專利名稱：改用超長引物以提高基因擴(kuò)增效能的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)，即一種體外酶促合成特異DNA片段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的就是要突破現(xiàn)有PCR方法中對引物設(shè)計長度的普遍認(rèn)知和人為限定，提供一種能使非專一擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚物降低或消除，使目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物更強(qiáng)、更純，能縮短反應(yīng)時間，能減少反應(yīng)所用的主要試劑量，使反應(yīng)穩(wěn)定性和重復(fù)性提高的PCR方法。
本發(fā)明聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法PCR的必要成份有耐熱DNA聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸、鎂離子、緩沖液、標(biāo)靶DNA和一對正、反引物。其中，一對正、反引物的長度均為31-50堿基，優(yōu)選為35-45堿基，謂之超長引物。超長引物的順序原則上應(yīng)與模板順序完全互補(bǔ)，但根據(jù)需要可有個別的錯配。正、反引物的鏈熔溫度即Tm的范圍均為82-92℃，優(yōu)選為85-90℃。PCR產(chǎn)物的鏈熔溫度減正、反引物鏈熔溫度之差均為-4-10℃。正、反引物均具有較高的嚴(yán)謹(jǐn)性。本發(fā)明聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR由于采用超長引物替代了一般長度引物，其PCR循環(huán)步驟由變性-退火-延伸三步簡化為高溫變性和退火延伸兩步，退火和延伸合二為一，而且可以在遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出標(biāo)準(zhǔn)PCR退火和延伸的極限值的條件下完成PCR反應(yīng)。退火溫度為72-82℃，延伸溫度也為72℃-82℃，優(yōu)選為75-80℃。本發(fā)明適用于標(biāo)準(zhǔn)PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR、也可以用于競爭定量PCR和實時熒光定量PCR減少非專一產(chǎn)物形成。還可以用于多重PCR，嵌套PCR和其它由標(biāo)準(zhǔn)PCR衍生的各種改良PCR方法，有廣泛的應(yīng)用前景。
為理解本發(fā)明的實質(zhì)及優(yōu)點，隨機(jī)選取下列十個基因進(jìn)行測試分析表一

十個基因長度從1282至4306鹼基，平均長度為2451鹼基，采用廣泛使用的商業(yè)化PCR引物設(shè)計軟件Oligo6進(jìn)行測試分析，該軟件將引物嚴(yán)謹(jǐn)性分為非常高、高、中等、可以、低和非常低六類，嚴(yán)謹(jǐn)性越高越好。其中甘油3磷酸脫氧酶基因(1282鹼基)測試結(jié)果見下表表二 具有不同嚴(yán)謹(jǐn)性的普通引物與超長引物的出現(xiàn)頻率

顯然，引物出現(xiàn)頻率隨嚴(yán)謹(jǐn)性增高而顯著下降，20鹼基普通引物的出現(xiàn)頻率由高嚴(yán)謹(jǐn)性轉(zhuǎn)到非常高嚴(yán)謹(jǐn)性時急劇下降，其數(shù)量在便于實際操作選擇的范圍內(nèi)；40鹼基超長引物的出現(xiàn)頻率則由中等嚴(yán)謹(jǐn)性轉(zhuǎn)到高嚴(yán)謹(jǐn)性時急劇下降。雖然，具有非常高嚴(yán)謹(jǐn)性的超長引物的出現(xiàn)頻率為零。但是具有高嚴(yán)謹(jǐn)性的超長引物有一定數(shù)量。而按隨機(jī)原則選擇的肌動球蛋白，蛋白激酶C等表一所列十個mRNA的全順序測試的統(tǒng)計結(jié)果見下表。
表三、具有非常高嚴(yán)謹(jǐn)性和高嚴(yán)謹(jǐn)性的引物的出現(xiàn)頻率(PCR產(chǎn)物設(shè)定為150-800鹼基)

