專利名稱：一種乙內(nèi)酰脲酶系及其編碼基因與生產(chǎn)菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶系及其編碼基因與生產(chǎn)菌，特別是一種乙內(nèi)酰脲酶系及其編碼基因與生產(chǎn)菌。
乙內(nèi)酰脲酶系在動(dòng)物、植物和微生物中分布廣泛，尤其以在微生物種群中分布較為廣泛。乙內(nèi)酰脲酶系的主要應(yīng)用是進(jìn)行各種氨基酸的酶法生產(chǎn)，不僅可用于各種天然氨基酸的酶法生產(chǎn)，還可用來(lái)生產(chǎn)D-型氨基酸以及各種D-或L-型的非天然氨基酸。
一種乙內(nèi)酰脲酶系的編碼基因，它具有下列序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同蛋白質(zhì)的DNA序列。
一種乙內(nèi)酰脲酶系，由下述3種蛋白質(zhì)組成1)具有序列表中序列2的氨基酸序列的乙內(nèi)酰脲消旋酶或?qū)⑿蛄?的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有乙內(nèi)酰脲消旋酶活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)；2)具有序列表中序列3的氨基酸序列的乙內(nèi)酰脲水解酶或?qū)⑿蛄?的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有乙內(nèi)酰脲水解酶活性的由序列3衍生的蛋白質(zhì)；3)具有序列表中序列4的氨基酸序列的N-氨甲酰氨基酸水解酶或?qū)⑿蛄?的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有N-氨甲酰氨基酸水解酶活性的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種上述乙內(nèi)酰脲酶系的高效生產(chǎn)菌。
本發(fā)明提供的上述乙內(nèi)酰脲酶系的生產(chǎn)菌是節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BT801CGMCC No0734及其功能相同的突變體或變異體。
節(jié)桿菌(Arthrobacter dp.)BT801已于2002年03月26日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡(jiǎn)稱為CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCC No0734。
本發(fā)明的節(jié)桿菌從沈陽(yáng)市渾河地區(qū)污泥中分離得到，為革蘭氏染色陽(yáng)性菌，不抗酸，不分解纖維素，接觸酶陽(yáng)性，于脫脂牛奶中加熱至63℃15分鐘不存活。菌體在生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)歷一個(gè)球狀—桿狀—球狀的周期性變化。菌株在GYP或LB平板上生長(zhǎng)良好，菌落為圓形且邊緣整齊。在暗培養(yǎng)條件下菌落呈乳白色，在光照條件下轉(zhuǎn)為乳黃至深黃色。
乙內(nèi)酰脲酶系產(chǎn)生菌Arthrobacter BT801的染色體DNA，經(jīng)Sau3A I部分酶切后分離30kb左右的片段，與經(jīng)Hpa I和Pst I酶切的黏粒載體pKC505進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物用包裝蛋白包裝，轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5α，得到轉(zhuǎn)化子。利用薄層層析的方法從轉(zhuǎn)化子中篩選得到陽(yáng)性克隆，通過(guò)亞克隆得到了序列表中序列1的乙內(nèi)酰脲酶系的完整基因，該基因能利用自身的啟動(dòng)子在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)生有活性的序列表中序列2、序列3、序列4的蛋白。
本發(fā)明的乙內(nèi)酰脲酶系具有廣泛的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。光學(xué)活性氨基酸在醫(yī)藥和食品行業(yè)應(yīng)用非常廣泛，氨基酸的酶法生產(chǎn)是目前生產(chǎn)氨基酸的主要手段之一。乙內(nèi)酰脲酶系能夠?qū)?-位單取代乙內(nèi)酰脲類化合物特異水解為氨基酸。例如，L-色氨酸可作為氨基酸輸液的成份和飼料添加劑，市場(chǎng)潛力很大，有關(guān)L-色氨酸酶法生產(chǎn)的報(bào)道很多，其中利用乙內(nèi)酰脲酶系以5-吲哚甲基乙內(nèi)酰脲為生產(chǎn)原料的路線頗受關(guān)注。尤其是利用本發(fā)明的酶系生產(chǎn)苯丙氨酸具有重要的經(jīng)濟(jì)實(shí)用意義。又如，L-苯丙氨酸是二肽甜味劑天冬甜精的主要原料，在這種甜味劑的生產(chǎn)成本中占相當(dāng)比重，由5-芐基乙內(nèi)酰脲酶法生產(chǎn)，方法新穎，前景樂(lè)觀。此外一些難于發(fā)酵生產(chǎn)的脂肪族氨基酸如L-纈氨酸、L-丙氨酸和L-異亮氨酸等亦可望通過(guò)本發(fā)明的乙內(nèi)酰脲酶系進(jìn)行酶法生產(chǎn)。本發(fā)明的乙內(nèi)酰脲酶具有L-和D-兩種不同立體選擇性，相應(yīng)水解產(chǎn)物也可為L(zhǎng)-或D-型的手性氨基酸，尤其對(duì)于一些不能直接通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)的D-型氨基酸和非蛋白質(zhì)氨基酸，乙內(nèi)酰脲酶更獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。
