角苷如Quil A。佐劑的添加量取決于佐劑本身的特性。細(xì)胞因子如INFγ、IL-12、IL18非常適合用于根據(jù)本發(fā)明的疫苗。
優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的重組野兔痘病毒采用胃腸外給藥途徑對(duì)非兔類動(dòng)物進(jìn)行給藥，包括但不限于肌內(nèi)、皮內(nèi)或皮下途徑給藥?；蛘?，該疫苗可以經(jīng)過(guò)腸道途徑給藥，例如口服、噴霧、眼內(nèi)、鼻內(nèi)或者in ovo給藥。
通常，根據(jù)本發(fā)明的重組野兔痘病毒以有效誘導(dǎo)外源蛋白足夠的表達(dá)水平的量給藥。該劑量通常取決于給藥途徑、給藥時(shí)間，以及接種動(dòng)物的年齡、健康狀況和飲食情況。這種重組野兔痘病毒可以102-1011pfu/每個(gè)受試者的劑量給藥，優(yōu)選104-109pfu/每個(gè)受試者的劑量，更優(yōu)選106-107pfu/每個(gè)受試者的劑量(pfu是嗜菌斑形成單位)。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以同時(shí)或伴隨其它活的或者滅活的疫苗給藥。這些復(fù)合疫苗可以經(jīng)腸道或胃腸外給藥。優(yōu)選推薦復(fù)合疫苗胃腸外給藥。
下面用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行闡述，并不限制本發(fā)明于所述的特定


圖1中間質(zhì)粒pVL和pVEL.的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的圖示。RHD表示兔出血病毒的cDNA。ab(5’)和cd(3’)表示粘液瘤病毒MGF側(cè)翼區(qū)域。啟動(dòng)子分別表示合成的晚期或者早期/晚期啟動(dòng)子。“mcs”表示含有用于導(dǎo)入外源DNA的多克隆位點(diǎn)的核酸序列。
圖2在pVL、pVEL基礎(chǔ)上構(gòu)建的多種重組DNA質(zhì)粒。P表示合成晚期(pVL)或者早期/晚期(pVEL)啟動(dòng)子區(qū)域。ab(5’)和cd(3’)表示粘液瘤病毒MGF側(cè)翼區(qū)域。RHDV Vp60表示RHDV Vp60蛋白的編碼基因。FeLV gp85表示貓白血病病毒env基因。FCV Vp60表示貓杯狀病毒衣殼蛋白的編碼基因。FPL Vp2表示貓傳染性粒細(xì)胞缺乏癥病毒vp2基因，CPV VP2表示犬細(xì)小病毒vp2基因。GFP表示綠色熒光蛋白的編碼基因。所有的質(zhì)粒含有Ampr選擇性標(biāo)記(未顯示)。
實(shí)施例實(shí)施例1中間DNA質(zhì)粒pVL和pVEL的制備該步驟中的起始質(zhì)粒是商品質(zhì)粒pCITE2-b(Novagen公司)，在載體的Sall和Hincll位點(diǎn)之間插入了兔出血病病毒的cDNA(MeyersG.等人，1991，Virology 184，p.664-676)。該質(zhì)粒被命名為pCITE/RHD.
