專利名稱：微生物快速分型方法及所用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)。特別提供了方法。該方法包括微生物快速分型的方法和程序的應(yīng)用、以及試劑盒。待分型的微生物可以是酵母、寄生蟲以及革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌。在CHEF或TAFE系統(tǒng)的微型裝置中，利用脈沖場微型凝膠電泳進(jìn)行微生物分型。
背景技術(shù)：
過去數(shù)年中，傳染性疾病增多，并出現(xiàn)多藥耐藥性(multi-drugresistance)微生物(Acar J和Courvalein P pp 50-53；Aubry-Damon H和Andremot A，pp 54-55；Trieu-Cout P和Poyart C，pp62-66，in’La Recherche’，vol 314，1998)。
傳染性疾病的爆發(fā)，需要對致病微生物進(jìn)行分型。分型是指將特定屬的不同種微生物分類為不同的亞群或亞類的方法(Busch U和Nitschko H，J Chromatogr B， 1999，722263-278)。從流行病學(xué)觀點來看，分型對于識別傳染病爆發(fā)、確定健康中心的醫(yī)院源性病原體的傳播途徑以及檢測傳染源是重要的。分型也用于鑒定新毒株和監(jiān)測接種程序。如果滿足以下標(biāo)準(zhǔn)，則認(rèn)為分型方法是適當(dāng)?shù)?MaslowJN等人，Clin Infect Dis，1993，17153-164)1.為分析的每個分離物給出明確結(jié)果。
2.給出可重復(fù)性結(jié)果。
3.區(qū)分種內(nèi)無關(guān)株。
有幾種微生物分型方法，其中一些基于表型特征分析(表型方法)，其它基于基因型特征分析(基因型方法)。表型方法檢測微生物的表達(dá)特征，基因型方法則證明微生物DNA之間的差別。因此，表型方法的缺點在于，提供遺傳背景變化的間接測定。使用基因型方法則沒有該缺點。
脈沖場凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE)是最廣泛使用的基因型分型方法之一。該方法據(jù)認(rèn)為是微生物分子分型的金標(biāo)準(zhǔn)。通過在凝膠中分離受到兩個不同方向的電脈沖作用的DNA分子進(jìn)行PFGE分型。電泳之后，微生物分離物DNA分子的條帶圖高度可重現(xiàn)、有差別，明確地表征其DNA(Oliver DM和Bean P，JClin Microbiol，1999，37(6)1661-1669)。另外，能夠在單個凝膠中比較多個分離物的全基因組。因此，PFGE已被認(rèn)為是最佳的分型方法(Maslow JN，Mulligan ME和Arbeit RD，Clin Infect Dis，1993(17)153-164；Busch U和Nitschko H，J Chromatogr B，1999(722)263.278)。PFGE的結(jié)果取決于DNA分離應(yīng)用的實驗條件以及所研究的微生物的屬和種。因此，a)如果該微生物具有幾條低于10Mb(1Mb＝1 000 000堿基對)的線性染色體，則獲得其染色體的條帶圖。該條帶譜稱作‘電泳染色體組型’。例如，該微生物可以是酵母、單細(xì)胞寄生蟲等。
b)如果該微生物具有一個單一的大的環(huán)狀染色體，則獲得該環(huán)狀DNA大限制性片段的條帶圖。這些圖稱作脈沖型，是在特定的實驗條件下獲得的。例如，該微生物可以是細(xì)菌，如大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。
比較不同菌株的電泳染色體組型，可以對其進(jìn)行特性鑒定和鑒別。細(xì)菌DNA的限制性片段也是如此。因此，分子染色體組型和脈沖型均可用于真菌、細(xì)菌和寄生蟲的比較研究。醫(yī)學(xué)微生物學(xué)常規(guī)使用PFGE，使得需要改善其樣品制備方法。還需要預(yù)先設(shè)計充分分離分子的運行條件，并分析產(chǎn)生的電泳圖。
利用PFGE的微生物分型方法一般包含以下步驟和程序1)制備樣品在營養(yǎng)液中培養(yǎng)微生物，在凝膠中包埋細(xì)胞，獲得固定化、去蛋白的完整DNA分子。
2)設(shè)計電泳運行選擇PFGE裝置上設(shè)定的實驗條件，以獲得分子間最好的分離。
3)樣品上樣凝膠中，進(jìn)行脈沖場凝膠電泳，以分離DNA分子。
4)分析電泳后得到的條帶圖，比較不同微生物分離物的結(jié)果。
分析當(dāng)前用于通過PFGE進(jìn)行微生物分型的裝置和程序。
脈沖場凝膠電泳脈沖場凝膠電泳(PFGE)開始于1984年，當(dāng)時Schwartz和Cantor(Cell，37，67-75，1984；US專利NO.4,473,452)觀察到，應(yīng)用按相對瓊脂糖凝膠的某個角度周期性轉(zhuǎn)換方向的電脈沖，可以將大的完整DNA分子解析為條帶圖。
作者還確定，分子的分離基本上取決于電脈沖的持續(xù)時間。后來，場力線形成的角度、電場強度、實驗溫度、緩沖液的離子強度、瓊脂糖凝膠的濃度以及包埋樣品的瓊脂糖膠塊(plug)的厚度，被確定為影響DNA分子分離的最重要因素(Birren B.和Lai E.PulsedField Gel Electrophoresisa practical guide.AcademicPress.New York，1993，p 107，111，129，131，135；López-Cánovas L.等人，J.of Chromatogr.A，1998，806，123-139；López-Cánovas L.等人，J.of Chromatogr.A，1998，806，187-197)。
已經(jīng)開發(fā)了不同系統(tǒng)進(jìn)行PFGE。它們具有電極布置不同的特征性槽。這些槽包括配置電極的OFAGE(Orthogonal Field AlternatingGel Electrophoresis，Carle C.F.和Olson M.V.Nucleic AcidsRes.1984，12，5647-5664)，CHEF(‘Contour Clamped HomogeneousElectric Field’，Chu G. Science 234，1986，1582-1585)，TAFE(‘Transversal Alternating Field Electrophoresis’，US專利NO.4,740,283)，F(xiàn)IGE(‘Field Inversion Gel Electrophoresis’，Carle G.F.和Olson M.V的US專利NO.4,737,251)，以及微型槽MiniTAFE和MiniCHEF(Riverón，A.M.等人，Anal.Lett，1995，28，1973-1991；歐洲專利申請EP 0 745 844，Bula.1996/49；US專利申請08/688,607，1995；古巴專利RPI Nro.02/95，1995)。
利用PFGE進(jìn)行微生物分型的常用系統(tǒng)。
CHEF和TAFE是以DNA分析為基礎(chǔ)通過PFGE進(jìn)行微生物分型的最常用系統(tǒng)。它們在凝膠的每個泳道產(chǎn)生整齊的條帶圖譜，因此可以對單次運行或不同電泳運行的結(jié)果進(jìn)行比較。
CHEF系統(tǒng)的電極圍繞凝膠放置成六角形陣列，鉗在其中的電壓保證整個凝膠的電場均勻。在整個槽產(chǎn)生均勻電場，可獲得整齊條帶，以及在凝膠泳道上的可重現(xiàn)遷移。CHEF槽中極性相反的電極間相隔33.5cm。其使用長寬可達(dá)21×14cm的水下凝膠。水平放置凝膠(CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System.Instruction Manual and Application Guide.Catalog Numbers170-3670 to 170-3673，BloRad，pp 11，1995)。如前述，CHEF系統(tǒng)已經(jīng)廣泛用于微生物分型。例如，細(xì)菌(Beverly，S，AnalBiochem，1989，177110-114；Dingwall A和Shapiro L，ProcNatl Acad Sci USA，1989，86119-123；Ferdows MS和BarbourAG，Proc Natl Acad Sci USA，1989，865960-5973；Kohara Y，Akiyma K和Isono K，Cell，1987，50495-508；Ohki M和SmithCl，Nucleic Acids Res，1989，173479-3490；Schoenline PV，Gallman LM和Ely B，Gene，1989，70321-329；Ventra L和Weiss AS，Gene，1989，7829-36)，假單胞菌屬(Pseudomonas)(Bautsch W，Grothues D和Tummler B，F(xiàn)EMSMicrobiol Lett，1988，52255-258；Romling U和Tummler B，JClin Microbiol，2000，38(1)464-465)，啤酒糖酵母(S.cerevisiae)(Albig W和Entian KD，Gene，1988，73141-152；Zerva L等人，J Clin Microbiol，1996，34(12)3031-3034)，溶組織內(nèi)阿米巴(E.histolytica)(Petter R等人，Infect Immun，1993，61(8)3574-3577)，肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)(McEllistrem MC等人，J Clin Microbiol，2000，38(1)351-353)，金黃色葡萄球菌(S.aureus)(Wicheihaus TA等人，J Clin Microbiol，1999，37(3)690-693)，結(jié)核桿菌(M.tuberculosis)(Singh SP等人，J Clin Microbial，1999，37(6)1927-1931)，溶血性巴斯德桿菌(P.haemolytica)(Kodjo A等人，J Clin Microbial，1999，37(2)380-385)，等等。
由于CHEF槽的尺寸較大，覆蓋電極平臺需要大量緩沖液。因此，即使應(yīng)用低電場強度時，槽中電流強度也可以達(dá)到很高的值。所以，CHEF實驗需要高額定功率輸出的電源。此外，槽中產(chǎn)生大量熱量，不能通過增大電場減少運行時間。為將啤酒糖酵母染色體(分子小于1.6Mb。1Mb＝106堿基對)分離成11條帶的特征圖，以分型酵母的不同菌株，CHEF槽需要電泳至少20小時(Zerva L等人，JClin Microbial，1996，34(12)3031-3034)。CHEF槽分離細(xì)菌DNA分子的大限制性片段需很長時間，需要20小時或更多。(vanBelkum A等人，J Clin Microbiol 1998，36(6)1653-1659；Marchadin H等人，Antimicrob Agents Chemother，2000，44(1)213-216；Romling U和Tummler B，J Clin Microbiol，2000，38(1)464-465)。同樣地，研究寄生蟲，例如溶組織內(nèi)阿米巴，也需要較長的運行時間。分離其染色體至少需要24小時(PatterR等人，Infect Immun，1993，61(8)3574-3577)。
