專(zhuān)利名稱(chēng)：用于核移植的供體細(xì)胞的制備和選擇的制作方法
背景技術(shù)：
A.細(xì)胞同步細(xì)胞周期分析的一種重要方法是使細(xì)胞能夠達(dá)到細(xì)胞周期(如S，M，G1，或G2)的相同時(shí)期的能力。幾年前已可作到細(xì)胞同步化，可以使用或不使用化學(xué)物質(zhì)。同步化的最佳方法之一利用這樣的事實(shí)球形的，有絲分裂期(M)細(xì)胞與玻璃表面的黏附力小于分裂間期細(xì)胞(如，分裂間期的細(xì)胞是那些在S，G1，或G2的細(xì)胞)。所以振蕩細(xì)胞培養(yǎng)物可以分離得到大量未污染的M期細(xì)胞(參見(jiàn)JAMES D.WATSON等，MOLECULAR BIOLOGYOF THE GENE 971(4thed.，1987)。非化學(xué)的“振蕩分離”(shake-off)技術(shù)對(duì)于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和一些HeLa亞系的效果很好(R.IANFRESHNEY，CULTURE OF ANIMAL CELLSA MANUAL OF BASIC TECHNIQUES384-385(3nded.1994)；和Zwanenburg，Mutat.Res.120151-9(1983))。在同步化人二倍體成纖維細(xì)胞中使用機(jī)械的振蕩分離得到可與CHO的觀(guān)察結(jié)果相比的成功(Tobey等Exp.Cell Res.179400-16(1988))。振蕩分離法已應(yīng)用于同步化胚胎鵪鶉骨骼成肌細(xì)胞(Devlin等，Dev.Biol.95175-92(1983))和HeLa細(xì)胞(Wheatley等，Cytobios.55191-204(1988))。另一種同步細(xì)胞到G1的機(jī)械方法是使用離心淘析，該方法導(dǎo)致細(xì)胞暫時(shí)滯留在G0期(Zickert等，Exp.Cell.Res.207115-21(1993))。
細(xì)胞同步化還可以通過(guò)結(jié)合機(jī)械振蕩分離和化學(xué)物質(zhì)(如蚜棲菌素)來(lái)得到(Graves等，Anal.Biochem.248251-7(1997))。但是，使用藥物(如蚜棲菌素或羥基脲)對(duì)CHO細(xì)胞有毒負(fù)作用，而振蕩分離則沒(méi)有(Fox等，Cytometry 8315-20(1987))?？蓡为?dú)使用藥物同步化細(xì)胞。G1和/或G0滯留藥物包括地塞米松(Goya等，Mol.Endocrinol.71121-32(1993))，以及其它糖皮質(zhì)激素(Sanchez等，Cell Growth Differ.4215-25(1993))，或者雙配位基3-羥基吡啶-4-酮(HPO)和六配位基去鐵胺(DFO)(Hoyes等，Cancer Res.524591-9(1992))。其它的G1特異性細(xì)胞周期同步化試劑在Gadbois等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA898626-8630(1992))的文章中討論。
溫度已經(jīng)被用來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞周期。冷激(cold-shock)可同步外周血或骨髓中不成熟的粒細(xì)胞(Boucher等，Hum.Genet.54207-11(1980))。通過(guò)將細(xì)胞轉(zhuǎn)換到低溫，例如30℃，人類(lèi)二倍體成纖維細(xì)胞即停滯在G1期(Enninga等，Mutat.Res.130343-53(1984))。使用機(jī)械振蕩分離方法使CHO細(xì)胞達(dá)到同步化之后，利用溫度將細(xì)胞周期停滯在G1期，S期，晚S期和G2+M期(Schneiderman等，Radiat.Res.116283-91(1988))。
供體細(xì)胞核的細(xì)胞周期階段強(qiáng)烈地影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和核移植胚胎的發(fā)育。供體核同步化在G1期是核移植胚胎成功發(fā)育的一個(gè)重要方面(Cheong等，Biol.Reprod.48958-63(1993))。具體地，晚S期染色質(zhì)影響胚胎中的染色體組成，這可以解釋當(dāng)使用晚S期供體核時(shí)，核移植胚胎的發(fā)育降低(Collas等，Biol.Reprod.46501-11(1992))。細(xì)胞周期影響供體核的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和移植到去核卵母細(xì)胞中的小鼠胚胎核的發(fā)育。當(dāng)供體融合到去核中期II卵母細(xì)胞后，細(xì)胞周期同步化已顯示出在豬外胚層細(xì)胞供體核的使用中對(duì)核物質(zhì)的核重新編程有重要作用(Ouhibi等，Mol.Resprod.Dev.44533-9(1966))。但是，為了體細(xì)胞核移植的目的進(jìn)行的細(xì)胞同步化，還沒(méi)有聯(lián)合使用有絲分裂細(xì)胞振蕩分離與雙聯(lián)體細(xì)胞篩選。而且，體細(xì)胞的振蕩分離和雙聯(lián)體篩選沒(méi)有聯(lián)合其他細(xì)胞周期同步化方法(如G1期滯留劑或方法)用于制備移植用的體細(xì)胞核。
B.制備用于核移植或核轉(zhuǎn)移的體細(xì)胞在1996年，報(bào)道的首例成功核移植是將細(xì)胞核從成熟的乳腺細(xì)胞移植到去核卵母細(xì)胞中(Campbell等，Nature 38064-6(1996))。繼此之后，又通過(guò)胚胎細(xì)胞的核移植培育出恒河猴。核移植包括制備胞質(zhì)體作為受體細(xì)胞。在多數(shù)情況下，胞質(zhì)體來(lái)源于染色體已被去除的成熟中期II卵母細(xì)胞。然后供體細(xì)胞核被置于透明帶和胞質(zhì)體之間；通過(guò)電刺激開(kāi)始融合及激活胞質(zhì)體。胞質(zhì)體成功地對(duì)供體細(xì)胞核重新編程是非常重要的，該步驟可被細(xì)胞周期所影響。參見(jiàn)Wolf等，Biol.Reprod.60199-204(1999)。通過(guò)利用胎兒細(xì)胞作為供體核來(lái)源已經(jīng)建立了一些妊娠。但是，使用細(xì)胞系來(lái)建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物允許大的克隆規(guī)模和在核移植前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體外遺傳操作。同上。調(diào)節(jié)早期胚胎發(fā)育的機(jī)理可能在哺乳動(dòng)物物種中保守，例如，不論染色體數(shù)目，物種或供體成纖維細(xì)胞的年齡，牛卵母細(xì)胞胞質(zhì)都可支持導(dǎo)入的分化供體核(Dominko等，Biol.Reprod.601496-1502(1999))。
根據(jù)Cibelli等，Science 2801256-9(1998)中論述的方法，活躍分裂的胎兒成纖維細(xì)胞可用作核供體。在國(guó)際PCT申請(qǐng)99/05266；99/01164；99/01163；98/3916；98/30683；97/41209；97/07668和US專(zhuān)利5,843,754中還公開(kāi)了制備用于供體分化核核移植的受體卵母細(xì)胞的其它制備方法。典型地，移植核是來(lái)自培養(yǎng)的胚胎干(ES)細(xì)胞，胚胎生殖(EG)細(xì)胞或其它胚胎細(xì)胞。參見(jiàn)國(guó)際PCT申請(qǐng)95/17500和95/10599；加拿大專(zhuān)利申請(qǐng)2,092,258；英國(guó)專(zhuān)利2,265,909；和美國(guó)專(zhuān)利5,453,366；5,057,420；4,994,384；4,664,097。內(nèi)細(xì)胞群(ICM)細(xì)胞也可用作核供體(Sims等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 906143-6147(1990)；和Keefer等，Biol.Reprod.50935-939(1994))。
