專利名稱：不動桿菌及采用該菌種拆分制備手性環(huán)戊烯酮的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物化工領域，涉及一種不動桿菌以及采用該微生物催化拆分制備手性化合物對映異構體的方法，特別涉及拆分制備環(huán)戊烯酮型手性醇對映體的方法。
除蟲菊酯及擬除蟲菊酯是一類多功能的家用或農用殺蟲劑。天然的除蟲菊酯來源于菊花的花蕊，它在陽光和空氣中極不穩(wěn)定；現(xiàn)在所用的殺蟲劑一般為人工合成的擬除蟲菊酯，有很多品種，如丙炔菊酯、丙烯菊酯、甲基丙炔菊酯、甲氰菊酯、氯菊酯、溴氰菊酯、氟氯氰菊酯等。(S)-烯丙醇酮是制備丙烯菊酯(allethrin)殺蟲劑的重要中間體，丙烯菊酯(allethrin)殺蟲劑的全名為(R，S)-3-烯丙基-2-甲基-4-氧代環(huán)戊-2-烯基(R，S)-順，反-2，2-二甲基-3-(2-甲基-1-丙烯基)環(huán)丙烷羧酸酯。另一種中間體菊酸有幾何及光學異構體，共有四個立體異構體。據(jù)報道，法國羅素-優(yōu)克福公司在1967年將(1R，3R)-反式菊酸與(S，R)-烯丙醇酮反應得到生物烯丙醇酮(bioallethrin)。70年代法國羅素-優(yōu)克福公司又以(1R，3R)-反式菊酸與含(S)-體為主要成份的烯丙醇酮反應得到了ES-生物菊酯(esbiothrin)。該酯中的烯丙醇酮組分S與R異構體之比72∶21。1972年Rauch等研制了(1R，3R)-反式菊酸與S-烯丙醇酮反應得到S-生物丙烯菊酯(S-bioallethrin)。在合成菊酯時所用S-烯丙醇酮的比例越高，產品的相對效力就越高。因此，開發(fā)S-烯丙醇酮可大大提高產品的殺蟲活性，降低用藥量。關于S-烯丙醇酮的合成，歸納起來主要有以下幾種方法(1)不對稱合成法此法以雙萘酚化鋰鋁作還原劑，以環(huán)烯(1，3)二酮為原料，直接合成單一構型的烯丙醇酮，此法所得產品光學純度高，但所用還原劑制備很難，故難以大規(guī)模生產。
(2)化學拆分法此法以(1R，4R，5S)-4-羥基-6，6-二甲基-3-氧雜雙環(huán)(3，1，0)環(huán)己烷-2-酮為拆分劑，與外消旋的烯丙醇酮形成醚對映體，再經分離，分別水解后制得R和S構型的烯丙醇酮。此法合成路線復雜，總收率低，不易制得，因而產品的生產成本很高。
(3)酶促拆分法由于不對稱合成法及化學拆分法的不完善性，使得人們開始考慮使用酶催化法拆分烯丙醇酮的外消旋體。美國專利USPatent No.4571436(1986)報道了日本住友公司從商品酶中篩選得到一種烯丙醇酮醋酸酯水解酶，該酶優(yōu)先水解(R)-烯丙醇酮醋酸酯，其eeS及eeP均高于90％。但是該商品酶制劑價格相對較高，反應后不易回收重復使用，且由于酶的乳化作用，使得萃取分離過程比較困難，并造成產品的損失，從而使生產的成本顯著增加，在一定程度上影響了其工業(yè)化應用的可行性。用微生物整體細胞(其中酶處于細胞內部，在某種程度上相當于天然的固定化酶)直接水解(R)-醇酮脂肪酸酯的方法，省去了酶純化的復雜步驟，大大降低了生產成本，是一種新的水解(R)-醇酮脂肪酸酯的方法。如《上海化工》第24卷第10期第7-8頁的綜述中所披露的技術路線，但該菌種還存在反應轉化率偏低和光學純度不高的缺陷。
本發(fā)明的構思是這樣的(1)自然界的微生物種類是非常豐富、多種多樣的。既然自然界存在著(R)和(S)兩種構型的手性酯，那末根據(jù)進化論的觀點可以推斷，自然界中必定也存在著對(R)和(S)兩種底物具有較高專一性的酯酶。因此，發(fā)明人認為只要設計一定的方法，巧妙地篩選分離得到高度專一性的酯酶產生菌，那末通過高度對映選擇性的酯水解等過程，就可獲得高度光學純的單一對映體(S)-醇酮或(R)-醇酮。
(2)微生物及其酶催化的對映體拆分過程，實質上是以兩種對映體底物的競爭性反應的速度快慢不同為前提的所謂“動力學拆分”過程，有關的定量分析及模擬曲線在文獻J.Am.Chem.Soc.1982，1047294中已有詳細記載。根據(jù)這一理論模型可以得到如下啟示當目標對映體為反應生成的產物(醇)時，首先要選擇對映選擇率(E值)盡可能高的細胞或酶；其次，在細胞或酶的選擇率不是特別高(如E＜50)的情況下，應當控制適當?shù)姆磻獣r間，使殘留底物(酯)和生成的產物(醇)的對映體過量值eeS及eeP均達到較高值，即eeS及eeP相等，這樣方可獲得光學純度較高的最終產物。
