一種豬胎兒成纖維細(xì)胞的單細(xì)胞培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種豬胎兒成纖維細(xì)胞的單細(xì)胞培養(yǎng)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中國(guó)是世界上養(yǎng)豬規(guī)模最大的國(guó)家，但豬生產(chǎn)水平遠(yuǎn)低于歐美養(yǎng)豬發(fā)達(dá)國(guó)家。短 期內(nèi)傳統(tǒng)的育種手段很難在豬生產(chǎn)性能方面取得大的進(jìn)展，但是轉(zhuǎn)基因技術(shù)打破了遠(yuǎn)緣有 性雜交的束縛，實(shí)現(xiàn)了不同物種生物體之間的基因交流，從而可以最大限度的利用和創(chuàng)造 遺傳變異，改良家畜的性狀，創(chuàng)造新的家畜品種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物為豬遺傳育種提供了新的技術(shù) 手段，可大大加速遺傳改良的速度，尤其是轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植技術(shù)的出現(xiàn)，為轉(zhuǎn)基因技術(shù) 在豬改良育種中的應(yīng)用提供了技術(shù)支撐。
[0003] 豬胎兒成纖維細(xì)胞是豬體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因克隆的重要工具細(xì)胞，目前用于豬轉(zhuǎn)基因克 隆的胎兒成纖維細(xì)胞是原代培養(yǎng)分離的混合胎兒體細(xì)胞系。在該混合細(xì)胞系中基因組中通 過(guò)轉(zhuǎn)染隨機(jī)插入帶有篩選標(biāo)記的外源基因，經(jīng)過(guò)加壓篩選獲得具有唯一篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因 混合細(xì)胞。
[0004] 但是，采用上述混合細(xì)胞系經(jīng)加壓篩選獲得的細(xì)胞具有一定的缺陷：一方面由于 加壓篩選只能得到具有篩選標(biāo)記的細(xì)胞，與其基因組的均一性無(wú)關(guān)，再將這些經(jīng)過(guò)隨機(jī)重 組的混合細(xì)胞分別通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)轉(zhuǎn)入受體卵細(xì)胞中進(jìn)行個(gè)體激活發(fā)育，得到的個(gè) 體將是具有不同重組位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因豬。另一方面定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因的脫靶效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致即使基因組 完全一致的細(xì)胞，產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)基因的可能，而這種混合細(xì)胞的體細(xì)胞克隆產(chǎn)生的后代將嚴(yán) 重不均一，可能有這樣或者那樣的表型，甚至達(dá)不到轉(zhuǎn)基因的效果，沒(méi)有任何新表型。
[0005] 因此，建立一種有效的胎兒成纖維細(xì)胞單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)將有利于提高轉(zhuǎn)基因豬的 特異性，有利于轉(zhuǎn)基因豬克隆效率的評(píng)價(jià)，以及特定均一轉(zhuǎn)基因豬品系的建立。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明提供了 一種成纖維細(xì)胞的單細(xì)胞培養(yǎng)方法。該單細(xì)胞培養(yǎng)方法 獲得的克隆細(xì)胞基因組完全一致，有利于提高轉(zhuǎn)基因豬的特異性，有利于轉(zhuǎn)基因豬克隆效 率的評(píng)價(jià)，以及特定均一轉(zhuǎn)基因豬品系的建立；本發(fā)明提供的單細(xì)胞培養(yǎng)方法獲得的克隆 細(xì)胞無(wú)需進(jìn)行加壓篩選，因此，可簡(jiǎn)化轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)工作。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種成纖維細(xì)胞的單細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0009] 步驟A:獲得成纖維細(xì)胞懸液和飼養(yǎng)層細(xì)胞；
[0010] 步驟B:將飼養(yǎng)層細(xì)胞以微滴形式接種至培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至飼養(yǎng)層細(xì)胞密度在微滴 內(nèi)100%匯合，獲得飼養(yǎng)層細(xì)胞微滴；
[0011] 步驟C:將成纖維細(xì)胞懸液接種至具有飼養(yǎng)層細(xì)胞微滴的培養(yǎng)皿，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，獲 得單細(xì)胞克隆。
[0012] 在本發(fā)明中，由于飼養(yǎng)層細(xì)胞微滴既能夠提供細(xì)胞因子，又占用少量培養(yǎng)皿面積， 達(dá)到了既能給成纖維細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的良好培養(yǎng)環(huán)境，又能保證有足夠的空間供成纖維 細(xì)胞增殖形成獨(dú)立的優(yōu)質(zhì)細(xì)胞克隆的目的，從而有利于單細(xì)胞克隆的獲得，可用于均一、無(wú) 篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)。
