專利名稱：點(diǎn)突變基因的檢測(cè)方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種點(diǎn)突變基因的檢測(cè)方法及裝置。
本發(fā)明的點(diǎn)突變基因的檢測(cè)方法包括以下步驟(1)用一段標(biāo)記生物素的3’端引物和一段標(biāo)記三聯(lián)吡啶釕復(fù)合物的5’端引物擴(kuò)增一段包含一個(gè)突變位點(diǎn)的待測(cè)序列，點(diǎn)突變發(fā)生后，恰巧能在該處形成一個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)；(2)擴(kuò)增后，樣品被分成兩等份，一份用限制性內(nèi)切酶酶切，只有當(dāng)點(diǎn)突變發(fā)生后，該酶才能將標(biāo)記三聯(lián)吡啶釕復(fù)合物的5’端從標(biāo)記生物素的3’端切去；另一份保持不變；
(3)生物素標(biāo)記的DNA序列通過與鏈霉親和素包被的磁珠連接而被收集到樣品池中，其它成分則被洗去；(4)通過檢測(cè)由樣品池中的三聯(lián)吡啶釕復(fù)合物產(chǎn)生的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)確定兩份樣品中與生物素標(biāo)記的DNA連接的三聯(lián)吡啶釕復(fù)合物的量；(5)通過比較樣品酶切前后電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度的變化來區(qū)分點(diǎn)突變是否發(fā)生。
一種點(diǎn)突變基因的檢測(cè)裝置包括樣品池、恒電位儀、光纖、光電倍增管、模數(shù)轉(zhuǎn)換器、微型計(jì)算機(jī)，其中樣品池由進(jìn)樣管、對(duì)電極、工作電極、參比電極、出樣管組成；樣品池、光纖、光電倍增管、模數(shù)轉(zhuǎn)換器、微型計(jì)算機(jī)依次連接；恒電位儀分別與樣品池中的對(duì)電極、工作電極、參比電極相連。
樣品由進(jìn)樣管進(jìn)入樣品池中，在工作電壓下發(fā)射出光子，光子通過光纖接收進(jìn)入光電倍增管中，光電倍增管將光信號(hào)放大并轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，電信號(hào)由模數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)后輸入微型計(jì)算機(jī)中，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后將結(jié)果輸出；反應(yīng)后的樣品從出樣管流出。
本發(fā)明具有靈敏、快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。


圖1是本發(fā)明一種點(diǎn)突變基因的檢測(cè)裝置示意圖；圖2是實(shí)例中酶切前后的突變型PS-1基因外顯子8中待測(cè)序列的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)結(jié)果圖；圖3是實(shí)例中酶切前后的野生型樣品和酶切前后的突變型樣品的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式
我們將該方法及裝置應(yīng)用于檢測(cè)PS-1基因密碼子235處的點(diǎn)突變，該突變位點(diǎn)位于PS-1基因外顯子8上，步驟如下用一段標(biāo)記生物素的3’端引物和一段標(biāo)記三聯(lián)吡啶釕復(fù)合物的5’端引物擴(kuò)增PS-1基因外顯子8中的一段包含一個(gè)突變位點(diǎn)的待測(cè)序列，點(diǎn)突變發(fā)生后，恰巧能在該處形成一個(gè)HpaII限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增后，樣品被分成兩等份。一份用HpaII酶切，只有當(dāng)點(diǎn)突變發(fā)生后，HpaII才能將標(biāo)記三聯(lián)吡啶釕復(fù)合物的5’端從標(biāo)記生物素的3’端切去；另一份則保持不變。生物素標(biāo)記的DNA序列通過與鏈霉親和素包被的磁珠連接而被收集到樣品池中，其它成分則被洗去。通過檢測(cè)由樣品池中的三聯(lián)吡啶釕復(fù)合物產(chǎn)生的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)確定兩份樣品中與生物素標(biāo)記的DNA連接的三聯(lián)吡啶釕復(fù)合物的量。通過比較樣品酶切前后電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度的變化來區(qū)分點(diǎn)突變是否發(fā)生。
圖1給出了本發(fā)明一種點(diǎn)突變基因檢測(cè)的裝置示意圖。由圖1可見，本裝置包括樣品池1、恒電位儀2、光纖3、光電倍增管4、模數(shù)轉(zhuǎn)換器5、微型計(jì)算機(jī)6和數(shù)據(jù)處理軟件；其中樣品池1由進(jìn)樣管1-1、對(duì)電極1-2、工作電極1-3、參比電極1-4、出樣管1-5組成。
