專(zhuān)利名稱(chēng)：制備共軛亞油酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備共軛亞油酸的方法。具體地說(shuō)，描述了一種通過(guò)發(fā)酵由亞油酸制備共軛亞油酸，具體地說(shuō)是其順-9，反-11異構(gòu)體的方法。
背景技術(shù)：
CLA是對(duì)各種共軛亞油酸異構(gòu)體的統(tǒng)稱(chēng)，其中只有兩種異構(gòu)體(順-9，反-11異構(gòu)體，即bovinic acid，和反-10，順-12異構(gòu)體)被發(fā)現(xiàn)具有生物活性。合成生產(chǎn)的市售CLA制品通常含有所有各種CLA異構(gòu)體且僅有40％的c9，t11異構(gòu)體，而牛奶中含有80％的c9、t11-182異構(gòu)體。
幾項(xiàng)研究已經(jīng)報(bào)道了在動(dòng)物脂肪中含有一種脂肪酸，其抑制試驗(yàn)動(dòng)物的癌癥，影響生長(zhǎng)因子并可以控制生物體中脂肪組織的量。Michael Pariza在研究漢堡包牛肉時(shí)發(fā)現(xiàn)其含有一種脂肪酸，通過(guò)化驗(yàn)確定為共軛亞油酸(CLA)。在動(dòng)物檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，與參照組相比，喂以含CLA飲食的動(dòng)物組減少了乳腺癌、胃癌和結(jié)腸癌的發(fā)生數(shù)量(Pariza，M.W.，Loretz，L.J.，Storkson，J.M.和Holland，N.C.，油炸絞細(xì)牛肉中突變形成的突變物和調(diào)節(jié)物，癌癥研究(副刊)，1983，432444-2446和Pariza，M.W.和Hargraves，W.A.，牛肉起源的突變形成突變物通過(guò)7，12二甲基苯并蒽抑制小鼠表皮腫瘤的起始，癌癥發(fā)生學(xué)，1985，6591-593)。而且在人細(xì)胞組織培養(yǎng)中，CLA也有抑制癌細(xì)胞發(fā)育的能力。雖然其作用機(jī)制仍然未知，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CLA在腫瘤發(fā)生的各個(gè)階段及對(duì)許多生長(zhǎng)因子都有影響，并且也有可能對(duì)致癌物質(zhì)在肝臟中的代謝有影響。這也表明CLA會(huì)扮演抗氧化劑的角色(Ip，C.，Chin，S.F.，Scimeca，J.A.和Pariza，M.W.，通過(guò)亞油酸共軛二烯酸衍生物預(yù)防乳腺癌，癌癥研究，1991，516118-6124)，從而此化合物會(huì)保護(hù)細(xì)胞膜免受自由基的不利影響。對(duì)此化合物降低膽固醇的效果也有研究并發(fā)現(xiàn)其并不象降膽固醇藥物那樣減少高密度脂蛋白的量(Lee，K.N.，Kritchevsky，D.和Pariza，M.W.，兔子中的共軛亞油酸和動(dòng)脈硬化癥，動(dòng)脈硬化，1994，10819-25)。CLA也可能對(duì)減肥者有利，因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)現(xiàn)此化合物可以剝離脂肪組織(Park等，以共軛亞油酸飼養(yǎng)及撤除共軛亞油酸后，小鼠身體組成的改變，脂質(zhì)，1999，34243-248)。
反過(guò)來(lái)，已有報(bào)道說(shuō)非共軛亞油酸有不利的影響，例如對(duì)乳癌的刺激作用。非共軛亞油酸的抗菌效用也是公認(rèn)的。
CLA可以通過(guò)化學(xué)的方法或通過(guò)酶的異構(gòu)化作用生產(chǎn)。天然的CLA，如在反芻動(dòng)物的瘤胃中，可由多聚不飽和脂肪酸形成(通過(guò)溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)的生物活性產(chǎn)生)并因此分泌到奶和肉中，這是所發(fā)現(xiàn)的最好的CLA的來(lái)源。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)從食物中獲得的CLA量在過(guò)去的十年間已有明顯的下降。通過(guò)飲食分析計(jì)算，在70年代每天平均的飲食含有大約0.45g的CLA。由于牛奶和奶產(chǎn)品使用的下降，現(xiàn)今平均每天的CLA攝入量為0.25g。從公眾健康的角度來(lái)看，在食物中增加天然的CLA是非常重要的，因?yàn)?，例如?jù)研究，使CLA攝入加倍可以減少癌癥的危險(xiǎn)。
幾項(xiàng)研究已經(jīng)對(duì)牛奶，具體說(shuō)是所有作為CLA來(lái)源食物的重要性進(jìn)行了報(bào)道。例如，根據(jù)芬蘭流行病學(xué)調(diào)查(Knekt等，口頭陳述)，牛奶的使用減少了乳癌的危險(xiǎn)。當(dāng)前，奶脂中CLA的濃度季節(jié)性地隨喂養(yǎng)質(zhì)量的不同而有相當(dāng)大的變化(2.4到28.1mg/g脂肪)。
已發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)有益微生物可以形成CLA。具體說(shuō)來(lái)，對(duì)瘤胃中的溶纖維丁酸弧菌及其異構(gòu)酶已有研究。然而該菌極端厭氧，以致于不可能在工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)CLA，因?yàn)樵摼暌蟮耐耆珔捬醯臈l件很難到達(dá)并且是不經(jīng)濟(jì)的(美國(guó)專(zhuān)利5,856,149，Pariza等)。
