專利名稱：：胸腺素α1-胸腺生成素-2基因工程融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程重組融合蛋白領(lǐng)域，其中該基因工程融合蛋白是由胸腺素al和胸腺生成素-2兩部分組成的。本發(fā)明還涉及基因工程融合蛋白用于制備治療動(dòng)物皮膚組織損傷及消化道損傷疾病的藥物的用途。本發(fā)明還涉及利用所述基因工程融合蛋白治療動(dòng)物皮膚組織損傷和消化道損傷疾病的方法。二.
背景技術(shù)：
：皮膚損傷和消化道損傷是動(dòng)物的常見疾病，現(xiàn)在主要應(yīng)用的生物治療方法主要有應(yīng)用各種生長(zhǎng)因子來治療，如表皮生長(zhǎng)因子EGF，堿性成纖維細(xì)胞因子FGF，血小板衍生生長(zhǎng)因子PDGF等，雖然目前最常用和有效的是使用EGF，但是一方面，EGF作為治療皮膚損傷的藥物，目前的治愈率還是有限，比如其對(duì)11度皮膚創(chuàng)傷的治愈率在40%左右(EGF溶液治療皮膚II度創(chuàng)傷的藥效觀察。中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2007年第7巻第1期，pp70-71)，有一部分外傷對(duì)EGF的反應(yīng)不敏感，我們稱之為難治性外傷。究其原因，最可能的原因是雖然EGF對(duì)創(chuàng)面的愈合作用比較明顯，但也受到其他因素的影響，如創(chuàng)面的感染，機(jī)體的情況等，EGF無明顯的抗感染作用，創(chuàng)面感染程度是影響EGF作用的重要因素，可能是因?yàn)閯?chuàng)面分泌物或壞死組織的存在，使得藥物不能直接與創(chuàng)面肉芽組織接觸所致(重組人表皮生長(zhǎng)因子在創(chuàng)面愈合中的臨床應(yīng)用進(jìn)展。青海醫(yī)藥雜志，2004年第34巻第ll期，pp61-62)。另一方面，對(duì)于動(dòng)物的消化道損傷類疾病的治療，如潰瘍性腸炎，目前的EGF等細(xì)胞因子類藥物均為外用制劑，無法產(chǎn)生可見的療效，所以目前這一類疾病還沒有有效的藥物來控制。本發(fā)明基于上述考慮，在針對(duì)皮膚創(chuàng)傷愈合和消化道損傷愈合的治療上，使用了如下解決方法，使用胸腺素a1和胸腺生成素-2共同作用，其中胸腺素a1是提高機(jī)體免疫力，消除感染，并且直接對(duì)燒傷等的創(chuàng)傷愈合的作用明顯(中國(guó)專利，ZL03116180.4，胸腺素al用于制備燒傷和燙傷藥物的用途)，胸腺生成素-2能夠進(jìn)一步提高機(jī)體免疫力，與胸腺素a1協(xié)同作用共同促進(jìn)傷口或消化道損傷的愈合，更重要的是本項(xiàng)目使用了注射的給藥途徑，進(jìn)一步消除了藥物與損傷組織接觸有限、給藥量粗放的缺點(diǎn)，同時(shí)注射給藥也使得本品可以到達(dá)體內(nèi)的受損部位，有利于消化道損傷的治療。另外，腸炎疾病的發(fā)病機(jī)理主要是由細(xì)菌或者病毒引起的，在發(fā)生炎癥水腫的同時(shí)晚期常常伴有腸道壁損傷，甚至消化道潰瘍、出血，導(dǎo)致休克。本發(fā)明中的基因工程融合蛋白中的胸腺素a1能夠起到加速修復(fù)腸壁的作用，其通過促進(jìn)受損消化道的修復(fù)，從而達(dá)到治療腸炎的作用。下面簡(jiǎn)要地介紹一下組成本發(fā)明中基因工程融合蛋白的2個(gè)組分1.胸腺素al人體的免疫系統(tǒng)中參與免疫反應(yīng)的主要細(xì)胞有T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。而胸腺是T淋巴細(xì)胞發(fā)育、分化的免疫中樞器官。胸腺分泌的胸腺因子(或激素)是T淋巴細(xì)胞發(fā)育分化所需的一系列必需物質(zhì)，其中胸腺素a1是現(xiàn)在結(jié)構(gòu)和功能研究得較為明確的一種主要的胸腺因子。胸腺素al是Goldstein等最早從小牛胸腺中提取的胸腺素組分5(TF5)中分離出來的一種多肽，含28個(gè)氨基酸，分子量3.108KD，等電點(diǎn)4.2，無二硫鍵與糖基化。胸腺素a1的氨基酸序列與原胸腺素a的N端一致，后者是Haritos等從大鼠胸腺中分離出來的，含109112個(gè)氨基酸，不同種屬，不同組織來源的原胸腺素a基因序列略有異。