第一步是導(dǎo)入MGF側(cè)翼序列。用myx a和myx b PCR引物擴(kuò)增5’端側(cè)翼序列。
myx a5’TTCTCGGAAGTCATACGGTATT3’(第1號(hào)序列)myx b5’CATGCCAATGGCACATAAGAGAGTTGCGACTAGGTC3’(第2號(hào)序列)用2μl MR24的組織培養(yǎng)物(106pfu ml-1)作為PCR反應(yīng)的模板，按照生產(chǎn)商提供的說(shuō)明用PCR珠(Pharmacia公司)進(jìn)行PCR反應(yīng)。用標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)室方法將PCR NcoI/平末端片段克隆到pCITE/RHD中。首先用KpnI消化，接著用T4DNA聚合酶進(jìn)行末端補(bǔ)平，然后用NcoI進(jìn)行消化，得到pCITE/RHD。最終質(zhì)粒稱為pCITE/RHDab。
用下述引物，對(duì)相同的模板制備物進(jìn)行第二個(gè)PCR反應(yīng)來(lái)制備3’側(cè)翼序列。所用的引物的序列為myx c5’CGGCTCGAGCTAATTACCATTAAGTAACCCGTTT TACA3’(第3號(hào)序列)XhoIMyx d5’GCTCTAGATATATCGTGTACGTAGTTCCCAAA AC3’(第4號(hào)序列)XbaI這個(gè)PCR片段作為XhoI/XbaI片段克隆到XhoI/XbaI酶切的pCITE/RHDab中。最終得到的質(zhì)粒命名為pCITE/RHDabcd。
之后通過(guò)雜交下面的寡核苷酸合成痘病毒啟動(dòng)子。
Vp35’CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGATCTTAAATGCC3’(第5號(hào)序列)Vp45’CATGGGCATTTAAGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGTA 3’(第6號(hào)序列)這2個(gè)互補(bǔ)的寡核苷酸一起退火形成與KpnI和NcoI限制性酶切位點(diǎn)兼容的粘性末端。同樣，下面的2個(gè)寡核苷酸也可以一起退火形成KpnI/NcoI的兼容片段。
Vp55’CAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAC 3’(第7號(hào)序列)Vp65’CATGGTATTTATATTCCAAAAAAAAAAAATAAAATTTCAATTTTTGGTAC3’(第8號(hào)序列)Vp5和Vp6一起組成一個(gè)早期/晚期啟動(dòng)子，同時(shí)Vp3和Vp4組成一個(gè)晚期啟動(dòng)子(Chakrabarti等人，Biotechniques 23，p.1094-1097，1997)。然后，將一個(gè)或者另外一個(gè)退火的寡核苷酸對(duì)克隆到KpnI/NcoI酶切的pCITE/RHDabcd中，產(chǎn)生pVP/RHD(晚期啟動(dòng)子)或者pEL/RHD(早晚期啟動(dòng)子)。因?yàn)樵跇?gòu)建好的兩個(gè)載體(pVP/RHD和pEL/RHD)中，RHD衣殼基因的閱讀框與第一個(gè)甲硫氨酸不相符合，因此必須對(duì)RHD衣殼基因(Vp60)進(jìn)行再克隆，并移去介于中間的序列以便獲得表達(dá)。用NcoI和EcoRI酶切質(zhì)粒pVP/RHD和pEL/RHD，移去Vp60編碼序列和起始ATG 5’端的非編碼序列。用下面的寡核苷酸擴(kuò)增產(chǎn)生的PCR擴(kuò)增片段置換Vp60基因。
