專利名稱：重組人胸腺素α原在制備預防及治療脂肪肝藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種胸腺素a原，尤其是涉及胸腺素a原在預防及治療脂肪肝藥物中的應用。
背景技術：
脂肪肝是指由于各種原因引起的肝細胞內脂肪堆積過多的病變。脂肪性肝病正嚴重威脅國人的健康，成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病，己被公認為隱蔽性肝硬化的常見原因。脂肪肝是一種常見的臨床現(xiàn)象，而非一種獨立的疾病。其臨床表現(xiàn)是輕者無癥狀，重者病情兇猛。 一般而言，脂肪肝屬可逆性疾病，早期診斷并及時治療?？苫謴驼?。正常人的肝內總脂肪量，約占肝重的5%，內含磷脂、甘油三酯、脂酸、膽固醇及膽固醇脂。脂肪量超過5%為輕度脂肪肝，超過10%為中度脂肪肝，超過25%為重度脂肪肝。當肝內總脂肪量超過30%時，用B超才能檢査出來，被B超檢査確診為"脂肪肝"。而脂肪肝患者，總脂量可達40%-50%，有些達60%以上，主要是甘油三酯及脂酸，而磷脂、膽固醇及膽固醇脂只少量增加。
根據(jù)脂肪肝發(fā)病原因，脂肪肝分為肥胖性脂肪肝、酒精性脂肪肝、營養(yǎng)失調性脂肪肝、藥物性脂肪肝、妊娠急性脂肪肝、糖尿病性脂肪肝等。根據(jù)肝組織病理學變化，可將脂肪肝分為三個時期I期為不伴有肝組織炎癥反應的單純性脂肪肝，II期為伴有肝組織炎癥和纖維化的脂肪性肝炎，III期為脂肪性肝硬化。
脂肪肝是一種常見的臨床現(xiàn)象，而非一種獨立的疾病。引起脂肪肝的病因很多，其臨床表現(xiàn)輕者無癥狀，重者病情兇猛，主要表現(xiàn)為肝臟受損。 一般而言，脂肪肝屬可逆性疾病早期診斷并及時治療?？苫謴驼！Ｖ委熢瓌t是去除病因調整飲食，增加運動，合理用藥。
近年來，隨著物質供應的豐富和生活方式的改變，超重與肥胖的發(fā)病率與日俱增，長期高糖、高脂肪和高膽固醇食物是引起糖尿病和肥胖的重要外因之一。肥胖不僅對于心血管危害嚴重，而且肥胖也是2型糖尿病獨立的高危因素，80% 90%的2型糖尿病患者伴有超重或肥胖。體重的增加與患2型糖尿病的危險性高度相關。目前比較流行的是使用體重指數(shù)(BM I )來判斷人是否超重或者肥胖，體重指數(shù)BMI-體重(kg) +身高的平方(m2)，正常BMI值在18—24之間。如果把BMK23的糖尿病發(fā)病風險定為1.0，則BMI》25的風險為5.5，即患糖尿病的危險性增加了 5.5倍；BMI》30的風險為25， BMI》35kg/m2的風險為72。肥
3胖患病率越高的國家，糖尿病的患病率也越高，如太平洋島國瑙魯，70%人群為肥胖，近一半的國民為糖尿病患者。肥胖，是形成2型糖尿病的環(huán)境因素中最重要的，肥胖是2型糖尿病自然病程的起源。肥胖先引起胰島素抵抗(胰島素降血糖的效應下降)，胰島代償性分泌更多的胰島素，以保持糖代謝正常，此時患者會有高胰島素血癥。當胰島出現(xiàn)缺陷吋，胰島素分泌量代償不了胰島素抵抗，則導致餐后血糖升高，又稱為糖耐量減低(IGT)。 IGT進一步損害胰島功能，當空腹血糖升高超過7.0mmol/L和(或)餐后血糖超過11.1mmol/L時，患者就被診斷為2型糖尿病。腹部肥胖又被稱為中心性肥胖，更易造成胰島素抵抗。中心性肥胖是指腰圍男性^90cm，女性》85cm，主要是由內臟脂肪增多堆積造成的。內臟脂肪組織具有內分泌功能，它的增多使其分泌的激素水平發(fā)生紊亂，從而拮抗了胰島素的降糖作用；相反，皮下脂肪組織的內分泌功能相對較弱。因而，對于相同體重的肥胖者，中心性肥胖者的胰島素抵抗要比均勻性肥胖者更為嚴重，也更難以糾正。2型糖尿病發(fā)生后，人體糖代謝和脂代謝進一步紊亂，致使血糖升高、血脂升高、脂肪重新分布，也會一定程度上加重肥胖的程度。由此肥胖和2型糖尿病形成了互為因果的惡性循環(huán)。
1984年，Haritos等(1 、Haritos AA,Goodall GJ, Horecker BL, Prothymosin alpha:isolation andproperties of the major immunoreactive form of thymosin alphal in rat thymus. Proc Natl Acad SciU S A，1984，81:1008; 2、 Haritos AA. Alpha-thymosins: relationships in structure, distribution, andfiinction. Isozymes Curr Top Biol Med Res 1987; 14:123-152; 3、 Goodall GJ， Dominguez