測試表明非常高嚴(yán)謹(jǐn)性引物的出現(xiàn)頻率從15增加到30鹼基時迅速下降。平均每個基因可搜索到具有非常高嚴(yán)謹(jǐn)性20鹼基長的引物100多個。除一個基因外均搜尋不到具有非常高嚴(yán)謹(jǐn)性30鹼基長的引物。具有非常高嚴(yán)謹(jǐn)性15鹼基長的引物的出現(xiàn)頻率雖然很高，但這些引物的Tm偏低，專一性不夠；具有非常高嚴(yán)謹(jǐn)性18-25鹼基長的引物，既有一定的數(shù)量可供選擇又有較高的Tm和專一性，因而現(xiàn)被公認(rèn)為最佳引物長度范圍。而本發(fā)明卻發(fā)現(xiàn)當(dāng)引物長度設(shè)定為31-50個鹼基時，雖然很難搜尋到具有非常高嚴(yán)謹(jǐn)性的引物，但幾乎每一個受測試基因都能得到一定數(shù)量具有高嚴(yán)謹(jǐn)性的引物。平均每個基因可搜索到具有高嚴(yán)謹(jǐn)性40鹼基長的引物79個。用PCR引物軟件Oligo6的嚴(yán)謹(jǐn)性標(biāo)準(zhǔn)來判斷，這些具有高嚴(yán)謹(jǐn)性的超長引物似不及具有非常高嚴(yán)謹(jǐn)性的普通引物，因而自PCR技術(shù)發(fā)明以來一直被忽略。本發(fā)明則從理論上分析并通過實驗證明以下幾點一、本發(fā)明的具有高嚴(yán)謹(jǐn)性超長引物的綜合性能優(yōu)于具有非常高嚴(yán)謹(jǐn)性的現(xiàn)行普通引物。
表四 本發(fā)明超長引物PCR與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR主要特征對照表

二、本發(fā)明的超長引物的鏈熔溫度(Tm)提高寡核苷酸的解鏈溫度(Tm)與鏈長，鹼基組成，排列和溶液特性等有關(guān)。當(dāng)引物鹼基長為31-50時，引物在通常PCR反應(yīng)條件下的Tm在82°到92℃之間，比普通引物的Tm溫度范圍高15-30℃，可以72℃至82℃之間的溫度退火并延伸。在這一溫度范圍內(nèi)退火延伸，既克服了非專一產(chǎn)物和引物二聚物的形成，又使Taq酶保持穩(wěn)定和顯示較高的酶活力。
三、本發(fā)明的超長引物與標(biāo)靶的專一結(jié)合強(qiáng)度高，錯配結(jié)合的強(qiáng)度不變，二者的凈差值大一個含20鹼基的核苷酸的排列順序超過1萬億種，此數(shù)值是人類基因組總長度的幾百倍，所以，對于一個設(shè)定的20鹼基長引物遇到順序完全相同的非標(biāo)靶DNA模板的可能性只有幾百分之一。PCR反應(yīng)需要二個引物順序都匹配，而且匹配順序必須比較靠近才能完成。從這一角度分析，非專一PCR產(chǎn)物幾乎不可能形成。其原因是當(dāng)引物與標(biāo)靶和非標(biāo)靶的錯配達(dá)到一定強(qiáng)度時PCR反應(yīng)就會發(fā)生。顯然，引物與標(biāo)靶的專一結(jié)合強(qiáng)度越高越好，引物與標(biāo)靶和非標(biāo)靶的錯配結(jié)合強(qiáng)度越低越好，引物專一結(jié)合與錯配結(jié)合的凈差值越大越好。本發(fā)明測試比較了超長引物與普通引物的這些特性，統(tǒng)計分析表明超長引物顯著比同源普通引物優(yōu)越。本發(fā)明按隨機(jī)方式在甘油3磷酸脫氫酶基因中選取G+C％分別為30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％和75％的含20鹼基寡核苷酸各5個作為普通引物；然后在這些寡核苷酸5′端延伸20鹼基得到含40鹼基的寡核苷酸作為超長引物。從甘油3磷酸脫氫酶基因隨機(jī)選取的50個引物與標(biāo)靶專一結(jié)合和錯配結(jié)合強(qiáng)度的測試計算統(tǒng)計結(jié)果列于表五。
表五 普通引物與在5′端延伸的超長引物與標(biāo)靶結(jié)合的特性