5’GCTCCATGGAGGGCAAAGCCCGTG 3’(第9號(hào)序列)5’TTGCTCAGGACACCGGCACCTGC3’(第10號(hào)序列)PCR反應(yīng)的模板是pCITE/RHD。用NcoI和EcoRI酶切PCR擴(kuò)增片段，將其克隆到已經(jīng)制備的pVP/RHD和pEL/RHD中。最終得到的質(zhì)粒分別命名為pVP/Vp60和pEL/Vp60。為了引入在其側(cè)翼有其它限制性酶切位點(diǎn)的基因，在pVP/Vp60和pEL/Vp60中單一的NcoI酶切位點(diǎn)的下游導(dǎo)入多克隆位點(diǎn)。下面的寡核苷酸序列mcsA5’CATGGATCGATGTCGACGGATCCACTAGTGAATTCACGCGTC3’(第11號(hào)序列)mcsB5’TCGAGACGCGTGAATTCACTAGTGGATCCGTCGACATCGATC3’(第12號(hào)序列)退火形成交疊末端，該與NcoI和XhoI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)兼容。用退火形成的寡核苷酸置換含有全部RHD相關(guān)序列的NcoI/XhoI片段，最終形成2個(gè)質(zhì)粒pVL和pVEL(見圖1)。
pVL和pVEL質(zhì)粒用于構(gòu)建含有下述基因的多種重組DNA兔出血病衣殼蛋白VP60(Meyers等.1991，見上文)、綠色熒光蛋白(Clonetech Laboratories公司，美國(guó)加利福尼亞Palo Alto)貓白血病包膜糖蛋白gp85(Stewart等，1986，J.Virol 58，p.825-834)、貓白血病基質(zhì)(gag)蛋白(Donahue等，1988，J.Virol 62，p.722-731)、貓杯狀病毒衣殼蛋白(GenBank登錄號(hào)Z11536和NC001481)、貓傳染性粒細(xì)胞缺乏癥病毒衣殼蛋白VP2(Carlson J.等1985，J.Virol.55，p.574-582)、犬細(xì)小病毒衣殼蛋白VP2(Reed P等，1988，J.Virol.62，p.266-276)。表1列出了已構(gòu)建的用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的重組粘液瘤病毒的多種DNA質(zhì)粒。每一個(gè)重組質(zhì)粒都采用的同樣的構(gòu)建方法。靶基因來(lái)自現(xiàn)有質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物或者為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，這樣在該基因的末端具有和pVL或者pVEL的mcs相兼容的限制性酶切位點(diǎn)。
pVLGFP DNA質(zhì)粒的制備含有GFP基因的質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)加利福尼亞Palo Alto的Clonetech laboratories公司，用NcoI和EcoRI從質(zhì)粒中酶切得到GFP基因。將該基因插入到pVL中得到pVLGFP。
pVELFeLVenv DNA質(zhì)粒的制備用下述寡核苷酸從pFGA5(Stewart等，1986見上文)中PCR擴(kuò)增包膜基因。
5’CACATC GATTGA TGG AAA GTC CAA CGC 3’(第13號(hào)序列)ClaI5’TGG AAT TCA TGG TCG GTC CGG ATC GTA 3’(第14號(hào)序列)EcoRI用ClaI和EcoRI酶切PCR片段并將其插入到pVEL中得到pVELFeL Venv。
pVELFPL DNA質(zhì)粒的制備用下述引物從復(fù)制型(rf)DNA中PCR擴(kuò)增得到FPL衣殼基因。
5’CACATCGATTGATGAGTGATGGAGCAG3’(第15號(hào)序列)5’CGGGAATTCTAGGTGCTAGTTGATATG 3’(第16號(hào)序列)按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Reed，P.等.1988，J.Virol.62，p.266-276)從FPL疫苗株感染的貓腎細(xì)胞(CRFK)中制備得到rfDNA。