C.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其制備前核顯微注射。已有各種各樣的方法用于遺傳修飾動(dòng)物以得到更優(yōu)良的性質(zhì)，其中包括前核顯微注射。前核顯微注射的一個(gè)不足就是基因插入位點(diǎn)是隨機(jī)的。這典型地導(dǎo)致不同的表達(dá)水平，必須產(chǎn)生幾個(gè)轉(zhuǎn)基因系以得到表達(dá)水平適當(dāng)?shù)南?。由于整合是隨機(jī)的，有利之處在于從一個(gè)基礎(chǔ)動(dòng)物開(kāi)始轉(zhuǎn)基因動(dòng)物系，以避免在監(jiān)測(cè)接合性時(shí)的困難和多插入位點(diǎn)相互作用可能引起的困難(Cundiff等，J.Animal Sci.7120-25(1993))。即使不考慮近交，仍需要6.5年的時(shí)間才能在純合的動(dòng)物中檢測(cè)繁殖(Seidel等，J.Animal Sci.7126-33(1993))。
前核注射方法的另一個(gè)缺點(diǎn)是效率不高。只有0.34到2.63％的基因注射胚胎發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，而這些的一小部分能夠適當(dāng)表達(dá)這些基因(Purcel等，J.Animal Sci.7110-19(1993))。這種效率低下導(dǎo)致產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的高成本，因?yàn)樾枰罅康氖荏w。這樣，能夠克隆包含目的基因修飾的動(dòng)物或能夠制備大量相同遺傳拷貝的包含目的基因修飾的動(dòng)物將是非常有利的。
胚胎干細(xì)胞。另一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的系統(tǒng)是使用胚胎干(ES)細(xì)胞。在小鼠中，ES細(xì)胞使研究人員能挑選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞并進(jìn)行基因?qū)ぐ小Ｅc其他轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，這種方法可允許進(jìn)行更多遺傳操作。例如，ES細(xì)胞更易于在體外作為集落生長(zhǎng)，可通過(guò)常規(guī)方法轉(zhuǎn)染，可通過(guò)抗生素抗性克隆篩選出轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(T.Doetschman，“Gene transfer in embryonicstem cells.”IN TRANSGENIC ANIMAL TECHNOLOGYA LABORATORY HANDBOOK115-146(C.Pinkert等，Academic Press，Inc.New York 1994))。而且，這種方法的效率很高，可產(chǎn)生足夠的轉(zhuǎn)基因集落(成百上千)以允許進(jìn)行第二次篩選獲得同源重組體。同上。ES細(xì)胞可與普通宿主胚胎進(jìn)行結(jié)合，由于它們?nèi)员３肿约旱臐撃?，可在所產(chǎn)生的動(dòng)物中發(fā)育成各種組織，包括生殖細(xì)胞。所以，轉(zhuǎn)基因修飾可傳遞至后代。
從早期小鼠植入前胚胎中體外獲得胚胎干(ES)細(xì)胞系的方法已眾所周知(Evans等，Nature 29154-156(1981)；Martin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA787634-7638(1981))。如果培養(yǎng)基中存在成纖維細(xì)胞(Evans等，1981)或分化抑制劑(Smith等，Dev.Biol.1211-9(1987))，ES細(xì)胞可以以不分化的狀態(tài)進(jìn)行傳代。
由于ES細(xì)胞具有將其基因組傳遞給其下一代的能力，ES細(xì)胞在家畜生殖系操作中很具潛力。一些研究單位已報(bào)道了所謂的多能胚胎細(xì)胞系的分離。例如Notarianni等，J.Reprod.Fert.Suppl.4355-260(1991)報(bào)道從豬和羊胚泡中建立了穩(wěn)定的，多能細(xì)胞系，該細(xì)胞系顯示了一些與免疫外科分離自羊胚泡的內(nèi)細(xì)胞群(ICMs)原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞相似的形態(tài)學(xué)和生長(zhǎng)特性。同樣，Notarianni等，J.Reprod.Fert.Suppl.4151-56(1990)公開(kāi)了來(lái)自豬胚泡的推定多能胚胎干細(xì)胞系培養(yǎng)物的維持和分化。Gerfen等，Anim.Biotech.61-14(1995)公開(kāi)了從豬胚泡中分離胚胎干細(xì)胞系。這些細(xì)胞在沒(méi)有小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層時(shí)穩(wěn)定維持并據(jù)報(bào)道在培養(yǎng)中分化成幾種不同的細(xì)胞類(lèi)型。
進(jìn)一步的，Sainto等，Roux’s Arch.Dev.Bid.201134-141(1992)報(bào)道，培養(yǎng)的牛胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞系存活了三代，但是在第四次傳代中丟失。Handyside等，Roux’s Arch.Dev.Biol.196185-190(1987)公開(kāi)了在允許小鼠ICMs來(lái)源的小鼠ES細(xì)胞系分離的條件下用免疫切除法分離的羊胚胎內(nèi)細(xì)胞群(ICMs)的培養(yǎng)。
Chemy等，Theriogenology 41175(1994)報(bào)道了來(lái)源于所謂多能牛原始生殖細(xì)胞的細(xì)胞系在長(zhǎng)期培養(yǎng)中的維持。這些細(xì)胞培養(yǎng)大約七天后，產(chǎn)生ES樣集落，這些集落對(duì)堿性磷酸酶(AP)染色呈陽(yáng)性染色，顯示出形成胚狀體的能力，并自發(fā)地分化成至少兩種不同的細(xì)胞類(lèi)型。
Campbell等，(1996)報(bào)道了在促進(jìn)小鼠ES細(xì)胞系分離的條件下培養(yǎng)九天的羊胚胎的胚盤(pán)(ED)細(xì)胞經(jīng)過(guò)核移植后產(chǎn)生了成活羊羔。
Van Stekelenburg-Hamers等，Mol.Reprod.Dev.40444-454(1995)報(bào)道了牛胚泡ICMs來(lái)源的所謂永久細(xì)胞系的分離及其性質(zhì)。作者在不同條件下分離并培養(yǎng)了八或九天牛胚泡ICMs，以鑒定出對(duì)于支持牛ICM細(xì)胞的黏附和自然發(fā)展效率最高的飼養(yǎng)層細(xì)胞和培養(yǎng)基。
據(jù)稱(chēng)，動(dòng)物干細(xì)胞已經(jīng)被分離，篩選并繁殖用于得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(參見(jiàn)Evans等，WO90/03432；Smith等，WO94/24274；和Wheeler等，WO94/26884)。Evans等，也報(bào)道了來(lái)自豬和牛物種所謂多能ES細(xì)胞的產(chǎn)生，據(jù)評(píng)價(jià)這對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)生很有用處。
來(lái)自轉(zhuǎn)基因胚胎的ES細(xì)胞可用于核移植。有蹄類(lèi)動(dòng)物ICM細(xì)胞在核移植中的應(yīng)用也有報(bào)道。在家畜類(lèi)動(dòng)物中，如有蹄類(lèi)，來(lái)自類(lèi)似的移植前家畜胚胎的核支持去核卵母細(xì)胞發(fā)育到分娩期(Keefer等，1994；Smith等，Biol.Reprod.401027-1035(1989))。與之相反，來(lái)自小鼠胚胎的核經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)移后在8細(xì)胞期之后不支持去核卵母細(xì)胞的發(fā)育(Cheong等，Biol.Reprod.48958(1993))。所以，來(lái)自家畜的ES細(xì)胞是非常期望的，因?yàn)樗鼈兛梢蕴峁┖芫邼摿Φ慕?jīng)遺傳操作或其它操作用于核移植方法的全能供體核來(lái)源。