利用乙內(nèi)酰脲酶酶法生產(chǎn)氨基酸的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)還在于，酶促水解過(guò)程不僅僅是選擇性水解外消旋底物中的一種異構(gòu)體，而且能夠利用乙內(nèi)酰脲類化合物的消旋作用將其對(duì)映體不斷轉(zhuǎn)化為可被酶解的那種異構(gòu)體，因此在理論上乙內(nèi)酰脲酶酶法生產(chǎn)氨基酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)100％，而且消旋作用與酶促水解可以在同一個(gè)體系中同時(shí)進(jìn)行，使工藝大大簡(jiǎn)化。堿性條件可以催化乙內(nèi)酰脲的消旋，但通常這種化學(xué)消旋是一個(gè)非常緩慢的過(guò)程。例如在室溫和pH8.5的條件下，20h只有10％L-吲哚甲基乙內(nèi)酰脲(L-IMH)轉(zhuǎn)化為D-IMH。而乙內(nèi)酰脲消旋酶可以在生理?xiàng)l件下高效率地催化乙內(nèi)酰脲類化合物的消旋，在乙內(nèi)酰脲酶酶法生產(chǎn)氨基酸中具有重要作用。此外，根據(jù)對(duì)地球原始環(huán)境的推測(cè)和分析，原始水圈的氨基酸可能多以對(duì)應(yīng)的N-氨甲酰氨基酸或乙內(nèi)酰脲類化合物的形式存在。乙內(nèi)酰脲酶還被認(rèn)為是在微生物三界系統(tǒng)形成之前就已經(jīng)存在的一種將N-氨甲酰氨基酸或乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化為游離氨基酸的原始酶類，因此乙內(nèi)酰脲酶及其產(chǎn)生菌是研究生命起源和進(jìn)化的重要生物材料。
下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
圖2為酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的紅外光譜圖。
圖3為酶解產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。
2、轉(zhuǎn)化反應(yīng)及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離精制將5g DL-5-芐基乙內(nèi)酰脲(可以按照水野正.JP.1985，60-11473和段々英則，水野正.JP.1985，60-11457的方法合成)和由上述步驟中100ml培養(yǎng)液得到的BT801菌體與含0.5mmol/L CoC12的PBS混合，于45℃保溫?cái)嚢璺磻?yīng)24小時(shí)，待不溶的底物消失且用Ehrlish試劑檢測(cè)中間產(chǎn)物顯色反應(yīng)微弱時(shí)停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。將反應(yīng)混合物于10000r/min離心15min，上清液通過(guò)732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，用蒸餾水洗2次，再用0.2mmol/L NH4OH洗脫，收集紫外吸收強(qiáng)的組分，減壓濃縮，調(diào)pH至5.48，加2倍乙醇，冷卻使結(jié)晶。收集析出的結(jié)晶，再溶于水，用乙醇重結(jié)晶，得到約2g精制產(chǎn)物。
3、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的鑒定對(duì)該酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行了薄層層析、熔點(diǎn)、元素分析、旋光等理化分析及紫外、紅外和質(zhì)譜等光譜學(xué)分析，結(jié)果如表1、

圖1、圖2及圖3所示。
表1酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物物理常數(shù)的測(cè)定結(jié)果轉(zhuǎn)化產(chǎn)物 標(biāo)準(zhǔn)品薄層層析Rf0.65 0.65比旋光度[α]20D-34.2-34.5熔點(diǎn)℃ 235 237元素分析CHN 65.366.798.3165.456.668.48圖1中，A為L(zhǎng)-苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(日本味之素公司產(chǎn)品)；B為轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；所用儀器為Shimadzu UV-2201，樣品濃度為0.82mg/ml。圖2中，曲線A為L(zhǎng)-苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(日本味之素公司產(chǎn)品)；曲線B為轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。圖3中，A為L(zhǎng)-苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(日本味之素公司產(chǎn)品)；B為轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；轟擊電子能量為70ev，加速電壓為6KV。
從表1及圖1-3中的結(jié)果可以看出BT801轉(zhuǎn)化DL-5-芐基乙內(nèi)酰脲所得產(chǎn)物確為L(zhǎng)-苯丙氨酸。