F，Horecker BL. Molecular cloning of cDNA for human prothymosin alpha. Proc Natl Acad Sci U S A1986; 83(23):8926-8928; 4、 Pan LX, Haritos AA, Wideman J， Komiyama T， Chang M， Stein S et al.Human prothymosin alpha: amino acid sequence and immunologic properties. Arch BiochemBiophys 1986;250(1):197-201)從大鼠胸腺分離出一種含有111個氨基酸殘基的多肽，其N端含已發(fā)現(xiàn)的所有胸腺素a原家族成員的序列，因此命名為胸腺素a原，人ProTa由109個氨基酸殘基組成，與大鼠ProTa的序列相比，有6個位點的差異，包括4個位點的替代和2個位點的缺失。
1985年，Haritos等(Komiyama T， Pan LX, Haritos AA， et al. The primary structure of ratparathymosin. Proc Natl Acad Sci U S A 1986; 83(5): 1242-1245。)發(fā)現(xiàn)大鼠ProTA能增強小鼠抗白色念珠菌(Candida albicans)感染的能力。1986年Pan又發(fā)現(xiàn)ProTa能刺激轉移抑制因子(MIF)的釋放，其作用比Tal強10 20倍(1 、 Haritos AA，r.Blacher, S.Stein,J..Horecker.Parathymosin alpha:a peptide from rat tissues with structural homology to prothymosinalpha. Proc Natl Acad Sci USA, 82:1050-1053; 2、 Pan LX， Haritos AA， Wideman J， et al. Human
4prothymosin alpha: amino acid sequence and immunologic properties. Arch Biochem Biophys 1986;250(1): 197-201)。 1987年，Salvin等(1、 Salvin SB, Horecker BL, Pan LX, Rabin BS. The effectof dietary zinc and prothymosin alpha on cellular immune responses of RF/J mice. Clin ImmunolImmunopathol 1987; 43(3):281-288)發(fā)現(xiàn)腹腔注射ProTa能增強RF/J小鼠產生抗體的能力,鋅能加強這種作用，能使青年大鼠和老年大鼠的細胞免疫和體液免疫都增強。Papanastasiou(Papanastasiou M, Baxevanis CN， Papamichail M. Promotion of murine antitumor activity byprothymosin alpha treatment: I. Induction of tumoricidal peritoneal cells producing high levels oftumour necrosis factor alpha. Cancer Immunol Immunother 1992; 35(2):145-150。)發(fā)現(xiàn)，CBA/2小鼠如果腹腔接種腫瘤細胞，一般8 12天之內產生腹水，10 14天后死亡，20%的經過ProTa處理的小鼠不產生腹水，并能夠使不產生腹水中的40% 60%的小鼠壽命可以延長到70天。當腹腔注射ProTa時，能夠增強巨噬細胞、提高NK,LAK細胞的活性(1、Lopez-Rodriguez JL,Cordero OJ， Sarandeses C,. Interleukin-2 killer cells: in vitro evaluation of combination withprothymosin alpha. Lymphokine Cytokine Res 1994; 13(3): 175-182; 2、 Baxevanis CN, GritzapisAD, Dedoussis GV，. Induction of lymphokine -activated killer activity in mice by prothymosinalpha. Cancer Immunol Immunother 