數(shù)據(jù)表明50個超長引物與標(biāo)靶結(jié)合的平均強(qiáng)度為574點，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過對非常高嚴(yán)謹(jǐn)性引物所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)360點，也比同源的普通引物的平均值高約150點。雖然超長引物專一結(jié)合的強(qiáng)度遠(yuǎn)高于普通引物，但超長引物的錯配結(jié)合平均值比普通引物只高6點。超長引物專一結(jié)合與錯配結(jié)合差值平均為435點，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過非常高嚴(yán)謹(jǐn)性引物所要求的200點，也比同源普通引物平均值高140多點。更有價值的是不少超長引物的錯配強(qiáng)度不僅沒有增加相反有所減少，有的甚至比同源普通引物低50多點，個別超長引物專一結(jié)合與錯配結(jié)合強(qiáng)度的凈差高達(dá)600點。
四、本發(fā)明的超長引物與非標(biāo)靶的錯配結(jié)合強(qiáng)度和普通引物的相近PCR反應(yīng)系統(tǒng)中非標(biāo)靶DNA的含量往往是模板DNA的幾萬至幾千萬倍。由于引物設(shè)計軟件的限制，設(shè)計引物時并不了解引物與非標(biāo)靶DNA的錯配強(qiáng)度。雖然，應(yīng)用BLAST等可以知道引物順序的同源性情況，但是錯配結(jié)合強(qiáng)度并非簡單地由同源性程度決定，而是取決于同源性序列長短，核苷酸組成和排列，特別是3′端順序的情況。本發(fā)明測試比較了超長引物和普通引物與非標(biāo)靶的錯配結(jié)合強(qiáng)度。以隨機(jī)的方式從甘油3磷酸脫氫酶基因選取11個含20鹼基的寡核苷酸作為普通引物。同樣，在其5′端延長20個鹼基得到11個同源的含40鹼基的寡核苷酸作為超長引物。從一個第4染色體的克隆中取一段2萬個鹼基長的核酸作為非標(biāo)靶進(jìn)行測試。列于表六的統(tǒng)計結(jié)果與表五所示的測試結(jié)果完全一致，即超長引物與標(biāo)靶專一結(jié)合強(qiáng)度比普通引物高得多，而與標(biāo)靶及非標(biāo)靶的錯配結(jié)合的平均值與普通引物相比略有上下。
表六 普通引物與在5′端延伸超長引物與非標(biāo)靶錯配結(jié)合強(qiáng)度11個隨機(jī)選取的引物對18,000鹼基長非標(biāo)靶的測試統(tǒng)計結(jié)果

