專利名稱：中國(guó)人胸腺素α原及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及中國(guó)人胸腺素α原編碼基因。
在T淋巴細(xì)胞分化成熟的過(guò)程中，胸腺上皮細(xì)胞分泌的多種肽類激素起著重要作用。Goldstein最先從胸腺素組分中分離到胸腺素α1(thymosinα)，它是一個(gè)含有28個(gè)氨基酸殘基的多肽，胸腺素α1具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用，目前臨床上用于治療病毒性肝炎，療效較好。人工合成及大腸桿菌表達(dá)的胸腺素α1具有相同的生物學(xué)活性。
Haritos等在液氮中直接勻漿新鮮大鼠胸腺，分離蛋白時(shí)，未分離得到胸腺素α1，而得到了分子量約為12Kda的新組分。序列分析表明，它含有111個(gè)氨基酸殘基，其N-末端的前28個(gè)氨基酸殘基為胸腺素α1序列，故稱該組分為胸腺素α原(prothymosin，縮寫為Pro Tα)。
人的Pro Tα基因位于第2號(hào)染色體上，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。人胸腺素α原與大鼠胸腺素α原不同，為109個(gè)氨基酸殘基的多肽；其cDNA的起始密碼子ATG后面緊接著的是胸腺素α原的成熟肽，即胸腺素α 1的序列，胸腺素α原cDNA上游和下游均無(wú)疏水氨基酸密集區(qū)域，顯示其無(wú)信號(hào)肽。同時(shí)，胸腺素α原也無(wú)N-糖基化位點(diǎn)。在胸腺素α原氨基酸殘基中，酸性的谷氨酸聚集成簇，約占整個(gè)氨基酸殘基的32％；而胸腺素α原的C-末端有很多核蛋白共有Lys-Lys-Gln-Lys片段，所述片段可能為核定位信號(hào)；提示胸腺素α原可能作為核蛋白，在核內(nèi)發(fā)揮生理作用。Manrow等的工作為此提供了依據(jù)，他們將人胸腺素α原基因與β一半乳糖苷酶基因融合，不論β一半乳糖在N端還是C末端，轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后，該融合蛋白皆出現(xiàn)于細(xì)胞核內(nèi)，而單獨(dú)的β一半乳糖苷酶則僅分布于胞漿內(nèi)，與胸腺素α原融合后方顯示該特性。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種中國(guó)人的胸腺素α原及其制備方法；即通過(guò)用植物血球凝聚素(PHA)和重組人白細(xì)胞介素1(IL-1)聯(lián)合刺激胎兒胸腺細(xì)胞，從中提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR獲得了人胸腺素α原cDNA；將其克隆到pUC19中，經(jīng)序列分析表明，與已報(bào)道的序列相比較，在N-端第38位的堿基C變?yōu)門。然后將所得的cDNA克隆到原核表達(dá)載體pBV220，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從而得到大腸桿菌中以可溶形式表達(dá)的胸腺素α原，這個(gè)胸腺素α原與文獻(xiàn)報(bào)道的肽鏈相比，在第13位的氨基酸殘基不同，由蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼?。?jīng)活性測(cè)定表明，它可明顯刺激人外周血淋巴細(xì)胞E-玫瑰花結(jié)的形成率。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，本發(fā)明人制備的胸腺素α原可提高老年小鼠血漿IgG水平，明顯增加老年小鼠已萎縮的胸腺和脾臟的重量，提高胸腺細(xì)胞CD8和脾臟細(xì)胞CD4的比例，顯著提高特異性抗體溶血素的產(chǎn)生；并且胸腺素α原還可刺激甲狀腺激素產(chǎn)生的作用。這些結(jié)果表明，胸腺素α原可以進(jìn)一步開發(fā)成為免疫功能調(diào)節(jié)的藥物。