瘡皰丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)被發(fā)現(xiàn)也可以產(chǎn)生CLA，但該致病菌也產(chǎn)生一種還原酶，從而將CLA進(jìn)一步還原成其它的脂肪酸(Verhulst等，系統(tǒng)應(yīng)用微生物，1987，912-15)。
一些丙酸菌也能夠?qū)営退徂D(zhuǎn)化成其共軛的順-9，反-11形式，這也是公知的。
而且，游離亞油酸到CLA的轉(zhuǎn)化比甘油三酯形式的脂肪酸到CLA的轉(zhuǎn)化更有效，這是公知的。然而，即使在相對(duì)低的濃度下，游離的亞油酸對(duì)丙酸菌的生長(zhǎng)也有抑制作用，從而阻礙了共軛亞油酸，具體來(lái)說(shuō)是其順-9，反-11形式的大量生產(chǎn)。
美國(guó)專(zhuān)利5,856,149(Pariza和Yang)公開(kāi)了一種用路式乳桿菌(Lactobacillus reuterii)的一個(gè)菌株(優(yōu)選路式乳桿菌PYR8)通過(guò)非共軛不飽和(9和12位的雙鍵)脂肪酸的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生順-9，反-11脂肪酸的方法。該公開(kāi)文本描述了產(chǎn)CLA菌株的分離并指出分離得到的45個(gè)菌株中只有4個(gè)具有所需的亞油酸異構(gòu)酶活性，因此它們能夠由亞油酸產(chǎn)生CLA。研究人員觀察到，產(chǎn)生的CLA量與細(xì)胞數(shù)量成正比，并推測(cè)此亞油酸異構(gòu)酶是在細(xì)胞生長(zhǎng)中無(wú)功能意義的累積酶。該公開(kāi)文本沒(méi)有敘述亞油酸在細(xì)菌生長(zhǎng)中的抑制作用，因此接下來(lái)也就沒(méi)有提出任何方法來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。
在“通過(guò)奶制品發(fā)酵劑培養(yǎng)物生產(chǎn)共軛亞油酸(應(yīng)用微生物雜志，1998年85期95-102頁(yè))”的文章中，J.Jiang、L.Bjorck和R.Fonden提出丙酸細(xì)菌可以將亞油酸轉(zhuǎn)化成CLA。Jiang等人在觀察到成熟干酪比其它乳制品含有更高水平的CLA這一現(xiàn)象之后，研究了19種不同的發(fā)酵劑細(xì)菌將加到生長(zhǎng)培養(yǎng)基上的亞油酸轉(zhuǎn)化成CLA的能力。他們研究了7個(gè)乳桿菌菌株、4個(gè)乳球菌菌株、2個(gè)鏈球菌菌株和6個(gè)丙酸細(xì)菌在MRS、牛奶和乳酸鈉培養(yǎng)基中由亞油酸產(chǎn)生CLA的能力。另外，通過(guò)在去污劑Tween 80的水溶液向MRS液體培養(yǎng)基中添加亞油酸的方法對(duì)不同濃度的亞油酸進(jìn)行了研究。所研究的細(xì)菌中只觀察到幾個(gè)丙酸細(xì)菌具有生物轉(zhuǎn)化活性，6個(gè)菌株中的3個(gè)，即費(fèi)氏丙酸桿菌費(fèi)氏亞種PFF(Propionibacteriumfreudenreichii ssp.freudenreichii PFF)和PFF6及費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種PFS(P.freudenreichii ssp.shermanii PFS)表現(xiàn)出活性。用菌株P(guān)FF6由原始濃度為750μg/ml的亞油酸獲得了最高的CLA產(chǎn)量，265μg/ml。產(chǎn)生的CLA中有70％-90％是有生物活性的c9，t11異構(gòu)體。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)乳桿菌、乳球菌或鏈球菌可以產(chǎn)生CLA。
因此，用Jiang等人描述的技術(shù)，最好的丙酸細(xì)菌，PFF6菌株，僅能夠?qū)⒓尤氲膩営退嶂械?5％轉(zhuǎn)化成為CLA。這些研究人員觀察到丙酸細(xì)菌的CLA生產(chǎn)與它們對(duì)游離亞油酸的耐受性正向相關(guān)。因此，該研究也證實(shí)了這樣一個(gè)公認(rèn)的事實(shí)亞油酸具有抗菌作用，其抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。此公開(kāi)文本指出該抗菌脂肪酸的作用可由使用表面活性劑，例如去污劑，如Tween80，或蛋白質(zhì)而消弱。然而，沿這些線路的研究并未被進(jìn)行，并且此公開(kāi)文本也沒(méi)對(duì)可能的、有用的技術(shù)進(jìn)行描述。
J.Jiang，L.Bjorck和R.Fonden的國(guó)際公開(kāi)99/29886，部分基于上述文章提出的研究結(jié)果。該申請(qǐng)涉及利用在食品應(yīng)用上有用的特定細(xì)菌，在體外生產(chǎn)CLA。除費(fèi)氏丙酸桿菌費(fèi)氏亞種和費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種以外，適合的細(xì)菌還包括短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)。按此公開(kāi)文本所述，發(fā)酵可以在有乳化劑，如Tween 80和卵磷脂存在的條件下進(jìn)行。然而，在該公開(kāi)文本的實(shí)施例中并沒(méi)有描述乳化劑的使用，而且所報(bào)道的最好的結(jié)果與上面的公開(kāi)文本一樣使用菌株P(guān)FF6由原始濃度為750μg/ml的亞油酸得到246.4μg/ml生物活性的c9、t11異構(gòu)體。因此其產(chǎn)率小于33％。