胸腺素a1是一種免疫活性肽，它主要作用于胸腺細(xì)胞成熟的早期和晚期，可增加T細(xì)胞表面Thy-l，Thy-2.3和Lyt_l.2.3表達(dá)，能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖，提高淋巴細(xì)胞產(chǎn)生干擾素和白介素2等細(xì)胞因子的能力，提高機(jī)體抗病毒、抗菌和抗感染的能力。因此胸腺素al是一種重要的免疫調(diào)節(jié)劑和增強(qiáng)劑。臨床上主要作為原發(fā)性或繼發(fā)性免疫功能缺陷病，腫瘤和慢性活動(dòng)性肝炎的免疫調(diào)節(jié)劑，其安全性和有效性已經(jīng)超萬例臨床應(yīng)用所證實(shí)，長(zhǎng)期使用，無蓄積性，無抗原性，并得到國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜业墓J(rèn)。目前也發(fā)現(xiàn)胸腺素al對(duì)創(chuàng)傷和燒傷的皮膚愈合有比較好的作用。2.胸腺生成素_2(thymopoietin-2):胸腺生成素-2是最早Goldstein等從小牛胸腺分離出的一種多肽，是一種49個(gè)氨基酸的多肽，由13種氨基酸組成的。相對(duì)分子質(zhì)量為4818。胸腺生成素-2具有調(diào)節(jié)神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)的作用和免疫激活作用，能夠促進(jìn)胸腺細(xì)胞和外周T細(xì)胞及B細(xì)胞分化發(fā)育，并且能夠雙向調(diào)節(jié)機(jī)體失衡的免疫功能，具有獨(dú)特的生物學(xué)作用，是一種重要的免疫調(diào)節(jié)劑，其3236位氨基酸稱為胸腺五肽，是胸腺生成素_2重要的功能活性部分，能雙向調(diào)節(jié)機(jī)體失衡的免疫功能，具有獨(dú)特的生物學(xué)作用，是一種重要的免疫調(diào)節(jié)劑。其中胸腺五肽作為化學(xué)合成的藥品已有產(chǎn)品上市，適應(yīng)癥為免疫增強(qiáng)，但是由于胸腺五肽的體內(nèi)半衰期很短，只有幾分鐘，影響了其治療效果，本項(xiàng)目的融合蛋白采用了胸腺生成素-2的全長(zhǎng)序列，半衰期較長(zhǎng)，能夠更加充分地發(fā)揮其免疫增強(qiáng)的效果。三.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及一種基因工程融合蛋白，是由2個(gè)組分組成，分別為胸腺素a1和胸腺生成素_2，之間通過lingker序列GGGSG連接起來，其為SEQIDNO:1所示的序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，所述的基因工程融合蛋白可以通過基因重組表達(dá)的方法進(jìn)行制備。在本發(fā)明中，所述的基因工程融合蛋白是通過基因工程重組表達(dá)的方法獲得的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過如下方法獲得所述的基因工程融合蛋白，包括如下步驟1)表達(dá)載體的構(gòu)建依據(jù)已知所述的基因工程融合蛋白的氨基酸序列(SEQIDN0:1)，選用大腸桿菌偏好密碼子全基因合成對(duì)應(yīng)于SEQIDN0:1氨基酸序列的DNA序列，同時(shí)在相應(yīng)于所編碼的氨基酸序列之5'端加上編碼3C酶切位點(diǎn)的堿基序列和限制性酶切位點(diǎn)Notl;3'端加上終止密碼子和限制性酶切位點(diǎn)EcoRI，得到編碼所述的基因工程融合蛋白的核酸序列。再分別將如上述制備的所述的基因工程融合蛋白序列以及篩選質(zhì)粒pBSK用限制性內(nèi)切酶處理好，經(jīng)計(jì)算各樣品濃度后按一定摩爾比加入T4連接體系。經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選成功的重組子pBSK-TT。用限制性酶切下融合蛋白基因，再將該基因與用限制性酶處理好的4pET32連接，經(jīng)篩選得到正確的重組子pET32-TT。2)所述的基因工程融合蛋白表達(dá)及分離純化將如上述所得重組子轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌，經(jīng)表達(dá)篩選出高表達(dá)基因工程菌，然后經(jīng)發(fā)酵，離心收集目的蛋白高表達(dá)的菌體。高壓均質(zhì)機(jī)破碎菌體并離心得到含目的前體蛋白上清液，將上清液上樣到鎳離子金屬鰲和層析(NiChelatingS印haroseFastFlow),洗脫目的前體蛋白，樣品脫鹽后使用3C酶進(jìn)行酶切，然后通過一步陰離子交換層析(QS印haroseHighPerformance)進(jìn)一步純化，最終得到的目的蛋白純度大于95%。