1994; 38(4):281-286);增強MHC限制的細胞免疫(1、Baxevanis CN， Thanos D, Reclos GJ， J et al. Prothymosin alpha enhances human and murine MHCclass II surface antigen expression and messenger RNA accumulation. J Immunol 1992;148(7): 1979-1984; 2、 Baxevanis CN， Thanos D, Reclos GJ, et al. Prothymosin alpha enhanceshuman and murine MHC class II surface antigen expression and messenger RNA accumulation. JImmunol 1992; 148(7):1979-1984)，抑制系統(tǒng)性紅斑狼疫(Baxevanis CN， Reclos CJ, PapamichailM et al. Prothymosin alpha restores the depressed autologous and allogenic mixed lymphocyteresponses in patient with systemic lupus erythematosus. Immuopharmaco immunotoxico, 1987,9:429)，促進IL-2，MIF的分泌和TN F-a， IFN-y的合成；促進IL-2受體的表達(1、Baxevanis CN，Gritzapis AD， Spanakos Q. Induction of tumor-specific T lymphocyte responses in vivo byprothymosin alpha. Cancer Immunol Immunother 1995; 40(6) :410-418; 2、 Lopez-Rodriguez JL,Cordero OJ， Sarandeses C,. Interleukin-2 killer cells: in vitro evaluation of combination .withprothymosin alpha. Lymphokine Cytokine Res 1994; 13(3):175隱182; 3、 Baxevanis CN, GritzapisAD, Dedoussis GV,. Induction of lymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha.Cancer Immunol Immunother 1994; 38(4):281-286; 4、 Voutsas IF, Baxevanis CN， Gritzapis AD, etal. Synergy between interleukin-2 and prothymosin alpha for the increased generation of cytotoxicT lymphocytes against autologous human carcinomas. Cancer Immunol Immunother 2000; 49(8):449-458; 5、 Cordero OJ, Sarandeses CS， Lopez JL， et al. Prothymosin alpha enhances IL-2 receptor expression in norma human T-lymphoctyes. Int J Immunpharmacol， 1991,13:1059)， 從而 產生非特異性腫瘤殺傷作用，同時,誘導腫瘤特異性細胞毒T細胞(CD8+)和輔助性T細胞 (CD4+)的特異性抗腫瘤作用。ProTa在疾病早期可以刺激淋巴因子激活的殺傷細胞 (lymphokien activated killer cells, LAK)活性，它是通過增加淋巴細胞與靶細胞的結合進而增 力口 IFN-y禾口 IL-2的分泌來實現(xiàn)的(1、 Lopez-Rodriguez JL， Cordero OJ， Sarandeses C，. Interleukin-2 killer cells: in vitro evaluation of combination with prothymosin alpha. Lymphokine Cytokine Res 1994; 13(3):175-182; 2、 Baxevanis CN， Gritzapis AD, Dedoussis GV,. Induction of lymphokine- activated killer activity in mice by prothymosin alpha. Cancer Immunol Immunother 1994; 38(4): 281-286)。