當(dāng)前使用的CHEF裝置的優(yōu)點在于，單次運行有可能分析40個樣品。該高通量樣品形式便于對比分析多個分離物樣品的電泳圖。
KJ Gardiner，W Laas和D Patterson在發(fā)表于Somatic CellMol Genet，1986(12)185的文章中提出TAFE系統(tǒng)。他們起初將該系統(tǒng)稱作″垂直脈沖場電泳″(Vertical Pulsed FieldElectrophoresis，VPFE)，并開發(fā)了裝置，受到1988年4月26日US專利4,740,283的保護(hù)。
在TAFE系統(tǒng)中，兩個電極對平行放置于水下凝膠(10×7.6×0.64cm，長×寬×厚)的兩面，即在槽中垂直放置。所述電極配置產(chǎn)生的電場力線橫穿凝膠，迫使分子在每次脈沖過程中遷移通過凝膠的厚度。在TAFE中，相似大小的分子移動的距離相似，并在凝膠中遷移到相同高度留下整齊的軌跡，而與凝膠中小孔(樣品上樣其中)的位置無關(guān)。因此，該系統(tǒng)便于對比分析多個分離物樣品的電泳圖譜，可用于微生物分型。
根據(jù)這些原理，Beckman Instruments制造了稱為″Geneline I，或Transverse Alternating Field Electrophoresis System(橫向交變場電泳系統(tǒng))″的裝置(Beckman，The Geneline SystemInstruction Manual，ed.Spinco Division of BeckmanInstruments Inc.，1988)，也稱為TAFE。該系統(tǒng)使用可以上樣20個樣品的凝膠(11×7.2×0.6cm，長×寬×厚)。然而，TAFE也需要大量的緩沖液(3.5L)和生物樣品。該裝置分離溶組織內(nèi)阿米巴染色體需要至少20小時(Báez-Camargo M等人，Mol Gen Genet 1996，253289-296)。因此，在微生物分型上，TAFE與CHEF的缺點相同。
結(jié)論是，最常使用的表征微生物和寄生蟲基因組的商品化裝置，需要長的運行時間以及大量的試劑和生物樣品，將DNA大分子分離成條帶圖。
FIGE系統(tǒng)已經(jīng)用于細(xì)菌的快速分型(Goering RV和Winters MA，J Clin Microbiol，30(3)577-580，1992；Grothues D等人，JClin Microbiol，26(10)1973-1977 1988)。然而，已有記述在FIGE實驗中DNA的電泳遷移率倒置(inversion)。DNA遷移率倒置妨礙正確判斷大小，并難以解釋和比較多個樣品給出的圖。與該現(xiàn)象有關(guān)的難題是，不可能預(yù)測何時發(fā)生DNA遷移率倒置(Birren B和LaiE.Pulsed Field Gel Electrophoresisa practical guide，pp10，Academic Press，Inc.San Diego，California.1993)。遷移率倒置的主要缺點在于，不可能明確鑒別給定條帶中的分子。為此，應(yīng)該轉(zhuǎn)移該條帶并與特異性探針雜交。雜交顯著增加了分析費用及所需時間，因此該分型方法更費錢費時。
企圖通過提高電極上的電壓，降低當(dāng)前CHEF裝置(例如GeneNavigator(Amersham-Pharmacia-LKB，Pharmacia Molecularand Cell Biology Catalogue，Pulsed Field GelElectrophoresis，Nucleic Acids Electrophoresis.1998，pp77-79)、CHEF DRII和CHEF Mapper(CHEF Mapper XA Pulsed FieldElectrophoresis System.Instruction Manual and ApplicationGuide.Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673.Bio-Rad，pp 11，1995))的電泳時間，這幾乎是不可能的。這是由于電源輸出和冷卻系統(tǒng)的限制。因此，制造商推薦該裝置應(yīng)用的最大電場為9V/cm(CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System.Instruction Manual and Application Guide.Catalog Numbers170.3670 to 170-3673.Bio-Rad，pp 2，1995)。所以，CHEF系統(tǒng)無法通過增加電場強度而降低電泳時間。當(dāng)前的TAFE裝置有類似問題。
PFGE微型裝置1995年報告了微型PFGE(MiniPFGE)裝置，微型CHEF(miniCHEF)和微型TAFE(miniTAFE)形式(Riverón AM等人，Anal.Lett.，1995，vol.28，pp 1973-1991；歐洲專利申請EP 0745 844，Bull.1996/49；US專利申請08/688,607，1995；古巴專利RPI 02/95，1995)。微型裝置克服了PFGE裝置提及的大部分缺點。在微型膠(4×4×0.5cm；長×寬×厚)中上樣7個樣品，4-6小時內(nèi)進(jìn)行脈沖場電泳實驗。MiniCHEF應(yīng)用的電場強度可以達(dá)到16V/cm，2.7小時內(nèi)提供良好分離的電泳條帶圖。相反極性的電極之間距離短，可制作小槽并使用少量緩沖液覆蓋電極。通過在miniCHEF和CHEF槽上施加指定的電壓(某一電場強度值‘E’)，微型槽產(chǎn)生的熱量總是少于商品化CHEF產(chǎn)生的熱量(Riverón AM等人，Anal.Lett.，1995 vol.28，pp.1973-1991)。
微型TAFE裝置容許22V/cm完成條帶分離(Riverón AM等人，Anal.Lett.，1995 vol.28，pp.1973-1991)。MiniTAFE可在5小時內(nèi)獲得啤酒糖酵母的電泳染色體組型。相反電極之間距離短(7.8cm)的MiniTAFE槽較小，使用少量緩沖液。然而，如果上樣微型膠的樣品超過0.1cm厚，則需要較長的運行時間，以獲得良好分離的電泳圖。根據(jù)以前的報告，樣品厚度影響電泳運行時間(López-Cánovas等人，J.Chromatogr.A，1998，806，pp.187-197)。樣品較厚時，為獲得相同條帶圖，需要較長的凝膠。然而，報道的miniCHEF微型膠只容許7個樣品，而miniTAFE支持13個樣品。它們是臨床實驗室對微生物分離物進(jìn)行分型的低通量樣品形式。
盡管miniPFGE裝置優(yōu)于當(dāng)前使用的系統(tǒng)，但miniCHEF和MiniTAFE兩者均未用于微生物分型。這可能屈從于企圖使用與常規(guī)凝膠同樣厚的樣品。此外，沒有選擇微型裝置運行參數(shù)的簡單方法。
制備固定化DNA為了在當(dāng)前裝置或微型裝置中利用PFGE進(jìn)行微生物分型，制備完整DNA分子的方法必不可少。先前報道的在溶液中分離和純化DNA的方法，引起分子剪切(Schwartz DC和Cantor CR，Cell，1984，37，pp.66-75)。Schwartz和Cantor提出制備PFGE樣品的方法學(xué)，只去除了小于1 Mb(106堿基對)的分子。該方法學(xué)包括收集培養(yǎng)細(xì)胞、洗滌細(xì)胞并包埋于瓊脂糖膠塊中。在后續(xù)步驟中，‘原位’形成原生質(zhì)球(如果存在細(xì)胞壁)，并進(jìn)一步在該膠塊中溶解。最后利用蛋白酶K使固定化的DNA分子脫去蛋白質(zhì)。該方法有效用于制備不同屬、種和來源的微生物樣品。然而，如果該微生物具有細(xì)胞壁，則需要形成原生質(zhì)球，形成原生質(zhì)球所需的酶以及蛋白酶都很昂貴。該報告的方法要求樣品兩次溫育過夜，樣品制備需要32小時(US專利NO.4,473,452，1984年9月25日)。
新近，Gardner(Gardner DCJ等人，Yeast，1993，9，1053-1055)從不形成原生質(zhì)球的細(xì)胞獲得了啤酒糖酵母染色體的條帶圖。同時，Higginson等人(Higginson D.等人，Anal.Lett.，1994，277，1255-1264)表明，啤酒糖酵母DNA可以利用8M脲而非蛋白酶K脫去蛋白質(zhì)。然而，由于使用蛋白酶脫去DNA的蛋白質(zhì)，Gardner描述的方法仍很昂貴，Higginson描述的方法便宜，但溫育耗費72小時，時間很長。后來，制備啤酒糖酵母樣品而沒有使用酶膠塊依次與LETK(10mM Tris、500mM EDTA、600mM KCI、pH7.5)溫育4小時，NDS(10mM Tris、500mM EDTA、1％十二烷基肌氨酸鈉(sarcosyl)、pH 9.5)2小時，以及NDS外加4M脲(NDSU)2小時。該方法需要10小時進(jìn)行樣品制備(López-Cánovas L，等人，Anal.Lett，1996，2912，2079-2084)。還描述了快速制備固定化DNA的方法，但是使用酶(例如Guidet F和Langridge P，Biotech，1992，122，222-223)。
按常規(guī)，用于PFGE實驗的固定化的DNA需要形成原生質(zhì)球，并利用蛋白酶去蛋白。這些要求與所研究的細(xì)胞類型(細(xì)菌、酵母等)無關(guān)(Maule J，Mol.Biotech.1998，9107-126；Olive DM和BeanP，J.Clin.Microbiol，1996，376，1661-1669)。例如，據(jù)報道通過溶葡萄球菌素固定細(xì)胞、去污劑溫育膠塊，可在2小時內(nèi)制備固定化的金黃色葡萄球菌DNA，而糞鏈球菌(StreptococcusFecalis)需要在固定化之前與溶菌酶和變?nèi)芫販赜?Goering RV.和Winter MA.，J.Cl in.Microbiol，1992，303，577-580)。在所述工作中，作者沒有利用蛋白酶K溫育樣品。然而Matushek等人報道(Matushek MG等人，J.Clin.Microblol，1996，3410，2598-2600)，如果樣品不與蛋白酶k溫育則不能獲得條帶圖。作為代替，他們提出了利用蛋白酶K快速制備固定化DNA樣品的方法。最近，McEllistrem等人(McEllistrem MC等人，J.Clin.Microbiol，2000，38；1，351-353)報告了制備肺炎鏈球菌固定化DNA的完全無酶方法。但該方法耗費6小時，作者將該方法的成功歸因于鏈球菌自溶素的活化。目前，只有啤酒糖酵母和肺炎鏈球菌完整DNA分子的制備方法中去除了原生質(zhì)球形成酶和蛋白酶，但完成制備分別需要10和6小時，時間很長。微生物樣品制備中去除原生質(zhì)體形成酶和蛋白酶K的可行性并不存在。因此，當(dāng)前方法費錢費時。