本發(fā)明涉及的中國(guó)人胸腺素α原cDNA序列如下5’cggaattc atg tct gat gca gct gta gat acc agc tcc gaa atc accacc aag gac tta aag gag aag aag gaa gtt gtg gaa gag gca gaa aat ggaaga gac gcc cct gct aac ggg aat gct aat gag gaa aac ggg gag cag gaggct gac aat gag gta gac gaa gaa gag gaa gaa ggt ggg gag gaa gag gaggag gaa gaa gaa ggt gat ggt gag gaa gag gat gga gat gaa gat gag gaagct gag tca gct acg ggc aag cgg gca gct gaa gat gat gag gat gac gatgtc gat acc aag aag cag aag gcc gac gag gat gac taa ggatcccg3’本發(fā)明涉及制備人胸腺素α原的方法，包括(a)合成富含A，T的引物；引物I 5’CGG AAT TCA TGT CTG ATG CAG CTG TAG ATA CCA G 3’引物II5’CGG GAT CCT TAG GTC ATC CTC GTC GGT C 3’(b)用(a)中合成的引物為模板合成胸腺素α原cDNA.；(c)將(b)得到的cDNA.克隆到表達(dá)載體中；(d)用所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞；(e)培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞，將所述細(xì)胞破碎后，從上清液中回收所表達(dá)的胸腺素α原。
其中所述的表達(dá)載體選自pBV220，pET32a。
其中所述的原核細(xì)胞為大腸桿菌。
其中所述的大腸桿菌選自大腸桿菌DH5a，JM101。
中國(guó)人胸腺素α原有調(diào)節(jié)免疫功能的作用。


圖1表示檢測(cè)胸腺總RNA的RT-PCR產(chǎn)物。APGEM7ZF(+)-Hae IIIMark，BRT-PCR產(chǎn)物。
圖2表示重組質(zhì)粒pUC19的限制酶裂解分析。A胸腺素α原cDNA對(duì)照B、C、D陽(yáng)性克隆菌株。
圖3表示中國(guó)人的胸腺素α原的cDNA序列。
圖4表示胸腺素α原表達(dá)的結(jié)果A對(duì)照菌，B、C、D不同培養(yǎng)基中胸腺α原的表達(dá)結(jié)果。
1.2培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基和高濃度培養(yǎng)基配方見參考文獻(xiàn)8。玉米漿培養(yǎng)基為10.4％玉米漿和0.5％的水解酪蛋白，調(diào)PH至7.0。
1.3酶制劑及其他試劑限制性內(nèi)切酶EcorI，BamhI及T4DNA連接酶均購(gòu)自Promega公司，總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄等試劑也購(gòu)自Promega公司，ITPG為中科院生態(tài)環(huán)境研究中心產(chǎn)品，植物血球凝集素IL-2等皆為標(biāo)準(zhǔn)試劑。
1.4引物合成本發(fā)明人設(shè)計(jì)出胸腺素α原的適合引物，從而使以所述引物合成的cDNA在原核生物細(xì)菌，特別是大腸桿菌中表達(dá)，能夠使胸腺素α原的表達(dá)產(chǎn)率大大提高。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，增加上游引物中的A，T含量，就可以明顯地提高胸腺素α原的表達(dá)。
引物I 5’CGG AAT TCA TGT CTG ATG CAG CTG TAG ATA CCA G 3’引物II5’CGG GAT CCT TAG GTC ATC CTC GTC GGT C 3’其中引物I為上游引物，引物II為下游引物，所述引物用美國(guó)ABI公司的391EPDNA合成儀合成。
1.5人胎兒胸腺細(xì)胞的培養(yǎng)取四月齡胎兒胸腺，制備成單個(gè)細(xì)胞，懸浮于RPMI1640培養(yǎng)液中，細(xì)胞密度為1×107/ml，在20ug/ml的PHA和500U/ml的IL-2聯(lián)合刺激下，于37℃，5％CO2下培養(yǎng)24小時(shí)。