使用ICM細(xì)胞。Collas等，Mol.Reprod.Dev.38264-267(1994)公開(kāi)了通過(guò)將溶解的供體細(xì)胞顯微注射到成熟去核卵母細(xì)胞中的牛ICMs核移植。在體外培養(yǎng)胚胎7天，產(chǎn)生15個(gè)胚泡，轉(zhuǎn)移到牛受體中后，導(dǎo)致4例受孕，并有2例生產(chǎn)。同樣，Keefer等，Biol.Reprod.50935-939(1994)公開(kāi)了在核移植方法中使用牛ICM細(xì)胞作為供體細(xì)胞，產(chǎn)生胚泡，該胚泡產(chǎn)生了幾例存活后代。進(jìn)一步的，Sims等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906143-6147(1993)公開(kāi)了通過(guò)將核從短期體外培養(yǎng)的牛ICM細(xì)胞中轉(zhuǎn)移到成熟去核卵母細(xì)胞中產(chǎn)生了小牛。
所以，盡管在文獻(xiàn)中有所報(bào)道，仍需要一種改進(jìn)的制備大量用于核轉(zhuǎn)移或移植的細(xì)胞的方法，以應(yīng)用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因或嵌合動(dòng)物。使用細(xì)胞周期同步細(xì)胞，其代表一種快速分裂亞群，作為供體核，采用核轉(zhuǎn)移方法可以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因或嵌合動(dòng)物特別是家畜的發(fā)育。
發(fā)明概述及目的本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備用于核轉(zhuǎn)移或核移植的供體體細(xì)胞的方法，包括步驟(A)通過(guò)振蕩細(xì)胞使供體體細(xì)胞的細(xì)胞周期同步化；(B)從所述經(jīng)過(guò)振蕩的體細(xì)胞中篩選出雙聯(lián)體細(xì)胞(doublet cells)，以及(C)制備選出的有絲分裂雙聯(lián)體細(xì)胞用于核轉(zhuǎn)移。還可任選地包括一個(gè)冷卻步驟，其中選出的雙聯(lián)體細(xì)胞被冷卻到低于新陳代謝的溫度，以延長(zhǎng)G1期。同樣，可選擇地，提高G1期的細(xì)胞數(shù)量或者G1期的時(shí)期可以通過(guò)將細(xì)胞放入到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中來(lái)完成，如缺乏至少一種下述物質(zhì)的培養(yǎng)基血清，異亮氨酸，谷氨酰胺或磷酸鹽，或者加入G1期同步化試劑(如蚜棲菌素或含羞草氨酸)。
本發(fā)明的一個(gè)具體目的是得到細(xì)胞，例如快速分裂的體細(xì)胞(細(xì)胞周期在15個(gè)小時(shí)或更短時(shí)間內(nèi)完成，更優(yōu)選10個(gè)小時(shí)或更短)。這樣的細(xì)胞可利用上述方法制備得到。


圖1匯合度和細(xì)胞壽命對(duì)細(xì)胞周期長(zhǎng)度的影響。直方圖說(shuō)明25％匯合度的細(xì)胞相比于90％匯合度的細(xì)胞的細(xì)胞周期長(zhǎng)度(以小時(shí)計(jì))的區(qū)別。細(xì)胞周期在獲自40天齡的胎兒(40D FET)，4年齡的母牛(4 YRS)，15年齡母牛(15 YRS)的細(xì)胞群和全體細(xì)胞中觀(guān)察。
圖2培養(yǎng)時(shí)間和供體年齡對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速率的影響。比較40天齡胎兒(40D FET)，0-13月(0-13MO)齡小牛和24-72月(24-72)齡小牛來(lái)源的細(xì)胞中的細(xì)胞生長(zhǎng)速率。依據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的天數(shù)比較群體倍增(PD)。平均PD值隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而減小。
圖3從培養(yǎng)物中回收的成纖維細(xì)胞G1期的長(zhǎng)度。
發(fā)明詳述為更好地理解本發(fā)明，下述具體描述參照了附圖和實(shí)施例，其中例舉和描述了本發(fā)明優(yōu)選的示例性實(shí)施方式。本發(fā)明涉及一種獲得體細(xì)胞作為供體細(xì)胞的新方法，其為核轉(zhuǎn)移或核移植提供一種目前最優(yōu)化的供體核群體。
A.定義“同步化的細(xì)胞”或“同步”指細(xì)胞培養(yǎng)物或制備所述細(xì)胞的方法，該細(xì)胞中多于90％的細(xì)胞在G1期。
“匯合細(xì)胞”指細(xì)胞群密度約為90％或更大。
術(shù)語(yǔ)“核轉(zhuǎn)移”或“核移植”指一種克隆方法，其中供體細(xì)胞核被移植到細(xì)胞胞質(zhì)體內(nèi)。該胞質(zhì)體可來(lái)自于去核卵母細(xì)胞，去核ES細(xì)胞，去核EG細(xì)胞，去核胚胎細(xì)胞或去核體細(xì)胞。核轉(zhuǎn)移技術(shù)或核移植技術(shù)在文獻(xiàn)中已知(Campbell等，Theriogenology 43181(1995)；Collas等，(1994)；Keefer等，(1994)；Sims等，(1993)；Evans等，WO90/03432；Smith等，WO94/24274；和Wheeler等，WO94/26884。同樣在US.PatentNos.4,994,384和5,057,420中描述了牛核移植的方法。在本申請(qǐng)中，“核轉(zhuǎn)移”或“核移植”或“NT”可互相替換使用。
術(shù)語(yǔ)“核轉(zhuǎn)移單元”和“NT單元”指體細(xì)胞或細(xì)胞核與去核胞質(zhì)體(如去核卵母細(xì)胞)之間的融合產(chǎn)物或注射產(chǎn)物，其有時(shí)在此稱(chēng)融合NT單元。
“體細(xì)胞”指任何多細(xì)胞生物，優(yōu)選動(dòng)物，的細(xì)胞，該細(xì)胞未成為配子。優(yōu)選的“體細(xì)胞”是黏附細(xì)胞?！梆じ郊?xì)胞”指培養(yǎng)時(shí)會(huì)黏附在組織培養(yǎng)瓶或其它這類(lèi)容器的表面上的細(xì)胞。
“動(dòng)物”包括哺乳動(dòng)物，例如家畜(如有蹄類(lèi)，如牛，水牛，馬，綿羊，豬和山羊)，以及嚙齒動(dòng)物(如小鼠，倉(cāng)鼠，大鼠和豚鼠)，馴養(yǎng)的動(dòng)物如狗，貓，馬，兔和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。動(dòng)物還包括瀕危甚至滅絕的物種如guar，大熊貓，象，非洲大羚羊，蘇門(mén)答臘虎，bucardo山羊，獵豹，豹貓等。
“雙聯(lián)體細(xì)胞(doublet cell)”包括通過(guò)細(xì)胞質(zhì)橋連接的那些細(xì)胞?！凹?xì)胞質(zhì)橋”發(fā)生在胞質(zhì)分裂的最后階段，在子細(xì)胞完全分離之前。
“快速分裂細(xì)胞”指在含有血清的培養(yǎng)基中以低群體密度(50％群體密度或更小)生長(zhǎng)的細(xì)胞。
“G1期同步試劑”指可提高G1期細(xì)胞的產(chǎn)生或滯留細(xì)胞在G1期的試劑。
“嵌合體”或“嵌合動(dòng)物”指由兩種遺傳上不同類(lèi)型的細(xì)胞組成的生物。嵌合體可以通過(guò)，例如兩個(gè)早期囊胚期胚胎的融合形成。
“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”指其基因組整合進(jìn)了一個(gè)或多個(gè)外來(lái)DNA分子的有機(jī)體。
B.細(xì)胞周期同步化可以使用有絲分裂振蕩分離進(jìn)行體細(xì)胞同步化，其中，通過(guò)拍擊組織培養(yǎng)瓶，振蕩細(xì)胞，使有絲分裂的細(xì)胞從瓶壁上搖下。簡(jiǎn)言之，在振蕩分離前24小時(shí)以0.5×106細(xì)胞平板培養(yǎng)。典型地，在渦旋器或其它振蕩儀器上放置培養(yǎng)瓶或其它組織培養(yǎng)皿約30-約60秒，進(jìn)行振蕩分離。取出含有振蕩分離出的細(xì)胞的培養(yǎng)基，離心。沉淀的細(xì)胞在250μl培養(yǎng)基中重懸浮。通過(guò)目測(cè)分離雙聯(lián)體細(xì)胞與振蕩步驟得到的非雙聯(lián)體細(xì)胞。雙聯(lián)體細(xì)胞也可通過(guò)例如使用梯度離心將雙聯(lián)體細(xì)胞與非雙聯(lián)體細(xì)胞分開(kāi)來(lái)分離。