大部分上述方法依據(jù)具有細(xì)胞壁的微生物必須在酶處理之前固定化的假定。Goering和Winter發(fā)表的文章有一例外(Goering RV和Winter MA，J.Cl in.Microbiol，1992，303，577-580)。作者在固定化之前將細(xì)胞懸浮于包含溶菌酶和變?nèi)芫?形成原生質(zhì)球的兩種酶)的溶液中。但是，尚無一般的無酶方法，在包埋入瓊脂糖凝膠之前處理具有細(xì)胞壁的微生物。這種方法應(yīng)該比當(dāng)前的樣品制備方法更便宜、更簡單。
報道了在溶液中分離核酸的方法，該方法從在引起微生物細(xì)胞壁通透性的試劑參與下加熱的細(xì)胞開始(歐洲專利0,657,530，1994，bulletin 95/24；US專利158,940，1993)。該方法釋放微生物未降解核酸的大片段，而無需物理上破壞完整細(xì)胞壁。該方法不需要水解酶。但是由于在溶液中分離DNA，而不能獲得完整的DNA分子；而且，作者沒有提出獲得所述微生物分子染色體組型或脈沖型的方法。作者報道，所獲DNA適于雜交，但未說明利用核酸內(nèi)切酶限制性酶切DNA的可能性?？傊?，該方法不能保證獲得完整的DNA分子，尚不了解其利用限制性酶消化的可能性。
因此，尚無一般方法，在短時間內(nèi)通過無酶方法制備酵母、革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌以及寄生蟲的固定化完整DNA。
制備固定化DNA樣品需要形成該樣品的模具(mold)。這些模具可以是可重復(fù)使用的或一次性?？芍貜?fù)使用的模具應(yīng)該能允許滅菌。這對于處理致病微生物樣品是重要的。使用一次性模具要求連續(xù)供應(yīng)，對于低預(yù)算的實驗室，這是限制因素。
以下為已知模具a)形成獨立的類似膠塊的模具(US專利4,473,452，1984年9月25日)；b)形成長條狀(其可切成獨立膠塊)的模具；
c)形成長方形‘面條’或長的瓊脂糖棒(其可切成獨立膠塊)的模具(Birren B和Lai E.Pulsed Field Gel Electrophoresisa practical guide，Academic Press，Inc.San Diego，California，1993，pp 29-30)。
一般而言，所述模具產(chǎn)生的樣品尺寸大于凝膠的狹槽。為此，需要用刀片或其它裝置切割條帶、面條等，以獲得與狹槽尺寸相似的膠塊。(CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System.Instruction Manual and Application Guide pp40，Section 7.Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673.Bio-Rad.1995)。然而，切割條帶或面條造成膠塊的大小和尺寸不均勻，其影響電泳圖的質(zhì)量。凝膠中DNA分子的分離取決于樣品厚度。因此難于比較凝膠不同泳道獲得的圖。難以比較條帶圖是微生物分型的缺點。
1995年10月10日的US專利5,457,050公開了在瓊脂糖凝膠中包埋細(xì)胞并處理膠塊的模具。根據(jù)制作材料，該模具可以一次性或可重復(fù)使用的。要求保護(hù)模具裝置為，在該模具內(nèi)部形成并處理樣品。但有缺點如果溫育過程中膠塊留在模具內(nèi)，獲得適于PFGE分析的樣品所需時間大大延長。由于膠塊和溫育溶液之間的接觸面積至少減小一半，溶解及去蛋白溶液的效應(yīng)分子不能充分到達(dá)細(xì)胞內(nèi)的靶分子。
選擇PFGE實驗條件實驗條件的選擇較為復(fù)雜。已經(jīng)報道了選擇PFGE運行條件的方法。
例如，Bio-Rad的CHEF Mapper可選自動算法(auto-algorithm)及另一交互式算法(CHEF Mapper XA Pulsed FieldElectrophoresis System.Instruction Manual and ApplicationGuide.pp 31-40 Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673.Bio-Rad.1995)。兩種選擇可以計算脈沖時間、脈沖斜坡(ramp)持續(xù)時間、重定向(reorientation)角度、電場以及最佳運行時間，以分離指定樣品的DNA分子。與假設(shè)固定實驗條件的自動算法不同，交互式算法允許改變輸入的緩沖液類型、溫度和濃度、以及瓊脂糖類型和濃度。兩種算法均以5年經(jīng)驗中收集的實驗和理論數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)。(Bio-Rad Catalogue.Life Science Research Products.Bio-RadLaboratories，ppl85.1998/99)。然而，制造商推薦DNA大小小于或大于預(yù)期的樣品分子時使用自動算法。此外，如果輸入自動算法以及交互性程序的大小范圍太寬，可產(chǎn)生錯誤結(jié)果，例如凝膠中部的條帶倒置。
提出了另一經(jīng)驗表達(dá)式，可給出分離大小介于給定值和稱作RSL(Resolution Size Limit，分離大小限制)的較高值之間的一組分子的電脈沖持續(xù)時間(Smith DR.Methods I，1990，195-203)。然而該表達(dá)式只在特定實驗條件下有效，不能預(yù)測任意兩個分子之間的分離。提出了另一關(guān)系式。它提供了分離給定的一組分子所需電場和脈沖時間的近似條件(Gunderson K和Chu G，Mol.Cell.Biol.，1991，113348-3354)。然而該關(guān)系式只可以粗略估計所述兩個變量，而不提供任何實驗條件下的分子遷移。
盡管對PFGE過程中的DNA分子重定向進(jìn)行了各種理論研究(Noolandi J，Adv.Electrophoresis，1992，51-57；Maule J，Mol.Biotech.1998，9107-126)，所述研究尚未給出在實驗室中實用有效的結(jié)果。這些研究沒有產(chǎn)生使得PFGE使用者可以選擇并設(shè)置分離待分析的分子所需要的實驗條件的方法。
López-Cánovas等人提出的方程式(López-Cánovas L等人，J.Chromatogr.A，1998，806123-139)，描述了DNA在PFGE中的遷移，沒有用于預(yù)測改變脈沖時間斜坡、電場、溫度和運行時間所應(yīng)獲得的條帶圖。在微生物分型中通常改變這些變量。
PFGE條帶圖分析從PFGE凝膠獲取圖象數(shù)據(jù)的計算機化系統(tǒng)可用于條帶圖分析(Gerner-Smidt P等人，J.Clin.Microbiol，1998，37(3)876-877；Tenover F等人，J.Clin.Microbiol，1995，33(9)2233-2239；van Belkum A等人，J.Clin.Microbiol，1998，36(6)1653-1659)。然而比較限制性圖仍是主觀過程，不能完全簡化為嚴(yán)格算法(Tenover F等人，J.Clin.Microbiol，1995，33(9)2233-2239)。盡管進(jìn)行了基于計算機的分析，圖的最終解釋必須服從于先前可見的觀察。
自動和非自動條帶圖分析得到條帶數(shù)目以及條帶中分子大小的結(jié)果。這一般通過比較未知DNA遷移與分子量標(biāo)志的遷移而實現(xiàn)。但是PFGE相對較新，并不一定總能得到DNA大小范圍較寬的大小標(biāo)志。因此，以PFGE條帶圖解釋為基礎(chǔ)進(jìn)行細(xì)菌分型的標(biāo)準(zhǔn)是，確定所比較微生物的DNA經(jīng)消化而獲得的不同限制性片段的數(shù)目。
根據(jù)在1.5％瓊脂糖、Lachema以及0.5X TBE(1X TBE89mMTris、89mM硼酸、2mM EDTA)的實驗中收集的電泳數(shù)據(jù)，提出方程式，其描述DNA分子在單脈沖斜坡、不同電場強度和不同溫度下的遷移(López-Cánovas L等人，J.Chromatogr.A，1998，806123-139)。但是，沒有擴(kuò)展并應(yīng)用該方程式以分析施加脈沖時間斜坡后的條帶圖的方法。在微生物的比較研究中經(jīng)常施加脈沖時間斜坡。
利用PFGE進(jìn)行微生物分型的現(xiàn)有方法。
微生物分型的全過程需要長時間和許多資源。電泳需要約20小時，制造商推薦或文獻(xiàn)報道的樣品制備方法需要大量酶(例如80mg/mL蛋白酶k)和長的溫育時間(CHEF Mapper XA Pulsed FieldElectrophoresis System. Instruction Manual and ApplicationGuide.pp 40-43 Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673.Bio-Rad.1995)。使用PFGE進(jìn)行微生物分型的限制因素是完成分離物分析所需的時間，為2-3天，從而降低了實驗室分析多個樣品的能力(Olive DM和Bean P，J.Clin.Microbiol，1999，376，1661-1669)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了在一個工作日(7-13小時)進(jìn)行微生物分離物分型的方法和試劑盒。通過在微型裝置中利用脈沖場凝膠電泳分離DNA分子，獲得特有的條帶圖，進(jìn)行分型。特別地i)此處提供了在至多60分鐘內(nèi)制備凝膠小塊中包埋的完整DNA樣品的方法和相關(guān)試劑盒。該方法基于利用不包含水解酶的溶液處理細(xì)胞。所述處理可以在凝膠包埋該細(xì)胞之前或之后進(jìn)行。該細(xì)胞可能是酵母、寄生蟲、革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌。利用由可滅菌的柔軟材料制成的模具包埋細(xì)胞。其產(chǎn)生大小均勻的微膠塊。根據(jù)所用模具的尺寸，微膠塊的厚度為0.03-0.1cm。
ii)提供了預(yù)測線性DNA遷移的方法。該方法以理論公式為基礎(chǔ)，可計算在電場、溫度、脈沖持續(xù)時間斜坡以及電泳持續(xù)時間的任何條件下，線性DNA分子在CHEF系統(tǒng)中的遷移。這些方法可以選擇作用于凝膠的最佳電泳條件，并分析電泳后獲得的條帶圖。
iii)此處提供了分離并分析微生物DNA分子的方法。在脈沖場凝膠電泳微型裝置中進(jìn)行分離。miniCHEF微型裝置在2.5-5小時內(nèi)產(chǎn)生條帶圖，而MiniTAFE為5-7小時。該方法可以研究多達(dá)27個固定化的微生物DNA樣品。所述樣品為a)利用無酶方法制備；b)在微型裝置的微型膠中，于通過預(yù)測方法輔助下選擇的最佳電泳條件下分離，c)分析估計DNA分子的大小。利用線性DNA遷移分析方法的輔助，對微型膠小孔中上樣的、經(jīng)過微型裝置中兩種電場作用的所有DNA分子進(jìn)行估計。在分析以前，通過任何染色方法檢測凝膠中的DNA分子。
本發(fā)明提供的樣品制備方法花費至多60分鐘，簡單、便宜，溶液中既不需要水解酶，也不需要蛋白酶，以溫育微生物細(xì)胞并產(chǎn)生固定化的完整DNA?？梢岳孟拗菩悦赶暾腄NA分子，如果對其進(jìn)行脈沖場凝膠電泳，完整的DNA分子或其限制性片段在微型膠中遷移，形成對應(yīng)于微生物的分子染色體組型或脈沖型的條帶圖。