單獨使用ProTa時可以刺激TNF-a和IL-2的分泌，如果與IL-2聯(lián) 合使用時，可增加NK細胞CD56， CD16/56和CD25及CD18/11黏附分子的表達。在IFN^ 存在的條件下，ProTa主要通過增加CD54 (細胞黏附分子配體)的表達，剌激單核細胞與集 結的腫瘤細胞的結合，達到清除腫瘤細胞的目的(1 、 Baxevanis CN, Gritzapis AD， Spanakos Induction of tumor-specific T lymphocyte responses in vivo by prothymosin alpha. Cancer Immunol Immunother 1995; 40(6):410-418; 2、 Lopez-Rodriguez JL, Cordero OJ， Sarandeses C，. Interleukin-2 killer cells: in vitro evaluation of combination with prothymosin alpha. Lymphokine Cytokine Res 1994; 13(3): 175-182; 3、 Baxevanis CN， Gritzapis AD, Dedoussis GV,. Induction of lymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha. Cancer Immunol Immunother 1994; 38(4):281隱286; 4、 Voutsas IF, Baxevanis CN, Gritzapis AD， et al. Synergy between interleukin-2 and prothymosin alpha for the increased generation of cytotoxic T lymphocytes against autologous human carcinomas. Cancer Immunol Immunother 2000， 49(8): 449-458。)。近 來研究表明，ProTa在DNA疫苗中還可以起到疫苗佐劑的效果(1、 Jin Y， Cao C， Li P， Liu X, Huang W, Li C et al. Boosting immune response to hepatitis B DNA vaccine by coadministration of Prothymosin alpha-expressing plasmid. Clin Diagn Lab Immunol 2005; 12(12): 1364-1369; 2、 Shiau AL, Chen CC， Yo YT, Chu CY, Wang SY， Wu CL. Enhancement of humoral and cellular immune responses by an oral Salmonella choleraesuis vaccine expressing porcine prothymosin alpha. Vaccine 2005; 23(48-49):5563-5571 )。
近來發(fā)現(xiàn)與ProTa同樣是"天然無結構蛋白"(natively unstructured protein)的一種核蛋白 P8與ProTa能夠形成復合物，將P8帶入核內，共同完成抗凋亡和促進細胞分裂的活性，并
6且發(fā)現(xiàn)如果兩者中只有其中一種蛋白高表達并沒有類似的功能，己經有許多研究表明P8在胰 島p細胞的增殖中發(fā)揮重要作用(Malicet C， Dagom JC, Neira JL, Iovanna JL.INSERM U.624, Stress Cellulaire, Marseille, France.p8 and prothymosin alpha: unity is strength.Cell Cycle. 2006;5(8):829-830)。