這些細(xì)胞可直接用于去核以進(jìn)行核移植或核轉(zhuǎn)移?？晒┻x擇地，該細(xì)胞可冷卻到新陳代謝以下溫度(如低于37℃，更優(yōu)選在4-20℃，最優(yōu)選在4℃)以維持它們停滯在G1期。這些細(xì)胞可用其它方法使之保持在G1期，例如在雙聯(lián)體篩選后，培養(yǎng)基中剝奪血清或缺失異亮氨酸，谷氨酰胺或磷酸鹽。藥物，例如秋水仙堿，可阻留細(xì)胞在M期(JAMES D.WATSON等，MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE 973(4thed.，1987)。其它藥物可阻留細(xì)胞在G1期，例如含羞草氨酸(Krude，Exp.Cell.Res.247148-59(1999))，糖皮質(zhì)素(Sanchez等，Cell Growth Differ.4215-25(1993))，蚜棲菌素和某些激酶抑制劑(如Gadbois等，1992中描述的KT5720，KT5823，KT5926和K5256)。其它藥物阻斷細(xì)胞在G1-S邊界，包括雙配位基的3-羥基吡啶-4-酮和六配位基的去鐵胺(Hoyes等，Cancer Res.524591-9(1992))。這些藥物可加入到選出的雙聯(lián)體細(xì)胞的培養(yǎng)基中以延長(zhǎng)G1期的時(shí)間。
C.使用體細(xì)胞進(jìn)行核移植和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的培育已使用綿羊成熟細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞用作核轉(zhuǎn)移供體來(lái)產(chǎn)生克隆綿羊后代(Wilmut等，Nature 385810-813(1997))。但是，該項(xiàng)研究中，重點(diǎn)在于使用處于靜止?fàn)顟B(tài)的血清饑餓核供體細(xì)胞對(duì)于Wilmut克隆方法的成功非常重要。在本發(fā)明中無(wú)須血清饑餓或靜止維持細(xì)胞在G0期。相反，使用分化的正在通過(guò)細(xì)胞周期的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，即G1期，G2期或M期或S期細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)克隆。
這樣，一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種改進(jìn)的克隆動(dòng)物的方法?？傮w來(lái)說(shuō)，該動(dòng)物是通過(guò)核轉(zhuǎn)移方法產(chǎn)生的(p Lourenco roduced)，該方法包括以下步驟(i)通過(guò)這里所述的方法獲得目的體細(xì)胞作為供體核來(lái)源，該細(xì)胞可以是血清饑餓或非血清饑餓的；(ii)從動(dòng)物如牛獲得卵母細(xì)胞；(iii)去除所述卵母細(xì)胞的細(xì)胞核；(iV)將目的體細(xì)胞或細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至去核卵母細(xì)胞中，例如通過(guò)融合或注射，以形成NT單元；(v)激活NT單元產(chǎn)生激活了的NT單元；以及(vi)將所述激活了的NT單元轉(zhuǎn)移至宿主動(dòng)物中，使NT單元發(fā)育成胎兒。
可選擇地，激活的NT單元在轉(zhuǎn)移到宿主動(dòng)物中之前，培養(yǎng)至2細(xì)胞發(fā)育階段以上。
本發(fā)明還包括一種遺傳工程或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的克隆方法，通過(guò)該方法，在將分化的動(dòng)物細(xì)胞(如體細(xì)胞)或細(xì)胞核插入到核轉(zhuǎn)移之前或之后去核的卵母細(xì)胞之前，在血清饑餓或非血清饑餓的分化動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞核中目的DNA序列被插入，去除或修飾。
除以上所述的用途之外，本發(fā)明的遺傳工程或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還可用于產(chǎn)生目的蛋白，例如藥理學(xué)上重要的蛋白例如人類(lèi)血清白蛋白。該目的蛋白可從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的奶或其它液體或組織中分離得到?？商娲兀庠碊NA序列可帶給轉(zhuǎn)基因動(dòng)物農(nóng)業(yè)上有用的特性，例如疾病抗性，體內(nèi)脂肪的減少，瘦肉產(chǎn)品增加，改進(jìn)的飼料轉(zhuǎn)化或改變的后代性別比例。
在去核和核轉(zhuǎn)移時(shí)卵母細(xì)胞的成熟階段已報(bào)道對(duì)于NT方法的成功具有顯著的意義(Prather等，Differentiation 481-8(1991))。大致上，成功的哺乳動(dòng)物胚胎克隆實(shí)踐是使用中期II期卵母細(xì)胞作為受體卵母細(xì)胞，因?yàn)閾?jù)認(rèn)為在這個(gè)階段卵母細(xì)胞可以通過(guò)引起核解裝配和染色質(zhì)濃縮來(lái)重新編程核。然后誘導(dǎo)NT單元的激活。在馴化的動(dòng)物中，卵母細(xì)胞激活期的范圍通常為吸出后(post-aspiration)16-52個(gè)小時(shí)，優(yōu)選大約20-45小時(shí)。
本領(lǐng)域已知卵母細(xì)胞的分離方法。基本上，這包括從動(dòng)物例如牛的卵巢中或生殖道內(nèi)分離出卵母細(xì)胞。一種容易獲得的牛卵母細(xì)胞來(lái)源是來(lái)自屠宰場(chǎng)的原料。
為成功使用遺傳改造，核轉(zhuǎn)移和克隆等技術(shù)，在卵母細(xì)胞用作核轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞之前，以及在它們可被精子細(xì)胞受精發(fā)育成胚胎之前，卵母細(xì)胞通常必須在體外成熟。這個(gè)過(guò)程大致需要收集哺乳動(dòng)物卵巢如來(lái)自屠宰場(chǎng)牛卵巢的未成熟(前期I)卵母細(xì)胞，然后在受精或去核之前，在成熟培養(yǎng)基中使其成熟直到卵母細(xì)胞到達(dá)中期II階段，通常對(duì)牛卵母細(xì)胞該期會(huì)出現(xiàn)在吸出后18-24小時(shí)。為了本發(fā)明的目的，該時(shí)間期被作為“成熟期”。在此用作計(jì)算時(shí)間期，“吸出(aspiration)”指未成熟卵母細(xì)胞從卵巢卵泡中吸出。
此外，在體內(nèi)已成熟的中期II階段卵母細(xì)胞，已成功應(yīng)用于核轉(zhuǎn)移技術(shù)。大致上，可從非超排卵或超排卵母牛或小母牛中，在發(fā)情期開(kāi)始之后或注射人類(lèi)絨毛膜促性腺激素(hCG)或相似激素之后約20到約30小時(shí)，外科收集成熟母牛中期II卵母細(xì)胞。
已有報(bào)道稱(chēng)去核和核轉(zhuǎn)移時(shí)卵母細(xì)胞成熟階段對(duì)于成功的NT方法意義顯著。(參見(jiàn)Prather等，Differentiation 481-8(1991))。大體上，成功的哺乳動(dòng)物胚胎克隆實(shí)踐使用中期II期卵母細(xì)胞作為受體卵母細(xì)胞，因?yàn)樵谶@個(gè)時(shí)期，據(jù)信卵母細(xì)胞可被或已被足夠“激活”而將導(dǎo)入的核當(dāng)作受精精子處理。在馴化的動(dòng)物中，尤其是家畜，卵母細(xì)胞激活時(shí)期大致從吸出后16-52小時(shí)，優(yōu)選28-42小時(shí)。
例如，未成熟的卵母細(xì)胞可在HEPES緩沖的倉(cāng)鼠胚胎培養(yǎng)基(HECM)中清洗，如Seshagine等，Biol.Reprod.40544-606(1989)中所述，然后在39℃，將其置于由含有10％胎牛血清的50μl組織培養(yǎng)基(TCM)199組成的成熟培養(yǎng)基液滴中，該培養(yǎng)基處在一層輕石蠟或硅油之下，并進(jìn)一步含有適當(dāng)促性腺激素如黃體生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)，和雌二醇。
經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的成熟期后，該成熟期范圍為從約10到約40小時(shí)，優(yōu)選16-18小時(shí)，卵母細(xì)胞將被去核。在去核之前，卵母細(xì)胞優(yōu)選被分離并在移去丘細(xì)胞之前置于含有1mg/ml透明質(zhì)酸酶的HECM中。這可通過(guò)從很細(xì)的吸液管反復(fù)吹打或通過(guò)簡(jiǎn)單渦旋進(jìn)行。然后從剝離的卵母細(xì)胞中篩選極體，然后選出的中期II卵母細(xì)胞，正如極體的存在所確定的，用于核轉(zhuǎn)移。