該方法基于化學(xué)改變細(xì)菌壁，使微生物溶解，或者小的效應(yīng)分子向細(xì)胞中的靶分子擴(kuò)散。在制備過程中，還通過透析去除不想要的細(xì)胞內(nèi)成分。結(jié)果在包埋細(xì)胞的微膠塊中獲得完整的DNA分子。
該方法包含以下一般步驟1)最初從住院病人的液體、或者生物技術(shù)收集物、或者分子生物學(xué)、遺傳學(xué)或其它普通實驗室所做的實驗中分離微生物細(xì)胞。
2)細(xì)胞在對每種微生物成分合適的液體或固體培養(yǎng)基中生長。
3)通過離心收集細(xì)胞，并進(jìn)一步洗滌。
4)細(xì)胞a)包埋入凝膠中并與無酶溶液溫育，或者b)與所述溶液溫育再包埋入凝膠中。在‘a(chǎn)’的情況下，包含固定化細(xì)胞的微膠塊首先在無酶溶液中50℃溫育5-30分鐘。在‘b’的情況下，細(xì)胞與該無酶溶液50℃溫育5-30分鐘，然后包埋入瓊脂糖微膠塊中。
5)如果要進(jìn)行電泳，則包含細(xì)胞的微膠塊對電泳緩沖液透析；或者，如果要保存微膠塊，則對保存緩沖液透析；或者，如果要消化DNA分子，則對限制性內(nèi)切酶緩沖液透析。
啤酒糖酵母、多形漢遜氏酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)和金黃色葡萄球菌為能夠在固定化之前在無酶溶液中溫育的生物。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、大腸桿菌和溶組織內(nèi)阿米巴應(yīng)該首先固定化，再于無酶溶液中溫育。最有效的細(xì)胞洗滌液列于表I。
表I.制備固定化DNA的最有效細(xì)胞洗滌液。
溫育細(xì)胞或包含細(xì)胞的微膠塊的無酶溶液，含有陰離子去污劑、金屬螯合劑、能夠競爭氫鍵形成的試劑以及Tris緩沖液。最有效的溶液包含1％肌氨酰(sarkosyl)、0.1M EDTA、0.01M Tris堿、4M脲、pH9.5(NDSU)。為溫育革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞，加入NP-40(nonidet P-40)(NDSUPlus)。
某些微生物，例如大腸桿菌應(yīng)該首先在無酶溶解液中37℃溫育10分鐘。其中包含1％肌氨酰、1％NP-40、0.1M EDTA、0.01MTris堿、pH8.0。進(jìn)一步其在NDSUPlus溶液中溫育半小時。
包含固定化DNA的微膠塊的保存緩沖液為TE-100(0.01M Tris堿、0.1M EDTA、pH8.0)。
在瓊脂糖微膠塊中包埋細(xì)胞的方法，是使用可滅菌的柔軟材料制成的模具。該模具是多達(dá)0.5cm寬的聚硅氧烷、橡膠或其它柔軟材料(參見實施例，實施例1)制成的薄片。薄片上刻有若干方形凹槽。凹槽可能達(dá)到0.3cm寬、0.03-0.1cm深。為灌注瓊脂糖-細(xì)胞懸液，將模具放在42C加熱表面上，在該溫度下預(yù)熱，然后將懸浮液灌注模具，借助刮刀使其均勻分布于凹槽中。然后用蓋子(可由玻璃、丙烯酸、塑料或其它任何材料制成)蓋住模具，4-15℃溫育，直至微膠塊變硬。抓住模具周邊，在包含處理微膠塊的無酶溶液的容器中彎曲模具，從柔性模具中取出大小均勻的微膠塊。每個0.3×0.07cm大小的微膠塊包埋0.12-3×108細(xì)菌細(xì)胞、8×107酵母細(xì)胞或6×104溶組織內(nèi)阿米巴營養(yǎng)體，制備懸浮液。所述微生物都可以使用這種模具制備?？傊@種模具可用于制備包含其它任何種類細(xì)胞的微膠塊。
在本發(fā)明中，選擇應(yīng)用于微型裝置的最佳電泳條件的方法，是基于計算線性DNA分子的遷移。利用描述線性DNA分子在miniCHEF微型膠中的遷移、重定向時間以及遷移速度的一組理論公式，進(jìn)行計算。該公式中輸入電場和溫度值，其應(yīng)該分別為1-20V/cm和4-30℃。為了應(yīng)用該公式，假定在1.5％瓊脂糖中進(jìn)行電泳，電泳緩沖液應(yīng)為44.5mM Tris、44.5mM硼酸、1mM EDTA、pH8.3(TBE0.5X)。描述DNA遷移的理論公式如下D=Σr=1n{vr tprΓr(tpr-tr)Npr+vm(tpr-tr)[1-Γr(tpr-tr)]Npr}---Eq.1]]>vr＝0.0207[QEU1.45/(8πηL1.35)] Eq.2vm＝0.665[QE1.76/(8πηL1.08)] Eq.3tr＝0.134(L1.14/vr)0.926Eq.4如果(tpr-tr)≤0則Гr(tpr-tr)＝1以及如果(tpr-tr)＞0則Гr(tpr-tr)＝0Eq.5其中tr重定向時間(s)，vr重定向過程中的遷移速度(cm/s)，vm重定向之后的遷移速度(cm/s)，Q1e-×bp(DNA凈電荷，e-電子電荷(靜電庫侖))，L0.34nm×bp(DNA外形長度(cm))，E電場強度(靜電伏特/cm)，η緩沖液的粘度(Poises)，通過在有關(guān)水的粘度和溫度的多項式函數(shù)中內(nèi)插實驗溫度(℃)，計算η。DDNA分子在CHEF微型膠中總的遷移(cm)，d每次脈沖的遷移(cm)，n脈沖時間斜坡數(shù).Npr斜坡‘r’的脈沖數(shù)，tpr斜坡‘r’的脈沖持續(xù)時間(s)，選擇最佳電泳條件的方法，包括以下步驟I.計算將要用于斜坡的脈沖持續(xù)時間(tpr)。為此1)將選擇的電場和溫度值輸入該公式。還應(yīng)給出最小和最大的線性DNA分子的大小。
2)通過使用公式4，估計最小和最大的線性DNA分子的重定向時間。
3)如果希望在單個圖中包括大小介于最大和最小分子之間的DNA分子，則計算兩個重定向時間的平均值(單個tpr或tp1)。
4)計算脈沖持續(xù)時間的數(shù)字序列(tpr)。其開始于比最小分子的重定向時間低1.5倍的脈沖持續(xù)時間，結(jié)束于比最大分子的重定向時間高1.5倍。脈沖持續(xù)時間線性增加，用于計算的tpr的數(shù)字序列。
5)為進(jìn)行電泳，可以利用步驟(3)計算的tp，否則使用步驟(4)計算的tpr數(shù)字序列。II.計算總的運行時間。根據(jù)計算的最小線性DNA分子的遷移估計總的電泳運行時間。如下進(jìn)行1)將電場和電泳緩沖液溫度值輸入公式2和3。
2)估計最小分子的重定向時間和遷移速度。將步驟I估計的電脈沖持續(xù)時間(tpr)輸入公式1。固定脈沖數(shù)的初始值。
3)每個斜坡‘r’的脈沖數(shù)逐一增加，每次利用公式1和5估計最小分子的遷移。重復(fù)該迭代，直至分子到達(dá)距離微型膠底部0.1-1cm的位置III.通過使用公式1-5，針對‘n’斜坡計算欲分離分子遷移，然后在選擇的電場、溫度、斜坡數(shù)″r″、電脈沖的持續(xù)時間以及脈沖數(shù)(Npr)條件下，預(yù)測這些分子在miniCHEF微型膠中的條帶圖。該計算包括以下步驟1)假定在1.5％瓊脂糖凝膠和0.5X TBE緩沖液中進(jìn)行電泳。
2)按公式2和3定義電場和緩沖液溫度值(將用于真正的實驗)。
3)根據(jù)上述步驟估計的數(shù)值，定義公式1的斜坡總數(shù)(n)、每個斜坡應(yīng)用的脈沖數(shù)(NPr)以及每個斜坡的脈沖持續(xù)時間(tpr)。
4)指定待分析的分子大小。
5)通過使用公式1-5，計算(欲分析的)DNA分子在指定電泳條件下將要遷移的距離。
6)以數(shù)字或圖形的形式，表示計算的線性DNA分子的遷移。
7)重復(fù)步驟2-6，直至預(yù)測的圖顯示線性DNA分子最佳分離。IV.根據(jù)以上結(jié)果，選擇使線性DNA分子最佳分離的實驗條件。然后將這些數(shù)據(jù)輸入電源、電泳控制裝置以及冷卻系統(tǒng)。應(yīng)用該方法優(yōu)選計算機程序，便于模擬不同大小DNA分子在miniCHEF中的分離。該程序可計算DNA分離的最佳實驗條件。該程序也將提供完成所需計算的快速方法，以實施本發(fā)明這一部分。編制了模擬條帶圖的程序。該程序允許使用者改變以下變量1-凝膠中欲分離的DNA片段或完整DNA分子的大小。
2-緩沖液溫度。
3-電壓。
4-每個斜坡應(yīng)用的脈沖時間和電脈沖數(shù)。
5-脈沖時間斜坡數(shù)，包含1-1000個斜坡。輸入所述數(shù)值，該程序提供以下結(jié)果。
1-在DNA重定向過程之中或之后的DNA分子速度(cm/s)。
2-每個DNA分子的重定向時間(秒)。
3-選定的運行時間內(nèi)，每個分子在凝膠中的遷移。
4-每個分子的遷移以及電泳圖示意圖。如下以圖形表示線性DNA分子在指定電泳條件下的遷移距離i)繪制與真實微型膠尺寸相同的微型膠，以及假定樣品上樣的小孔。
ii)在每個小孔下劃線。代表不同大小DNA分子分離后形成的條帶。每條線與小孔同寬。按DNA分子在真實微型膠中遷移離開小孔的距離劃線。
iii)給每條線、或假定的條帶指定一種顏色。顏色隨該條帶包含的分子大小而變化。即，使用鑒別指定大小的分子的顏色代碼。
該程序建立了選擇合適實驗條件的方法，通過在miniCHEF中脈沖場凝膠電泳分離完整染色體大小的DNA分子或大的DNA片段。該程序如果輸入不同的實驗變量值，則獲得不同的電泳圖，從而可以鑒別在CHEF和miniCHEF中分離目的分子的實驗條件。該方法不消耗試劑和生物樣品。它是以描述線性DNA在miniCHEF中遷移的理論公式為基礎(chǔ)。該公式是利用真實的miniCHEF實驗獲得的線性DNA的遷移數(shù)據(jù)擬合而成。因此，其正確描述了該分子電泳時的遷移。此外，其不在凝膠中間產(chǎn)生遷移率倒置的異常結(jié)果。
本發(fā)明申請了通過在miniCHEF和miniTAFE微型裝置中電泳分離DNA而進(jìn)行快速微生物分型。將利用無酶方法制備的啤酒糖酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和溶組織內(nèi)阿米巴細(xì)胞樣品上樣微型膠中。也可以上樣利用常規(guī)酶法制備的這些微生物或其它任何微生物的樣品。
使用MiniCHEF和miniTAFE微型槽獲得染色體組型或脈沖型。miniCHEF和MiniTAFE中極性相反電極對之間的距離分別為大約11.6cm和7.8cm。miniCHEF和miniTAFE應(yīng)用的電場強度達(dá)到20V/cm和22V/cm。
實施本發(fā)明這一部分所選擇的電泳裝置，包括先前由Riverón等人1995年描述的miniCHEF和miniTAFE微型槽(Riverón AM等人，Anal.Lett.，1995，281973-1991；歐洲專利申請EP 0,745,844，Bull，1996/49；US專利申請08/688,607，1995；古巴專利RPI Nro.02195，1995)，該發(fā)明內(nèi)容此處全文引入供參考。略微改變miniCHEF槽的底板，以支持4-7cm寬的瓊脂糖微型膠。該微型膠可上樣12-27個樣品。略微加寬miniTAFE槽，以支持7cm寬的微型膠。miniTAFE微型膠可上樣27個樣品。