pVELFCV DNA質(zhì)粒的制備用FCV F9株按照每個(gè)細(xì)胞0.1pfu的數(shù)量感染貓腎細(xì)胞(CRFK)。36小時(shí)后收集細(xì)胞并用異硫氰酸胍(TRIzol試劑GibCoBRL)制備總RNA。用寡聚T引物合成cDNA的第一鏈(SuperScript ChoiceGibClBRL)。已經(jīng)報(bào)道了FCV的F9株的完整核酸序列和基因組組織結(jié)構(gòu)(GenBank登錄號(hào)M86379)。合成寡核苷酸作為第二條DNA鏈合成的引物，隨后PCR擴(kuò)增衣殼基因。下述寡核苷酸用來(lái)產(chǎn)生FCV的Vp60衣殼蛋白基因(F9株)
5’GGATCGATGCGCGGATGACGGGTCAATC3’(第17號(hào)序列)ClaI5’GGGGACTAGTATTCATAACTTAGTCATGGG 3’(第18號(hào)序列)SpeI將Vp60衣殼基因插入到pVL和pVEL的mcs中分別得到pVLFCV和pVELFCV。
pVELCPV DNA質(zhì)粒的制備從Nobivac Parvo的CPV疫苗株中PCR擴(kuò)增得到編碼衣殼蛋白VP2的基因，用NcoI和EcoRI酶切并將其插入到pVEL中。
實(shí)施例2重組粘液瘤病毒的制備選用在兔腎細(xì)胞(RK13)中長(zhǎng)期傳代而減毒的非病原性粘液瘤病毒(命名為MR24)。當(dāng)經(jīng)皮下、皮內(nèi)或者肌內(nèi)途徑對(duì)兔子進(jìn)行給藥時(shí)，該減毒粘液瘤病毒(MR24)表現(xiàn)無(wú)病原性(0％致死率)。MR24是用于兔子的粘液瘤疫苗候選株。所有病毒的滴度和擴(kuò)增在兔腎細(xì)胞(RK-13)中進(jìn)行測(cè)定。
用下面所述的構(gòu)建重組疫苗病毒的方法生產(chǎn)重組粘液瘤病毒(Mackett等.1985，見上文)。按照每個(gè)細(xì)胞0.1pfu的數(shù)量用粘液瘤病毒MR24感染兔子腎細(xì)胞(RK13)。2小時(shí)后用脂轉(zhuǎn)染胺試劑(GibCoBRL)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染。采用有限稀釋和鑒定免疫熒光的方法對(duì)重組病毒進(jìn)行篩選。
轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，對(duì)感染/轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行3次凍融以便釋放病毒。用組織培養(yǎng)基對(duì)野生型和重組病毒的初級(jí)混合物進(jìn)行50倍稀釋，然后用10μl病毒混合物感染事先接種有RK13細(xì)胞的96孔板。孵育該96孔平板72小時(shí)，以便完成病毒感染和增殖過(guò)程。之后對(duì)平板進(jìn)行3次凍融處理，同時(shí)保證平板的每個(gè)孔的單獨(dú)狀態(tài)。以此作為第一輪的主板(master plate)。之后，從每個(gè)孔中取出5μl含有培養(yǎng)基的病毒加到接種有RK13細(xì)胞的相同的96孔培養(yǎng)板中。48小時(shí)后，副本平板用冰冷的甲醇固定，并用免疫熒光篩選重組蛋白表達(dá)的平板。
例如按照下述方法篩選pVELFeLVenv感染和轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表達(dá)FeLV包膜蛋白的細(xì)胞將小鼠單克隆抗體3-17的腹水(EuropeanVeterinary Laboratory，Woerden荷蘭)稀釋1000倍，然后添加到固定的96孔板每個(gè)孔中，在37℃孵育1小時(shí)。然后用PBS洗滌平板5次，并和FITC標(biāo)記的兔抗小鼠IgG(Sigma Chemical Co)共同孵育1小時(shí)。最后用PBS洗滌平板5次并且用熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。辨認(rèn)并記錄因感染而產(chǎn)生熒光點(diǎn)的孔。由第一輪主板相應(yīng)的孔稀釋到更多接種RK-13細(xì)胞的96孔板中，該板成為第二輪主板。連續(xù)進(jìn)行該逐步富集步驟直到重組病毒占總病毒的20-50％為止。按照同樣的方法對(duì)其它重組粘液瘤病毒的重組蛋白的表達(dá)進(jìn)行篩選。