據(jù)此，發(fā)明人首先從土壤中篩選出產酯酶的菌株，利用此菌株所產的酯酶對烯丙醇酮脂肪酸酯進行對映選擇性水解，獲得光學純度較高的R-醇酮；然后用對甲基苯磺酰氯將其磺酰化，再通過化學水解以及磺酸酯水解過程中伴隨的構型翻轉，即可將R-醇酮磺酸酯轉化為S-醇酮。與此同時，原來酶促水解反應中殘留的S-醇酮脂肪酸酯經過化學水解后，則保持原有的立體構型，直接轉化為S-醇酮。
使用的微生物用于對(R，S)-醇酮脂肪酸酯進行對映選擇性水解的微生物是一種屬于不動桿菌屬的菌種，不動桿菌(Acinetobacter sp.)YQ231即為具有這種能力的菌種，以下簡稱YQ231，該菌種已于2002年8月16日在中國微生物菌種保藏管理委員會保藏，保藏號為CGMCC0789。
該菌種是通過如下的方法篩選獲得的取1g新鮮土樣，加到50ml篩選培養(yǎng)基中(含0.2％(NH4)2SO4，0.2％K2HPO4，0.05％NaCl和0.05％MgSO4·7H2O)，另加入少量烯丙醇酮醋酸酯(0.1％)，進行富集培養(yǎng)；富集后取少許培養(yǎng)液，稀釋涂平板(培養(yǎng)基組成同上)培養(yǎng)，再挑取單菌落在搖管中用豐富培養(yǎng)基(例如葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％)培養(yǎng)24h后，加入烯丙醇酮醋酸酯(1％)，轉化24h后，用等體積的乙酸乙酯萃取出產物醇和殘留的酯，使用手性氣相色譜柱進行分析(柱溫160℃，進樣器及檢測器溫度均為280℃)，計算底物的轉化率和產物的對映體過量值(eeP)。最后從370株侯選菌株中選出一株專一性水解(R)-烯丙醇酮醋酸酯的微生物不動桿菌YQ231。
YQ231菌種具有如下的性質(1)形態(tài)特征革蘭氏染色陰性，桿狀或球狀(穩(wěn)定生長期為球形)，成對及多個排列成鏈狀，大小為1.0-1.5×1.5-2.5μm，無芽孢，無鞭毛；(2)培養(yǎng)特征YQ231菌株在30℃平板上培養(yǎng)12h可形成小的菌落，36h后形成粘稠、濕潤的白色菌落，邊緣光滑，中間下陷。在培養(yǎng)物中有少量絲狀體，好氧；(3)生理生化特征菌株YQ231的生理生化試驗結果見表1。
表1YQ231菌株的生理生化試驗結果特性 Properties 結果 Results過氧化氫酶 Catalase+V.P試驗V.P test-M.R試驗M.R test-葡萄糖產酸 Acid from glucose +果糖產酸 Acid from fructose +乳糖發(fā)酵lactose fermentation -淀粉水解Hydrolysis of starch -明膠水解Hydrolysis of gelatin +果膠水解Hydrolysis of pectin -檸檬酸鹽利用Utilization of citrate +乙醇氧化Alcohol oxidate-氧化酶 Oxidizing enzyme -脲酶Urease -產生吲哚Production of indole -產生H2SProduction ofH2S +硝酸鹽還原 Nitrate reduction -油脂水解Fat hydrolysis +蔗糖利用Utilization of sucrose -葡萄糖利用 Utilization of glucose -甘露醇利用 Utilization of mannitol-乳糖利用Utilization of lactose -半乳糖利用 Utilization of galactose +肌醇利用Utilization of creatol -果糖利用Utilization of fructose-山梨醇利用 Utilization of sorbitol-根據(jù)菌株YQ231的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特征，該菌株與《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版，山東大學出版社1988年12月)中不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)的分類特征最相符，所以判定菌株YQ231為不動桿菌，定名為不動桿菌(Acinetobacter sp.)YQ231。