1.6胸腺細(xì)胞總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄PCR取刺激培養(yǎng)的胸腺細(xì)胞，按Promega公司的總RNA試劑盒方法提取細(xì)胞的總RNA，最后，溶于滅菌的去離子水中，取一定量的RNA，加下游引物和dNTP，在42℃下，反轉(zhuǎn)錄酶作用30分鐘，將胸腺素α原mRNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，進(jìn)一步加入上游引物及TaqDNA聚合酶后，進(jìn)行如下步驟先在94℃變性2分鐘，50℃退火1分鐘，71℃延伸1分鐘，再在94℃1分鐘，50℃1分鐘，和72℃1分鐘進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸7分鐘。
1.7按Sambrook等人(分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南，第二版，1992，科學(xué)出版社，金冬雁等)的方法進(jìn)行DNA重組及其鑒定。按Sanger雙脫氧末端終止法進(jìn)行序列分析。
1.8玫瑰花結(jié)實(shí)驗(yàn)用淋巴細(xì)胞分離液分離健康人外周血單核細(xì)胞，用Hanks液配成2×106/ml，實(shí)驗(yàn)管加一定量的胸腺素α原表達(dá)上清液，對(duì)照則加相同對(duì)照菌上清液于30℃水浴90分鐘，加0.5％的綿羊紅細(xì)胞后，涂片，染色，于高倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞中形成玫瑰花結(jié)的細(xì)胞數(shù)(結(jié)合4個(gè)及以上綿羊紅細(xì)胞)，計(jì)算玫瑰花形成細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，可用公式求得表達(dá)上清液的激活率。 1.9重組人胸腺素α原對(duì)老齡小鼠免疫功能的影響選用15月齡的25只雌性昆明種小鼠作為衰老模型。小鼠群養(yǎng)，自由攝食、攝水。隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組每日腹腔注射腺素α原300ng/只，對(duì)照組每日腹腔注射生理鹽水，實(shí)驗(yàn)期為三周。處死前四天，腹腔注射綿羊紅細(xì)胞0.4ml/只(約含紅細(xì)胞20億)，觀察特異性抗體溶血素產(chǎn)生情況；處死后取血、胸腺和脾臟。
血漿IgG水平的測(cè)定用免疫單擴(kuò)散定量法。
溶血素測(cè)定采用微量法。血漿稀釋500倍，加0.2％的羊紅細(xì)胞和10％的豚鼠血清，高鐵血紅素法測(cè)定上清中血紅素含量，以反映機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的能力。按下列公式計(jì)算每只小鼠樣品半數(shù)溶血值HC50. 血漿甲狀腺激素水平測(cè)定采用放免法。
胸腺和脾臟指數(shù)是指小鼠每10g體重所具有的胸腺和脾臟mg數(shù)。
2.結(jié)果與討論2.1胸腺素α原cDNA的篩選體外培養(yǎng)人胚胎胸腺細(xì)胞，經(jīng)PHA和IL-2聯(lián)合刺激，提取的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR，瓊脂糖凝膠電泳可觀察到有一條明顯的DNA帶，其分子量與胸腺素α原cDNA的大小相符，結(jié)果示于圖1。
2.2胸腺素α原cDNA的克隆，篩選及序列測(cè)定常規(guī)低熔點(diǎn)瓊脂糖回收法，經(jīng)RT-PCR得到的特異帶，用EcoRI和BamH I雙酶切處理，在T4DNA連接酶的作用下，克隆入經(jīng)相同消化的Puc19中，轉(zhuǎn)化常規(guī)CaC12處理的JM101感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在含X-gal的瓊脂平板上挑選白色菌落，用EcoR I和BamH I雙酶切鑒定，可見一特異帶被所述酶切出來(lái)，其分子量與胸腺素α原RT-PCR產(chǎn)物一致，結(jié)果見于圖2。
挑出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，用Promega公司的質(zhì)粒純化系統(tǒng)提取質(zhì)粒，用GibcoBLRL公司的雙鏈測(cè)序系統(tǒng)測(cè)序，測(cè)得的胸腺素α原cDNA序列與文獻(xiàn)報(bào)道的一致。