微型膠的瓊脂糖濃度可以為0.8-1.5％，優(yōu)選值1.5％。1X TBE緩沖液為0.089M Tris堿、0.089M硼酸和0.002M EDTA(乙二胺四乙酸的鈉鹽)，可使用的濃度范圍為0.25-1X，優(yōu)選0.5X。緩沖液溫度可以在4-30℃之間變化。也可使用1X TAE緩沖液(0.04MTris-乙酸和0.001M EDTA)。為了鉗住miniCHEF電極的電壓并改變miniCHEF和miniTAFE槽的電場方向，可以使用任何定制裝置，包括Riverón AM等人，Anal.Lett，1995，28(5)845-860；以及Riverón AM等人，Anal.Lett.，1995，28(11)1973-1991描述的裝置。
可以使用最大輸出300瓦的任何電源給電極通電。
將瓊脂糖微膠塊裝入微型膠的小孔中。由用于灌注微型膠的梳齒形成小孔?？墒褂貌煌氖嶙友b載較寬或較窄的微膠塊。這取決于所灌注的微膠塊的尺寸。
使用溴化乙錠染色微型膠各個條帶中的分子。用紫外線(紫外線透射儀)照射微型膠，利用550nm濾光片的照相機拍攝圖像。也可使用其它任何染色方法。
電場強度、緩沖液溫度、脈沖時間斜坡、電泳時間以及每個斜坡中設(shè)置的電脈沖數(shù)來自于該模擬程序(或者選擇分離分子最佳條件的方法)結(jié)果，或來自使用者采用的另一方法(包括他的實驗經(jīng)驗)的結(jié)果。使用模擬程序時，緩沖液的濃度應(yīng)該是0.5X TBE，瓊脂糖(Lachema)凝膠必須是1.5％，電場必須達(dá)到20V/cm，溫度必須為4-30℃，并且必須是miniCHEF槽。使用模擬程序但希望使用miniTAFE時，可以使用該模擬程序給定的相同的電場和溫度條件，但是每個斜坡的脈沖數(shù)應(yīng)該增加1.5倍，脈沖持續(xù)時間增加1.2倍。
在其它的電場強度和溫度條件下，也可以在微型裝置中獲得待分離樣品所含分子的典型條帶圖。
本發(fā)明分析電泳后所得條帶圖的優(yōu)選方法是根據(jù)測定線性DNA分子在微型膠中的遷移距離，以及利用公式1-5計算分子大小。該方法要求，在電場為1-20V/cm、溫度4-30℃、1.5％瓊脂糖(Lachema)、0.5X TBE緩沖液以及任意脈沖時間斜坡數(shù)‘n’(1-1000)和電泳時間下，通過在miniCHEF裝置中電泳在微型膠中獲得條帶圖。該方法包括i)在電泳及染色微型膠中的條帶之后，測定線性DNA分子在微型膠中的遷移距離。
ii)將電場、緩沖液溫度、斜坡數(shù)(n)、每個斜坡應(yīng)用的脈沖數(shù)(NPr)以及每個斜坡的脈沖持續(xù)時間(tpr)的數(shù)值輸入公式1-5。
iii)將電泳之后條帶遷移的實際距離(D，cm)輸入程序。
iv)由遷移距離計算每個條帶的分子大小。如下進(jìn)行1)限定假定的DNA分子的初始大小為1000對堿基。
2)使用公式2、3和4分別估計假定的DNA分子的vr、vm和tr。
3)利用公式1和5，估計假定的DNA分子在實驗所用電泳條件下的理論遷移(Dt，cm)。
4)比較D和Dt。如果Dt大于D，則將假定的分子的大小增加1000bp。
5)重復(fù)步驟2)-4)，直至估計的假定的DNA分子的遷移小于或等于實際分子在微型膠中的遷移距離(D)。
6)認(rèn)為條帶中的DNA分子與滿足4)中所提條件的假定的DNA分子大小相同。也認(rèn)為估計的假定分子的tr、vr和vm值與實際分子相同。
7)利用測定的所有條帶的距離，重復(fù)步驟1)-6)；即微型膠中分離的所有分子。
利用電泳圖和矩陣描述電泳。其在行中包含每個片段或所分離分子的序數(shù)；列中為所分離分子的大小、重定向時間和遷移速度。
計算機程序可提供實踐本發(fā)明這一部分的優(yōu)選方法。該程序?qū)⑻峁┻M(jìn)行計算的快速方法，以估計電泳中分離的片段或完整DNA分子的大小和動力學(xué)參數(shù)。編制程序，允許使用者改變以下變量1-分子的遷移距離，即在凝膠中每個條帶圖的位置。
2-緩沖液溫度。
3-電泳槽設(shè)置的電壓。
4-每個斜坡設(shè)置的脈沖時間和電脈沖數(shù)。
5-斜坡數(shù)(限于1-1000)將所述數(shù)值輸入該程序，產(chǎn)生以下結(jié)果1-在重定向過程之中或之后的DNA速度(cm/s)。
2-每個分子的重定向時間(s)。
3-分子大小(kb)。
將miniCHEF電泳條件以及得到的分子遷移距離輸入程序，該程序可以計算凝膠中每個條帶所含分子的大小和動力學(xué)參數(shù)。通常，鑒定條帶的分子不需要分子量標(biāo)志。該分析可以根據(jù)其動力學(xué)特性分類DNA片段或分子。借助于通常使用的另外方法也可描述電泳結(jié)果。
實施例實施例1.制備樣品微膠塊的可滅菌模具。


圖1示意圖中顯示了柔性材料(聚硅氧烷、橡膠或其它任何材料)制成的可滅菌模具的例子。該模具用于制備瓊脂糖包埋的DNA樣品。薄片(1)具有49個凹槽(2)。在模具或薄片上灌注瓊脂糖-細(xì)胞懸液，并用特殊的刮刀(4)分布于模具。然后用蓋子(3)蓋住薄片(1)，得到包含包埋有細(xì)胞的微膠塊(5)。利用熔化的聚硅氧烷制作實際模具的薄片。將其注入另一模具，直至形成薄片(1)。本實施例中，微膠塊尺寸為3×3×0.7mm(長、寬×厚)。拿住薄片的邊緣，在含有溶液的容器中彎曲，取出薄片(1)上的微膠塊(5)。于是微膠塊從薄片上脫落，掉入溶液中。
其它模具變體的凹槽寬度可以從1.5mm直至微型膠寬度，而厚度為0.5mm-1.5mm不等。薄片上刻壓的凹槽數(shù)目也可變化。
實施例2.從液體培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物開始，無酶制備瓊脂糖包埋的酵母完整DNA。
酵母(啤酒糖酵母、多形漢遜酵母或巴斯德畢赤酵母)在液體YPG培養(yǎng)基中(YPG10g酵母抽提物、20g葡萄糖和10g蛋白胨，溶于1L蒸餾水)生長，30℃振搖至晚對數(shù)期。離心收集細(xì)胞，用0.05M EDTA、pH7.5(洗滌液，表I)洗滌。利用以下兩種不同方法獲得瓊脂糖包埋的完整DNA方法1細(xì)胞于包埋入瓊脂糖微膠塊之前溫育。
方法2細(xì)胞包埋入瓊脂糖微膠塊中，再溫育微膠塊。
兩種方法均在先溶于0.125M EDTA的1.5％低熔點瓊脂糖中制備1.3×1010細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，由此將細(xì)胞包埋于瓊脂糖。將細(xì)胞懸液灌注圖1所示的薄片模具(1)，然后用蓋子(3)蓋住模具，使瓊脂糖變硬，直至形成樣品微膠塊(5)。
在方法1中，從100ml液體培養(yǎng)物獲得細(xì)胞團(tuán)，重懸于5mlNDSU中，50℃溫育5分鐘。懸浮液進(jìn)一步在TE-100中稀釋5倍。離心收集細(xì)胞，如上所述包埋于瓊脂糖微膠塊。
在方法2中，收集細(xì)胞、洗滌再包埋于瓊脂糖微膠塊(見表I)。含細(xì)胞的瓊脂糖微膠塊在NDSU中45℃溫育半小時。
將微膠塊在TE-100中(0.01M Tris堿、0.1M EDTA、pH8.0)洗滌兩次，5分鐘，再4℃保存于新鮮的TE-100中。利用兩種方法之任何一種處理微膠塊，并于電泳以前，在運行溫度下將微膠塊于TBE中溫育10分鐘。
分離為條帶圖的啤酒糖酵母染色體(12)及線粒體(13)DNA的微型膠(10)照片如圖2所示。將細(xì)胞包埋于微膠塊中，并與NDSU溫育，制備樣品(方法2)。miniCHEF使用的微型膠寬7cm，可上樣最多27個樣品(11)。電泳運行條件為，10V/cm、20℃、1.5％瓊脂糖、0.5XTE、脈沖時間50秒以及電泳4小時。
分離為條帶圖的多形漢遜酵母染色體(17)及線粒體(18)DNA的miniCHEF微型膠泳道(16)照片也如圖2所示。根據(jù)方法2制備多形漢遜酵母的染色體。在miniCHEF中，按10V/cm、20℃、1.5％瓊脂糖、0.5X TBE、脈沖時間120秒以及電泳4小時進(jìn)行分離。
如圖2所示，還在miniTAFE(20)微型膠中分離啤酒糖酵母染色體。也顯示了染色體(21)及線粒體(22)DNA的條帶圖。利用方法1制備樣品，即在瓊脂糖包埋之前溫育細(xì)胞。在由梳子形成的13個狹槽(23)中上樣該樣品。該微型膠為7cm寬。在miniTAFE中應(yīng)用10V/cm、20℃、1.5％瓊脂糖、0.5X TBE、脈沖時間60秒以及電泳6小時。
實施例3.從液體和固體培養(yǎng)基中生長的銅綠假單胞菌無酶制備瓊脂糖包埋的完整DNA。
從血瓊脂平板分離銅綠假單胞菌的兩個克隆。其一接種于5mlLB培養(yǎng)基(每升蒸餾水含10g酵母提取物、5g氯化鈉和10g細(xì)菌用胰蛋白胨)，另一劃線于LB平板(LB添加1.2％細(xì)菌用瓊脂)。
兩種培養(yǎng)物均37℃溫育過夜。液體培養(yǎng)物振搖溫育，平板則保持靜止。液體中生長的細(xì)胞通過離心收集，而平板則用合適的洗滌液(表I所示)洗滌，再離心收集。
利用表I所示溶液洗滌在液體或固體培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞，離心收集，按濃度2×109細(xì)胞/mL重懸于溶于0.15M NaCl的1.5％低熔點瓊脂糖中。將瓊脂糖-細(xì)胞混合物灌注圖1所示的薄片模具(1)，然后用蓋子(3)蓋住薄片，使瓊脂糖靜置，直至形成膠塊(5)。將微膠塊與NDSUPlus 50℃溫育半小時。然后用TE-100于50℃洗滌微膠塊兩次，10分鐘，并4℃保存于新鮮的TE-100中。限制性酶消化之前，洗滌微膠塊，并在Xba I限制性酶緩沖液中溫育10分鐘。每個微膠塊用20U Xba I 37℃消化2小時。在10V/cm、20℃、1.5％瓊脂糖和0.5X TBE下于miniCHEF中分離限制性片段，分別應(yīng)用20、15、10、5和3秒的脈沖斜坡(ramp)以及5、15、320、1020和100次脈沖。
在miniCHEF微型膠(25)中分離的條帶圖如圖3所示。由液體LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)物制備銅綠假單胞菌微膠塊(27)，由LB平板的培養(yǎng)物制備微膠塊(28)。分離的DNA片段的大小也如圖所示。
實施例4.從固體培養(yǎng)基生長的金黃色葡萄球菌無酶制備瓊脂糖包埋的完整DNA。
從血瓊脂培養(yǎng)基分離金黃色葡萄球菌的一個克隆，劃線于Mueller-Hinton平板(Oxoid)。該平板于37℃溫育過夜。用洗滌液(0.15M NaCl、0.01M EDTA、pH8.0，表I)洗滌平板表面，離心收集細(xì)胞。
利用以下兩種不同方法制備瓊脂糖包埋的完整DNA方法1在包埋入瓊脂糖微膠塊之前溫育細(xì)胞。
方法2細(xì)胞包埋入瓊脂糖微膠塊中，再溫育該微膠塊。
兩種方法均在溶于洗滌液(表I)的1.5％低熔點瓊脂糖中制備4×1010細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞包埋于瓊脂糖。將細(xì)胞懸液灌注圖1所示的薄片模具(1)，然后用蓋子(3)蓋住薄片，使瓊脂糖變硬，直至形成微膠塊(5)。
在方法1中，細(xì)胞團(tuán)重懸于3ml NDSUPlus中，50℃溫育30分鐘。然后懸浮液在TE-100中稀釋5倍。離心收集細(xì)胞，包埋于瓊脂糖微膠塊中。
在方法2中，收集細(xì)胞、洗滌再包埋于瓊脂糖微膠塊。瓊脂糖微膠塊與NDSUPlus于50℃溫育1小時。