表1DNA質(zhì)粒和相應(yīng)的重組粘液瘤病毒

最后通過(guò)從瓊脂覆蓋培養(yǎng)基中挑選單個(gè)的感染點(diǎn)來(lái)純化重組子。
實(shí)施例3雞中的myxo/RHD檢測(cè)非兔類動(dòng)物感染重組粘液瘤病毒是否可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體反應(yīng)。以皮下或者肌內(nèi)途徑用myxo/RHD免疫小雞。在接種日程第0天和第14天，雞接種105pfu的病毒。在第0天、第14天以及第28天取得血樣，分析其中針對(duì)RHDV的抗體。結(jié)果如表2所示。在整個(gè)試驗(yàn)中所有雞的臨床表現(xiàn)都正常。
表2在雞中孵育myxo/RHD的結(jié)果。用能夠抑制4個(gè)單位的RHDV純抗原引起的兔血紅細(xì)胞凝集的免疫血清的稀釋倍數(shù)的倒數(shù)表示抗體水平。

實(shí)施例4在貓中的Myxo FCV建立實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)粘液瘤/貓杯狀病毒衣殼重組病毒(myxo/FCV)誘導(dǎo)中和性抗體并且預(yù)防毒性貓杯狀病毒感染的有效性。用5×106點(diǎn)形成單位(ffu)的myxo/FCV對(duì)一組的4只貓進(jìn)行皮下免疫(組1)，在第一次免疫后的第3周進(jìn)行重復(fù)免疫。4只未接種疫苗的對(duì)照動(dòng)物(組2)和檢測(cè)動(dòng)物一起圈養(yǎng)(Housed)。在2次免疫4周后，用105.3TCID50的毒性貓杯狀病毒株對(duì)所有貓進(jìn)行鼻腔內(nèi)攻擊。每個(gè)鼻孔滴入0.5ml攻擊病毒。
表3試驗(yàn)安排

在試驗(yàn)開始時(shí)進(jìn)行鼻拭取樣檢測(cè)是為了確保沒有動(dòng)物在口咽部位存在貓杯狀病毒。與此相似，采血確保沒有動(dòng)物在開始試驗(yàn)前有抗FCV抗體。在免疫攻擊后進(jìn)行鼻拭取樣來(lái)檢測(cè)分泌的病毒。
試驗(yàn)中得到的血樣用于病毒中和性分析。這些分析可以檢測(cè)貓?bào)w內(nèi)循環(huán)中的抗體水平。已知在恢復(fù)期動(dòng)物體內(nèi)出現(xiàn)含有血清中和性抗體，并且作為疫苗接種效果所提供的已經(jīng)存在的中和性抗體有助于對(duì)疾病的防護(hù)(Hohdatsu等。1999 J.Vet.Med.Sci.61，299-301)。
表4用myxo/FCV(MS0013)對(duì)貓接種的結(jié)果(血清中和效價(jià))。該數(shù)據(jù)表明獲得病毒中和效果的最大的血清稀釋度。接種疫苗前的血樣(前血)中沒有針對(duì)FCV的抗體。在體外，稀釋1-4倍的血清顯示體外對(duì)病毒生長(zhǎng)的非特異性抑制作用。

*所用臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)是歐洲藥典中對(duì)貓杯狀病毒疫苗生產(chǎn)所限定的(1996年6月第3版，ISBN92-871-2991-6)。其要求臨床分值顯著低于對(duì)照的疫苗符合測(cè)試。在這項(xiàng)研究中，與對(duì)照組的34相比，疫苗接種組的臨床平均分值是4.5。