[0013] 作為優(yōu)選，成纖維細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度為5~10個(gè)/mL。
[0014] 作為優(yōu)選，成纖維細(xì)胞懸液的接種量為10~15mL/皿。
[0015] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，步驟C中細(xì)胞培養(yǎng)為38°C、5% 0)2恒溫培養(yǎng)8~ 11天。
[0016] 作為優(yōu)選，飼養(yǎng)層細(xì)胞的接種量為300~500yL/微滴。
[0017] 作為優(yōu)選，飼養(yǎng)層細(xì)胞微滴在培養(yǎng)皿中的密度為10~12個(gè)/皿。
[0018] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，步驟B中飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)條件為37°C、5%C02 恒溫培養(yǎng)。
[0019] 作為優(yōu)選，成纖維細(xì)胞為3代以內(nèi)的成纖維細(xì)胞。
[0020] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，成纖維細(xì)胞為豬胚胎成纖維細(xì)胞。但成纖維細(xì)胞 的來(lái)源并非限定于此，其它動(dòng)物來(lái)源的成纖維細(xì)胞的單細(xì)胞培養(yǎng)同樣適用于本發(fā)明。
[0021] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備方法為：取胚胎成纖維細(xì)胞，經(jīng) 絲裂霉素C處理2. 5h，去除絲裂霉素C，加入胰酶消化液孵育，終止消化，獲得飼養(yǎng)層細(xì)胞。
[0022] 本發(fā)明提供了一種成纖維細(xì)胞的單細(xì)胞培養(yǎng)方法。該單細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括：步驟 A:獲得成纖維細(xì)胞懸液和飼養(yǎng)層細(xì)胞；步驟B:將飼養(yǎng)層細(xì)胞以微滴形式接種至培養(yǎng)皿，培 養(yǎng)至飼養(yǎng)層細(xì)胞密度在微滴內(nèi)100%匯合，獲得飼養(yǎng)層細(xì)胞微滴；步驟C:將成纖維細(xì)胞懸 液接種至具有飼養(yǎng)層細(xì)胞微滴的培養(yǎng)皿，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，獲得單細(xì)胞克隆。本發(fā)明至少具有如 下優(yōu)勢(shì)之一：
[0023] 本發(fā)明提供的單細(xì)胞培養(yǎng)方法獲得的克隆細(xì)胞基因組完全一致，有利于提高轉(zhuǎn)基 因豬的特異性，有利于轉(zhuǎn)基因豬克隆效率的評(píng)價(jià)，以及特定均一轉(zhuǎn)基因豬品系的建立；
[0024] 本發(fā)明提供的單細(xì)胞培養(yǎng)方法獲得的克隆細(xì)胞無(wú)需進(jìn)行加壓篩選，因此，可簡(jiǎn)化 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)工作。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1示由本發(fā)明培養(yǎng)的豬胎兒成纖維細(xì)胞單細(xì)胞克??；
[0026] 圖2示定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線（GFP基因）；
[0027] 圖3示本發(fā)明單細(xì)胞培養(yǎng)克隆基因組GFP拷貝數(shù)與DNA質(zhì)量的關(guān)系；
[0028] 圖4示G418篩選克隆基因組GFP拷貝數(shù)與DNA質(zhì)量的關(guān)系。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 本發(fā)明公開了一種成纖維細(xì)胞的單細(xì)胞培養(yǎng)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文 內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人 員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí) 施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法 和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0030] 本發(fā)明提供的成纖維細(xì)胞的單細(xì)胞培養(yǎng)方法中所用材料、試劑和儀器均可由市場(chǎng) 購(gòu)得。
[0031] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0032] 實(shí)施例1豬胚胎的獲得
[0033] 懷孕30天實(shí)驗(yàn)用母豬用戊巴比妥鈉耳靜脈注射劑量為1. 4mL/Kg，先快速注射全 劑量的50%，然后緩慢注射，10分鐘內(nèi)注射麻醉，使用新潔爾滅在腹部消毒，然后在腹正中 打開切口，用腸鉗夾封閉妊娠子宮的兩端，子宮內(nèi)可觸及若干個(gè)雞蛋樣胚胎。絲用線結(jié)扎子 宮兩端，切斷，縫扎子宮殘端，縫合線關(guān)閉腹腔。在超凈工作臺(tái)中內(nèi)剖開子宮，取出胚胎，用 含1 %抗生素的37°C預(yù)熱的PBS洗滌三遍，置于無(wú)菌瓶皿，除去頭、四肢及內(nèi)臟。
