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一種復(fù)合核酸靶分子擴增的方法

文檔序號:592270閱讀:219來源:國知局
專利名稱:一種復(fù)合核酸靶分子擴增的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種復(fù)合核酸靶分子擴增的方法。
核酸包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),核酸為鏈狀結(jié)構(gòu),其基本單位是核苷酸,由少量(2-100個)核苷酸組成的核酸稱為寡聚核苷酸,由大量(100個以上)核苷酸組成的核酸為多聚核苷酸,核苷酸的特性決定于其堿基。DNA中的四種堿基分別由A、C、G、T表示,RNA中的四種堿基分別由A、C、G、U表示。核酸中的堿基A與T(或U)配對(互補),G與C配對(互補),有連續(xù)堿基配對的核酸鏈能結(jié)合(雜交)為雙鏈結(jié)構(gòu)。從自然界提取的DNA一般為雙鏈結(jié)構(gòu),雙鏈核酸結(jié)構(gòu)在高溫(如90℃-100℃)下會裂變(變性)成單鏈核酸分子。當一短小的寡聚核苷酸分子與一較長的單鏈多聚核苷酸分子雜交后,這一寡聚核苷酸分子可作為引物以多聚核苷酸分子為模板,在聚合酶(Polymerase)的作用下,根據(jù)堿基配對原理復(fù)制出一條互補的多聚核苷酸分子鏈。如一寡聚核苷酸與一核酸鏈有相同或相互補的序列,則這一寡聚核苷酸對這一核酸鏈具有專一性或特異性。利用如上原理可進行核酸(多聚核苷酸)的復(fù)制或擴增。常用的DNA擴增方法采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),一典型的PCR是由兩個特異性(專一性)的寡聚核苷酸(引物)分別與互補的兩條靶分子鏈(分別稱上鏈和下鏈)雜交。與上鏈(左端為5’端,右端為3’端)有共同序列的引物為5’端引物,與上鏈有互補序列的引物為3’端引物。據(jù)此5’端引物可以下鏈為模板在聚合酶的作用下復(fù)制出上鏈,同理3’端引物會以上鏈為模板復(fù)制出下鏈。反復(fù)此一變性→雜交→復(fù)制過程可得到大量的靶分子。進行高通量的核酸靶分子檢測可用基因芯片進行,一般基因芯片上置有大量的單鏈核酸探針,它們可識別相應(yīng)的核酸靶分子。從生物體中提取的DNA分子一般為雙鏈的大分子結(jié)構(gòu),由數(shù)千個以上的堿基單位組成。用物理方法(如超聲波)或生物化學(xué)方法如脫氧核糖核酸酶(DNase),可使DNA降解為短小的分子片段,這一由大分子轉(zhuǎn)化為多個小分子的過程叫片段化。在適當?shù)臈l件下連接酶(Ligase)可把其它DNA片段與靶分子連接在一起達到末端延伸和修飾的目的。DNA靶分子片段也可在末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下使核酸3’末端延伸。此外在適當?shù)哪0宕嬖谙?,DNA分子也可由聚合酶進行末端修飾和延伸?,F(xiàn)已知人類基因組的某些堿基位點在不同個體之間常有差異,這種高頻率的單堿基置換稱為單堿基位點多態(tài)性(SNP)。對個體SNP位點進行堿基特征的檢驗是對這一個體進行基因型的測定,這在醫(yī)學(xué)臨床診斷和科學(xué)研究中有重要價值。由于SNP位點在人類基因組中的數(shù)量多而且是分散的,所以對一個體進行基因型測定(如用基因芯片方法),需對大量的與SNP位點相關(guān)的脫氧核糖核酸片段進行擴增或富集。用PCR對多個與SNP相關(guān)的靶分子進行擴增(復(fù)合核酸靶分子擴增)時,需要大量的引物,因而在實際應(yīng)用中成本很高。此外在同一容器中對多個核酸靶分子進行擴增時,引物之間會相互雜交和復(fù)制,產(chǎn)生大量的非靶分子,因而會抑制靶分子的擴增。
本發(fā)明的目的是提供一種復(fù)合核酸靶分子擴增的方法,它能彌補現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。
一種復(fù)合核酸靶分子擴增的方法,包括使樣品中核酸分子片段化,并對片段化所得的分子鏈進行末端延伸,然后在引物的作用下進行PCR擴增,其特征是PCR反應(yīng)中使用的引物是對延伸所得的序列具有專一性的引物和對靶分子原序列具有專一性的引物,所述的末端延伸通過末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)或連接酶反應(yīng)或聚合酶反應(yīng)或這些反應(yīng)的組合而實現(xiàn)。