利用兩種方法之任何一種處理以后，將微膠塊于TE-100中50℃洗滌兩次，10分鐘。在限制性酶消化之前洗滌微膠塊，并與Sma I限制性酶緩沖液冰上溫育10分鐘。每個微膠塊用20 U Sma I 37℃消化2小時。分離在微型膠(30)條帶圖(31)中的金黃色葡萄球菌DNA大限制性片段，如圖4所示。根據(jù)方法2制備微膠塊(32)，通過方法1制備微膠塊(33)。運行條件為10V/cm、20℃、1.5％瓊脂糖、0.5XTBE以及脈沖斜坡1、5、9、13、17和21秒。所有斜坡均應(yīng)用130次脈沖。分離的DNA片段的大小也如圖所示。
實施例5.無酶制備瓊脂糖包埋的溶細(xì)胞內(nèi)阿米巴完整DNA溶細(xì)胞內(nèi)阿米巴(克隆A)營養(yǎng)體在TYI-S-33培養(yǎng)基中生長至對數(shù)期。冷凍培養(yǎng)瓶、離心沉淀細(xì)胞，收集營養(yǎng)體。沉淀經(jīng)冷的PBS洗滌，按每毫升溶液2.5×106營養(yǎng)體的比例，與冷的高滲溶液(0.5MNaCl、0.05M EDTA、0.01M Tris、pH7.0)溫育15分鐘。108營養(yǎng)體進(jìn)一步重懸于1ml溶于高滲溶液中的2％低熔點瓊脂糖。將懸浮液灌注圖1所示柔性聚硅氧烷模具，使微膠塊于4℃變硬。微膠塊與NDSU(0.01M Tris堿、0.1M EDTA、1％肌氨酰(w/v)、4M脲、pH9.5)于45℃溫育1小時。電泳之前，將微膠塊與0.5 X TBE在運行溫度下溫育10分鐘。為了保存，用TE-100(0.01M Tris堿、0.1M EDTA、pH8.0)洗滌微膠塊兩次，每次5分鐘，并4℃保存于新鮮的TE-100中。
溶細(xì)胞內(nèi)阿米巴(38)、啤酒糖酵母(37)以及λ-DNA聚體(39)的DNA條帶圖(36)，如圖5所示。在電場9.03V/cm、脈沖時間120秒、20℃、1％瓊脂糖(Seakem)、0.5X TBE運行緩沖液以及電泳6小時下進(jìn)行電泳。上樣0.1cm厚的微膠塊。
實施例6設(shè)計miniCHEF的電泳運行條件。利用模擬程序(選擇 DNA最佳分離條件的方法)設(shè)置實驗條件。
模擬在miniCHEF槽中(其極性相反的電極間距為11.6cm)分離啤酒糖酵母染色體所需的脈沖時間斜坡。目的在于獲得顯示由啤酒糖酵母所有染色體形成的11條帶圖。假定在1.5％瓊脂糖凝膠和0.5X TBE運行緩沖液中進(jìn)行電泳。采用Goffeau報道的啤酒糖酵母染色體的大小值(Goffeau A等人，Science，1996，274546)230kb(chrom.I)，270kb(chrom.VI)，315kb(chrom.III)，440kb(chrom.IX)，589kb(chrom.VIII)，577kb(chrom.V)，667kb(chrom.XI)，745kb(chrom.X)，784kb(chrom.XIV)，813kb(chrom.II)，924kb(chrom.XIII)，948kb(chrom.XVI)，1091kb(chrom，VII and chrom.XV)，1554kb(chrom.IV)和2352 kb(chrom.XII)。
該模擬程序預(yù)測4個脈沖時間斜坡，每個斜坡的脈沖時間為5、40、75和110s以及42次脈沖，以在電場強度10V/cm和20℃達(dá)到單一圖的最佳的啤酒糖酵母染色體分離。遷移的結(jié)果，用于鑒別每條染色體的重定向時間、遷移速度和顏色代碼，如表II所示。
表II.使用模擬程序獲得的定量結(jié)果。根據(jù)模擬程序的顏色代碼，為啤酒糖酵母染色體指定大小(kb)和顏色。
D實驗值圖6微型膠(40)中的分子遷移距離。
D預(yù)測值在圖6實驗所用運行條件下，根據(jù)模擬程序預(yù)測的分子遷移距離。
vr重定向過程中的分子遷移速度。
vm重定向之后的分子遷移速度。
Tr分子的重定向時間。
具有在利用模擬程序預(yù)測的條件下，于miniCHEF中獲得啤酒糖酵母196-2染色體(41)的條帶圖的真實微型膠(40)的照片如圖6所示。也顯示了在假定的微型膠(42)中模擬的、由模擬程序繪制的條帶圖，這兩個圖類似。在真實實驗中分離的、瓊脂糖包埋的啤酒糖酵母196-2完整DNA分子，是根據(jù)本發(fā)明公開的無酶方法制備。
本發(fā)明公開的部分模擬程序的流程圖，如圖7所示。流程圖中顯示了以遷移數(shù)據(jù)或預(yù)先已知的大小數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，估計脈沖斜坡的計算方法。
如果使用者在該方法中輸入遷移數(shù)據(jù)，則模擬程序先根據(jù)該數(shù)據(jù)估計分子大小，并進(jìn)一步估計線性脈沖時間斜坡的設(shè)置。如果使用者在該方法中輸入大小數(shù)據(jù)，則模擬程序直接估計脈沖時間斜坡。脈沖數(shù)遞增結(jié)束的標(biāo)準(zhǔn)是，使最小分子遷移2.5cm的脈沖數(shù)。
最后，通過程序計算脈沖斜坡并應(yīng)用于使用者指定的一組分子，模擬程序提供使用者應(yīng)該在凝膠中觀察到的結(jié)果(參見圖6所示微型膠43的真實條帶圖以及假定的微型膠42的模擬圖)。該程序還提供定量數(shù)據(jù)。由于該方案無關(guān)緊要而沒有顯示這部分圖形。
實施例7分析電泳染色體組型或脈沖型。
圖8顯示釀酒酵母的電泳染色體組型(61)，其是所述染色體經(jīng)1.5％瓊脂糖、0.5X TBE、10V/cm、20℃、2.95秒和453次脈沖、以及21.56秒和453次脈沖分離之后在miniCHEF中得到的。測定了該染色體組型中每個條帶的遷移(62-66)。
將每個條帶的遷移數(shù)據(jù)、電場強度、脈沖持續(xù)時間和數(shù)目以及運行緩沖液的溫度輸入遷移分析方法中。
此處公開的方法可以計算每個條帶中所分離的分子的大小、重定向時間和遷移速度。這些結(jié)果如表III所示。此即為本發(fā)明這一部分公開的遷移分析方法所提供的結(jié)果形式。
表III.每個條帶中分子的大小、重定向時間和遷移速度。應(yīng)用脈沖斜坡以后，通過將凝膠中每個條帶的位置輸入該方法進(jìn)行估計。
10V/cm，20℃真實大小2.95s/453脈沖； 估計值條帶 (kb)21.56s/453脈沖D實驗值 D理論值大小(kb) vr×103cm vm×103cm tr(s)622.362.23 230 2100.094430.2785 3.9632.292.14 270 2260.092040.2768 4.3641.971.96 315 3020.083100.2705 6.4651.551.42 440 4010.075300.2644 9.5660.840.82 577 5640.066830.2573 15.2D實驗值圖8微型膠中的分子遷移距離。
D理論值在圖8實驗的運行條件下，各種大小的真實分子應(yīng)該遷移的距離。
vr重定向過程中的分子遷移速度。
vm重定向之后的分子遷移速度。
tr重定向時間。
DNA遷移分析方法的流程圖如圖9所示。所給出的是處理單一大小分子的流程圖，重復(fù)該步驟則可以分析所有分子。
如果將遷移數(shù)據(jù)輸入實施例7所述方法，該方法可如同本實施例所述方法一樣，估計分子大小。
實施例8.大腸桿菌分離物的miniCHEF分型。
按大腸桿菌表型水平的特征，從血瓊脂平板上每個分離物(INN3和INN7)提取一個單一克隆。進(jìn)一步將其在5ml LB培養(yǎng)基中(每升蒸餾水含10g酵母提取物、5g氯化鈉、10g細(xì)菌用胰蛋白胨)再培養(yǎng)。每個培養(yǎng)物37℃振搖溫育過夜。
洗滌每個培養(yǎng)物的細(xì)胞(洗滌液參見表I)、離心，按每ml溶于0.15M NaCl的1.5％低熔點瓊脂糖2×109細(xì)胞的比例重懸沉淀。將每個瓊脂糖細(xì)胞混合物灌注圖1所示模具薄片(1)。用蓋子(3)蓋住薄片，使瓊脂糖變硬，直至形成微膠塊(5)。將兩組微膠塊與NDSUPlus于50℃溫育半小時。然后洗滌微膠塊，與Xba I限制性酶消化緩沖液溫育10分鐘，每個微膠塊用20 U Xba I于37℃消化2小時。
miniCHEF微型膠(86)中分離的條帶圖(87)如圖10所示。在miniCHEF中分離Xba I消化的大腸桿菌分離物INN3(88)和INN7(89)總DNA，可以鑒別它們之間的6條共有片段(90)。然后根據(jù)Tenover方法(Tenover F等人，J.Clin.Microbiol.，1995，339，2233-2239)其分成兩個不同的大腸桿菌亞型。在miniCHEF中，于10V/cm、20℃、1.5％瓊脂糖和0.5X TBE、分別應(yīng)用25、20、15和5秒脈沖斜坡以及35、40、50、140和800次脈沖條件下分離DNA限制性片段。
附圖簡述圖1.灌注微膠塊的模具圖。下圖所示灌注瓊脂糖-細(xì)胞懸液的刻有凹槽的薄片。上圖所示模具的蓋子及微膠塊。右側(cè)還展示了分布瓊脂糖-細(xì)胞懸液的刮刀。
圖2.在miniCHEF和miniTAFE微型膠中分離的啤酒糖酵母和多形漢遜酵母染色體條帶圖的照片。上圖7cm寬的miniCHEF微型膠、其27個狹槽以及啤酒糖酵母染色體的條帶圖。圖中部所示4cm寬的微型膠以及多形漢遜酵母染色體的條帶圖。通過將包含固定化細(xì)胞的微膠塊與NDSU溫育，無酶方法制備樣品。運行條件10V/cm、20℃、1.5％瓊脂糖、0.5X TBE、脈沖時間50秒以及電泳4小時。下圖所示帶有啤酒糖酵母染色體條帶圖的miniTAFE微型膠。MiniTAFE使用10V/cm、1.5％瓊脂糖、0.5X TBE、脈沖時間60秒以及電泳6小時。通過將細(xì)胞與NDSU溫育，然后包埋于瓊脂糖微膠塊中，制備樣品。
圖3.在miniCHEF中獲得的銅綠假單胞菌Xba I大限制性DNA片段的條帶圖。左側(cè)為由液體LB培養(yǎng)基生長的細(xì)胞制備銅綠假單胞菌微膠塊，而右側(cè)為由LB平板生長的細(xì)胞制備的微膠塊。于10V/cm、20℃、1.5％瓊脂糖以及0.5X TBE使用MiniCHEF，分別施加20、15、10、5和3秒的脈沖斜坡以及5、15、320、1020和100次脈沖。
圖4.MiniCHEF產(chǎn)生的金黃色葡萄球菌Sma I大限制性DNA片段的條帶圖。通過將包含細(xì)胞的微膠塊與NDSUPlus溫育、通過無酶方法制備的樣品的條帶圖如左側(cè)所示。通過將細(xì)胞與NDSUPlus溫育、然后包埋于瓊脂糖微膠塊中制備的樣品的條帶圖如右側(cè)所示。在兩種樣品制備物中，細(xì)胞皆在平板上培養(yǎng)。運行條件為10V/cm、20C、1.5％瓊脂糖、0.5X TBE，脈沖時間為1、5、9、13、17和21。每個斜坡作用130次脈沖。
圖5.溶組織內(nèi)阿米巴、釀酒酵母和λ-噬菌體串聯(lián)體DNA條帶圖的照片。在miniTAFE微型膠中進(jìn)行電泳，電場強度9.03V/cm、脈沖時間120 s、20℃、1％瓊脂糖(SeaKem)、0.5X TBE緩沖液以及電泳6小時。上樣0.1cm厚樣品。從左至右，泳道1啤酒糖酵母196-2的微膠塊；泳道2、3、4和5包含溶組織內(nèi)阿米巴營養(yǎng)體的微膠塊與NDSUPlus在45℃分別溫育0.5、1、2和16小時，泳道6λDNA序列梯(ladders)。