因此，提供一種新的、具有更高產(chǎn)率的生產(chǎn)共軛亞油酸的方法仍是十分必要的。在要求盡可能多的使用游離的亞油酸作為CLA起始物的時(shí)候，所要解決的最基本問(wèn)題就是怎樣最小化或避免游離亞油酸的抗菌作用。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的目的是提供一種新的、具有高產(chǎn)率的生產(chǎn)共軛亞油酸的方法。
本發(fā)明的目的也是提供新的產(chǎn)品，其通過(guò)利用本發(fā)明的方法進(jìn)行生產(chǎn)并且含有大量的CLA。
發(fā)明詳述本發(fā)明基于這樣一種想法，即游離亞油酸對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用通過(guò)向培養(yǎng)基中添加某種形式的亞油酸而減弱，該種形式的亞油酸不明顯抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，但在這些細(xì)菌的培養(yǎng)過(guò)程中是可用的。
依本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)亞油酸作為膠束混合物加到反應(yīng)液體培養(yǎng)基中時(shí)，其對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用明顯低于任何其它形式的亞油酸。通過(guò)添加適當(dāng)大小的去污劑，可使亞油酸在培養(yǎng)條件下保持膠束狀態(tài)。這也部分地減弱了亞油酸對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用。膠束狀亞油酸的使用及膠束在培養(yǎng)過(guò)程中的穩(wěn)定性也使明顯提高CLA的產(chǎn)量成為可能。
通過(guò)使用膠束化的亞油酸作為發(fā)酵的起始材料及通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)膩営退崤c去污劑的比例，有可能使亞油酸到CLA的轉(zhuǎn)化達(dá)到90％以上且形成的CLA的97％以上將分泌到培養(yǎng)基中。因此依本發(fā)明所述，發(fā)展了一種將大量亞油酸制備成某種形式的方法，其使細(xì)菌能夠有效地將亞油酸轉(zhuǎn)化成CLA，具體說(shuō)是c9，t11異構(gòu)體，而不受亞油酸對(duì)生長(zhǎng)的抑制作用。
因此本發(fā)明涉及一種用微生物從亞油酸制備CLA的方法，該方法的特征為作為起始物使用的亞油酸以膠束的形式加到反應(yīng)液體培養(yǎng)基中。
此膠束含有適當(dāng)比例的游離的亞油酸和表面活性劑。
本發(fā)明也涉及由本發(fā)明方法生產(chǎn)的產(chǎn)品和其就此應(yīng)用或在功能食品和保健品生產(chǎn)中的應(yīng)用。
膠束化作用可以簡(jiǎn)單方法進(jìn)行，即將亞油酸和一種成膠去污劑以適當(dāng)比例在堿性條件下混合。這種制備方法既不需要特定的條件也不需要特殊的設(shè)備。其簡(jiǎn)單、廉價(jià)并且也易于大規(guī)模操作。
游離亞油酸被用來(lái)進(jìn)行依本發(fā)明所述的膠束化作用。游離亞油酸可以買(mǎi)到。也可以從植物油(如紅花油、玉米油或葵花油)中通過(guò)已知的方法(參考如Christie，W.W.，氣相色譜與脂質(zhì)-實(shí)用指南，第二版，1989，The Oily Press，Ayr，蘇格蘭)水解脂肪酸(不進(jìn)行皂化)制備游離亞油酸。
考慮到純的游離亞油酸是十分昂貴的這一點(diǎn)，該方法通常為一種經(jīng)濟(jì)的替代方法。由于化學(xué)殘留物的影響，合成制備的亞油酸在食品使用上并不總是適合的。
紅花油是優(yōu)選的亞油酸來(lái)源。其亞油酸的含量高達(dá)78％，并且由此得到的游離亞油酸制品比買(mǎi)的游離亞油酸要便宜上百倍。
從本發(fā)明的角度來(lái)看，表面化學(xué)劑的選擇不是一個(gè)關(guān)鍵的參數(shù)，例如在微生物領(lǐng)域廣泛使用的聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯(polyoxyethylenesorbitane esters，Tween制品)(幾個(gè)生產(chǎn)商，例如Fluka和Sigma)和PEG 20失水山梨糖醇油酸酯Kotilen-0/1 VL(by Dr.W.Kolb AG)都適用于此目的。幾種其它的表面活性劑也是適用的。
以上述方法制備的膠束化亞油酸到CLA的轉(zhuǎn)化可通過(guò)發(fā)酵有效進(jìn)行。發(fā)酵時(shí)，可以使用任何能夠?qū)営退徂D(zhuǎn)化成CLA的細(xì)菌，例如出現(xiàn)在上述背景領(lǐng)域中的細(xì)菌。然而，發(fā)酵優(yōu)選以食品級(jí)的細(xì)菌進(jìn)行，尤其是丙酸菌。適合的菌株包括，例如，費(fèi)氏丙酸桿菌種的菌株，尤其是屬于費(fèi)氏丙酸桿菌費(fèi)氏亞種和費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種的菌株。
通過(guò)向培養(yǎng)基中添加一定量的表面活性劑，即去污劑，消除培養(yǎng)基的影響，穩(wěn)定膠束亞油酸。
上述物質(zhì)，例如Tween和Kotilen，可被用作表面活性劑。優(yōu)選的表面活性劑濃度根據(jù)添加的膠狀亞油酸的量和所使培養(yǎng)基的不同而變。通常使用的去污劑為0.5％到1.5％，優(yōu)選1％。因此，膠束化的亞油酸被加到發(fā)酵液體培養(yǎng)基中作為生產(chǎn)CLA的起始物。