3)所述的基因工程融合蛋白體外生物活性測(cè)定用E玫瑰花結(jié)實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行生物活力測(cè)試。4)所述的基因工程融合蛋白體內(nèi)生物活性測(cè)定對(duì)犬創(chuàng)傷愈合的療效成年犬若干，每只均于背部形成相同的創(chuàng)面4個(gè)，分為3組，A組為空白對(duì)照組，B組為陽性對(duì)照藥組，C組為本發(fā)明中的基因工程融合蛋白用藥組，通過觀察完全愈合的天數(shù)來判定藥物的療效。5)對(duì)犬消化道損傷的療效對(duì)犬消化道損傷的療效，成年犬若干，制備腸炎模型后，隨機(jī)將模型動(dòng)物分為兩組，每組10只，一組為治療組，一組為對(duì)照組。兩組均肌肉注射頭孢抗菌素，口服補(bǔ)液鹽。治療組肌肉注射本基因工程融合蛋白，50ug/kg，一天一次，連續(xù)使用，對(duì)照組肌肉注射生理鹽水。四.具體實(shí)施例方式1.所述的基因工程融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與工程菌的獲得首先通過全基因合成擴(kuò)增出融合蛋白的全基因序列，并在5'端加上編碼3C酶切位點(diǎn)的堿基序列和限制性酶切位點(diǎn)Notl;3'端加上終止密碼子和限制性酶切位點(diǎn)EcoRI，設(shè)計(jì)如下CGGCCGCTGGAGGTGCTGTTTCAGGGCCCCAGCGACGCCGCCGTGGACACCAGCAGCGAGATCACCACCAAGGACCTGAAGGAGAAGAAGGAGGTGGTGGAGGAGGCCGAGAACGGCAGCGGCGGCGGCAGCGACAAGCCCGACATGGCCGAGCTGGAGAAGTTCGACAAGAGCAAGCTGAAGAAGACCGAGACCCAGGAGAAGAACCCCCTGCCCAGCAAGGAGACCATCGAGCAGGAGAAGCAGGCCGGCGAGAGCTAATAGGAATTC分別將如上述制備的所述的基因工程融合蛋白的核苷酸序列以及篩:用限制性內(nèi)切酶處理好，經(jīng)計(jì)算各樣品濃度后按一定摩爾比加入T4連接體系。經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選成功的重組子pBSK-TT。目的片段經(jīng)Notl、EcoRI雙酶切后分別回收小片段，質(zhì)粒pET32經(jīng)Notl、EcoRI雙酶切后回收大片段，14t:在T4連接酶體系中兩段目的基因片段進(jìn)行連接，經(jīng)篩選得到的重組質(zhì)粒命名為pET32-TT。然后用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布在含有100ug/ml氨芐青霉素的LB平板，挑選陽性菌落在LA中培養(yǎng)，至0D600為0.60.8時(shí)加入IPTG0.lmM誘導(dǎo)3-4小時(shí)，離心收集菌體，8M尿素破菌后15%SDS-PAGE電泳時(shí)出現(xiàn)一條40K左右的蛋白帶，表達(dá)量為菌體可溶性蛋白的40X左右。經(jīng)胸腺素al的單克隆抗體免疫印跡檢定，顯示陽性反應(yīng)。所獲得的高效表達(dá)所述的基因工程融合蛋白的工程菌命名為PET32-TT/BL21(DE3)。2.發(fā)酵1)搖瓶表達(dá)含所述的基因工程融合蛋白基因的pET32-TT/BL21(DE3)，在含100ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中搖瓶過夜(37t:，200rpm)，再按l:30接種含有100ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37t:培養(yǎng)3小時(shí)后，加入0.lmMIPTG誘導(dǎo)4小時(shí)。收集菌體經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)含基因工程融合蛋白以可溶性表達(dá)為主，表達(dá)量占菌體可溶性蛋白的40%。2)發(fā)酵工藝a.培養(yǎng)基a)種子液培養(yǎng)基(LA):胰蛋白胨10克/升、酵母粉5克/升、氯化鈉10克/升、氨芐青霉素100微克b)培養(yǎng)基(15升)磷酸氫二鈉375克、磷酸二氫鉀80克、氯化鈉10克、氯化銨45克、胰蛋白胨；50克。