圖2給出了酶切前后的突變型PS-1基因外顯子8中待測(cè)序列的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的檢測(cè)結(jié)果圖，其中1代表樣品酶切前的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度曲線，2代表樣品酶切后的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度曲線。由圖3可以看出樣品酶切前檢測(cè)到的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度約為243cps；樣品酶切后檢測(cè)到的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度約為114cps，接近本底信號(hào)強(qiáng)度108cps，在該實(shí)驗(yàn)中，我們可認(rèn)為基本檢測(cè)不到電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。
圖3出了酶切前后的野生型樣品和酶切前后的突變型樣品的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度對(duì)比圖。在圖3中，A代表未酶切的野生型樣品，B代表酶切后的野生型樣品，C代表未酶切的突變型樣品，D代表酶切后的突變型樣品，E代表本底信號(hào)。由圖3可以看出野生型樣品酶切前后的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度基本保持不變，都約為242cps；突變型樣品酶切前后的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度變化很大，基本上可以認(rèn)為由有到無。因此，由樣品酶切前后電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度的變化可以很容易地判斷點(diǎn)突變是否發(fā)生。
權(quán)利要求
1.一種點(diǎn)突變基因的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟(1)用一段標(biāo)記生物素的3’端引物和一段標(biāo)記三聯(lián)吡啶釕復(fù)合物的5’端引物擴(kuò)增一段包含一個(gè)突變位點(diǎn)的待測(cè)序列，點(diǎn)突變發(fā)生后，恰巧能在該突變位點(diǎn)處形成一個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)；(2)擴(kuò)增后，樣品被分成兩等份，一份用該種限制性內(nèi)切酶酶切，只有當(dāng)點(diǎn)突變發(fā)生后，限制性內(nèi)切酶才能將標(biāo)記三聯(lián)吡啶釕復(fù)合物的5’端從標(biāo)記生物素的3’端切去；另一份保持不變；(3)生物素標(biāo)記的DNA序列通過與鏈霉親和素包被的磁珠連接而被收集到樣品池中，其它成分則被洗去；(4)通過檢測(cè)由樣品池中的三聯(lián)吡啶釕復(fù)合物產(chǎn)生的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)確定兩份樣品中與生物素標(biāo)記的DNA連接的三聯(lián)吡啶釕復(fù)合物的量；(5)通過比較樣品酶切前后電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度的變化來區(qū)分點(diǎn)突變是否發(fā)生。
2.一種點(diǎn)突變基因的檢測(cè)裝置，其特征在于由樣品池、恒電位儀、光纖、光電倍增管、模數(shù)轉(zhuǎn)換器、微型計(jì)算機(jī)組成，其中樣品池由進(jìn)樣管、對(duì)電極、工作電極、參比電極和出樣管組成；樣品池、光纖、光電倍增管、模數(shù)轉(zhuǎn)換器、微型計(jì)算機(jī)依次連接，恒電位儀分別與樣品池中的對(duì)電極、工作電極、參比電極相連。
全文摘要
本發(fā)明提供一種點(diǎn)突變基因的檢測(cè)方法，利用待測(cè)序列的突變位點(diǎn)發(fā)生突變后恰巧能形成一個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，用該內(nèi)切酶可切去標(biāo)記在突變型樣品上的電化學(xué)發(fā)光底物而導(dǎo)致檢測(cè)不到電化學(xué)發(fā)光信號(hào)；野生型樣品由于不存在酶切位點(diǎn)，因此酶切前后檢測(cè)到的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)基本一致；通過比較樣品酶切前后電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度的變化來區(qū)分點(diǎn)突變是否發(fā)生；一種點(diǎn)突變基因檢測(cè)裝置包括如下組件樣品池、恒電位儀、光纖、光電倍增管、模數(shù)轉(zhuǎn)換器、微型計(jì)算機(jī)和數(shù)據(jù)處理軟件；本發(fā)明具有靈敏、快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1392270SQ02134518
公開日2003年1月22日 申請(qǐng)日期2002年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月6日
發(fā)明者邢達(dá), 朱德斌 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)