細(xì)胞去核的方法。去核可用已知的方法完成，例如在U.S.Patent No.4,994,384中所述，該文獻(xiàn)在此列入作為參考文獻(xiàn)。例如將中期II卵母細(xì)胞置于可選含有7.5μl/ml細(xì)胞松弛素B的HECM中，以進(jìn)行立即去核，或者將其置于合適的培養(yǎng)基中如胚胎培養(yǎng)基，如CR1 aa(CR1培養(yǎng)基在U.S.Patent No.5,096,822中描述。CR1 aa以氨基酸進(jìn)行補(bǔ)充)，加入10％發(fā)情期母牛血清，然后遲些時(shí)間優(yōu)選不超過(guò)24小時(shí)之后，更優(yōu)選16-18小時(shí)之后，進(jìn)行去核。
去核可通過(guò)使用微量加樣器除去極體和鄰接的細(xì)胞質(zhì)以顯微手術(shù)方式進(jìn)行。卵母細(xì)胞可被篩選以鑒定那些已成功去核的細(xì)胞。這種篩選可這樣實(shí)施用1μg/ml 33342 Hoechst染料在HECM中對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行染色，然后在紫外光下觀(guān)察卵母細(xì)胞少于10秒鐘。成功去核的卵母細(xì)胞可被置于合適的培養(yǎng)基如補(bǔ)充10％血清的CR1aa培養(yǎng)基中。
在本發(fā)明中受體卵母細(xì)胞優(yōu)選在體外成熟起始后約10小時(shí)到約40小時(shí)，更優(yōu)選在體外成熟起始后約16小時(shí)到24小時(shí)，最優(yōu)選在體外成熟起始后約16-18小時(shí)的時(shí)間范圍內(nèi)被去核。
相同物種或不同物種哺乳動(dòng)物的單個(gè)體細(xì)胞將被轉(zhuǎn)移到用于產(chǎn)生NT單元的卵母細(xì)胞的卵周隙中。最近，有報(bào)道稱(chēng)轉(zhuǎn)移guar細(xì)胞到去核的牛卵母細(xì)胞產(chǎn)生了能存活的胚胎(Scientific American Lonza等，October2000)。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，哺乳動(dòng)物細(xì)胞和卵母細(xì)胞將用于產(chǎn)生NT單元。例如，細(xì)胞可用電融合進(jìn)行融合。電融合可通過(guò)提供大得足夠致使胞質(zhì)膜瞬間損壞的電脈沖來(lái)實(shí)現(xiàn)。這種胞質(zhì)膜的損壞是非常短暫的，因?yàn)槟ず芸熘匦滦纬?。這樣，如果兩種鄰接的膜被損壞，然后在重新形成脂雙層時(shí)，將會(huì)在兩個(gè)細(xì)胞之間打開(kāi)小通道。由于這種小通道的熱不穩(wěn)定性，它將不斷擴(kuò)大直至兩個(gè)細(xì)胞變?yōu)橐粋€(gè)。參考Prather等的U.S.Patent 4,997,384(在此其全部被列入作為參考)進(jìn)一步討論了該方法。可使用各種電融合介質(zhì)，包括如蔗糖，甘露糖醇，山梨糖醇和磷酸鹽緩沖溶液。融合可使用仙臺(tái)(Senclai)病毒作為融合劑(Graham，WistarInst.Symp.Monogr.919(1969))來(lái)完成。
同樣，在某些情況下(如對(duì)小供體核)，可優(yōu)選將核酸直接注射到卵母細(xì)胞中而不使用電融合。這種技術(shù)在Collas等，Mol.Reprod.Dev.38264-267(1994)中公開(kāi)，在此全部列入作為參考。
優(yōu)選地，在卵母細(xì)胞成熟起始后約24小時(shí)，體細(xì)胞或生殖細(xì)胞和卵母細(xì)胞在500p.m室內(nèi)應(yīng)用約90-120V的電脈沖融合15微秒。融和后，得到的NT單元被置于合適的培養(yǎng)基如CR1aa培養(yǎng)基中直到激活。典型的激活可在其后短時(shí)間內(nèi)，通常短于24小時(shí)后完成，優(yōu)選在約4-9小時(shí)后完成。
NT單元可通過(guò)已知的方法激活。這些方法包括如在亞生理學(xué)溫度下培養(yǎng)NT單元，基本上是給NT單元應(yīng)用冷或?qū)嶋H上涼的溫度休克。這可通過(guò)在室溫下培養(yǎng)NT單元簡(jiǎn)便地完成，室溫相對(duì)于胚胎通常所處的生理學(xué)溫度條件要冷些。
可供替代的，激活可通過(guò)使用已知的激活劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如在受精期間卵母細(xì)胞的精子滲透已顯示出可激活融合前卵母細(xì)胞以在核轉(zhuǎn)移后產(chǎn)生更大數(shù)量的存活受孕和遺傳相同的多個(gè)小牛。同樣，電休克和化學(xué)休克等處理也可激活融合后的NT胚胎。合適的卵母細(xì)胞激活方法已在U.S.Patent No.5,496,720中由Susko-Parrish等進(jìn)行了研究，在此將其全部列入作為參考。
此外，激活可通過(guò)同時(shí)或相繼(i)增加卵母細(xì)胞中二價(jià)陽(yáng)離子水平，以及(ii) 減少卵母細(xì)胞中細(xì)胞蛋白的磷酸化，來(lái)實(shí)現(xiàn)。
這可通過(guò)向卵母細(xì)胞胞質(zhì)中導(dǎo)入二價(jià)陽(yáng)離子例如鎂，鍶，鋇或鈣，例如以離子載體的形式，來(lái)完成。其它增加二價(jià)陽(yáng)離子水平的方法包括使用電休克，用乙醇處理和用籠形螯合劑處理。
磷酸化作用可用已知的方法減少，例如通過(guò)加入激酶抑制劑(例如絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑，如6-二甲基氨基嘌呤，星形孢菌素，2-氨基嘌呤和鞘氨醇)。
可供替代的，細(xì)胞蛋白的磷酸化還可通過(guò)向卵母細(xì)胞中加入磷酸酶來(lái)抑制，如磷酸酶2A和磷酸酶2B。
在一個(gè)實(shí)施方案中，NT激活通過(guò)簡(jiǎn)單地將融合的NT單元暴露在含有5μM離子霉素和1mg/mlBSA的TL-HEPES培養(yǎng)基中，然后在融和后約24小時(shí)內(nèi)，優(yōu)選在融合后約4到約9小時(shí)，將其在含有30mg/ml的BSA的TL-HEPES培養(yǎng)基中清洗，來(lái)實(shí)現(xiàn)。
激活的NT單元可在適合的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)，直到產(chǎn)生培養(yǎng)的內(nèi)細(xì)胞群(CICM)細(xì)胞和細(xì)胞集落。適于培養(yǎng)和成熟胚胎的培養(yǎng)基在本領(lǐng)域中已知。已知可用于牛胚胎培養(yǎng)和維持的培養(yǎng)基包括Ham’s F-10+10％胎牛血清(FCS)，補(bǔ)充10％胎牛血清的組織培養(yǎng)培養(yǎng)基199(TCM-199)，Tyrodes-白蛋白-乳酸鹽-丙酮酸鹽(TALP)(Tyrodes-Albumin-Lactate-Pyruvate)，Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液(PBS)，Eagle’s和Whitten’s培養(yǎng)基。一種用于收集和成熟卵母細(xì)胞的普通培養(yǎng)基是TCM-199，補(bǔ)充1-20％FCS，新生動(dòng)物血清，發(fā)情期母牛血清，羊羔血清或去勢(shì)牛血清。優(yōu)選的維持培養(yǎng)基包括含有Earl鹽，10％胎牛血清，0.2mM丙酮酸鈉和50μm/ml慶大霉素硫酸鹽的TCM-199。上述任一種還可包括共同培養(yǎng)各種細(xì)胞類(lèi)型，例如顆粒細(xì)胞，輸卵管細(xì)胞，BRL細(xì)胞和子宮細(xì)胞和STO細(xì)胞。
另一種維持培養(yǎng)基在Rosenkrans的U.S.Patent No.5,096,822中有描述，在此將其列入作為參考。這種胚胎培養(yǎng)基，命名為CR1，含有維持胚胎所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。
例如，激活的NT單元可轉(zhuǎn)入含有2.0mM DMAP(Sigma)的CR1aa培養(yǎng)基中，并在環(huán)境條件下培養(yǎng)，例如約38.5℃，5％CO2，適合的時(shí)間如約4到約5小時(shí)。
然后，優(yōu)選清洗培養(yǎng)的NT單元，然后置于合適的培養(yǎng)基中，如含有10％FCS和6mg/ml含有20在孔平板中的CR1aa培養(yǎng)基，該平板優(yōu)選包含適當(dāng)?shù)膮R合飼養(yǎng)層。合適的飼養(yǎng)層包括，舉例來(lái)說(shuō)，成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞，如來(lái)源于有蹄類(lèi)的成纖維細(xì)胞和子宮上皮細(xì)胞，雞成纖維細(xì)胞，鼠(如小鼠或大鼠)成纖維細(xì)胞，STO和SI-m220飼養(yǎng)細(xì)胞系和BRL細(xì)胞。