以上成分一起在罐中滅菌；下面的成分單獨(dú)滅菌后加入發(fā)酵罐。硫酸鎂20克、葡萄糖100克、補(bǔ)料(500克/升)葡萄糖b.發(fā)酵過程a)種子培養(yǎng)從已鑒定的平皿上劃取菌種，接種到50毫升(250毫升的三角瓶)LA中，37度、200轉(zhuǎn)/分、8小時(shí)后將這50毫升種子液轉(zhuǎn)接到700毫升LA中，36度、200轉(zhuǎn)/分，過夜。b)發(fā)酵過程將培養(yǎng)好的種子液(0D600=3-4)加入罐中，調(diào)好各參數(shù)，37度、150轉(zhuǎn)、溶氧100%，開始發(fā)酵；5小時(shí)后開始以2.5速流加2小時(shí)，加入終濃度0.3mM的IPTG誘導(dǎo)(五小時(shí))。3.層析1)親和層析采用鎳離子金屬鰲和層析(NiChelatingS印haroseFastFlow)，平衡液A采用25mMTris-HCl，pH8.O，O.5MNaCl，10mM咪唑平衡后，裂菌的離心上清上樣，用A平衡后用洗脫液25mMTris-HCl，pH8.O，O.5MNaCl，O.2M咪唑洗下目的融合蛋白。2)脫鹽采用S印hadexG-25層析介質(zhì)，平衡液為25mMTris-HCl，pH8.O，O.15MNaCl，平衡，上一步得到的樣品上樣，平衡，收集蛋白峰。3)酶解上一步的蛋白峰加入3C酶(2U/mL)，室溫過夜酶切大約16小時(shí)。4)陰離子交換層析采用QS印haroseHighPerformance層析介質(zhì)，平衡液為20mMPB，pH7.4，上一步得到的酶切樣品用水稀釋4倍進(jìn)行上樣，平衡后采用20mMPB，pH7.4，01MNaCl，20個(gè)柱體積的梯度洗脫，收集目的蛋白洗脫峰。4.檢領(lǐng)[J得到的基因工程融合蛋白通過SDS-PAGE純度檢測(cè)和反相HPLC檢測(cè)，純度均大于95%。5.基因工程融合蛋白體外活性檢測(cè)E玫瑰花結(jié)實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行生物活力測(cè)試基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)液1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基10.0g，NaHC032.2g，H印es5.9g，丙酸鈉0.llg，O.05M巰基乙醇2.0ml，ddH201000ml;細(xì)胞培養(yǎng)基基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基90ml，小牛血清10ml，雙抗(青霉素+鏈霉素)100U/ml，谷胱甘月太0.03g/ml;測(cè)活培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基95ml小牛血清5.Oml，雙抗及谷胱甘肽濃度與上相同。過濾滅菌；裂解液:SDS10g，，DMSO25ml，ddH2019ml，調(diào)PH=4.7。方法首先分離健康人外周血單核細(xì)胞，使用小牛血清調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2X106/ml。各取200i！1細(xì)胞液加入EP管中，再分別加入等量的測(cè)試樣品與陽性對(duì)照藥日達(dá)仙，37t:水浴90分鐘，每支EP管中加入200ii1，綿羊紅細(xì)胞(2X106/ml)，4t:放置3小時(shí)，涂片、染色后放于高倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)，淋巴細(xì)胞中形成玫瑰花結(jié)的細(xì)胞數(shù)(結(jié)合3或以上的為一個(gè)玫瑰花結(jié))。計(jì)算玫瑰藥形成細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。按以下公式計(jì)算激活率。激活率=樣品管藥結(jié)百分比一對(duì)照管藥結(jié)百分比X100%對(duì)照管藥結(jié)百分比樣品和日達(dá)仙的E玫瑰花結(jié)形成數(shù)和激活率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由上表可知，本發(fā)明的基因工程融合蛋白能夠顯著提高人外周血淋巴細(xì)胞E玫瑰花結(jié)形成數(shù)量，且由于融合蛋白中的胸腺素a1與胸腺生成素-2的協(xié)同作用，其生物活性遠(yuǎn)大于陽性對(duì)照藥日達(dá)仙(天然的胸腺素al)。