本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)將含有酯酶活性的微生物細胞或者由其分離的酯酶為催化劑，以外消旋醇酮的脂肪酸酯為原料，在20-50℃，pH＝5-10，最好25-40℃和pH＝6-8.5條件下進行轉化反應，至一定轉化率，一般40-50％，最好45-50％時停止反應，反應時間一般為2-48h。然后用乙酸乙酯萃取水解生成的(R)-醇酮和反應殘余的(S)-醇酮脂肪酸酯，加無水硫酸鈉干燥后蒸發(fā)去除有機溶劑，得到(R)-醇酮和(S)-醇酮脂肪酸酯的混合物。
所說的微生物，是指以外消旋的烯丙醇酮醋酸酯為唯一碳源分離篩選到的能夠專一性水解(R)-醇酮脂肪酸酯的酯酶產生菌，例如不動桿菌Acinetobacter sp.YQ231。
所說的外消旋醇酮脂肪酸酯包括烯丙醇酮脂肪酸酯或炔丙醇酮脂肪酸酯；所說的酯是指由烯丙醇酮或炔丙醇酮與短鏈(C1-C8)脂肪酸構成的酯，尤其是乙酸酯和丁酸酯。
所說的催化劑，是指以所述及的微生物，如不動桿菌Acinetobacter sp.YQ231為種子，利用發(fā)酵工程、酶工程和基因工程技術制備的具有上述酯酶水解活力的生物材料，包括發(fā)酵液、活細胞、休止細胞，凍干細胞、固定化細胞、細胞破碎液及提取物、不同純度的酶制劑和各種形式的固定化酶，也包括含有上述酯酶基因的各種“克隆”及其表達的蛋白質產物。
由于底物酯在水中很難溶解，分散不好而影響酶的作用效率，因此反應時最好向反應系統(tǒng)中添加適量的助溶劑，如乙醇、丙酮、二甲亞砜等，或者加入乳化劑如吐溫-80、曲拉通、壬基酚聚氧乙烯醚等；其濃度范圍可在0.1-5％之內，最好在0.5-1.5％(w/v)。
按照本發(fā)明，可優(yōu)選采用經過培養(yǎng)獲得的YQ231的細胞為催化劑，加入量為5～20g(濕重)/L，并以pH為6～8.5的磷酸鉀為緩沖液。
(2)產物的處理采用現(xiàn)有技術，如美國專利US Patent No.4571436(1986)公開的方法，對所獲得的含有(R)-醇酮和(S)-醇酮脂肪酸酯的混合物進行磺?；退?，然后從水解產物中收集最終的產物(S)-醇酮單一對映體。該方法簡述如下在含有(R)-醇酮和(S)-醇酮脂肪酸酯的混合物中加入丙酮和三乙基氨，然后滴加對甲基苯磺酰氯/丙酮溶液，攪拌反應，將反應混合物倒入稀鹽酸溶液中，然后從反應產物中收集(R)-醇酮磺酸酯和(S)-醇酮脂肪酸酯的混合物；稀鹽酸溶液的濃度為0.5～2wt％。
然后加入碳酸鈣和水加熱回流，反應物冷卻后倒入碳酸氫鈉水溶液中，再用乙酸乙酯萃取、無水硫酸鎂干燥，蒸發(fā)濃縮去除溶劑即得到最終的產物(S)-醇酮單一對映體。
所述及的菌種的培養(yǎng)包括以下步驟(1)菌種的準備將不動桿菌YQ231在滅過菌(121℃，20-40min)的豐富培養(yǎng)基(例如葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％，瓊脂1.5％)平板上劃線，于25～30℃靜置培養(yǎng)約2天后挑取單菌落，作為種子進行斜面培養(yǎng)(培養(yǎng)條件同上)，約2天后保存于4℃冰箱中備用。
(2)細胞的培養(yǎng)挑取上述斜面培養(yǎng)的種子，接種到裝有20mL液體培養(yǎng)基(組成同上，但不加瓊脂)的100mL小搖瓶中，在適當溫度(20～50℃，最好25～40℃)和轉速(例如60～300r/min，一般100～200r/min)的搖床上培養(yǎng)12～18h后，按適當比例(比如5％)接種于含有100mL生長培養(yǎng)基的500mL大搖瓶中，在搖床上(30℃，150r/min)培養(yǎng)24～30h后取出，在4℃、8000r/min離心除去上清液，所得細胞用生理鹽水(0.85％NaCl)洗滌一次，置于4℃冰箱中貯存?zhèn)溆?。上述培養(yǎng)所得的細胞也可不經離心分離，即直接向含有細胞的發(fā)酵液中加入適量的底物酯和乳化劑進行水解拆分反應。