胚胎轉(zhuǎn)移的方法和受體動(dòng)物的管理在本發(fā)明中是胚胎轉(zhuǎn)移工業(yè)中使用的標(biāo)準(zhǔn)方法。同步的轉(zhuǎn)移對(duì)于本發(fā)明的成功是重要的，即，NT胚胎的階段與雌性受體動(dòng)物的發(fā)情周期是同步的。這一點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)和如何維持受體在Seidel，“Cricial review of embryo transfer procedure withcattle”，F(xiàn)ERTILIZATION AND EMBRYONIC DEVELOPMENT IN VITRO(LMastroianni，Jr等編.Plenum Press，New York，NY，1981)中回顧，在此將其列入作為參考。
本發(fā)明還可用于克隆基因工程的或轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。如上所述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于轉(zhuǎn)基因方法可以通過(guò)使用體細(xì)胞來(lái)源而簡(jiǎn)化，該體細(xì)胞源可被克隆繁殖。尤其的，供體核所用的體細(xì)胞，可以是血清饑餓或非血清饑餓的，具有插入，缺失或修飾的目的DNA序列。然后這些遺傳改變后的體細(xì)胞將和卵母細(xì)胞用于核移植。
任何已知的插入，缺失或修飾哺乳動(dòng)物細(xì)胞目的DNA序列的方法都可用于改變將用作核供體的體細(xì)胞。這些方法可以去除DNA序列的全部或部分，而且該DNA序列可以是異源的。還包括同源重組的技術(shù)，其可允許在細(xì)胞基因組特異的一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行一段DNA序列或幾段序列的插入，缺失或修飾。一個(gè)優(yōu)選的方法是正/負(fù)篩選方法，其由Capecchi申請(qǐng)了專(zhuān)利(U.S.Patent No.5,631,153，5,627,059和5,847,982)，或在U.S.Patent No.6,110,735；5,948,653；5,925,577；5,830,698；5,776,777；5,763,290；5,574,205和5,527,644中所述的載體，將以上文獻(xiàn)全文列入作為參考。
本發(fā)明還可用于提供帶有目的基因型的成年動(dòng)物，例如母牛。帶有證實(shí)的遺傳優(yōu)越性或其它目的性狀的成年動(dòng)物的增殖是十分有用的，這包括轉(zhuǎn)基因或基因工程的動(dòng)物和嵌合動(dòng)物。這樣，本發(fā)明將可以產(chǎn)生單性別后代，并產(chǎn)生具有改進(jìn)的肉生產(chǎn)，繁殖性狀和/或疾病抗性的動(dòng)物。進(jìn)一步的，來(lái)自NT胎兒的細(xì)胞和組織，包括轉(zhuǎn)基因和/或嵌合胎兒，如下所述，結(jié)合使用CICM細(xì)胞，可用于治療多種疾病的細(xì)胞、組織和器官移植中。因此，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有多種用途，包括疾病模型，外源移植細(xì)胞或器官，以及產(chǎn)生藥用蛋白。
為產(chǎn)生CICM細(xì)胞和細(xì)胞系，在促進(jìn)細(xì)胞分裂而不分化的條件下培養(yǎng)激活的NT單元。當(dāng)NT單元已培養(yǎng)到所需的大小時(shí)，采用機(jī)械方法從透明帶中分離出細(xì)胞，然后投入使用。這可優(yōu)選通過(guò)如下方式完成取出包含培養(yǎng)的NT單元(其典型地含有至少約50個(gè)細(xì)胞)的細(xì)胞團(tuán)，清洗這些細(xì)胞，并將其在飼養(yǎng)層(如射線(xiàn)照射的成纖維細(xì)胞)上平板培養(yǎng)。典型的，用于制備干細(xì)胞或細(xì)胞集落的細(xì)胞將從培養(yǎng)的NT單元內(nèi)的大部分中得到，NT單元優(yōu)選的大小是含有至少50個(gè)細(xì)胞。但是，具有更少或更多細(xì)胞的培養(yǎng)NT單元以及從培養(yǎng)NT單元其它部分得到的細(xì)胞也可用于獲得ES細(xì)胞和細(xì)胞集落。這些細(xì)胞在飼養(yǎng)層上適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基如補(bǔ)充10％FCS和0.1mMβ-巰基乙醇(Sigma)和L-谷氨酰胺的alpha MEM中維持。生長(zhǎng)培養(yǎng)基盡可能經(jīng)常更換以?xún)?yōu)化生長(zhǎng)，如約每2-3天更換。
這種培養(yǎng)方法導(dǎo)致CICM細(xì)胞或細(xì)胞系的形成。本領(lǐng)域技術(shù)人員可按特定CICM細(xì)胞最適生長(zhǎng)的需要改變培養(yǎng)條件。同樣，例如，基因工程或轉(zhuǎn)基因母牛CICM細(xì)胞可按本發(fā)明的方法產(chǎn)生。那即是說(shuō)，上述方法可用于生產(chǎn)這類(lèi)NT單元，該單元已導(dǎo)入一段或幾段目的DNA序列，或者該單元中已去除或修飾了一段或幾段內(nèi)源DNA序列。這些基因工程或轉(zhuǎn)基因NT單元可用作產(chǎn)生基因工程或轉(zhuǎn)基因CICM細(xì)胞。
這樣得到的CICM細(xì)胞和細(xì)胞系具有很多治療和診斷應(yīng)用。最特別的是，這樣的CICM細(xì)胞可用作細(xì)胞移植治療。
在這個(gè)方面，已知小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞能夠分化成幾乎所有的細(xì)胞類(lèi)型，如造血干細(xì)胞。所以，本發(fā)明制備的CICM細(xì)胞應(yīng)當(dāng)具有類(lèi)似的分化能力。根據(jù)已知的方法，本發(fā)明的CICM細(xì)胞可經(jīng)誘導(dǎo)分化得到目的細(xì)胞類(lèi)型。例如，通過(guò)在分化培養(yǎng)基中和細(xì)胞分化所需條件下培養(yǎng)CICM細(xì)胞，目的母牛CICM細(xì)胞可誘導(dǎo)分化成造血干細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞，肝臟細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，上皮細(xì)胞，尿道細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞等。導(dǎo)致CICM細(xì)胞分化的培養(yǎng)基和方法以及合適的培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域內(nèi)公知技術(shù)。
例如，Palacios等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927530-7(1995)介紹了通過(guò)將干細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)方法，從胚胎細(xì)胞系產(chǎn)生造血干細(xì)胞，該誘導(dǎo)方法包括在缺乏視黃酸的懸浮培養(yǎng)基中開(kāi)始培養(yǎng)這些細(xì)胞聚集物，然后在含有視黃酸的相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將細(xì)胞聚集物轉(zhuǎn)移到一種可提供細(xì)胞黏附的基質(zhì)中。
而且，Pedersen，J.Reprod.Feti l.Dev.6543-552(1994)，一篇評(píng)論文章，引用了大量文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)公開(kāi)了體外分化胚胎干細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生不同分化了的細(xì)胞類(lèi)型的方法，其中包括細(xì)胞造血細(xì)胞，肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞。這些文獻(xiàn)特別是其中涉及分化胚胎干細(xì)胞的方法的公開(kāi)在此將其全文列入作為參考。