最新研究表明，ProTa能夠與Nrf2 - Keapl復合物中的Keapl相結合，使Nrf2從Keapl 抑制狀態(tài)脫離出來，Nrf2與Keapl的解偶連。脫離了束縛的Nrf2轉移進入細胞核內，與 Maf蛋白結合成異二聚體后識別并與ARE結合，啟動第II相解毒酶和抗氧化應激蛋白基因 的轉錄，提高細胞抗氧化應激能力。研究結果發(fā)現(xiàn)，ProTa與Nrf2 - Keapl復合物中的Keapl 結合是特異性的，突變的ProTa (MProTa)無法行使該功能。廣泛存在的ProTa為細胞內恒 定的抗氧化基因的基本水平的表達，以達到防止細胞被氧化損傷的目的發(fā)揮了重要作用。 (Olga V. Markova, Alexandra G. Evstafieva, Svetlana E. Mansurova， Sergey S. Moussine, Larisa A. Palamarchuk, Mikhail O. Pereverzev， Andrey B. Vartapetian and Vladimir P. Skulachev， Prothyomosin alpha interaction with KEAP1 doesn't lead to prothymosin alpha ubiquination and degradation，Mol Biol (Mosk). 2007 ，41(5):868-875)。
至今還未發(fā)現(xiàn)任何有關胸腺素a原與預防和治療脂肪肝以及在抑制肥胖肥胖方面的相 關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供胸腺素a原，特別是重組人胸腺素a原在制備預防及治療脂肪肝 藥物中的應用。
本發(fā)明所述重組人胸腺素a原基因序列為 atgtcagacg cagccgtaga caccagctcc gaaatcacca ccgaggactt ssaggagaag 60 aagggsgttg tggssgsggc gg3333tgg3 sgsgscgccc ctgctcscgg gsstgctsst 120 gaggaasatg gggsgccggs ggctgscaisc gaggtagatg a3ga3g3gga sgsaggtggg 180 gaggaagaag gtgatggtga ggaagaggat ggagatgaag atgagggagc tgagtcsgct 240 acgggcssgc gggcagctga sgatgatgag gstascgatg tcgataccca gasgcsgsag 300 sccgscgsgg 3tgsct3g。
相應的蛋白序列為 Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser SerGlu lie Thr Thr Glu Asp Leu Lys Glu Lys Lys Gly Val Val Glu-Glu Ala Glu Asn Gly Arg Asp Ala Pro Ala His Gly Asn Ala Asn Glu Glu Asn Gly Glu Pro Glu Ala Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly GlyGlu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Asp Gly Asp Glu Asp Glu Gly Ala Glu Ser Ala Thr Gly Lys Arg Ala Ala Glu Asp Asp GluAsp Asn Asp Val Asp Thr Gin Lys Gin Lys Thr Asp Glu Asp Asp * 。
本發(fā)明所述重組人胸腺素a原具有降低體重，減少脂肪細胞大小，減少體內脂肪指數(shù)、 肝臟指數(shù)和抑制脂肪肝的產生方面的功能。
本發(fā)明所述重組人胸腺素a原具有有效抑制體內脂肪的堆積、降低血脂水平、調節(jié)體內 脂肪代謝正常、達到治療和改善脂肪肝的癥狀的功能。
由此可見，本發(fā)明所述重組人胸腺素a原可用于制備預防及治療脂肪肝藥物。所述脂肪 肝包括酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝。送藥途徑包括口服和皮下注射等。
本發(fā)明所述胸腺素a原，還包括所有從哺乳動物提取的胸腺素a原、基因工程表達的胸 腺a原、胸腺素al和胸腺5-肽。


圖l為ProTaPCR產物檢測圖譜。在圖1中，l為ProTaPCR產物，2為PucMix8:分子量標 準，bp:堿基對；1116bp， 883bp， 6 92bp， 501bp， 404bp， 331bp分別代表不同大小DNA。
圖2為ProTa和pGEX-6p-l (EcoRI+BamHI)酶切圖譜。在圖2中，l為Puc Mix 8:分子量 標準；2為含ProTa質粒五co及I+5fl/wHI酶切；3為pGEX -6p-l五co及I+5a/wHI酶切；1116bp， 883bp， 6 92bp， 501bp， 404bp， 331bp分別代表不同大小DNA。