本發(fā)明的方法，工藝過程比較簡單，反應條件比較溫和；所用菌種(含胞內酯酶)的催化活性和立體選擇性較高，所獲得的(S)-醇酮光學純度可達90％ee以上。該方法具有簡單實用、成本低廉的優(yōu)點，可望在工業(yè)生產上推廣應用。
取100mL上述培養(yǎng)液，離心收集菌體，用生理鹽水洗滌后，懸浮于100mL巴比妥鈉-鹽酸緩沖液中(100mM，pH8.5)，加入1.5g壬基酚聚氧乙烯醚，再加入濃度為5wt％的烯丙醇酮醋酸酯，于30℃和160r/min的搖床上保溫反應，生成(R)-烯丙醇酮，結果為當反應進行到2小時，轉化率即高于30％，繼續(xù)反應至14小時，反應接近終點(50％)，此時，eeS及eeP達到80％，對映選擇率(E值)接近40。
實施例2取實施例1中的發(fā)酵液50mL，離心收集菌體，用生理鹽水洗滌后，懸浮于100mL巴比妥鈉-鹽酸緩沖液中(100mM，pH8.5)，加入1.5g壬基酚聚氧乙烯醚，再加入2.0g烯丙醇酮醋酸酯，于30℃和160r/min的搖床上保溫反應，結果為反應進行到24小時，烯丙醇酮醋酸酯轉化反應基本結束，此時，eeS及eeP達到90％，E值接近50。
實施例3在5-L發(fā)酵罐中裝入3L生長培養(yǎng)基(含蔗糖1％，吐溫-80 0.15％，黃豆餅粉2％，硫銨0.2％，K2HPO40.2％，NaCl 0.1％，MgSO40.02％，pH8.0)，滅菌后按5％的接種量接入YQ231種子培養(yǎng)液，在溫度為30℃、攪拌轉速為500r/min和通氣速率為1.0vvm的條件下發(fā)酵，至24h放罐時菌濃為3g/L(干重)，酶活為900U/L。
取上述發(fā)酵液50mL，用0.1M、pH8.0的磷酸鉀緩沖液稀釋至100mL，直接加入2g烯丙醇酮醋酸酯和1.5g壬基酚聚氧乙烯醚，于30℃磁力攪拌3h，停止反應并用乙酸乙酯萃取，蒸去溶劑后得到對映體純度均超過94％的(R)-烯丙醇酮和(S)-烯丙醇酮醋酸酯；再加入3g丙酮，在溫度為-15～0℃條件下加入0.65g三乙胺，然后在同樣溫度下滴加對甲基苯磺酰氯(0.62g)/丙酮(2g)溶液，大約10分鐘內滴完后，繼續(xù)攪拌反應1.5小時，將反應混合物倒入30ml稀鹽酸溶液(1％)中，然后用二氯甲烷萃取、無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)濃縮得到(R)-醇酮磺酸酯和(S)-醇酮醋酸酯的混合物。然后加入0.1g碳酸鈣和10mL水加熱回流2小時，反應物冷卻后倒入5％碳酸氫鈉水溶液中，再用乙酸乙酯萃取、無水硫酸鎂干燥，蒸發(fā)濃縮去除溶劑即得到最終的產物(S)-烯丙醇酮，光學純度為91.0％，收率為85.0％。
實施例4取實施例3中所述的發(fā)酵液100mL，離心收集細胞并重新懸浮于25mL Tris-HCl緩沖液中(20mmol/L，pH7.5)，加入75mL含2％(w/v)海藻酸鈉的Tris-HCl緩沖液(20mmol/L，pH7.5)，分散均勻后用注射器滴加到0.1mol/L的CaCl2溶液中，待形成球狀顆粒后，置于新鮮CaCl2溶液中浸泡30分鐘使顆粒充分硬化。然后收集固定化細胞顆粒，重新懸浮于100ml Tris-HCl緩沖液中(50mmol/L，pH8.0)，加入2g烯丙醇酮醋酸酯和1.5g壬基酚聚氧乙烯醚，于30℃搖床上振蕩反應5h，停止反應后用乙酸乙酯萃取，蒸去溶劑后得到對映體純度超過93％的(R)-烯丙醇酮和(S)-烯丙醇酮醋酸酯。然后按上述實施例3中的后處理步驟對(R)-醇酮進行磺酰化以及對二種混合的酯進行加熱水解，結果獲得光學純度為90.5％的(S)-烯丙醇酮，收率為86％。第一批反應結束后，過濾收集固定化細胞，并用Tris-HCl緩沖液(50mmol/L，pH8.0)洗滌后，投入新鮮反應液繼續(xù)反應，然后按同樣的步驟進行產品的轉化和分離提取。如此重復5批后，酶的活力無顯著損失，所得(S)-醇酮的光學純度也都保持在90％以上，平均收率為85％。
根據(jù)本發(fā)明公開的技術方案和實施例，有關的工程技術人員可以方便地將本發(fā)明所說的微生物菌種及其培養(yǎng)與轉化工藝，舉一反三地用于其它類型的酯(如烯丙醇酮丁酸酯和炔丙醇酮醋酸酯)的對映體拆分。