本發(fā)明的新技術(shù)可以向發(fā)酵液體培養(yǎng)基中添加高達(dá)至少1,000μg/ml培養(yǎng)基的亞油酸，而不使細(xì)菌的生長(zhǎng)發(fā)生明顯的改變或轉(zhuǎn)化效率的下降。因此，用這種技術(shù)進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化比用已知技術(shù)的生物轉(zhuǎn)化要好很多，即至少80％的亞油酸轉(zhuǎn)化成CLA，并且至少75％的此種CLA是最有生物活性的異構(gòu)體。
發(fā)酵以已知方法進(jìn)行。選擇培養(yǎng)基和發(fā)酵條件以滿足所用菌株的需要，從而提供最佳的CLA產(chǎn)量。在本發(fā)明公開(kāi)以后，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，適當(dāng)發(fā)酵參數(shù)的選擇就是很明顯的事了。
因此，使用膠束化的亞油酸就有可能通過(guò)消除亞油酸的生長(zhǎng)抑制影響生產(chǎn)與細(xì)菌生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)的CLA了。CLA也可以與為其它目的而進(jìn)行的細(xì)胞生產(chǎn)同時(shí)產(chǎn)生。該方法的一個(gè)特殊特征為CLA可在細(xì)胞培養(yǎng)后產(chǎn)生或單獨(dú)使用休眠(即非生長(zhǎng))細(xì)胞產(chǎn)生，其中CLA既可以在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中產(chǎn)生也可以在緩沖液中產(chǎn)生。不需要在緩沖液中單獨(dú)添加去污劑以穩(wěn)定亞油酸去污劑膠束。如果需要，也可以利用所用細(xì)菌在生產(chǎn)過(guò)程中直接在所生產(chǎn)的(食品)產(chǎn)品中產(chǎn)生CLA。
發(fā)酵中形成并分泌到胞外的CLA可通過(guò)先有技術(shù)進(jìn)行分離，并且如果需要的話，可通過(guò)已知方法得到高純度的CLA產(chǎn)品?；蛘?，含CLA和細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵液可就此使用，或者可對(duì)此CLA和細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行濃縮或干燥。
獲得的含CLA的產(chǎn)品可就此作為保健品使用。此產(chǎn)品也可在功能食品和類(lèi)似產(chǎn)品的生產(chǎn)中使用。
在本文件中，術(shù)語(yǔ)食品泛指所有可食用的產(chǎn)品，其可以是固狀、膠狀或液狀，并且既包括即食產(chǎn)品也包括將本發(fā)明產(chǎn)品加到與消耗相關(guān)的產(chǎn)品中作為該產(chǎn)品的添加劑或組成成份的產(chǎn)品。例如食品可以是乳品工業(yè)、肉類(lèi)加工業(yè)、食品加工業(yè)、飲料工業(yè)、面包業(yè)和糖果業(yè)的產(chǎn)品。典型的產(chǎn)品包括乳制品，如酸奶酪、凝乳、凝乳酪、酸奶、酪乳和其它發(fā)酵的乳飲料，未成熟干酪和成熟干酪，填餡等。飲料，如乳清飲料、水果飲料和啤酒為另一個(gè)重要的組。
首選的實(shí)施方案有凍干制品，如含CLA的膠囊和丙酸細(xì)菌粉末，及由于丙酸細(xì)菌活力而增加了其CLA含量的發(fā)酵奶制品。
下面，我們將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述。這些實(shí)施例僅為例證本發(fā)明，并不對(duì)其范圍進(jìn)行任何的限制。
參考實(shí)施例1膠束化作用對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和CLA生成的影響為證明本發(fā)明方法的效果，我們進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，研究了在含游離亞油酸、游離亞油酸和去污劑、及實(shí)施例1的膠束化亞油酸和去污劑的培養(yǎng)基上，丙酸細(xì)菌的生長(zhǎng)和丙酸細(xì)菌CLA的生成。以沒(méi)有添加物的相同培養(yǎng)基(生長(zhǎng)陽(yáng)性對(duì)照)和僅加有去污劑的培養(yǎng)基作為對(duì)照。
為進(jìn)行檢測(cè)，首選在MRS液體培養(yǎng)基上對(duì)丙酸菌菌株費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種JS(PJS)，DSM 7067和費(fèi)氏丙酸桿菌費(fèi)氏亞種131(P131)進(jìn)行培養(yǎng)。在MRS液體培養(yǎng)基中添加1)沒(méi)有添加物2)600μg/ml的亞油酸
3)從含5mg/ml亞油酸的貯存液中添加600μg/ml的亞油酸及添加1％在水溶液中的Tween 80制劑(Tween終含量為0.2％)4) 添加0.9％的Kotilen和600μg/ml實(shí)施例1的膠束化亞油酸5)僅添加0.9％的Kotilen(無(wú)亞油酸)菌株P(guān)JS也在含5％乳清透過(guò)物(whey permeate)(valio Oy)、2％酪素水解物(Valio Oy)和1％酵母抽提物(LabM)的乳清基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，其中按上述1到5進(jìn)行添加。