五、當(dāng)標(biāo)靶含突變時本發(fā)明的超長引物的Tm仍較高被擴(kuò)增的標(biāo)靶DNA有可能在引物區(qū)內(nèi)存在突變，這種情況下超長引物仍具有較高的Tm，因而比普通引物優(yōu)越。一個20鹼基寡核苷酸存在一個錯配鹼基時，鏈熔溫度降低約六度，而40鹼基寡核苷酸則只降低約三度。
本發(fā)明從甘油3磷酸脫氫酸基因中隨機(jī)選取七個G+C％在40-55％的20鹼基寡核苷酸作為普通引物，然后在5′端延伸20個鹼基得到含40鹼基同源超長引物。根據(jù)最鄰近鹼基法計算，普通引物的平均Tm為62度，如標(biāo)靶有一個突變則Tm降低到56度。反之，超長引物的平均Tm為92度，如標(biāo)靶有一個突變其Tm仍高達(dá)89度。所以，當(dāng)標(biāo)靶出現(xiàn)突變時超長引物仍能在較高的溫度退火。
六、本發(fā)明的超長引物的專一結(jié)合強(qiáng)度受標(biāo)靶突變的影響較小本發(fā)明從若干具有非常高嚴(yán)謹(jǐn)性20鹼基長的引物中隨機(jī)選取一個作測試，該引物與標(biāo)靶專一結(jié)合強(qiáng)度為393點。在5′端延伸20鹼基得到含40鹼基同源超長引物，該超長引物與標(biāo)靶結(jié)合強(qiáng)度為540點。突變對結(jié)合強(qiáng)度的影響與突變的位置密切有關(guān)，也與突變鹼基的種類有關(guān)。本發(fā)明測試當(dāng)突變發(fā)生在不同位置時引物與突變標(biāo)靶的專一結(jié)合強(qiáng)度。每一位置測試三種突變并取平均值。結(jié)果表明，一方面，不論突變發(fā)生在哪一位置，超長引物與標(biāo)靶的結(jié)合強(qiáng)度都超過300點，當(dāng)突變發(fā)生在距3′端的第三，第四位或大于第七鹼基的任何位置時，引物與標(biāo)靶的結(jié)合強(qiáng)度都在400點與500點之間；而同樣情況下普通引物在300與400點之間。所以，超長引物對突變的耐受性比普通引物高。換言之，如果標(biāo)靶含有一個未知突變，超長引物能在比其最高退火溫度(75-80℃)低約5-10度(即65℃以上)的條件下完成擴(kuò)增，并保持PCR產(chǎn)物比較專一。同樣情況下，普通引物必須用相當(dāng)?shù)蜏囟葋硗嘶?，非專一產(chǎn)物干擾就成為嚴(yán)重問題。另一方面，如果需要區(qū)分等位基因，則超長引物也比通常引物優(yōu)越。當(dāng)?shù)任换蛲蛔儼l(fā)生在引物3′端第一或第二位時，超長引物與基因的結(jié)合強(qiáng)度差值達(dá)200多點，在較大的退火溫度范圍內(nèi)能用PCR將其區(qū)分開來。超長引物因其長而比其同源普通引物有更多的幾率遇到突變，當(dāng)突變發(fā)生在超長引物的3′端一半，普通引物也會遇到。如發(fā)生在超長引物的5′端一半，普通引物避開了這種突變，超長引物雖不能避開，但這種突變對超長引物的專一結(jié)合影響很小。
七、本發(fā)明的超長引物對G+C％的范圍要求可放寬普通引物設(shè)計中通常要求引物的C+G％在45到55之間。當(dāng)C+G％低于45％時，不僅引物的Tm偏低，而且引物與標(biāo)靶的專一結(jié)合強(qiáng)度往往達(dá)不到非常高嚴(yán)謹(jǐn)性引物所需的標(biāo)準(zhǔn)。例如在隨機(jī)選取的G+C％在30％到40％之間的15個含20鹼基的引物中，只有一個引物與標(biāo)靶的專一結(jié)合達(dá)到了非常高嚴(yán)謹(jǐn)性引物所規(guī)定的360點。增加G+C％固然可增高Tm及與標(biāo)靶專一結(jié)合的強(qiáng)度，但往往也增強(qiáng)了引物的二級結(jié)構(gòu)。超長引物可以在G+C％相對較低的情況下仍具有足夠高的Tm和與標(biāo)靶專一結(jié)合的強(qiáng)度。所以，超長引物設(shè)計對G+C％的要求可放寬。也有可能設(shè)計3′端富含A和T的引物，使引物與標(biāo)靶和非標(biāo)靶的錯配強(qiáng)度降低，有利非專一PCR產(chǎn)物的減少和消除。
八、本發(fā)明超長引物的綜合性能明顯優(yōu)于普通引物本發(fā)明用引物設(shè)計軟件搜尋具有非常高嚴(yán)謹(jǐn)性20鹼基長引物，規(guī)定PCR產(chǎn)物長150-800鹼基，共得到31對引物符合要求，根據(jù)引物的位置和產(chǎn)物大小，31對引物可分成7組，每組取一對作代表。用同樣方法搜尋到44對高嚴(yán)謹(jǐn)性40鹼基長引物，44對引物可分成4組，每組也取一對作代表。表八綜合性地比較了7對具有非長高嚴(yán)謹(jǐn)性20鹼基長引物和4對具有高嚴(yán)謹(jǐn)性40鹼基長引物的特性。表七 具有非常高嚴(yán)謹(jǐn)性普通引物和本發(fā)明的具有高嚴(yán)謹(jǐn)性超長引物性能比較表

由表七可知4對超長引物的3′端互補(bǔ)鹼基數(shù)，發(fā)夾柄和環(huán)的鹼基數(shù)，與標(biāo)靶的錯配強(qiáng)度等基本數(shù)據(jù)與7對普通引物完全相同或非常接近互有上下。而在引物Tm，引物Tm與PCR產(chǎn)物Tm凈差值及與標(biāo)靶專一結(jié)合強(qiáng)度等方面，超長引物明顯優(yōu)于普通引物。
圖6為超長引物PCR產(chǎn)物電泳條帶照片(退火溫度68℃、70.3℃)，(甘油濃度0％，10％，15％，30％)。
圖7為超長引物PCR產(chǎn)物電泳條帶照片(退火溫度72.9℃、74.8℃)，(甘油濃度0％，10％，15％，20％)。
圖8為超長引物PCR產(chǎn)物電泳條帶照片(退火溫度72℃-80℃)。
表八 25微升PCR反應(yīng)管的成份組成

本發(fā)明實施例PCR所用的DNA均為cDNA，是從商品人組織總RNA用商品反轉(zhuǎn)錄試劑盒而合成。除非另行指出，每20微升PCR反應(yīng)液加入相當(dāng)于由10ng總RNA生成的cDNA。本發(fā)明實施例所用PCR試劑為含Taq酶抗體的商品PCR試劑盒。PCR首次變性為95.5℃1分鐘，循環(huán)變性條件除另行指出外均為95.5℃30秒。PCR和電泳設(shè)備分別為帶梯度功能的商品PCR儀和商品聚丙烯酰胺豎式板電泳系統(tǒng)，電泳膠染色用溴乙錠或其他商品核酸染色劑。PCR產(chǎn)物條帶記錄分析用商品圖像分析儀。本發(fā)明實施例所有附圖照片見