圖6.用于獲得啤酒糖酵母196-2染色體條帶圖的真實miniCHEF微型膠(40)的照片(左側(cè))，由模擬程序預(yù)測的假定的微型膠(42)的圖形(右側(cè))。在模擬程序預(yù)測的條件下進(jìn)行真實的電泳。利用本發(fā)明公開的無酶方法，制備在此電泳運行中進(jìn)行分析的、固定化的啤酒糖酵母196-2完整DNA分子。對于電場強度10V/cm以及緩沖液溫度20℃，利用模擬程序預(yù)測的運行條件為5、40、75和110秒4次脈沖斜坡、每斜坡42次脈沖。遷移數(shù)據(jù)和用于鑒別分子大小的顏色代碼如表II所示。
圖7.miniCHEF微型膠中模擬DNA條帶圖的方法的流程圖。圖中使用以下參數(shù)和變量DNA大小(kb)、DNA重定向時間(tr)、miniCHEF重定向過程之中(vr)和之后(vm)的DNA遷移速度。另外，tpr每個斜坡的脈沖時間，Npr每個斜坡的脈沖數(shù)，獲得的g0、g1、g2、g3、g4系數(shù)以描述實驗溫度的函數(shù)粘度(η)，Dt利用該方法預(yù)測的理論距離，n斜坡數(shù)，E電場，LDNA外形長度，bp堿基對，QDNA凈電荷。
圖8.miniCHEF獲得的啤酒糖酵母染色體的電泳染色體組型(61)。電泳條件10V/cm、1.5％瓊脂糖凝膠、0.5X TBE、20℃、2.95秒和453次脈沖、以及21.56秒和453次脈沖。
圖9.需要填入遷移距離以估計大小(kb)、重定向時間(tr)、miniCHEF分離的分子在重定向過程之中(vr)和之后(vm)的遷移速度的方法流程圖。tpr每個斜坡的脈沖時間，NPr每個斜坡的脈沖數(shù)，獲得系數(shù)g0、g1、g2、g3、g4，描述粘度(η)為實驗溫度(T)的函數(shù)，DDNA分子在凝膠中的遷移距離，Dt利用該模擬程序預(yù)測的理論遷移距離，n掃描數(shù)，E電場，LDNA外形長度，bp堿基對，QDNA凈電荷。
圖10.Xba I限制性消化INN3和INN7大腸桿菌分離物DNA分子后，進(jìn)行MiniCHEF分型。使用無酶方法制備樣品。運行條件為10V/cm、20℃、1.5％瓊脂糖凝膠和0.5X TBE，分別應(yīng)用25、20、15、10和5秒的脈沖斜坡以及35、40、50、140和800次脈沖。點(90)標(biāo)記兩種分離物所共同具有的限制性片段。
本公開方案的優(yōu)點1-在5分鐘至1小時內(nèi)，制備包埋任意凝膠的薄微膠塊中的微生物完整DNA分子。制備無需使用酶，快速完成，成本低。
2-使用液體或固體培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞，無酶制備用于PFGE的DNA樣品，效率高。某些種類的細(xì)胞可以在包埋之前于無酶溶液中溫育。這種改變減少了樣品制備所需時間。
3-利用本公開方法制備的凝膠包埋DNA分子，無限制性內(nèi)切酶抑制劑。這些分子利用限制性內(nèi)切酶消化2小時，在微型裝置中進(jìn)行脈沖場凝膠電泳實驗，給出其典型的條帶圖。
4-獲得大小均勻的包含固定化微生物DNA的微膠塊，因而無需在電泳之前進(jìn)行切割。同樣的微膠塊保證了結(jié)果的重現(xiàn)性。
5-在2.5至7小時的運行時間內(nèi)，獲得多個樣品(多達(dá)27個)的分子染色體組型或脈沖型。緩沖液和分離基質(zhì)的消耗低。分離所需時間取決于所研究的微生物和所用的微型裝置，以及使用的電場、運行溫度和脈沖時間斜坡。
6-在微型裝置中通過脈沖場微型膠電泳分析微生物基因組所使用的裝置，需要的實驗臺空間小。
7-可以在進(jìn)行實驗以前，按要求多次在計算機上模擬條帶圖。此模擬可選擇產(chǎn)生分子間最佳分離的電場、溫度和脈沖時間斜坡，而不需試劑和生物樣品的費用。
8-利用基于描述DNA分子在miniCHEF微型膠中遷移的公式的方法，選擇脈沖斜坡。然后，選擇斜坡的方法產(chǎn)生分子間分離的最佳圖片。
9-為估計DNA分子的大小、重定向時間和遷移速度，大小標(biāo)志并不必要。此處公開的估計這些參數(shù)的方法，以分子在凝膠中的遷移距離為基礎(chǔ)，提供了上述信息。使用任意條件的脈沖斜坡以及電場強度1-20V/cm、溫度4-30℃進(jìn)行電泳，都可以應(yīng)用該方法，但是要求在1.5％瓊脂糖凝膠和0.5X TBE中進(jìn)行實驗。
10-電泳圖中分離的條帶可由每個條帶中遷移的分子大小、該分子的重定向時間及其遷移速度所確定。
11-此處公開的方法節(jié)省時間、化學(xué)試劑和生物樣品。
12-該方法，包括27個微生物的DNA樣品制備和基因組分析，需要一個工作日。
13-提供了試劑盒，簡化微生物完整DNA的制備。
權(quán)利要求
1.利用脈沖場凝膠電泳的微生物快速分型方法，其包括以下步驟(i)利用相關(guān)試劑盒，通過無酶方法，制備包埋于凝膠微膠塊中的微生物的完整DNA分子，(ii)利用脈沖場凝膠電泳微型槽分離微膠塊中包含的DNA分子，所述微型槽為TAFE或CHEF，(iii)利用一種方法根據(jù)槽中設(shè)定的電場以及溫度，選擇脈沖斜坡和電泳時間的合適值，脈沖斜坡和電泳時間的合適值應(yīng)使該DNA片段或完整DNA分子的分離最好，(iv)設(shè)置步驟(iii)計算的微型槽的溫度、電場強度和脈沖斜坡持續(xù)時間，分離DNA分子的混合物，(v)一旦在CHEF微型膠中進(jìn)行電泳，則利用一種方法分析微型膠中線性DNA分子的遷移距離。
2.權(quán)利要求1的利用脈沖場凝膠電泳的微生物快速分型方法，其中按照以下步驟制備包埋于微膠塊中的完整DNA分子(i)收集液體或固體培養(yǎng)基中生長的微生物細(xì)胞，(ii)在包含去污劑、螯合劑和氫鍵斷裂試劑的緩沖液中溫育該細(xì)胞，(iii)根據(jù)所選微生物，選擇于溫育之前或之后在微膠塊中固定細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1和2的利用脈沖場凝膠電泳的微生物快速分型方法，其中利用模具將細(xì)胞固定于微膠塊中，該模具為表面壓有多個凹槽的軟片，凹槽決定微膠塊的尺寸；該片由聚硅氧烷、橡膠或其它柔軟物質(zhì)制成，可以或不可以滅菌。
4.權(quán)利要求3的利用脈沖場凝膠電泳的微生物快速分型方法，其中該模具的凹槽為任意寬度、長度0.3cm，深度0.03-0.1cm，因此根據(jù)所選微生物，可以在每個產(chǎn)生的微膠塊中固定大約106-108細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1和2的利用脈沖場凝膠電泳的微生物快速分型方法，其中在包含去污劑、螯合劑和氫鍵斷裂試劑的緩沖液中溫育細(xì)胞所需時間為5-60分鐘，而溫育體積為‘c·v·20’mL；‘v’為微膠塊的體積(mL)，‘c’為待溫育的微膠塊數(shù)目。
6.權(quán)利要求1的方法，其中利用無酶方法制備酵母細(xì)胞的固定化DNA樣品需要包含1％肌氨酰、100mM EDTA、4M脲、10mMTris、pH9.5的溶液，在45℃溫育該固定化細(xì)胞30-60分鐘，導(dǎo)致固定化的完整DNA，其在與適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶緩沖液溫育10分鐘之后，能夠利用限制性內(nèi)切酶任意消化。
7.權(quán)利要求1的方法，其中利用無酶方法制備細(xì)菌細(xì)胞的固定化DNA樣品需要包含1％肌氨酰、1％NP-40、100mM EDTA、4M脲、10mM Tris、pH9.5的溶液，在50℃溫育該固定化細(xì)胞30-60分鐘，導(dǎo)致固定化的完整DNA，其在與適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶緩沖液溫育10分鐘之后，能夠利用限制性內(nèi)切酶任意消化。
8.權(quán)利要求1的方法，其中利用無酶方法制備大腸桿菌細(xì)胞的固定化DNA樣品需要兩種不同溶液依次溫育該固定化細(xì)胞；第一種溶液包含1％肌氨酰、1％NP-40、100mM EDTA、10mM Tris、pH8.0的，在37℃溫育該固定化細(xì)胞10分鐘，第二種溶液包含1％肌氨酰、1％NP-40、4M脲、10mM Tris和100mM EDTA、pH9.5，在50℃溫育該固定化細(xì)胞30分鐘，導(dǎo)致固定化的完整DNA，其在與適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶緩沖液溫育10分鐘之后，能夠利用限制性內(nèi)切酶任意消化。
9.權(quán)利要求1的方法，其中利用無酶方法制備溶組織內(nèi)阿米巴細(xì)胞的固定化DNA樣品需要首先在包含0.5M NaCl、10mM Tris和100mM EDTA、pH7.0的高滲溶液中冰浴非固定化營養(yǎng)體15分鐘，然后在微膠塊中完成細(xì)胞固定化，并在包含1％肌氨酰、4M脲、10mM Tris和100mM EDTA、pH9.5的溶液中，45℃溫育該微膠塊1小時，導(dǎo)致固定化的完整DNA，其在與適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶緩沖液溫育10分鐘之后，能夠利用限制性內(nèi)切酶任意消化。
10.權(quán)利要求1的方法，其中利用無酶方法制備酵母啤酒糖酵母、巴斯德畢赤酵母或多形漢遜酵母細(xì)胞的固定化DNA可如下進(jìn)行在包含1％肌氨酰、0.5M NaCl、4M脲、10mM Tris和100mMEDTA、pH9.5的溶液中，50℃溫育5-30分鐘非固定化細(xì)胞，該細(xì)胞進(jìn)一步在微膠塊中固定化，導(dǎo)致固定化的完整DNA，其在與適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶緩沖液溫育10分鐘之后，能夠利用限制性內(nèi)切酶任意消化。
11.權(quán)利要求1的利用脈沖場凝膠電泳的微生物快速分型方法，其中在微型裝置的微型凝膠中通過脈沖場電泳分離其完整DNA分子或其限制性片段，由所獲條帶圖中包含的信息進(jìn)行菌株區(qū)分或分離微生物的分型，該微型裝置為(i)miniCHEF槽，其極性相反的電極間最大間距為11.6cm，使微型膠可達(dá)7cm，(ii)miniTAFE(橫向交變場電泳)槽，其極性相反的電極間最大間距為7.8cm，使微型膠可達(dá)7cm。
12.權(quán)利要求11的微生物快速分型方法，其中利用0.5-1.5％瓊脂糖凝膠，1X TBE電泳緩沖液(1 X TBE為89mM Tris、89mM硼酸、2mM EDTA、pH8.3)、或1/2或1/4所述濃度的相同緩沖液，在CHEF或TAFE系統(tǒng)的脈沖場凝膠電泳微型裝置中分離DNA分子，以區(qū)分或分型微生物分離物或菌株；使用者通過計算方法或經(jīng)驗方法或任何其它方法選擇緩沖液溫度、電場和脈沖斜坡，進(jìn)行分離，包含的實驗變量為4-30℃、miniCHEF為1-20V/cm、miniTAFE為1-25V/cm以及任意電脈沖持續(xù)時間。