這樣，使用已知的方法和培養(yǎng)基，本領(lǐng)域技術(shù)人員可培養(yǎng)目的體細(xì)胞和利用體細(xì)胞核制備得到的細(xì)胞，來(lái)獲得用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因或嵌合動(dòng)物的細(xì)胞。
本發(fā)明已通過(guò)優(yōu)選實(shí)施方式來(lái)說(shuō)明。但是，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可在不脫離本發(fā)明精神的原則下，將本發(fā)明以不同于上述形式的具體形式實(shí)施。下述實(shí)施例是用于說(shuō)明而不能將本發(fā)明保護(hù)范圍限于此。本發(fā)明的保護(hù)范圍由附加的權(quán)利要求書(shū)說(shuō)明，而不是由前述的說(shuō)明限定，所有落入權(quán)利要求范圍的變化或替換均屬本發(fā)明保護(hù)范圍。
實(shí)施例1匯合和細(xì)胞年齡對(duì)于細(xì)胞周期長(zhǎng)度的影響建立胎兒細(xì)胞系 從屠宰場(chǎng)得到牛胎兒，測(cè)量其頂臀長(zhǎng)度。在洗液(含有抗生素/抗真菌劑(Sigma)和二性霉素(Gibco)的DPBS)中清洗后，去除頭部和內(nèi)部器官，剩余的組織用解剖刀分成細(xì)小塊狀。通過(guò)將組織塊沉到50ml試管底部再去除上清液的方法使其在洗液中清洗2次。向組織塊加入30-40ml含有0.08％胰蛋白酶(Difco)和0.02％EDTA(Sigma)的PBS(Gibco)溶液，在39℃，5％CO2條件下培養(yǎng)組織塊30min。每間隔30mm，小心移出上清液，在另一試管中以300×g離心5mm。然后去除上清液，分離出組織塊，再另外加入30-40ml含有0.08％胰蛋白酶和0.02％EDTA的PBS溶液，再在39℃，5％CO2條件下培養(yǎng)組織塊30min。小心移出上清液將組織塊保留在50ml試管中；再向組織塊中加入等體積的補(bǔ)允了10％FCS(胎牛血清，Hyclone)，谷氨酰胺(Sigma)，巰基乙醇(Gibco)和抗生素/抗真菌劑的alpha MEM(Gibco)，將組織塊以1,000×g離心5分鐘。小心吸出上清液分離沉淀。在補(bǔ)充了上述組分的alpha MEM中重懸浮組織塊，在100mm組織培養(yǎng)皿(Coming)上接種，39℃，5％CO2條件下培養(yǎng)。組織塊再用含有胰蛋白酶-EDTA的PBS溶液培養(yǎng)，收集上清，并如上所述接種細(xì)胞。接種的第三天，使用胰蛋白酶-EDTA溶液收集細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。選出1百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，在100mm組織培養(yǎng)皿上再接種，剩余的細(xì)胞冷凍在含有10％DMSO(Sigma)的alpha MEM中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可同樣制備其它類(lèi)似的貼壁細(xì)胞。
建立小牛和成熟細(xì)胞系 通過(guò)修剪皮毛以及消毒液清洗以徹底清潔皮膚表面后在耳朵上打孔(1mm)。耳打孔樣品用洗液清洗3遍，分離出皮膚外層和內(nèi)層表面之間的軟骨部分。樣品轉(zhuǎn)移到100mm組織培養(yǎng)皿上，用載玻片覆蓋以防止其在培養(yǎng)基中飄浮。制得該外植體后，加入10ml補(bǔ)充了建立胎牛細(xì)胞系(上述)中所用組分的alpha MEM，并在39℃，5％CO2條件下培養(yǎng)。在第10天分離出外植塊后，使用含0.08％胰蛋白酶和0.02％EDTA的PBS溶液收集單層細(xì)胞，計(jì)數(shù)并在100mm組織培養(yǎng)皿中重接種。
群體倍增和細(xì)胞計(jì)數(shù)初次接種后，當(dāng)細(xì)胞有90％匯合時(shí)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶作用方法使用20 0.08％胰蛋白酶和0.02％EDTA的PBS溶液計(jì)數(shù)細(xì)胞。收集的細(xì)胞以1000×g離心5分鐘，細(xì)胞沉淀在10ml alpha MEM中重懸浮。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)合適的細(xì)胞樣品。當(dāng)這些培養(yǎng)物達(dá)到95％的匯合時(shí)，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，計(jì)算其群體倍增時(shí)間。重復(fù)該方法直到這些細(xì)胞衰老。在收集過(guò)程和重接種步驟中得到的過(guò)量細(xì)胞冷凍在補(bǔ)充的alpha MEM和10％DMSO(Sigma)中，在液氮中保存。
細(xì)胞固定，染色和流式細(xì)胞術(shù) 比較不同匯合度細(xì)胞的細(xì)胞周期(圖1)。細(xì)胞經(jīng)過(guò)在70％乙醇中的過(guò)夜固定后，用冷的PBS徹底清洗細(xì)胞，再用10RNase處理，接下來(lái)在37℃孵育2-3hrs。孵育后，用propedium碘化物(Sigma)染色。
分離分裂的G1期細(xì)胞 在“振蕩分離”前24小時(shí)，5.0×105的細(xì)胞接種于含有10ml補(bǔ)充了10％FCS的alpha MEM的100mm Corning組織培養(yǎng)皿中。第二天用PBS清洗平皿，在振蕩分離前約1到約2小時(shí)替換培養(yǎng)基。將這些平皿渦旋30-60秒，取出培養(yǎng)基并離心，將細(xì)胞沉淀在250μl培養(yǎng)基中重懸浮。
通過(guò)胞質(zhì)橋連接的細(xì)胞剛剛經(jīng)歷胞質(zhì)分裂，處于早G1期。在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，這些早G1期細(xì)胞基于這個(gè)特性被鑒定出(通過(guò)目測(cè)法)并投入使用。
G1期雙聯(lián)體的Bdru標(biāo)記G1期雙聯(lián)體細(xì)胞置于含有250μl補(bǔ)充了溴脫氧尿苷(Bdru)(Boehringer Mannheim)alpha MEM的Lab-Tek4孔培養(yǎng)室(Nunc)中。在0，2，4，和7小時(shí)，用70％的乙醇(在50mM甘氨酸緩沖液中，pH2.0)固定細(xì)胞約20分鐘。固定后，清洗細(xì)胞，用抗Bdru在37℃孵育30min。30min后，清洗細(xì)胞，并加入抗鼠Ig熒光素；然后將固定的細(xì)胞在37℃再孵育另外的30分鐘。在再次孵育之后，清洗固定的細(xì)胞，再用甘油封固。使用落射熒光顯微鏡(Nikon)鑒定處在S期細(xì)胞所占的百分比。
細(xì)胞周期長(zhǎng)度的評(píng)定使用25μm的傾斜針通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)顯微操作分離出G1期雙聯(lián)體。單個(gè)的雙聯(lián)體轉(zhuǎn)移到50A4滴來(lái)源于成纖維細(xì)胞活躍分裂培養(yǎng)物的補(bǔ)充了10％FCS的alpha MEM(條件培養(yǎng)基)中。摘下(Pick-off)的時(shí)間計(jì)為0小時(shí)，此后每2個(gè)小時(shí)評(píng)定分離的雙聯(lián)體的細(xì)胞分裂程度。每個(gè)培養(yǎng)皿評(píng)定10微滴，在24小時(shí)內(nèi)分裂的細(xì)胞所占比例用于計(jì)算平均細(xì)胞周期長(zhǎng)度。
圖1的結(jié)果是通過(guò)測(cè)量90％匯合細(xì)胞對(duì)25％匯合細(xì)胞的細(xì)胞周期長(zhǎng)度得到的。得到細(xì)胞，如上所述進(jìn)行接種。在多數(shù)情況下，25％匯合度的細(xì)胞其細(xì)胞周期長(zhǎng)度短于90％匯合度的細(xì)胞細(xì)胞周期長(zhǎng)度。
實(shí)施例2培養(yǎng)時(shí)間和供體年齡對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速率的影響圖2說(shuō)明上述制備得到的細(xì)胞其培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，導(dǎo)致每天群體分裂或倍增數(shù)目(PD/DY)減少。
實(shí)施例3培養(yǎng)物回收的成纖維細(xì)胞的G1期長(zhǎng)度成纖維細(xì)胞按實(shí)施例1所述制備，培養(yǎng)，收集。圖3顯示在采取(pick-off)后從培養(yǎng)物中回收的成纖維細(xì)胞的G1期長(zhǎng)度。