圖3為pGEX-6p-l-ProTa (EcoRI+BamHI)酶切鑒定圖譜。在圖3中，1， 2， 3為酶切圖譜； 4為分子量標準；bp為堿基對單位；116bp， 883bp, 6 92bp， 501bp， 404bp， 331bp分別代表 不同大小DNA。
圖4為融合蛋白GST-ProTa表達的SDS-PAGE電泳圖譜。在圖4中，結果證明在預計的位置 有目的蛋白的高表達(箭頭所指)。(1， 2， 3， 4， 5分別為IPTG誘導前，誘導lh，誘導2h，誘 導3h,誘導4h，菌體蛋白電泳圖；6為Marker:蛋白分子量標準，KD，蛋白分子量單位，千道 爾頓；97kDa， 66kDa， 45kDa， 30kDa， 20kDa， 14 kDa分別代表不同分子量大小標準蛋白。
圖5為GST-ProTa滲透休克實驗樣品SDS-PAGE電泳圖譜。在圖5中，l為Marker:蛋白分 子量，KD，蛋白分子量單位，千道爾頓；2為滲透樣品對照；3為低滲樣品；97kDa， 66kDa， 45kDa， 30kDa， 20kDa， 14 kDa分別代表不同分子量大小標準蛋白。
圖6為GST-ProTa Glutathione Sepharose4B柱色譜圖。在圖6中，橫坐標為時間(min)， 縱坐標為吸光值(u);吸脫峰代表樣品出峰特征圖，UV280檢測代表紫外波長。
圖7為GST-ProTa Glutathione Sepharose4B純化樣品電泳圖譜。在圖7中，l為Marker:蛋
8白分子量，KD，蛋白分子量單位，千道爾頓；2為上樣對照；3為穿透；4為洗脫樣品；97kDa， 66kDa， 45kDa， 30kDa， 20kDa， 14 kDa分別代表不同分子量大小標準蛋白。圖8為GST-ProTa (EK酶)酶切圖譜。在圖8中，1為酶切前對照，2，酶切l(wèi)h ; 3， 酶切2h; 4， Marker; 5，酶切3h;6，酶切4h。箭頭所指為ProTa蛋白(KD，蛋白分子量單位， 千道爾頓)(16 kDa， 14 kDa,10 kDa， 8 kDa,分別代表不同分子量大小標準蛋白)。圖9為ProTa酶切后過Glutathione Sepharose 4B柱樣品電泳圖譜。在圖9中，1 3為ProTa 酶切洗脫；4 6為酶切穿透；7 9為酶切對照；10為Marker:標準，KD，蛋白分子量單位， 千道爾頓；97kDa， 66kDa， 45kDa， 30kDa, 20kDa， 14 kDa分別代表不同分子量大小標準蛋 白。圖10為ProTa QFF柱純化樣品電泳圖譜。在圖10中，l為Marker蛋白分子量標準；2 3 為樣品ProTa樣品；KD代表蛋白質分子量，千道爾頓；16 kDa， 14 kDa,10 kDa， 8 kDa, 6 kDa分別代表不同分子量大小標準蛋白。圖ll為ProTadot-blot實驗。在圖11中，l為陰性對照；2 3為樣品。圖12為本發(fā)明實施例重組人胸腺素a原對小鼠膽固醇水平的影響。在圖12中，PTa/5嗎，PTa/10嗎分別代表5嗎用藥量和10嗎用藥量；橫坐標為不同組別，縱坐標為膽固醇濃度 (mmol/L)。圖13為本發(fā)明實施例重組人胸腺素a原對小鼠甘油三脂水平的影響。在圖13中， PTa/5嗎，PTa/10嗎分別代表5嗎用藥量和IO嗎用藥量；橫坐標為不同組別，縱坐標為甘油 三脂濃度(mmol/L)。圖14為本發(fā)明實施例重組人胸腺素a原對小鼠脂肪指數(shù)的影響。在圖13中，PTa/5pg， PTa/10嗎分別代表5嗎用藥量和IO嗎用藥量；橫坐標為不同組別，縱坐標為脂肪指數(shù)。圖15為本發(fā)明實施例重組人胸腺素a原對小鼠體重的影響。在圖15中，PTa/5ng， PTa/10嗎分別代表5嗎用藥量和10嗎用藥量；橫坐標為不同組別，縱坐標為體重(克)。圖16為本發(fā)明實施例重組人胸腺素a原對小鼠肝臟指數(shù)的影響。在圖16中，PTa/5嗎， PTa/10嗎分別代表5g用藥量和10昭用藥量；橫坐標為不同組別，縱坐標為肝臟指數(shù)。圖17為本發(fā)明實施例重組人胸腺素a原對小鼠脂肪細胞大小的影響。在圖17中，A: 對照組；B:代表5嗎用藥量；C:代表10嗎用藥量；標尺為20(^m。圖18為本發(fā)明實施例重組人胸腺素a原對小鼠肝臟的影響。在圖18中，A:對照組；B:代表5嗎用藥量；C:代表10嗎用藥量；D:代表喂養(yǎng)普通詞料組。圖19為本發(fā)明實施例重組人胸腺素a原對小鼠肝臟的影響。在圖19中，A:對照組；B:代表5嗎用藥量；C:代表10嗎用藥量；D:代表喂養(yǎng)普通飼料組。圖20為本發(fā)朋實施例重組人胸腺素a原對小鼠體重的影響。在圖20中，(a)5嗎用藥量 與對照組，(b)10嗎用藥量與對照組；A:對照組；B:代表5嗎用藥量；C:代表10嗎用藥量。圖21為本發(fā)明實施例重組人胸腺素a原對小鼠肝臟的影響。在圖21中，A:對照組；B: 代表5嗎用藥量；C:代表10嗎用藥量；D:代表喂養(yǎng)普通飼料組。