13.權(quán)利要求1的微生物快速分型方法，該方法利用如下預(yù)先給定的公式，其描述在miniCHEF微型裝置的微型膠中線性DNA分子每一脈沖的遷移‘d’(cm)d＝vr tpГ(tp-tr)+vm(tp-tr)[1-Г(tp-tr)]vr＝0.0207[QE1.45/(8πηL1.35)]vm＝0.665[QE1.76/(8πηL1.08)]tr＝0.134(L1.14/vr)0.926如果(tp-tr)≤0則Г(tp-tr)＝1以及如果(tp-tr)＞0則Г(tp-tr)＝0‘tr’為線性DNA分子的重定向時間(秒)，‘vr’和‘vm’分別為DNA重定向之中及之后的遷移速度(cm/秒)，‘Q’為DNA凈電荷(靜電庫侖)，按1e- x bp計算，其中‘e-’為電子電荷，‘bp’為堿基對，‘L’為DNA外形長度(cm)，按0.34nm x bp計算，‘E’為電場強度(靜電伏特/cm)，‘η’為緩沖液粘度(Poises)，通過在實驗溫度(℃)和水的粘度相關(guān)多項式中內(nèi)插實驗溫度值計算，其中本方法提供并使用了基于所述公式的計算方法，如果在miniCHEF微型膠中應(yīng)用‘n’脈沖時間斜坡分離，該方法能夠預(yù)測線性DNA分子所給出的條帶圖，該方法也能分析應(yīng)用‘n’脈沖時間斜坡進(jìn)行電泳結(jié)束后獲得的條帶圖，該方法適用于‘n’、電場和溫度分別為1-1000、1-20V/cm以及4-30℃，在1.5％瓊脂糖和包含44.5mM Tris、44.5mM硼酸、1mM EDTA、pH8.4的緩沖液中進(jìn)行電泳。
14.權(quán)利要求1和13的微生物快速分型方法，其中提供了計算方法，該方法能夠確定最佳脈沖時間斜坡，并分析‘n’脈沖時間斜坡后獲得的條帶圖，其中所述方法通過預(yù)測應(yīng)用‘n’脈沖斜坡時線性DNA分子在微型膠中的遷移‘D’而進(jìn)行計算，通過下式計算每個分子的遷移‘D’D=Σr=1ndr·Npr]]>其中‘Npr’為作用于斜坡‘r’的脈沖數(shù)，‘tpr’為斜坡‘r’的脈沖持續(xù)時間(秒)，‘dr’為給定分子在每個斜坡‘r’中每一脈沖的遷移，‘dr’按下式給定dr＝vr tprГr(tpr-tr)+vm(tpr-tr)[1-Гr(tpr-tr)]如果(tpr-tr)≤0則Гr(tpr-tr)＝1以及如果(tpr-tr)＞0則Гr(tpr-tr)＝0
15.權(quán)利要求14的微生物快速分型方法，其中確定最佳脈沖斜坡的方法包含以下步驟(i)在公式中輸入實驗中應(yīng)用的電場和溫度值以及待研究分子的大小，(ii)計算斜坡中使用的脈沖持續(xù)時間，(iii)根據(jù)微型膠中最小分子的遷移，計算總的電泳運行時間，(iv)計算微型膠中所有分子的遷移，進(jìn)一步預(yù)測在選擇的電場和溫度、步驟(iii)計算的運行時間、計算的電脈沖持續(xù)時間以及各個斜坡的脈沖數(shù)下，該分子在CHEF微型裝置的微型膠中給出的條帶圖，(v)選擇模擬圖中產(chǎn)生線性DNA分子的帶之間最佳分離的條件為miniCHEF的設(shè)定條件。
16.權(quán)利要求15的微生物快速分型方法，其中根據(jù)計算最小線性DNA分子在miniCHEF微型膠中的遷移，計算總的電泳運行時間；在描述miniCHEF中線性DNA分子遷移的公式中，輸入‘n’斜坡應(yīng)用的電場、溫度和電脈沖持續(xù)時間(tpr)的值，計算運行時間；進(jìn)一步固定每個斜坡電脈沖‘Npr’的初始值，所有‘Npr’的初始推薦值為1，然后所有‘r’的‘Npr’值增加1，按D=Σr=1ndr·Npr]]>估計最小分子的遷移‘D’；當(dāng)‘D’值顯示該分子到達(dá)距離微型膠底部0.1-1cm的位置時，‘Npr’不再增加，按2·Σr=1ntpr·Npr]]>計算總運行時間。
17.權(quán)利要求15的微生物快速分型方法，其中計算微型膠分離線性DNA分子的脈沖時間斜坡所用的電脈沖持續(xù)時間，包含以下步驟(i)在描述miniCHEF微型膠中線性DNA分子每次脈沖遷移‘d’的公式中，輸入選擇的電場、溫度值以及將要分析的最小(A)和最大(B)的分子的大小，(ii)通過該公式計算兩種線性DNA分子的重定向時間(分別為trA和trB)，(iii)計算所用斜坡，如果希望單個圖形中包含大小介于最大和最小之間的DNA分子，則單脈沖持續(xù)時間為最小和最大分子重定向時間的平均值(0.5·[trA+trB])，(iv)計算所用斜坡，‘n’項脈沖時間斜坡的持續(xù)時間是數(shù)字序列，其開始于比最小分子的重定向時間低1.5倍的數(shù)值，結(jié)束于比最大分子的重定向時間高1.5倍的數(shù)值，該數(shù)字序列按線性增量增加，因此tp1＝trA/1.5，tp2＝tp1+Δ，tp3＝tp1+2Δ，…，tpn＝1.5·trB，其中Δ＝|(tp1-tpn)|/(n-1)，n＝te/(tp1+tpn)；‘te’為運行時間，(v)選擇步驟(iii)或(iv)的計算值為實驗所用電脈沖持續(xù)時間。
18.權(quán)利要求15的微生物快速分型方法，其中計算線性DNA分子在miniCHEF微型膠中的遷移，并預(yù)測所述DNA分子在該微型膠中的條帶圖，包含以下步驟(i)假定在1.5％瓊脂糖和0.5X TBE緩沖液中進(jìn)行電泳，(ii)為該公式定義電泳中使用的電場和緩沖液溫度值，以及假定的電泳中分離的分子大小，(iii)定義斜坡數(shù)‘n’、每個斜坡應(yīng)用的脈沖數(shù)(Npr)、每個斜坡的脈沖持續(xù)時間(tpr)以及待分析的分子大小，(iv)計算該分子在指定電泳條件的遷移距離；按D=Σr=1ndr·Npr]]>計算，(v)顯示數(shù)字或圖形結(jié)果，(vi)重復(fù)步驟(i)-(v)，直到預(yù)測圖顯示DNA分子之間的最好分離。
19.權(quán)利要求1和13的微生物快速分型方法，其中提供了分析在miniCHEF微型膠中電泳結(jié)束后線性DNA分子遷移距離的方法，該方法中替換了公式D=Σr=1ndr·Npr]]>中每條帶從遷移起點分離的距離‘D’；通過逆插法從該替換計算，產(chǎn)生每個條帶包含的分子大小、遷移速度和該分子的重定向時間，如果在電場強度1-20V/cm、溫度4-30℃、1.5％瓊脂糖凝膠、0.5X TBE緩沖液進(jìn)行電泳，并應(yīng)用‘n’脈沖時間斜坡，其中‘n’為1-1000，可應(yīng)用該方法，計算方法包括以下步驟(i)測定電泳結(jié)束時條帶與遷移起點的分離距離(D)，(ii)為公式D=Σr=1ndr·Npr]]>定義電場(E)、緩沖液溫度、脈沖時間斜坡數(shù)(n)、每個斜坡應(yīng)用的脈沖數(shù)(Npr)、每個斜坡的脈沖時間(tpr)以及每個條帶從遷移起點分離的距離(D)，(iii)計算凝膠每個條帶中包含的分子大??；計算步驟包括(a)估計1000bp DNA分子在指定電泳條件下假定的遷移(Dt)，(b)如果估計的假定遷移(Dt)大于該分子在凝膠中遷移的實際距離(D)，即(Dt＞D)，則將DNA分子的大小增加1000bp，(c)重復(fù)步驟(a)和(b)，直至該DNA分子的假定的遷移低于或等于測定的實際距離(Dt≤D)，(d)認(rèn)為條帶中包含的DNA分子與滿足(c)中條件的DNA分子大小相似，(e)對微型膠中的所有條帶重復(fù)整個程序，(iv)計算大小時，每個分析的條帶中所包含分子的重定向時間和遷移速度為步驟(iii)提供的‘dr’值，以使Dt=Σr=1ndr·Npr≤D,]]>(v)顯示數(shù)字形式的結(jié)果。
20.權(quán)利要求18的微生物快速分型方法，其中提供了線性DNA在指定電泳條件下遷移的圖形表示法，該圖形表示法包含(i)繪制與實際微型膠大小成比例的矩形，在該矩形中繪制各種較小的矩形，其代表假定的上樣DNA樣品的狹槽，(ii)在每個小矩形或狹槽下端畫線，線代表在微型膠中分離的各個大小分子的條帶，線離開狹槽的距離與各個大小分子在實際微型膠中遷移的距離成比例，(iii)根據(jù)DNA分子的大小給每條線指定顏色，即利用顏色代碼確認(rèn)假定包含于劃線所示條帶中的分子大小。
21.實現(xiàn)無酶方法制備DNA樣品的試劑盒，其是權(quán)利要求1的利用脈沖場凝膠電泳的微生物快速分型方法的一部分，其包含(a)灌注細(xì)胞懸液并獲得包埋于凝膠中的細(xì)胞的模具；(b)細(xì)胞洗滌溶液；(c)細(xì)胞包埋溶液；(d)DNA去蛋白化溶液；(e)樣品保存溶液；以及(f)微膠塊洗滌溶液。
22.權(quán)利要求21的試劑盒，其中酵母細(xì)胞的洗滌溶液包含0.05M EDTA、pH7.5。
23.權(quán)利要求21的試劑盒，其中金黃色葡萄球菌或大腸桿菌細(xì)胞的洗滌溶液包含0.15M NaCl和0.01M EDTA、pH8.0。
24.權(quán)利要求21的試劑盒，其中銅綠假單孢菌細(xì)胞的洗滌溶液包含0.15NaCl。
25.權(quán)利要求21的試劑盒，其中使用兩種溶液洗滌溶組織內(nèi)阿米巴，其一包含PBS、pH7.4，另一為包含0.5M NaCl、0.01MTris和0.05M EDTA、pH7.0的高滲溶液。
26.權(quán)利要求21-25的試劑盒，其中所述微生物的細(xì)胞包埋溶液包含在該細(xì)胞的洗滌溶液中制備的1.5-2.0％低熔點瓊脂糖。
27.權(quán)利要求21-25的試劑盒，其中DNA去蛋白化溶液包含緩沖液、金屬螯合劑、去污劑和氫鍵斷裂劑。
28.權(quán)利要求27的試劑盒，其中啤酒糖酵母、多形漢遜酵母或溶組織內(nèi)阿米巴的DNA分子的去蛋白化溶液包含1％十二烷基肌氨酸鈉、4M脲、0.01M Tris和0.1M EDTA、pH9.5。
29.權(quán)利要求27的試劑盒，其中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌或銅綠假單胞菌DNA分子的去蛋白化溶液包含1％十二烷基肌氨酸鈉、1％Nonidet、4M脲、0.01M Tris和0.1M EDTA、pH9.5。
30.權(quán)利要求21的試劑盒，其中用于在去蛋白溶液處理之后洗滌微膠塊的溶液包含10mM Tris、100mM EDTA、pH8.0。
31.權(quán)利要求21的試劑盒，其中用于在限制性內(nèi)切酶DNA消化之前洗滌微膠塊的溶液包含10mM Tris、0.5mM EDTA、pH8.0。
32.權(quán)利要求21的試劑盒，其中用于保存包含固定化DNA分子的微膠塊的溶液為0.1M EDTA、pH8.0。
全文摘要
本發(fā)明公開了快速分型酵母、寄生蟲和細(xì)菌的方法。該方法包括以下步驟a)利用只包含緩沖液、去污劑、螯合劑和氫鍵斷裂試劑的試劑盒的方法，在5－60分鐘內(nèi)制備完整的固定化DNA。b)利用CHEF(Contour Clamped HomogeneousElectric Field)和TAFE(Transversal Alternating FieldElectrophomsis)系統(tǒng)的脈沖場電泳微型設(shè)備，在2.5－7小時內(nèi)分離完整的DNA分子或其限制性片段。c)通過預(yù)先模擬該凝膠中將得到的電泳圖的方法，選擇miniCHEF應(yīng)用的最適條件。d)不需利用大小標(biāo)志，而是利用分析遷移距離的方法，提供重定向時間、遷移速度和分子大小。
文檔編號C12Q1/68GK1479790SQ01820303
公開日2004年3月3日 申請日期2001年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月7日
發(fā)明者L·洛佩茲卡諾瓦斯, A·M·里沃隆洛加斯, D·希吉森克拉克, A·桑切茲阿隆索, E·歐羅茲科歐羅茲科, O·阿蘭希比亞迪亞茲, M·C·阿里歐薩阿庫納, H·T·克拉克東德里茲, R·吉加托佩雷茲, L 洛佩茲卡諾瓦斯, 克拉克東德里茲, 兇勸⒙∷, 拮瓤婆仿拮瓤, 枷１妊塹涎親, 死, 油信謇鬃, 里沃隆洛加斯, 阿里歐薩阿庫納 申請人:國家科學(xué)研究中心