每個(gè)菌株在培養(yǎng)基中30℃、72小時(shí)培養(yǎng)兩次，然后新鮮培養(yǎng)液1％接種每個(gè)檢測(cè)液體培養(yǎng)基。待測(cè)培養(yǎng)液用Klett儀測(cè)定培養(yǎng)液的細(xì)胞密度，30℃監(jiān)測(cè)4天。培養(yǎng)期末(96h)，形成的CLA量用氣相色譜進(jìn)行測(cè)定，包括檢測(cè)c9，t11異構(gòu)體單獨(dú)的量及其與其它異構(gòu)體一起的量。
脂肪酸分析按M.Suutari，K.Liukkonen和S.Laakso在文章“酵母的溫度適應(yīng)性脂肪酸的作用”(微生物遺傳學(xué)雜志1990，1361469-1474)中的方法進(jìn)行，稍有修改。對(duì)培養(yǎng)基取樣以進(jìn)行分析，細(xì)胞以離心進(jìn)行分離(5,000g，15分鐘)。上清以0.2μm濾器進(jìn)行過(guò)濾，取樣0.2到0.5ml。細(xì)胞團(tuán)用自來(lái)水洗滌。上清樣和洗滌過(guò)的細(xì)胞被凍干。
凍干樣品中加入1ml皂化劑溶于49％甲醇的3.7M的NaOH。樣品以氮?dú)馓幚?，混勻并在密閉管中于100℃水浴溫浴30分鐘，期間混勻一次。樣品冷至室溫，然后加入4ml甲基化試劑溶于48％甲醇中的3.3M的HCL溶液。樣品以氮?dú)馓幚?，混勻，樣品管?0℃水浴溫浴10分鐘，然后對(duì)其進(jìn)行冷卻。向樣品中添加1.5ml正己烷/甲基叔丁醚溶液(1∶1)，充分振蕩10分鐘以抽提脂肪酸的甲酯。下層水相以巴斯德移液器移出。向樣品中加入3ml 0.3M NaOH溶液并充分振蕩5分鐘以洗滌有機(jī)相。對(duì)樣品進(jìn)行離心(5,000g，20分鐘)并用巴斯德移液器回收有機(jī)層。樣品以硫酸鈉干燥并以氮?dú)馓幚怼?br> 脂肪酸的甲酯用連有火焰電離檢測(cè)器(FID)和自動(dòng)取樣儀(HewlettPackard 7673A)的氣相色譜(Hewlett Packard 5890 series 11，賓州，美國(guó))進(jìn)行分析。在此分析中使用了一個(gè)毛細(xì)管柱(HP-FFAP，25m×0.2m×0.3μm)。樣品以分流注射(分流比1∶20；隔膜洗率1到2ml/min)進(jìn)樣。柱子的入口壓為150kPa，載氣(氦氣)在柱中的流速約為1ml/min。補(bǔ)氣(空氣)的流速為30ml/min，進(jìn)入檢測(cè)器的氫氣的流速為40ml/min。進(jìn)樣溫度和檢測(cè)器溫度為250℃。烘箱溫度為70到200℃。溫度以每分鐘25攝氏度的速度上升。結(jié)果以與氣相色譜相連的惠普化學(xué)工作站軟件(HPChemstation software)處理并輸出。
樣品中的脂肪酸通過(guò)與已知標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸的滯留時(shí)間進(jìn)行比較得以鑒定。一種Sigma的制劑被用來(lái)鑒定共軛亞油酸，此制劑為CLA的正，反-9，11和-10，12異構(gòu)體混合物。為對(duì)脂肪酸進(jìn)行量化，使用C19∶0脂肪酸甲酯(十九烷酸甲酯，Sigma)作為內(nèi)標(biāo)。
細(xì)菌的生長(zhǎng)結(jié)果列于表1.1。
表1.1PJS和P131菌株在含亞油酸(LA)的MRS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)
從結(jié)果來(lái)看，與對(duì)照相比，本身濃度為600μg/ml的亞油酸或由含1％Tween水溶液的貯液添加的亞油酸對(duì)兩個(gè)菌株的生長(zhǎng)都有抑制作用。按照本發(fā)明，使用相應(yīng)量的膠束化亞油酸減弱了亞油酸對(duì)生長(zhǎng)的抑制作用，其菌株幾乎與對(duì)照以相同的方式生長(zhǎng)。
PJS和P131菌株在MRS基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中形成的CLA的量列于表1.2，PJS菌株在乳清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的相應(yīng)結(jié)果列于表1.3。
表1.2PJS和P131菌株在含亞油酸(LA)的MRS培養(yǎng)基中形成的CLA
表1.3PJS菌株在含亞油酸(LA)的乳清透過(guò)培養(yǎng)基中形成的CLA
從結(jié)果來(lái)看，按本發(fā)明進(jìn)行的膠束化作用幾乎可以使100％的亞油酸轉(zhuǎn)化成CLA，其中75％以上為優(yōu)選的c9，t11 CLA異構(gòu)體。如果亞油酸就此加入的話，則僅有32％被轉(zhuǎn)化成CLA；如果加入1％去污劑溶液中的亞油酸的話，則僅有47％被轉(zhuǎn)化成CLA。因此，考慮到最小化亞油酸對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用和最大化由亞油酸產(chǎn)生的CLA，按照本發(fā)明進(jìn)行的膠束化作用取得了相當(dāng)好的結(jié)果。
實(shí)施例1亞油酸膠束的制備為制備膠束貯液，在試管中稱(chēng)量300mg亞油酸(順-9，反12-十八碳二烯酸，L-1376，Sigma)，加入10ml含0.36ml失水山梨糖醇油酸酯去污劑(Kotilen 0/1或Tween 80)的無(wú)氧蒸餾水并溫和振蕩。在混合物中逐滴加入2N氫氧化鈉溶液以使混合物剛好澄清(約0.5到0.6ml)。將溶液轉(zhuǎn)入50ml容量瓶，并以無(wú)氧蒸餾水補(bǔ)齊至刻度，然后就得到了含6mg/ml亞油酸的膠束貯液。將溶液分成恰當(dāng)?shù)膸追荩缘獨(dú)鈱⒖諝馀懦霾⒗鋬霰４妗?br> 膠束貯液也可以做的比上述的更濃或更稀。其中很重要的一點(diǎn)是，游離亞油酸的量和失水山梨糖醇油酸酯的量要保持與上述一樣的比例。