本發(fā)明的優(yōu)點是在復(fù)合PCR反應(yīng)中,對每一把分子的擴增都使用一個對原序列有專一性的引物,因而減少了專一性引物的使用,降低了反應(yīng)成本,并可減少非特異性產(chǎn)物的形成。
下面通過實施例說明本發(fā)明。
對一病人DNA樣品中的100個SNP靶序列進行擴增,擴增前把DNA樣品隨機地切成平均200堿基長的片段,然后用末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)在DNA鏈的3’末端延伸10-50個A堿基,再使這些修飾后的DNA鏈與一引物雜交,這一引物的3’端部分具有含20個T堿基的序列,它與延伸所得的序列相互補,5’端部分為T3啟動子序列。雜交后用聚合酶將靶分子鏈作進一步修飾,復(fù)制出T3啟動子互補序列,同時用引物復(fù)制出上述DNA片段的互補鏈。把經(jīng)修飾后和復(fù)制所得的DNA分子鏈用于PCR反應(yīng)使之擴增,擴增時所用的3’端引物為T3引物,所用的5’端引物是分別對100個SNP專一的引物,它們的3’端部分(15-30堿基)具有對靶分子專一的序列,其5’端部分具有相同的序列(T7啟動子序列)。這5’端T7序列可以抑制非特異性產(chǎn)物的形成。PCR后,對產(chǎn)物進行末端標記,然后使這些標記的PCR產(chǎn)物與相應(yīng)的SNP基因芯片進行分子雜交,再經(jīng)信號分析后而確定這一病人的DNA在這100個SNP位點的基因型。PCR擴增后的產(chǎn)物也可用轉(zhuǎn)錄的方法產(chǎn)生標記的RNA,然后使標記的RNA與基因芯片上的核酸探針雜交。DNA的標記也可在PCR中實現(xiàn),如用標記的引物或標記的核苷酸,所得的標記的DNA與基因芯片上的核酸探針雜交。
本實施例中對DNA片段進行末端延伸是用末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)和聚合酶反應(yīng),也可單獨通過連接酶反應(yīng)或末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)或聚合酶反應(yīng)或這些反應(yīng)的組合而實現(xiàn)。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合核酸靶分子擴增的方法,包括使樣品核酸分子片段化,并對片段化所得的分子鏈進行末端延伸,然后在引物的作用下進行PCR擴增,其特征是在PCR中使用的引物是對延伸所得的序列具有專一性的引物和對靶分子原序列具有專一性的引物,所述的末端延伸通過末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)或連接酶反應(yīng)或聚合酶反應(yīng)或上述反應(yīng)的組合而實現(xiàn)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征是在復(fù)合核酸靶分子擴增所用的多個對靶分子原序列專一的引物中,其3’端為專一的序列,5’端部分具有相同的序列。
全文摘要
一種復(fù)合核酸靶分子擴增的方法,包括使樣品中核酸分子片段化,并對片段化所得的分子鏈進行末端延伸,然后在引物的作用下進行PCR擴增,其特征是PCR反應(yīng)中使用的引物是對延伸所得的序列具有專一性的引物和對靶分子原序列具有專一性的引物,所述的末端延伸通過末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)或連接酶反應(yīng)或聚合酶反應(yīng)或這些反應(yīng)的組合而實現(xiàn)。本發(fā)明的優(yōu)點是減少了專一性引物的使用,降低了反應(yīng)成本,并可減少非特異性產(chǎn)物的形成。
文檔編號C12P19/00GK1319672SQ01107740
公開日2001年10月31日 申請日期2001年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月11日
發(fā)明者吳昌, 吳明 申請人:吳昌, 吳明
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