比較myxo-FCV疫苗接種(表4)和常規(guī)疫苗接種(表5)的結(jié)果，可以清楚的看到第一次疫苗接種后組1動(dòng)物的抗體反應(yīng)與接種2倍劑量多種商品疫苗的動(dòng)物相當(dāng)。這表明這些貓被防護(hù)于這些疾病。二次疫苗接種后抗體的滴度明顯超過(guò)了商品疫苗產(chǎn)生的效果(Hohdatsu等，1999 J.Vet.Med.Sci.61，299-301，DeSilver等，1997，1stInt.Symp.杯狀病毒ESVV 131-143)。
表5商品FCV疫苗免疫血清對(duì)FCV株*的中和性抗體滴度免疫血清FCV 疫苗A 疫苗B 疫苗C 疫苗D分離物 #20a)#C3#C1#C4#C2#C5#C6 #A7F4 20b)80 10 5 5 5 160 20F9 16016064040 10 10 160 320255 10 20 20 5 ＜5＜5640 ＞64091-1＜5＜5＜5＜5＜5＜5＜5 ＜5a)血清數(shù)量b)中和滴度*來(lái)自Hohdatsu等(1998)據(jù)Yokoyama等(1998)報(bào)道，在免疫攻擊前，表達(dá)FCV抗原的貓皰疹病毒載體也誘導(dǎo)產(chǎn)生很低滴度的血清中和性抗體(在2.5和3.0區(qū)域)。
參考文獻(xiàn)Hohdatsu T，Sato K，Tajima T和Koyama H。商品貓杯狀病毒(FCV)疫苗免疫血清針對(duì)FCV視野分離物的中和性特性J Vet MedSci 1999；61299-301。
Yokoyama N，F(xiàn)ujita K，Damiani等。表達(dá)貓杯狀病毒免疫原性抗原的重組貓herepesvirus 1型載體的進(jìn)一步開發(fā)。J of Vet Med Sci1998；60717-723。
Reed LJ和Meunch H。估測(cè)50％終點(diǎn)的簡(jiǎn)單方法。Am J Hygiene1938；27493-497。
實(shí)施例5用Myxo/FCV在豬和牛中進(jìn)行中和試驗(yàn)通過(guò)皮內(nèi)和肌內(nèi)注射途徑給藥，在牛和豬中檢測(cè)粘液瘤病毒作為真核表達(dá)載體在非天然宿主中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的適用性。
在小牛和豬中使用含有編碼成熟型衣殼抗原的貓杯狀病毒基因片段的粘液瘤病毒載體。這個(gè)試驗(yàn)的2個(gè)組中分別為12周齡的4頭小牛和6周齡的4頭豬。
在開始試驗(yàn)前1周采集血樣(10ml/動(dòng)物)，檢測(cè)動(dòng)物是否對(duì)貓杯狀病毒呈血清陰性。之后，按照1ml PBS含有1×108FFU重組粘液瘤病毒/注射途徑/動(dòng)物對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行皮下或者肌內(nèi)注射。每種動(dòng)物作為一組進(jìn)行圈養(yǎng)。4周后，采集血樣(10ml/動(dòng)物)，并且按照相同劑量，即1ml PBS含有1×108FFU重組粘液瘤病毒/注射途徑/動(dòng)物，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行皮下或者肌內(nèi)再次注射。上次注射后2周，采集血樣(10ml/動(dòng)物)，并且按照GMO體內(nèi)試驗(yàn)的指導(dǎo)原則處死動(dòng)物。采集的血樣在體外通過(guò)病毒中和分析的方法檢測(cè)是否出現(xiàn)了針對(duì)杯狀病毒的抗體。
表6.試驗(yàn)設(shè)計(jì)和時(shí)間框架每組含有4頭豬或者4頭牛

FCV血清中和試驗(yàn)的方法在CrFK細(xì)胞中利用c.p.e.進(jìn)行血清中和性分析。二百TCID50的病毒的5倍復(fù)制產(chǎn)物和血清系列稀釋物(開始1∶4)混合，終體積為600μl。在37℃條件下，于5ml無(wú)菌稀釋管中孵育病毒/血清混合物60分鐘。將100μl檢測(cè)混合物添加到96孔組織培養(yǎng)板中，該培養(yǎng)板的孔中已經(jīng)有100μl培養(yǎng)基，其中接種有CrFK細(xì)胞。繼續(xù)孵育5天，根據(jù)Reed和Meunch[1]的方法計(jì)算TCID50的值。