序列表<160>4<210>1<211>4261<212>DNA<213>人工序列<400>1gatctacacc tattgggcag gattcaactg gccggcactc ggcgtgtatg tcgccgcgct60gctgttgtcc ctgctcacgc ccgatctcat gtttgtcaca ggtctcgttg catccggaat120tctgcattat ctagtgatga agttctgggt ctcgaagacg aatcccctgt cctcaagtac180cgaggacctg aacgcgaagt accttgttcc ggcagatgcg caggagcgcg ccccggaaac240cacaccaccg gctgtacagg agtaaacgat gcgaattcat atcatcaacc cgaacagctc300gtcggagttg accgaggcgg tagccgagac tgcacgaagc gttgtctcag ctggcaccgc360ggtcaccgca gtcaatccat cttcggggcc ggccgttatc gaaggcagct acgatgaggc420actggccacg taccaccttg tacaggaggt gatgcgtgcg gaacgggaag acaggccgga480cgcttacgta attgcctgtt tcggtgatcc aggcctgaat gcagtgaggg agctgacaga540gaagcctgtc gttggaatcg ccgaggctgc catccaactg tcatcgttta tcggcgcaac600tttctccata gtgagcacgc ttccacgcgt gcgaagccac ctccacgggc tcgttcgccg660cgcgggagca acaaaccgcc ttgcctcagt caaaacgccg gatctcggtg taatggcatt720ccatgaagac gccggcagcg cccaagccac cctcgaacag gccgctaaag aagccgtgca780agaagacggc gccgaagtcg ttgttcttgg atgcgccggc atggccggtc 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Arg Ile His Ile Ile Asn Pro Asn Ser Ser Ser Glu Leu Thr1 5 10 15Glu Ala Val Ala Glu Thr Ala Arg Ser Val Val Ser Ala Gly Thr20 25 30Ala Val Thr Ala Val Asn Pro Ser Ser Gly Pro Ala Val Ile Glu35 40 45Gly Ser Tyr Asp Glu Ala Leu Ala Thr Tyr His Leu Val Gln Glu50 55 60Val Met Arg Ala Glu Arg Glu Asp Arg Pro Asp Ala Tyr Val Ile65 70 75Ala Cys Phe Gly Asp Pro Gly Leu Asn Ala Val Arg Glu Leu Thr80 85 90Glu Lys Pro Val Val Gly Ile Ala Glu Ala Ala Ile Gln Leu Ser95 100 105Ser Phe Ile Gly Ala Thr Phe Ser Ile Val Ser Thr Leu Pro Arg110 115 120Val Arg Ser His Leu His Gly Leu Val Arg Arg Ala Gly Ala Thr125 130 135Asn Arg Leu Ala Ser Val Lys Thr Pro Asp Leu Gly Val Met Ala140 145 150Phe His Glu Asp Ala Gly Ser Ala Gln Ala Thr Leu Glu Gln Ala155 160 165Ala Lys Glu Ala Val Gln Glu Asp Gly Ala Glu Val Val Val Leu170 175 180Gly Cys Ala Gly Met Ala Gly Leu Ala Arg Arg Leu Ser Glu Glu185 190 195Leu Gln Val Pro Val Ile Asp Pro Val Glu Ala Ala Cys Arg Val200 205 210Ala Glu Ser Leu Ser Ala Leu Gly Tyr Gly 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Ser Leu Leu Lys His Ser Pro Phe Asp Gly Met Pro Val Thr410 415 420Gly Lys Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val Val Ala Glu425 430 435Asn Gly Lys Ile Leu Val Glu Pro Gly Phe Gly Gln Phe Val Thr440 445 450Cys Arg Glu Ser Gln Asp Pro Lys455 458<210>4<211>412<212>PRT<213>人工序列<400>4Met Thr Ser Leu Arg Ala Gln Ala Asp Arg Ile Glu Lys Asp Ile15 10 15Arg Asp Leu Ala Arg Phe Ser Ala Gly Gly Pro Gly Val Thr Arg20 25 30Leu Ser Tyr Thr Pro Glu His Ala Ala Ala Arg Asp Leu Ile Ile35 40 45Ala Ala Met Gln Gln Ala Gly Leu Asp Val Arg Glu Asp Gly Leu50 55 60Gly Asn Ile Thr Gly Arg Arg Glu Gly Ser Asp Pro Asp Leu Pro65 70 75Ala Ile Ala Val Gly Ser His Phe Asp Ser Val Arg Asn Gly Gly80 85 90Met Phe Asp Gly Thr Ala Gly Val Val Cys Ala Leu Glu Ala Ala95 100 105Arg Val Val Asn Glu Ser Glu Tyr Val Asn Arg His Pro Phe Glu110 115 120Phe Ile Ala Ile Val Glu Glu Glu Gly Ser Arg Phe Asn Ser Gly125 130 135Met Leu Gly Gly Arg Ala Leu Ala Gly Leu Val Thr Asp Glu Asp140 145 150Leu Asp Lys Leu Lys Asp Glu Asp Gly Ile Ser Val Arg Asp Ala155 160 165Ala Thr Glu Phe