具體實施方式
以下實施例將結合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。實施例所采用的材料與方法說明如下。1.實驗取材重組人前胸腺原a原制備方法如下質粒pGEX-6p-1， BL21、重組菌株pGEX-6p-1-ProT a ， DH5a-7、 BL21菌株由本實驗室 周克夫保存，ProTa基因克隆及重組菌株pGEX-6p-1-ProTa的構建方法參見本申請人的發(fā)明 專利申請(申請?zhí)枮?00710009083. 0)。本發(fā)明在原先構建的pGEX 6P-l-ProTa基礎上將pGEX-6p-l-ProTa中的融合蛋白中的PP酶 切位點，改成EK酶切位點，因此分別重新合成ProTa上游引物和下游引物如下上游引物5-CCCCTGGGATCCGATGACGATGACAAGTCAGACGCAGCCGTAGACA -3;下游引物3 pGEX Sequencing Primer (24bp): 5- CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3 經過PCR及酶切后將ProTa基因片斷插入原核表達載體pGEX 6P-1中，再經過誘導表達獲 得融合蛋白，融合蛋白經過EK酶酶切將融合蛋白中的GST切除并經過一系列過柱純化后獲得本 發(fā)明所使用的重組ProTa蛋白重組ProTa的構建及蛋白表達。 表達構建1、 目的片斷的PCR反應；2、 載體與目的片斷的酶切回收；3、 連接，轉化及轉化子酶切鑒定。 融合蛋白表達。 融合蛋白純化1. 蛋白的酶切；2. 酶切后目的蛋白的捕獲與純化。 Glutathione Sepharose 4B柱。Q Sepherose F.F.柱。試驗動物為昆明種小鼠，SPF級，(20i2)g，6-7周齡，雄性，廈門大學實驗動物中心提供， 合格證號0501452。高糖高脂詞料由江蘇雙獅實驗動物飼料有限公司配制，配方基礎料60%，豬油10%， 蔗糖10%，奶粉5%，膽固醇3% ，雞蛋10%，麻油2%。 2.實施方法 動物分組40只小鼠隨機分為A,B，C，D4組，每組IO只按如下方法進行喂食，A， B， C組每天喂 養(yǎng)高糖高脂高膽固醇飼料，D組喂養(yǎng)常規(guī)飼料，每只食物定量5g/d，同時B組，C組分別口 服ProTalO和20ng/d，分上、下午兩次服完。A組，D組口服相同體積的PBS。連續(xù)3個月。 實驗結束，稱量動物體重，眼睚取血，離心分離血清用于以下生化指標檢測。 膽固醇采用酶比法。 甘油三脂采用酶比法。處死動物后，分離肝臟，生殖器周圍脂肪和腎臟周圍脂肪，按公式器官指數(shù)=器官重量 /100g體重，分別計算肝臟指數(shù)和脂肪指數(shù)。肝臟病理切片，HE染色及PAS染色均參考文獻(人體寄生蟲學實驗技術，陳佩惠等編 著，北京科學出版社，1988.9)，按常規(guī)方法進行固定、包埋和染色處理。本實驗所有數(shù)據(jù)通過SPSS (version 13. 0 ， SPSS Inc.)軟件進行分析處理，其結果參見圖 12 21。從圖1 11的結果發(fā)現(xiàn)，當喂養(yǎng)高糖高脂高蛋白飼料的同時口服重組人前胸腺原a原， 能夠明顯增強小鼠糖耐量作用，減輕體重增長趨勢，降低肝臟指數(shù)，有效減輕脂肪肝的發(fā)生。 同時發(fā)現(xiàn)，用藥組腹腔脂肪細胞大小明顯比對照組小，脂肪指數(shù)用藥組比對照組小。血清生 化指標檢測發(fā)現(xiàn)，用藥組甘油三脂和膽固醇水平明顯比對照組低。以上結果經過統(tǒng)計分析均 達到顯著差異水平(P<0.05)。綜合上述結果分析證明，重組人胸腺原a原在預防和治療因為喂養(yǎng)高糖、高脂、高蛋白飼 料引發(fā)的脂肪肝，抑制肥胖及其相關疾病具有突出的功能。