Reed，L.J.，和Meuch.1938.估測(cè)50％終點(diǎn)的簡(jiǎn)單方法。Am JHygiene 1938；27493-497。
表7FMD004試驗(yàn)，免疫血清中針對(duì)FCV的Sns的結(jié)果

實(shí)施例6粘液瘤病毒在多種類型細(xì)胞中的體外生長(zhǎng)用由2種不同的粘液瘤病毒株構(gòu)建的表達(dá)綠色熒光蛋白的重組粘液瘤病毒感染細(xì)胞。根據(jù)隨時(shí)間顯示熒光的細(xì)胞數(shù)目的增多來(lái)分析細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。
當(dāng)myxo/GFP重組病毒添加到培養(yǎng)的多種類型的細(xì)胞中時(shí)，可以觀察到熒光，結(jié)果列在表8中。這表明這種病毒能夠進(jìn)入非兔細(xì)胞并且在其中表達(dá)GFP基因。表8表明在某些類型細(xì)胞中，病毒能在體外生長(zhǎng)。并且，對(duì)于所檢測(cè)的2個(gè)構(gòu)建產(chǎn)物，表現(xiàn)出的模式不同。
表8粘液瘤病毒在多種類型的細(xì)胞中的生長(zhǎng)細(xì)胞類型 生長(zhǎng)MS20-10MR24兔腎細(xì)胞(Rk-13) ++++ ++++非洲猴腎細(xì)胞(Vero)++++ ++++牛胚肺細(xì)胞(BEL) + +貓胚成纖維細(xì)胞(FeF) + -雞胚成纖維細(xì)胞(CEF) + -犬腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)72 - -實(shí)施例8對(duì)犬細(xì)小病毒疫苗的反應(yīng)的ELISA檢測(cè)為了檢測(cè)用表達(dá)犬細(xì)小病毒衣殼蛋白Vp2的重組粘液瘤病毒接種狗誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，進(jìn)行了ELISA方法。對(duì)這種疫苗接種的反應(yīng)和傳統(tǒng)疫苗接種產(chǎn)生的反應(yīng)做了比較。
材料和方法材料TBS(50mM Tris緩沖鹽溶液)50mM Tris-鹽緩沖液，pH7.56.35g Tris-HCl1.18g Tris堿8.77g NaCl800ml dH2O調(diào)節(jié)pH到7.5并且用dH2O定容到1L。
TBS-Tween按照上述方法制備TBS，然后添加0.5mL TWEEN 20，充分混和。
方法1.抗CPV單克隆抗體重懸在0.1M Na2CO3緩沖液中，pH9.6，濃度為5-10μg/ml。在40℃孵育ELISA平板過(guò)夜，每孔中加入100μl抗體懸液。
2.甩去除過(guò)剩的抗原包被液，每孔加入200μl含有1％BSA和2％干奶粉的TBS溶液封閉殘留的結(jié)合位點(diǎn)，室溫放置1小時(shí)。
3.甩去除封閉液，每孔再加入100μl含有滴度為約107p.f.u.ml-1犬細(xì)小病毒的組織培養(yǎng)液上清。室溫孵育1-2小時(shí)。
4.用TBS-Tween洗滌平板4次。
5.用TBS系列稀釋血清。ELISA平板的孔中加入100μl這些稀釋液，室溫繼續(xù)孵育1-2小時(shí)。
6.隨后，用TBS-Tween洗滌平板4次。
7. 按照操作說(shuō)明，加入偶聯(lián)堿性磷酸酶的抗犬二抗(如ICNbiomedical Research Products貨號(hào)675071)稀釋物，室溫孵育1-2小時(shí)。
8.用TBS-Tween洗滌平板4次。
9.添加底物PNPP(p-硝基苯磷酸鹽如SIGMA化學(xué)公司序列號(hào)為N2770)進(jìn)行ELISA顯色。
10.用分光光度計(jì)讀取420nm的光吸收值。
結(jié)果如表9所示。