實(shí)施例2亞油酸和去污劑對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和CLA產(chǎn)生的影響通過(guò)在150ml乳清基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基和MRS液體培養(yǎng)基(LabM)中培養(yǎng)丙酸細(xì)菌，檢測(cè)亞油酸對(duì)去污劑之比的影響。乳清基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有2％的乳清透過(guò)物(Valio Oy)，0.5％的胰蛋白胨(LabM)和1％的酵母抽提物(LabM)。以上述膠束形式的貯液向培養(yǎng)基中添加亞油酸，使游離亞油酸在培養(yǎng)基中的終濃度為600μg/ml。單獨(dú)向培養(yǎng)基中加入需要量的失水山梨糖醇油酸酯(Kotilen 0/1或Tween 80)。將培養(yǎng)基的pH調(diào)至6.3。將在乳清基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的丙酸菌菌株費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種JS以2％(v/v)接種量接種，30℃培養(yǎng)。以Klett-Summerson比色計(jì)(filtre No.66)測(cè)量培養(yǎng)基的濁度，以此監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)(96小時(shí))。CLA和亞油酸以氣相色譜進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果列于表2。此處及在實(shí)施例3到4的CLA結(jié)果中所指的CLA生產(chǎn)是指由PJS微生物細(xì)胞形成的CLA，其由從總CLA濃度中減去培養(yǎng)基中源于去污劑的CLA量算出。CLA的產(chǎn)率計(jì)算如下形成CLA的克數(shù)/最初LA的克數(shù)。
表2乳清透過(guò)培養(yǎng)基和MRS液體培養(yǎng)基X)中去污劑的濃度對(duì)PJS生長(zhǎng)和CLA生產(chǎn)的影響
X)MRS液體培養(yǎng)基含有0.1％的Tween 80，隨后由于0.1％添加使終濃度升至約0.2％。
亞油酸可以膠束的形式大量添加至PJS菌株的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中而不會(huì)完全抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。由表2可以看出，進(jìn)一步添加去污劑可以減少亞油酸的抑制作用。當(dāng)培養(yǎng)基中的亞油酸對(duì)去污劑的比例適當(dāng)時(shí)，亞油酸在培養(yǎng)基中的量可以上升，從而使與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的亞油酸到CLA的轉(zhuǎn)化同低濃度亞油酸時(shí)一樣有效。因此可以達(dá)到所需的工業(yè)意義量的CLA順-9，反-11異構(gòu)體。在此試驗(yàn)中，與濃度為600μg/ml亞油酸相當(dāng)?shù)淖钸m去污劑含量為0.9％到1％，但更大量也可以使用。
實(shí)施例3在調(diào)節(jié)pH的發(fā)酵中CLA的生產(chǎn)在工業(yè)水平上培養(yǎng)丙酸菌最有效的方法是在發(fā)酵罐中培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基的pH值可以保持在最適細(xì)胞生長(zhǎng)的水平。通過(guò)在溶液體積為2升的發(fā)酵罐培養(yǎng)液中培養(yǎng)PJS細(xì)胞，進(jìn)行了共軛亞油酸生產(chǎn)過(guò)程的檢測(cè)。生長(zhǎng)培養(yǎng)基用實(shí)施例2中的乳清透過(guò)培養(yǎng)基。此生長(zhǎng)培養(yǎng)基分別含有400、600、1000或1400μg/ml的膠束化亞油酸和0.6％、0.9％或1.5％的Kotilen去污劑。在培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)自動(dòng)添加銨溶液使亞油酸濃度為400、600和1000μg/ml的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH保持在6.3，亞油酸濃度為1400μg/ml的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH保持在6.5。培養(yǎng)溫度為30℃，攪拌速度為100rpm。在乳酸鈉緩沖液瓊脂中測(cè)定活的丙酸菌細(xì)胞濃度，將瓊脂平板在30℃厭氧培養(yǎng)5到7天。


圖1顯示了在加有400μg/ml亞油酸和0.6％失水山梨糖醇油酸酯的培養(yǎng)基中由亞油酸形成CLA的過(guò)程。很明顯，亞油酸到CLA的轉(zhuǎn)化與PJS細(xì)胞的生長(zhǎng)同時(shí)發(fā)生。
表3比較了發(fā)酵罐中CLA的生產(chǎn)過(guò)程，培養(yǎng)基中亞油酸含量為400、600和1000μg/ml的培養(yǎng)94小時(shí)，1400μg/ml的培養(yǎng)108和132小時(shí)。
表3在調(diào)節(jié)pH的PJS細(xì)胞培養(yǎng)中CLA的生產(chǎn)
*也含有源于Kotilen的CLA。