11序列表本發(fā)明所述重組人胸腺素a原基因序列為 atgtcagacg csgccgtaga caccagctcc gsaatcacca ccgaggactt aaaggagaag 60 aagggagttg tggaagaggc ggaaaatgga agagacgccc ctgctcacgg gaatgctaat 120 gaggaaaatg gggagccgga ggctgacaac gsggtagatg aagaagagga agaaggtggg 180 gaggasgaag gtgatggtga ggaagaggat ggsgatgaag atgagggagc tgagtcagct 240 acgggcssgc gggcagctgs agatgstgsg gatsscgatg tcgatsccca gasgcagsag 300 sccgscgsgg stgsctsgo相應的蛋白序列為Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu lie Thr Thr Glu Asp Leu Lys Glu LysLys Gly Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Arg Asp Ala Pro Ala His Gly Asn Ala AsnGlu Glu Asn Gly Glu Pro Glu Ala Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly GlyGlu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Asp Gly Asp Glu Asp Glu Gly Ala Glu Ser AlaThr Gly Lys Arg Ala Ala Glu Asp Asp Glu Asp Asn Asp Val Asp Thr Gin Lys Gin Lys Thr Asp Glu Asp Asp * 。
權利要求
1.重組人胸腺素α原在制備預防及治療脂肪肝藥物中的應用，所述重組人胸腺素α原基因序列為atgtcagacg cagccgtaga caccagctcc gaaatcacca ccgaggactt aaaggagaag 60aagggagttg tggaagaggc ggaaaatgga agagacgccc ctgctcacgg gaatgctaat120gaggaaaatg gggagccgga ggctgacaac gaggtagatg aagaagagga agaaggtggg180gaggaagaag gtgatggtga ggaagaggat ggagatgaag atgagggagc tgagtcagct240acgggcaagc gggcagctga agatgatgag gataacgatg tcgataccca gaagcagaag300accgacgagg atgactag；相應的蛋白序列為Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Glu Asp Leu Lys Glu LysLys Gly Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Arg Asp Ala Pro Ala His Gly Asn Ala AsnGlu Glu Asn Gly Glu Pro Glu Ala Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly GlyGlu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Asp Gly Asp Glu Asp Glu Gly Ala Glu Ser AlaThr Gly Lys Arg Ala Ala Glu Asp Asp Glu Asp Asn Asp Val Asp Thr Gln Lys Gln LysThr Asp Glu Asp Asp *。
全文摘要
重組人胸腺素α原在制備預防及治療脂肪肝藥物中的應用，涉及一種胸腺素α原。提供胸腺素α原，特別是重組人胸腺素α原在制備預防及治療脂肪肝藥物中的應用。重組人胸腺素α原具有降低體重，減少脂肪細胞大小，減少體內脂肪指數(shù)、肝臟指數(shù)和抑制脂肪肝的產生方面的功能。重組人胸腺素α原具有有效抑制體內脂肪的堆積、降低血脂水平、調節(jié)體內脂肪代謝正常、達到治療和改善脂肪肝的癥狀的功能。重組人胸腺素α原可用于制備預防及治療脂肪肝藥物。所述脂肪肝包括酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝。送藥途徑包括口服和皮下注射等。胸腺素α原，還包括所有從哺乳動物提取的胸腺素α原、基因工程表達的胸腺α原、胸腺素α1和胸腺5-肽。
文檔編號A61K38/22GK101670098SQ200910111409
公開日2010年3月17日 申請日期2009年4月1日 優(yōu)先權日2009年4月1日
發(fā)明者劉升發(fā), 吳漢洲, 周克夫, 王世媛, 偉 韓 申請人:廈門大學;廈門伯賽基因轉錄技術有限公司