[0034] 實(shí)施例2豬胚胎成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
[0035] 將實(shí)施例1獲得的胚胎組織切成1_X1_X1_大小的碎塊，利用滅菌眼科剪將 組織剪碎至糊狀，將其涂布到細(xì)胞培養(yǎng)皿底部，置于38°C、飽和濕度的C02培養(yǎng)箱中放置4h 后，加入細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM+10 %胎牛血清+1 %雙抗+1 %非必需氨基酸），盡量避免組織塊 漂浮，繼續(xù)以上述條件進(jìn)行培養(yǎng)，每隔72h更換培養(yǎng)液一次，在第8天成纖維樣細(xì)胞開始從 組織塊孵出。加入37°C的2. 5g/L胰蛋白酶，置C02培養(yǎng)箱內(nèi)消化30min。100目篩網(wǎng)過(guò)濾， lOOOrpm離心5min，收集細(xì)胞。以PBS液洗滌1次，再用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液洗 滌2次，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。原代分離的細(xì)胞記錄為P0代，按1:4傳代后 記錄P1代，約四天長(zhǎng)到90%以上匯合度可再次傳代或凍存，下一代為P2代，以此類推。
[0036] 實(shí)施例3飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備
[0037] 1)原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)：
[0038] 選取6-10周齡雌雄鼠1:1合籠，次晨和下午分別查陰栓1次，見(jiàn)陰栓者計(jì)為妊娠 〇.5d。取妊娠12. 5-14. 5d孕鼠。處死妊娠小鼠，在75%醫(yī)用酒精中浸兩分鐘。取出孕鼠， 超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌取出子宮，置于盛有PBS的90mm培養(yǎng)皿中，PBS清洗1次，吸去廢液。在體式 鏡下用尖鑷子撕開子宮壁和胎膜，取出胎鼠，去除胎鼠頭、尾、四肢和內(nèi)臟，PBS洗滌3次后， 將胎體充分剪碎。加入胰酶消化液（〇. 5g/L胰酶-0. 02 %EDTA) 10mL吹打成混懸液，于37°C 消化5min，后加入等量的含體積含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)入50mL的離心管，并 充分吹打細(xì)胞懸液后，l〇〇〇rpm，離心5min，棄上清。最后加入含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清 的。用DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，室溫靜置兩三分鐘，待未剪碎細(xì)胞團(tuán)塊完全沉至離心管底， 吸取上清細(xì)胞懸液至新的50mL離心管中，補(bǔ)充培養(yǎng)基并混懸細(xì)胞液，接種至兩個(gè)新培養(yǎng)瓶 中，補(bǔ)充MEF培養(yǎng)基至培養(yǎng)瓶中至細(xì)胞懸液為25mL，并將培養(yǎng)瓶移入37°C，體積分?jǐn)?shù)為5% C02，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。等細(xì)胞貼滿瓶底達(dá)到90%以上匯合，吸去培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基，PBS 洗滌1次，分別在各培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入lmL0. 5g/L胰酶-0. 02%EDTA消化液，37°C消化lmin，顯 微鏡觀察細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞逐層脫落時(shí)加入等量含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消 化，移液器充分吹打散細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入15mL離心管，1000r/min，離心5min，棄上清。 加入新鮮的MEF培養(yǎng)基5mL重懸細(xì)胞，按1:4傳代到新培養(yǎng)瓶，補(bǔ)足MEF培養(yǎng)基，移入37°C， 5%C02的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代分離的細(xì)胞記錄為P0代，按1:4傳代后記錄P1代，約 四天長(zhǎng)到90%以上匯合度可再次傳代或凍存，下一代為P2代，以此類推。
[0039] 2)飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備：
[0040] ①取3-5代內(nèi)長(zhǎng)至80%匯合的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF)，吸去原培養(yǎng)基，加入終 濃度為lOmg/L絲裂霉素C的MEF培養(yǎng)基6mL至90mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中處理細(xì)胞2. 5h。②棄 去培養(yǎng)基，每次加5mLPBS洗滌細(xì)胞3遍次，完全去除絲裂霉素C，加2mL胰酶消化液，37°C 孵育lmin后，顯微鏡觀察細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞逐層脫落時(shí)加入等量含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液終止消化，移液器充分吹打散細(xì)