圖1-圖8最左側(cè)均為標(biāo)準(zhǔn)DNA，中心條帶為500鹼基，其他條帶按100鹼基遞減至100鹼基或遞增至1000鹼基。本發(fā)明三個實施例PCR的超長引物長度分別為實施例1，正向39、反向37；實施例2，正向31、反向31；實施例3，正向49、反向46。
表九 實施例1、2、3的超長引物的長度和順序

引物的其他各項數(shù)據(jù)和特性列于表十。
表十 實施例1、2、3 PCR的超長引物的有關(guān)數(shù)據(jù)和特性

1)最高退火溫度和延伸溫度實施例測試了在不同退火溫度(52-76)下PCR產(chǎn)物的形成。圖1和圖2分別為實施例1應(yīng)用普通和超長引物的試驗結(jié)果。退火溫度自左至右分別為52、55.8、58.6、62、66、69.4、72.1、74.1和76℃，退火時間1分鐘，延伸為76℃1分鐘。圖1說明應(yīng)用普通引物作PCR，當(dāng)退火溫度為52至62℃時才有反應(yīng)產(chǎn)物形成；當(dāng)退火溫度大于69.4℃就沒有產(chǎn)物條帶被檢出。圖2說明應(yīng)用超長引物作PCR，退火溫度從52到76℃都有PCR產(chǎn)物形成。進(jìn)一部試驗超長引物在更高退火溫度(74-80℃)下PCR產(chǎn)物的形成，圖3中自左至右退火溫度分別為74、74.5、75、75.7、76.7、77.7、78.5、79.1和80℃，退火時間為1分鐘，延伸為80℃20秒。結(jié)果表明當(dāng)退火溫度接近78℃時仍有PCR產(chǎn)物形成。圖八為實施例3應(yīng)用超長引物的試驗結(jié)果。如圖八所示，78.8℃有明顯產(chǎn)物條帶，79.5℃有微弱產(chǎn)物條帶，表明能在79℃退火。
2)非專一PCR產(chǎn)物如圖1所示，應(yīng)用普通引物作PCR，若退火溫度較低有非專一產(chǎn)物條帶形成，而若退火溫度較高目標(biāo)PCR產(chǎn)物就消失。所以，能得到專一PCR產(chǎn)物的合適退火退度為66℃左右，范圍相當(dāng)狹窄。如圖2所示，應(yīng)用超常引物時當(dāng)退火溫度大于66℃時便無非專一產(chǎn)物條帶出現(xiàn)。在很寬的退火溫度范圍內(nèi)能得到純的PCR產(chǎn)物。
3)引物二聚物的形成引物二聚物的形成在PCR反應(yīng)中相當(dāng)普遍。本發(fā)明實施例的一些實驗表明應(yīng)用普通引物時均有不同程度的引物二聚物形成。圖2和圖3顯示，應(yīng)用超長引物作PCR，在通常的退火溫度下也有引物二聚物形成，但將退火溫度提高70℃左右引物二聚物形成便大大減弱或完全消除。
4)PCR穩(wěn)定性和重復(fù)性超長引物PCR均采用二步法，比傳統(tǒng)的三步法簡化。而且變性與退火延伸溫度之差僅15至20度，遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)PCR的30-50度。在極高的溫度下退火和延伸，不僅減少或消除了非專一條帶和引物二聚物形成，也使PCR反應(yīng)的穩(wěn)定性和重復(fù)性提高，降低了管與管之間的誤差。本發(fā)明實施例共作了36個重復(fù)測定。試驗分4次進(jìn)行，每次試驗含9個重復(fù)管，PCR循環(huán)數(shù)分別為25、28、29和32。普通引物PCR在62℃退火30秒，72℃延伸1分鐘；超長引物PCR在76℃退火延伸1分鐘。每次試驗的相對掃描平均值為11.11，普通引物4次試驗的標(biāo)準(zhǔn)誤差分別為0.73，0.75，0.91和1.28；與普通引物PCR并行的4次超長引物PCR試驗的標(biāo)準(zhǔn)誤差分別為0.43，0.38，0.48和0.52。這些結(jié)果說明超長引物PCR的穩(wěn)定性優(yōu)于普通引物。超長引物PCR可以固定用二步法，PCR儀器的設(shè)計也可更簡單。
5)PCR反應(yīng)時間Taq酶的最適溫度在75-80℃之間，此時的延伸速度是70℃的一倍以上。傳統(tǒng)PCR的延伸溫度為68-72℃，如在更高溫度下延伸可能導(dǎo)致解鏈。超長引物PCR則可在75-80℃之間延伸，發(fā)揮Taq酶的最大活力，使PCR反應(yīng)時間縮短。本發(fā)明實施例試驗了超長引物在74℃和76℃退火和延伸溫度下，完成PCR所需時間。圖4中自左至右退火延伸時間分別為5、10、20和30秒。試驗表明退火延伸能在20秒內(nèi)完成。試驗的變性條件為98℃10秒。每一循環(huán)的計算值僅為30秒。實際上在32分鐘內(nèi)完成了30循環(huán)的全部PCR反應(yīng)，是標(biāo)準(zhǔn)PCR所需時間的四分之一至一半。