Gly Leu Gln Pro Gly Asn Leu Gln Thr Ser Val170 175 180Arg Ser Arg Leu Asp Leu Arg Ala Phe Ile Glu Pro His Ile Glu185 190 195Gln Gly Pro Val Leu Glu Gln Glu Gly Ile Glu Ile Gly Val Val200 205 210Thr Ser Ile Val Gly Ile Arg Thr Leu Arg Val Ala Val Leu Gly215 220 225Arg Ser Asp His Ala Gly Thr Thr Pro Met His Leu Arg Gln Asp230 235 240Ala Leu Ile Pro Ser Ala Leu Met Val Arg Glu Val Asn Arg Leu245 250 255Val Asn Glu Leu Gly Asp Glu Thr Val Ala Thr Val Gly His Leu260 265 270Thr Val Ala Pro Gly Gly Ile Asn Gln Val Pro Gly Glu Val Asn
275 280 285Phe Thr Leu Asp Leu Arg Ser Pro His Glu Glu Ser Leu Lys Gln290 295 300Ile Val Lys Gln Ile Thr Val Met Ile Gln Glu Val Ala Ser Gln305 310 315Ala Glu Val Thr Ala Asn Val Glu Glu Phe Phe Ser Leu Asp Pro320 325 330Val Pro Leu Ala Pro Ser Val Val Asp Ala Val Arg Gln Ala Ala335 340 345Ser Asn Leu Arg Phe Ser His Arg Asp Met Pro Ser Gly Ala Gly350 355 360His Asp Ser Met Phe Ile Ser Gln Val Thr Asp Val Gly Met Val365 370 375Phe Val Pro Ser Arg Asp Gly Arg Ser His Val Pro Glu Glu Trp380 385 390Ser Asp Phe Asp Asp Leu Arg Lys Gly Thr Asp Val Val Leu Gly395 400 405Val Met Thr Ala Leu Asp Lys410 41權(quán)利要求
1.一種乙內(nèi)酰脲酶系的編碼基因，它具有下列序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同蛋白質(zhì)的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于所述乙內(nèi)酰脲酶系的編碼基因是序列1的DNA序列。
3.一種乙內(nèi)酰脲酶系，由下述3種蛋白質(zhì)組成1)具有序列表中序列2的氨基酸序列的乙內(nèi)酰脲消旋酶或?qū)⑿蛄?的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有乙內(nèi)酰脲消旋酶活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)；2)具有序列表中序列3的氨基酸序列的乙內(nèi)酰脲水解酶或?qū)⑿蛄?的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有乙內(nèi)酰脲水解酶活性的由序列3衍生的蛋白質(zhì)；3)具有序列表中序列4的氨基酸序列的N-氨甲酰氨基酸水解酶或?qū)⑿蛄?的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有N-氨甲酰氨基酸水解酶活性的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的乙內(nèi)酰脲酶系，其特征在于所述乙內(nèi)酰脲酶系由具有序列表中序列2的氨基酸序列的乙內(nèi)酰脲消旋酶、具有序列表中序列3的氨基酸序列的乙內(nèi)酰脲水解酶和具有序列表中序列4的氨基酸序列的N-氨甲酰氨基酸水解酶組成。
5.節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BT801 CGMCC No0734及其功能相同的突變體或變異體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種乙內(nèi)酰脲酶系及其編碼基因與生產(chǎn)菌。本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)化效率較高的乙內(nèi)酰脲酶系及其編碼基因。本發(fā)明乙內(nèi)酰脲酶系的編碼基因，具有下列序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明的乙內(nèi)酰脲酶系，由下述3種蛋白質(zhì)組成1)具有乙內(nèi)酰脲消旋酶活性的序列2蛋白質(zhì)；2)具有乙內(nèi)酰脲水解酶活性的序列3蛋白質(zhì)；3)具有N－氨甲酰氨基酸水解酶活性的序列4蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的上述乙內(nèi)酰脲酶系的生產(chǎn)菌是節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BT801CGMCC №0734。本發(fā)明的乙內(nèi)酰脲酶系具有生產(chǎn)氨基酸等廣泛的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/61GK1458276SQ02116788
公開(kāi)日2003年11月26日 申請(qǐng)日期2002年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月13日
發(fā)明者張惟材 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所