實(shí)施例4在低匯合度下使用細(xì)胞振蕩分離和篩選有絲分裂雙聯(lián)體細(xì)胞制備用于核轉(zhuǎn)移的體細(xì)胞按以上實(shí)施例1中所述制備用于核移植的細(xì)胞。
核移植 用1.0％透明質(zhì)酸酶在18hpm在體外剝離成熟的卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞在TL-hepes中清洗，然后用Hoescht 33342(Sigma)染色20min。使用18-20μm傾斜針去除細(xì)胞核。用Uv光確定核的去除。在24小時(shí)，供體細(xì)胞使用20μm傾斜針進(jìn)行轉(zhuǎn)移，在以山梨醇作基礎(chǔ)的培養(yǎng)基中使用115mv電脈沖融合20sec(Electrocell manipulator 200，Sam Diego，CA)。
激活在28hpm，使用一種Ca離子載體(5mM)(Cal Biochem)處理重建的卵母細(xì)胞和對(duì)照4min并用DMAP(200mm)處理3.5小時(shí)使其化學(xué)激活。在激活后3.5小時(shí)，卵母細(xì)胞在HCEM hepes中簡(jiǎn)單清洗并轉(zhuǎn)入培養(yǎng)。
在體外培養(yǎng)核轉(zhuǎn)移胚胎 在含有小鼠阻斷飼養(yǎng)層和0.5ml覆蓋有200μl胚胎測(cè)試礦物油(Sigma)的培養(yǎng)基的4-孔組織培養(yǎng)皿(Munc)中進(jìn)行胚胎的培養(yǎng)。25-50個(gè)胚胎被置于每一個(gè)孔中，在39℃，5％CO2條件下培養(yǎng)。在第四天，向培養(yǎng)基中加入10％FCS。在第7和第8天，記錄向胚泡的發(fā)育(development to blastocyst was 10 recorded)。使用在甘油中的1％ Hoechst(Sigma)封固細(xì)胞，描述細(xì)胞數(shù)目。
應(yīng)用的供體體細(xì)胞優(yōu)選任何一種貼壁細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員也知悉可以替換和使用其它類(lèi)似的方法和材料。
實(shí)施例5在低匯合度下采用細(xì)胞振蕩分離和有絲分裂雙聯(lián)體篩選制備用于核轉(zhuǎn)移的體細(xì)胞以及使用冷卻步驟延長(zhǎng)G1期如上所述，通過(guò)將細(xì)胞置于4℃和進(jìn)行核轉(zhuǎn)移步驟可延長(zhǎng)體細(xì)胞的G1期。
實(shí)施例6結(jié)合血清饑餓采用有絲分裂振蕩分離以及雙聯(lián)體細(xì)胞篩選制備用于核移植的供體體細(xì)胞以上所用的方法和材料可以與某些試劑結(jié)合使用，這些試劑使細(xì)胞同步化在G1期，例如某些激酶抑制劑(如KT5720，KT5823或KT5926)。細(xì)胞可通過(guò)上述的振蕩分離制備得到。然后細(xì)胞可在含有激酶抑制劑的培養(yǎng)基中重懸浮，激酶抑制劑可以下述任一種濃度存在KT5720約11μM，KT5823約15μM，KT5926約3μM或K2526約11μM。如果需要進(jìn)一步延長(zhǎng)G1期，可通過(guò)將細(xì)胞置于4℃進(jìn)一步延長(zhǎng)G1期。然后細(xì)胞可如前述進(jìn)行應(yīng)用。
在此所有的參考文獻(xiàn)全文列入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種篩選和使用供體體細(xì)胞用于核轉(zhuǎn)移或核移植的方法，包括步驟(A)通過(guò)用機(jī)械方式將細(xì)胞從培養(yǎng)皿表面脫落使供體體細(xì)胞的細(xì)胞周期同步化；(B)篩選雙聯(lián)體體細(xì)胞；以及(C)在核轉(zhuǎn)移或核移植中使用所述選出的細(xì)胞或所述雙聯(lián)體體細(xì)胞的細(xì)胞核。
2.一種制備供體體細(xì)胞用于核轉(zhuǎn)移或核移植的方法，包括步驟(A)獲得約25％到約50％匯合的細(xì)胞并平板培養(yǎng)細(xì)胞約24小時(shí)至同步化步驟；(B)通過(guò)用機(jī)械方式將細(xì)胞從培養(yǎng)皿表面脫落使供體體細(xì)胞的細(xì)胞周期同步化；(C)篩選雙聯(lián)體體細(xì)胞；以及(D)在核轉(zhuǎn)移或核移植中使用雙聯(lián)體體細(xì)胞的細(xì)胞核。
3.一種制備供體體細(xì)胞用于核轉(zhuǎn)移或核移植的方法，包括步驟(A)獲得匯合細(xì)胞并將其在平板培養(yǎng)約24小時(shí)至同步化步驟；(B)通過(guò)用機(jī)械方式將細(xì)胞從培養(yǎng)皿表面脫落使供體體細(xì)胞的細(xì)胞周期同步化；(C)篩選雙聯(lián)體體細(xì)胞；以及(D)在核轉(zhuǎn)移或核移植中使用雙聯(lián)體體細(xì)胞的細(xì)胞核。
4.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括冷卻選出的有絲分裂雙聯(lián)體細(xì)胞以延長(zhǎng)它們的G1期的步驟。
5.權(quán)利要求4的方法，其中細(xì)胞冷卻到4℃。
6.權(quán)利要求1的方法，其中選出的細(xì)胞接下來(lái)在缺乏至少一種下述物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)血清，異亮氨酸，谷氨酰胺或磷酸鹽。
7.權(quán)利要求1的方法，其中向所述選出細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入G1期同步化試劑以延長(zhǎng)它們的G1期。
8.權(quán)利要求7的方法，其中G1期同步化試劑選自蚜棲菌素，含羞草氨酸，KT5823，KT5720，KT5926和K252b。
9.權(quán)利要求1的方法，其中當(dāng)細(xì)胞為約20％到約50％匯合時(shí)使用機(jī)械方式使細(xì)胞脫落。
10.權(quán)利要求9的方法，其中當(dāng)細(xì)胞為約25％匯合時(shí)振蕩細(xì)胞。
11.權(quán)利要求1的方法，其中當(dāng)細(xì)胞匯合時(shí)使用機(jī)械方式使細(xì)胞脫落。
12.一種制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，包括步驟(A)根據(jù)權(quán)利要求1制備供體體細(xì)胞；(B)從所述選出的體細(xì)胞中分離細(xì)胞核；(C)在適于形成核轉(zhuǎn)移(NT)單元的條件下，將細(xì)胞核插入至少一個(gè)去核的胚胎干(ES)細(xì)胞，胚胎生殖(EG)細(xì)胞，去核胚胎，或去核體細(xì)胞中，以產(chǎn)生融合的NT；(D)激活所述融合的NT單元，產(chǎn)生激活了的NT單元；以及(E)將所述激活了的NT單元轉(zhuǎn)移至宿主哺乳動(dòng)物中，使激活了的NT單元發(fā)育成胎兒。
13.一種制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，包括步驟(A)根據(jù)權(quán)利要求1制備體細(xì)胞；(B)從所述選出的體細(xì)胞中分離細(xì)胞核；(C)在適于形成核轉(zhuǎn)移(NT)單元的條件下，將細(xì)胞核插入到去核的卵母細(xì)胞，去核的精子，去核的胚胎，或去核的體細(xì)胞中，以產(chǎn)生融合的NT單元；(D)激活所述融合的NT單元，產(chǎn)生激活了的NT單元；以及(E)將所述激活了的NT單元轉(zhuǎn)移至宿主哺乳動(dòng)物中，使激活了的NT單元發(fā)育成胎兒。
14.一種制備嵌合動(dòng)物的方法，包括步驟(A)根據(jù)權(quán)利要求1制備體細(xì)胞；(B)從所述選出的體細(xì)胞中分離細(xì)胞核；(C)在適于形成核轉(zhuǎn)移(NT)單元的條件下，將細(xì)胞核插入至少一個(gè)去核的ES細(xì)胞或去核的EG細(xì)胞中，以產(chǎn)生融合的NT單元；(D)激活所述融合的NT單元，產(chǎn)生激活了的NT單元；以及(E)將所述激活了的NT單元插入至宿主哺乳動(dòng)物胚胎中，使該胚胎發(fā)育成胎兒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種將體細(xì)胞群體同步化在G
文檔編號(hào)C12N15/85GK1399513SQ00815685
公開(kāi)日2003年2月26日 申請(qǐng)日期2000年10月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月14日
發(fā)明者J·M·羅伯爾, K·普特哈普萊, J·G·科諾特, J·D·杰麗 申請(qǐng)人:馬薩諸塞大學(xué)