2.3胸腺素α原cDNA在大腸桿菌中的表達(dá)將獲得的胸腺素α原cDNA克隆入表達(dá)載體pBV220，然后轉(zhuǎn)化DH5a。于30℃培養(yǎng)4小時(shí)后，42℃熱誘導(dǎo)4小時(shí)，胸腺素α原的表達(dá)量約占細(xì)菌總蛋白的15～20％左右(圖4)。
2.4表達(dá)產(chǎn)物初步活性的測(cè)定將克隆有胸腺素α原的cDHA菌大量培養(yǎng)，超聲破碎，將上清液和沉淀物分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果胸腺素α原蛋白帶出現(xiàn)于上清液中，即它以可溶形式表達(dá)，不形成包涵體。將表達(dá)上清液加入外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液中，與綿羊紅細(xì)胞一起溫育，結(jié)果示于表1。由表1可見，胸腺素α原可明顯提高淋巴細(xì)胞玫瑰花結(jié)形成率，說(shuō)明大腸桿菌表達(dá)的胸腺素α原具有生物活性。由于它以可溶形式表達(dá)，因而不需要復(fù)性，只需從細(xì)菌蛋白中進(jìn)一步純化出胸腺素α原，即可用于免疫學(xué)活性的測(cè)定及臨床應(yīng)用。
表1. 胸腺素α原對(duì)T細(xì)胞E-致瑰花結(jié)形成率的影響組別 E-致瑰花結(jié)形成率活化率對(duì)照 45 0pBV220DH5a55.1 22.4ProTα-EXPrestione70.3 56.2
2.5胸腺素α原調(diào)節(jié)免疫功能的實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.5.1胸腺素α原對(duì)衰老小鼠胸腺、脾臟重量和指數(shù)的影響胸腺素α原對(duì)衰老小鼠胸腺和脾臟重量和指數(shù)的影響結(jié)果見表2。
表2.胸腺素α原對(duì)衰老小鼠胸腺脾臟重量和指數(shù)的影響組別n 胸腺(mg)胸腺指數(shù) 脾臟(mg)脾臟指數(shù)對(duì)照組 10 26.6±3.7 6.7±0.9 185.7±21.5 44.8±3.9ProTα 15 48.6±3.5*11.2±0.7*218.9±15.5*49.3±2.8**與對(duì)照結(jié)果相比較p＜005從表2可知，胸腺素α原可明顯提高已萎縮的胸腺和脾臟的重量，并且胸腺和脾臟指數(shù)的變化趨勢(shì)與重量是一致的。
2.5.2胸腺素α原對(duì)衰老小鼠血漿IgG的影響胸腺素α原可提高衰老小鼠血漿IgG的水平，但這種影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性，見表3。
2.5.3胸腺素α原對(duì)衰老鼠血漿溶血水平的影響溶血素為B淋巴細(xì)胞接受抗原刺激而產(chǎn)生的特異性抗體。衰老過(guò)程中特異性抗體的產(chǎn)生減少，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組胸腺素α原可明顯提高血漿溶血素水平，說(shuō)明胸腺素α原還也可調(diào)節(jié)老齡機(jī)體T細(xì)胞依賴的體液免疫功能。見表4。
表3.胸腺素α原對(duì)衰老小鼠血漿IgG的影響組別n IgG(g/L)對(duì)照105.93±3.29ProTα 106.47±2.51
表4.胸腺素α原對(duì)衰老鼠血漿溶血素水平的影響組別n溶血素(DC50)對(duì)照10142.5±6.0ProTα 15 204.0±17.6**與對(duì)照組結(jié)果相比較p＜0012.5.4胸腺素α原對(duì)衰老鼠血漿甲狀腺素水平的影響機(jī)體的內(nèi)分泌功能影響免疫功能，同時(shí)免疫功能也可能影響內(nèi)分泌功能。機(jī)體存在神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)，它在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，調(diào)節(jié)機(jī)體的功能狀態(tài)方面起重要作用。胸腺組織上存在甲狀腺激素和生長(zhǎng)激素的受體，表明它們可能具有調(diào)節(jié)胸腺細(xì)胞的作用。胸腺素α原對(duì)甲狀腺素和促甲狀腺激素TSH等的影響尚未見報(bào)道，本發(fā)明人測(cè)定了衰老小鼠甲狀腺激素的水平，以了解胸腺素α原對(duì)它們的影響，同時(shí)也測(cè)定了血清中腺垂體分泌的促甲狀腺激素TSH的變化，結(jié)果見表5。