實(shí)施例4細(xì)胞生長(zhǎng)后期CLA的生產(chǎn)通過(guò)重復(fù)實(shí)施例3的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了丙酸菌在細(xì)胞生長(zhǎng)后期產(chǎn)生CLA的能力，其區(qū)別在于膠束溶液中的亞油酸和失水山梨糖醇油酸酯去污劑僅在PJS細(xì)胞的快速生長(zhǎng)末期，即培養(yǎng)開(kāi)始51小時(shí)后，加入到液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中亞油酸濃度為600μg/ml，去污劑濃度為0.9％。添加時(shí)的細(xì)胞濃度為1.8×1010cfu/ml。此后，細(xì)胞停止生長(zhǎng)3小時(shí)，然后緩慢地繼續(xù)生長(zhǎng)。
細(xì)胞產(chǎn)生的亞油酸到CLA的轉(zhuǎn)化非常迅速3小時(shí)內(nèi)CLA產(chǎn)率為45％，6小時(shí)內(nèi)為58％。與在開(kāi)始時(shí)就在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中有亞油酸和去污劑的相應(yīng)培養(yǎng)(約100小時(shí))相比，此方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是總的發(fā)酵周期較短(約60小時(shí))。
實(shí)施例5在緩沖液中非生長(zhǎng)細(xì)菌細(xì)胞對(duì)CLA生產(chǎn)的用途在乳清基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)PJS細(xì)胞，30℃培養(yǎng)3天，離心細(xì)胞并以0.1 M磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)洗滌。在50ml 0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.8)中加入2.0g濕細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞濃度約為3×1010cfu/ml。加入實(shí)施例1的膠束化亞油酸使緩沖液中亞油酸的濃度為600μg/ml。此溶液在6℃或30℃溫浴21小時(shí)。以GC法和用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)235nm處進(jìn)行測(cè)定的方法對(duì)CLA進(jìn)行分析。
結(jié)果列于表4。所研究的每個(gè)溫度下都有通過(guò)非生長(zhǎng)PJS細(xì)胞在緩沖液中形成CLA，在30℃最有效。在營(yíng)養(yǎng)液中的CLA生產(chǎn)需要添加去污劑，以保持亞油酸處在膠束狀態(tài)。去污劑的優(yōu)選濃度根據(jù)此溶液的起始物濃度的不同而不同。反過(guò)來(lái)，在此緩沖液中無(wú)需向反應(yīng)培養(yǎng)液中單獨(dú)加入去污劑，這甚至是有害的。
表4CLA產(chǎn)率(形成CLA的克數(shù)/有非生長(zhǎng)PJS細(xì)胞的磷酸緩沖液(pH 7.8)中LA的克數(shù))
實(shí)施例6紅花油中CLA的生產(chǎn)a)紅花油的皂化在溫和條件下用抗氧化劑通過(guò)皂化作用可從紅花油中釋放出脂肪酸，從而防止了亞油酸的氧化。使用氫氧化鉀或鈉、乙醇、水和抗壞血酸進(jìn)行皂化，例如以下述比例紅花油10g，KOH飽和水溶液5ml，乙醇50ml，水10ml(此量也可以更低)和抗壞血酸1g。此混合物以氮?dú)馓幚聿⑸w緊蓋子。此混合物通過(guò)磁力攪拌皂化過(guò)夜。未皂化的部分用如30ml正己烷從溶液中抽提出來(lái)。為防止乳化作用，也可以在混合物中加入水。然后溶液用濃鹽酸酸化(pH 2到3)。從溶液中抽提出飽和脂肪酸，例如以40ml正己烷抽提兩次。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將正己烷蒸發(fā)，將脂肪轉(zhuǎn)移至有緊密螺紋蓋的瓶子里并用氮?dú)馓幚韼追昼?。然后此脂肪混合物就制備好了，在冰箱中保存以防氧化?br> b)膠束的形成按照本發(fā)明，脂肪酸膠束由從紅花油制備得到的游離脂肪酸混合物通過(guò)Kotilen、水和氫氧化鈉(例如按以下比例紅花油制品700mg、水30ml、Kotilen 0.75ml、2N氫氧化鈉溶液1.5ml)制備得到。在混合之前，可將Kotilen和水加熱至約40℃。用氮?dú)馓幚磉^(guò)的水與Kotilen混合。將紅花油制品加入此混合物，充分混勻。最后，逐滴加入氫氧化鈉溶液至溶液澄清。
c)CLA的產(chǎn)生用細(xì)菌從脂肪溶液中可以產(chǎn)生CLA，例如用以下的方法在例如含有2％乳清透過(guò)物、0.5％酪素水解物、0.5％酵母抽提物和0.9％ Kotilen的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入含有亞油酸和2％接種量的費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種JS培養(yǎng)物(其已生長(zhǎng)3天)。此細(xì)菌在30℃產(chǎn)生的CLA量(％)列于表5。
表5CLA產(chǎn)率與加入亞油酸量的比例關(guān)系