6.基因工程融合蛋白對(duì)犬皮膚損傷的治療效果成年犬9只，每只均于脊柱兩側(cè)各取1.5cmX1.5cm中厚皮片2塊，形成相同的創(chuàng)面4個(gè)，共計(jì)創(chuàng)面36個(gè)，分為3組，A，B，C，每組12個(gè)創(chuàng)面，創(chuàng)面A組為空白對(duì)照組傷后當(dāng)天始至傷后11天，每天外用0.1M磷酸緩沖液(PBSpH7.4內(nèi)含0.1%小牛血清)2次，每次50i！L，涂于創(chuàng)面上，稍干后涂少許四環(huán)素眼膏；B創(chuàng)面組為陽性對(duì)照藥組傷后當(dāng)天始至傷后ll天用藥，為基因重組人表皮生長(zhǎng)因子，深圳華生元基因工程發(fā)展有限公司產(chǎn)品，金因肽，2000U/mL，外用，每天一次；C創(chuàng)面組為本發(fā)明中的基因工程融合蛋白，皮下注射，50iig/kg，一天一次。結(jié)果A組完全愈合的天數(shù)是15天，B組完全愈合的天數(shù)是10天，C組完全愈合的天數(shù)是7天，由此可見，應(yīng)用本發(fā)明中的基因工程融合蛋白注射的方法治療，大大加快了傷口愈合的速度。7.融合蛋白對(duì)狗腸炎的治療效果大量培養(yǎng)自行分離鑒定的犬細(xì)小病毒，檢測(cè)毒價(jià)。將病毒配制成5X106/ml備用，購買30日齡的犬20只，每只犬灌服2毫升。24小時(shí)后，犬出現(xiàn)發(fā)燒，腹瀉，白細(xì)胞降低，便中偶帶血，食欲不振，隨機(jī)分為兩組，每組10只，一組為治療組，一組為對(duì)照組。兩組均肌肉注射頭孢抗菌素，口服補(bǔ)液鹽。治療組肌肉注射本品，50iig/kg，一天一次，連續(xù)使用。對(duì)照組肌肉注射生理鹽水。治療組治療一次以后，部分犬腹瀉癥狀減輕，便血停止，便由稀變干，治療三次后，治療組8條犬，腹瀉停止，無發(fā)燒癥狀，食欲正常，判定臨床治愈。兩條無腹瀉癥狀，但食欲不佳。對(duì)照組腹瀉癥狀加重，2天后有3條死亡，3天后又有3條死亡。其余4條仍然腹瀉，消瘦，食欲不振，發(fā)燒。綜上，本品對(duì)細(xì)小病毒的腸炎治愈率為80%。序列表〈110〉軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所〈120〉胸腺素a1-胸腺生成素_2基因工程融合蛋白〈160>1〈210>1〈211>82〈212>PRT〈213>SEQIDNO:〈400〉1SerAspAlaAla1LeuLysGluLysGlyGlyGlySerGluLysLeuLysAlaGlyGluGinThrLeuThrAla8ValAspThrSerSerGlulieThrThrLysAsp51015LysGluValValGluGluAlaGluAsnGlySer202530GinPheLeuGluAspProSerValLeuThrLys354045SerGluLeuValAlaAsnAsnValThrLeuPro505560ArgLysAspValTyrValGinLeuTyrLeuGin657075ValLysArg808權(quán)利要求一種基因工程融合蛋白，如SEQIDN01的序列所示的序列，是由胸腺素a1和胸腺生成素-2通過基因工程重組技術(shù)連接組成。2.—種多核苷酸序列，其編碼權(quán)利要求1所述的融合蛋白。3.根據(jù)權(quán)利要求1中的基因工程融合蛋白來源是通過大腸桿菌作為表達(dá)宿主菌表達(dá)、純化得到。4.根據(jù)權(quán)利要求l中基因工程融合蛋白是用于制備創(chuàng)傷治療藥物的用途。5.根據(jù)權(quán)利要求l中基因工程融合蛋白是用于制備消化道損傷治療藥物的用途。全文摘要本專利涉及一種高效融合蛋白，特征為將胸腺素a1和胸腺生成素-2通過基因工程重組技術(shù)連接組成高效的融合蛋白，經(jīng)表達(dá)、純化出的融合蛋白具有很強(qiáng)的促進(jìn)傷口愈合的功效。應(yīng)用本發(fā)明得到的融合蛋白，用于創(chuàng)傷與潰瘍性腸炎的治療。文檔編號(hào)A61K38/32GK101787081SQ20091000096公開日2010年7月28日申請(qǐng)日期2009年1月23日優(yōu)先權(quán)日2009年1月23日發(fā)明者李樹民,王福軍,莘旭妮,趙翠波申請(qǐng)人:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所