表5.胸腺素α原對(duì)衰老鼠血漿甲狀腺素和促甲狀腺激素TSH水平的影響組別n T4(ng/ml) T3(ng/ml) TSH(UIU/ml)對(duì)照1020.89±3.98 0.74±0.08 0.64±0.04ProTα 1036.90±2.85*0.90±0.07*0.47±0.05**與對(duì)照組結(jié)果相比較p＜0.01從表5可知，胸腺素α原可明顯提高血漿甲狀腺素T4和T3的水平。補(bǔ)充胸腺素α原可使血清中TSH的水平明顯降低，這可能與較高水平的T3、T4反饋性抑制腺垂體分泌TSH有關(guān)。
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權(quán)利要求
1.一種中國(guó)人的胸腺素α原編碼基因，其特征是cDNA序列如下5’cggaattc atg tct gat gca gct gta gat acc agc tcc gaa atc accacc aag gac tta aag gag aag aag gaa gtt gtg gaa gag gca gaa aat ggaaga gac gcc cct gct aac ggg aat gct aat gag gaa aac ggg gag cag gaggct gac aat gag gta gac gaa gaa gag gaa gaa ggt ggg gag gaa gag gaggag gaa gaa gaa ggt gat ggt gag gaa gag gat gga gat gaa gat gag gaagct gag tca gct acg ggc aag cgg gca gct gaa gat gat gag gat gac gatgtc gat acc aag aag cag aag gcc gac gag gat gac taa ggatcccg3’
2.一種制備胸腺素α原的方法，其特征包括(a)合成富含A，T的引物；引物I 5’CGG AAT TCA TGT CTG ATG CAG CTG TAG ATA CCA G 3’引物II5’CGG GAT CCT TAG GTC ATC CTC GTC GGT C 3’(b)用(a)中合成的引物為模板合成胸腺素α原cDNA；(c)將(b)得到的cDNA.克隆到表達(dá)載體中；(d)用所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞；(e)培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞，將所述細(xì)胞破碎后，從上清液中回收所表達(dá)的胸腺素α原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是其中所述的表達(dá)載體選自pBV200，pET32a。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是其中所述的原核細(xì)胞為大腸桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征是其中所述的大腸桿菌選自大腸桿菌DH5a，JM101。
6.按照權(quán)利要求1～5制備的中國(guó)人胸腺素α原的方法，其特征是有調(diào)節(jié)免疫功能的作用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，中國(guó)人胸腺素α原通過(guò)用植物血球凝集素和重組人白細(xì)胞介素1聯(lián)合刺激胎幾胸腺細(xì)胞，從中提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR獲得人胸腺素α原cDNA。它可明顯刺激人外周血淋巴細(xì)胞E－玫瑰花結(jié)的形成率，亦可顯著提高老年小鼠血漿IgG水平，特異性抗體溶血素的產(chǎn)生，可進(jìn)一步開發(fā)成為免疫功能調(diào)節(jié)的藥物。
文檔編號(hào)C12N15/16GK1436847SQ02100578
公開日2003年8月20日 申請(qǐng)日期2002年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月6日
發(fā)明者劉佃辛, 馬清鈞, 金宏, 王先遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所