6)Taq酶用量從實際應(yīng)用角度而言，Taq酶在75-80℃之間的穩(wěn)定性與在40-72℃之間的穩(wěn)定性毫無區(qū)別。在75-80℃之間延伸比在68-72℃之間延伸更大地發(fā)揮了Taq的酶活力。所以，若保持通常的延伸時間可使酶用量減少。本發(fā)明實施例測試了完成PCR反應(yīng)所需要的加酶量。圖6自左之右，Taq酶用量為試劑盒推薦用量，也即本發(fā)明常規(guī)用量的100％、50％、40％、33％和25％。退火延伸時間為1分鐘。在測試的范圍內(nèi)都顯示相近的PCR產(chǎn)物條帶。
引物長度的倍增給引物的Tm，與PCR產(chǎn)物Tm的差值，與標(biāo)靶專一結(jié)合的強(qiáng)度，退火及延伸溫度等方面帶來了極大幅度的變化。除了以上的測試統(tǒng)計分析和實施例所說明的內(nèi)容，超長引物PCR必然在PCR檢測靈敏度，鎂離子濃度范圍，總離子強(qiáng)度影響，Taq酶抑制劑作用，模板DNA純度要求等方面產(chǎn)生深刻的有利PCR改進(jìn)和應(yīng)用的變化。
權(quán)利要求
1.改用超長引物以提高基因擴(kuò)增效能的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所說的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中的引物改用一對長度均為31-50鹼基的正、反引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所說的一對正、反引物的鏈熔溫度均為82-92℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所述的一對正、反引物與標(biāo)靶順序完全互補(bǔ)或有個別錯配，PCR產(chǎn)物的鏈熔溫度減正、反引物鏈熔溫度之差為-4-10℃，一對正、反引物具有較高的嚴(yán)謹(jǐn)性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所說的PCR循環(huán)為高溫變性和退火延伸兩步，退火延伸溫度為72-82℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所說的一對正、反引物長度均為35-45鹼基。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所說的一對正、反引物的鏈熔溫度均為85-90℃。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所說的退火延伸溫度為75-80℃。
全文摘要
本發(fā)明是一種分子生物學(xué)技術(shù),即一種改進(jìn)的體外酶促合成特異DNA片段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法PCR,其特點是突破了現(xiàn)有PCR對引物長度設(shè)計的普遍認(rèn)知和人為限制,以一對長度為31－50堿基的超長引物替代現(xiàn)有長度堿基引物,其PCR循環(huán)步驟亦隨之簡化為高溫變性和退火延伸兩步,退火溫度和延伸溫度均為72－82℃。本發(fā)明的超長引物具有高嚴(yán)謹(jǐn)性,綜合性能明顯優(yōu)于現(xiàn)行普通引物,其鏈熔溫度提高,與標(biāo)靶的專一及錯配結(jié)合的強(qiáng)度增高而錯配結(jié)合強(qiáng)度并不增加,本發(fā)明適用于標(biāo)準(zhǔn)PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR,也可以用于競爭定量PCR和實時熒光定量PCR減少非專一產(chǎn)物形成,還可以用于多重PCR嵌套PCR和其它由標(biāo)準(zhǔn)PCR衍生的各種改良PCR方法,有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12P19/00GK1381588SQ02117448
公開日2002年11月27日 申請日期2002年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月17日
發(fā)明者徐定邦, 朱德芬, 史炳照, 徐文慧 申請人:徐定邦, 徐文慧