表9對(duì)CPV反應(yīng)的ELISA檢測(cè)結(jié)果

ELISA結(jié)果清楚的表明來(lái)自傳統(tǒng)疫苗接種的犬的血清1∶40稀釋度導(dǎo)致背景水平的光吸收，即和未接種疫苗的犬免疫血清一樣。與此相對(duì)應(yīng)，用myxoma-CPV(Vp2)接種的犬的免疫血清稀釋度為1∶1280時(shí)吸光值和背景水平一致。
權(quán)利要求
1.含有外源DNA的活的重組野兔痘病毒在制備治療或預(yù)防非兔類動(dòng)物的感染性疾病的載體疫苗中的用途，此外源DNA操作性連接至少一個(gè)表達(dá)控制元件并且被整合到病毒基因組的非必須區(qū)域中。
2.根據(jù)權(quán)利要求的1的病毒的用途，其用于制備治療或預(yù)防貓或者犬的感染性疾病的載體疫苗。
3.含藥學(xué)可接受的載體和活的含有外源DNA的重組野兔痘病毒的疫苗，此外源DNA操作性連接至少一個(gè)表達(dá)控制元件并且被整合到病毒基因組的非必須區(qū)域中，并且此外源DNA至少編碼一種在非兔類中產(chǎn)生感染性疾病的病原體抗原。
4.含有外源DNA的活的重組野兔痘病毒，此外源DNA操作性連接至少一個(gè)表達(dá)控制元件并且被整合到病毒基因組的非必須區(qū)域中，其特征在于此外源DNA編碼至少一種非兔類病原體的抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的病毒，其特征在于此野兔痘病毒是粘液瘤病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或者5的病毒，其特征在于該外源DNA編碼至少一種貓或者犬病原體的抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或者5的病毒，其特征在于該外源DNA編碼至少一種貓或者犬病毒的抗原。
8.根據(jù)權(quán)利要求4到7的病毒，其特征在于該外源DNA編碼貓白血病病毒(FeLV)的包膜蛋白、貓杯狀病毒(FCV)衣殼蛋白、貓傳染性粒細(xì)胞缺乏癥病毒(FPL)VP2蛋白，和/或犬細(xì)小病毒(CPV)VP2。
9.權(quán)利要求4到8的病毒，其特征在于該外源DNA和表達(dá)調(diào)控元件插入到病毒基因組的MGF ORF中。
10.權(quán)利要求4到9的病毒，其特征在于操作性連接于外源DNA的表達(dá)調(diào)控元件是合成的痘病毒啟動(dòng)子。
11.權(quán)利要求10的病毒，其特征在于該啟動(dòng)子是早期/晚期啟動(dòng)子。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有外源DNA的活的、重組野兔痘病毒在制備用于治療或預(yù)防非兔種動(dòng)物的感染性疾病的載體疫苗中的用途。此外源DNA操作性連接至少一個(gè)表達(dá)控制元件并且被整合到病毒基因組的非必須區(qū)域中。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有外源DNA的活的、重組野兔痘病毒的用途，此外源DNA操作性連接至少一個(gè)表達(dá)控制元件并且被整合到病毒基因組的非必須區(qū)域中，其特征在于此外源DNA編碼至少一個(gè)非兔種病原體的抗原。因其宿主范圍有限，此重組野兔痘病毒在如非兔種脊椎動(dòng)物等非易感宿主中不致病。用此重組野兔痘病毒接種可在接種疫苗的非兔種宿主中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原性或者免疫原性反應(yīng)，即使在宿主中未觀察到該病毒的生產(chǎn)性復(fù)制。
文檔編號(hào)C12N15/86GK1527883SQ02806102
公開日2004年9月8日 申請(qǐng)日期2002年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月8日
發(fā)明者N·斯皮貝, N 斯皮貝 申請(qǐng)人:阿克佐諾貝爾公司