實(shí)施例7含干CLA的組合物的制備在含2％乳清透過(guò)物(Valio Oy)、0.5％酪素水解物(Valio Oy)、0.5％酵母抽提物(Lab M)和0.2g按實(shí)施例1膠束化的亞油酸的乳清培養(yǎng)基中培養(yǎng)費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種JS。1％新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物接種此培養(yǎng)基，在培養(yǎng)期間，用pH自動(dòng)調(diào)節(jié)儀將pH保持在6.5，溫度保持在30℃。培養(yǎng)4天后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將細(xì)胞培養(yǎng)物和培養(yǎng)基一起蒸發(fā)至原體積的1/4，并將獲得的濃縮物在Heto干燥器中凍干。粉末產(chǎn)率為23到25g/1000ml。獲得的粉末含8.056mg/g(193mg/24g粉末)CLA，即原始亞油酸的96％已被轉(zhuǎn)化成CLA。總CLA中，79％是最具活性的異構(gòu)體。結(jié)果列于表6。表6由PJS在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中產(chǎn)生的CLA
權(quán)利要求
1.通過(guò)微生物方法從亞油酸制備共軛亞油酸的方法，其特征在于亞油酸以膠束的形式加到反應(yīng)液體培養(yǎng)基中。
2.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于該膠束也含有表面活性劑。
3.權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于此膠束通過(guò)游離亞油酸與表面活性劑在堿性條件下反應(yīng)所形成。
4.權(quán)利要求1到3中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于該膠束含有亞油酸和聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯的混合物。
5.權(quán)利要求1到4中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于主要制備共軛亞油酸順-9，反-11異構(gòu)體。
6.權(quán)利要求1到5中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于用丙酸細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
7.權(quán)利要求6所述方法，其特征在于該丙酸細(xì)菌菌株屬于費(fèi)氏丙酸桿菌種，并優(yōu)選其亞種費(fèi)氏丙酸桿菌費(fèi)氏亞種或費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種。
8.權(quán)利要求7所述方法，其特征在于該丙酸細(xì)菌為費(fèi)氏丙酸桿菌費(fèi)氏亞種131或費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種JS。
9.權(quán)利要求1到8中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于該共軛亞油酸的制備與細(xì)菌生長(zhǎng)同時(shí)進(jìn)行。
10.權(quán)利要求1到9中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于此轉(zhuǎn)化在有表面活性劑存在的條件下進(jìn)行。
11.權(quán)利要求10所述方法，其特征在于該表面活性劑為聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯，其使用濃度為0.5％到1.5％。
12.權(quán)利要求1到8中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于該共軛亞油酸的制備在細(xì)菌培養(yǎng)之后進(jìn)行。
13.權(quán)利要求12所述方法，其特征在于此轉(zhuǎn)化用從沒(méi)有添加表面活性劑的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分離出的細(xì)胞進(jìn)行。
14.權(quán)利要求1到13中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于該共軛亞油酸的制備與食品制備相連。
15.權(quán)利要求1到13中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于該共軛亞油酸從此反應(yīng)培養(yǎng)液中分離出來(lái)并可能被干燥。
16.權(quán)利要求1到13中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于該共軛亞油酸和細(xì)菌細(xì)胞被濃縮并可能被干燥。
17.權(quán)利要求16所述方法，其特征在于該亞油酸和細(xì)菌細(xì)胞被回收、濃縮和凍干。
18.通過(guò)權(quán)利要求1到17中任何一項(xiàng)所述方法制備的產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)發(fā)酵由亞油酸制備共軛亞油酸，具體地說(shuō)是其順－9，反－11異構(gòu)體的方法。本發(fā)明也涉及用該方法制備的產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C12R1/01GK1391613SQ00815851
公開(kāi)日2003年1月15日 申請(qǐng)日期2000年11月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月19日
發(fā)明者S·拉克索, A·拉尼奧, M·維維斯勒卡, A·邁瑞－瑪克尼恩, S·泰克尼恩, T·索瑪拉尼恩 申請(qǐng)人:瓦利奧有限公司