權利要求
1.一種不動桿菌CGMCC0789。
2.一種拆分制備手性環(huán)戊烯酮的方法，其特征在于包括如下步驟(1)以含有酯酶活性的微生物細胞或者由其分離的酯酶為催化劑，以外消旋醇酮的脂肪酸酯為原料進行轉化反應，然收集(R)-醇酮和(S)-醇酮脂肪酸酯的混合物；(2)采用常規(guī)的方法對所獲得的含有(R)-醇酮和(S)-醇酮脂肪酸酯的混合物進行水解，然后從水解產物中收集最終的產物(S)-醇酮單一對映體。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所說的微生物，是指以外消旋的烯丙醇酮醋酸酯為唯一碳源分離篩選到的能夠專一性水解(R)-醇酮脂肪酸酯的酯酶產生菌。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所說的催化劑為所述及的微生物，是以不動桿菌CGMCC0789為種子，通過發(fā)酵工程、酶工程和基因工程技術制備的具有上述酯酶水解活力的生物材料。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于生物材料包括發(fā)酵液、活細胞、休止細胞，凍干細胞、固定化細胞、細胞破碎液及提取物、不同純度的酶制劑和各種形式的固定化酶，或含有上述酯酶基因的各種“克隆”及其表達的蛋白質產物。
6.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于外消旋醇酮脂肪酸酯包括烯丙醇酮脂肪酸酯或炔丙醇酮脂肪酸酯。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所說的酯為由烯丙醇酮或炔丙醇酮與短鏈(C1-C8)脂肪酸構成的酯。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于所說的酯是乙酸酯和丁酸酯。
9.根據(jù)權利要求2～8任一項所述的方法，其特征在于轉化反應在20-50℃，pH＝5-10條件下進行轉化反應，反應時間一般為2-48h。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于轉化反應在25-40℃和pH＝6-8.5條件下進行。
11.根據(jù)權利要求2～8任一項所述的方法，其特征在于反應時向反應系統(tǒng)中添加適量的助溶劑。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其特征在于助溶劑包括乙醇、丙酮、二甲亞砜或乳化劑。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其特征在于助溶劑濃度為0.1-5％。
14.根據(jù)權利要求13所述的方法，其特征在于助溶劑濃度為0.5-1.5％(w/v)。
15.根據(jù)權利要求2～8任一項所述的方法，其特征在于所說的催化劑為經過培養(yǎng)不動桿菌CGMCC0789，加入量為5～20g(濕重)/L，并以pH為6～8.5的磷酸鉀為緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種不動桿菌CGMCC0789及采用該菌種拆分制備手性環(huán)戊烯酮的方法。本發(fā)明的方法包括以含有酯酶活性的微生物細胞或者由其分離的酯酶為催化劑，以外消旋醇酮的脂肪酸酯為原料進行轉化反應，得到(R)－醇酮和(S)－醇酮脂肪酸酯的混合物。然后對其進行磺?；蛪A水解，再從水解產物中收集最終的產物(S)－醇酮單一對映體。本發(fā)明工藝過程比較簡單，反應條件比較溫和；所用菌種(含胞內酯酶)的催化活性和立體選擇性較高，所獲得的(S)－醇酮光學純度可達90％以上。該方法具有簡單實用、成本低廉的優(yōu)點，可望在工業(yè)生產上推廣應用。
文檔編號C12P7/26GK1408848SQ02137019
公開日2003年4月9日 申請日期2002年9月17日 優(yōu)先權日2002年9月17日
發(fā)明者許建和, 趙玉巧, 武慧淵, 陳亞, 周琳婷 申請人:華東理工大學