胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入15mL離心管，1000r/min，離心 5min，棄上清。可以大量制備并按標(biāo)準(zhǔn)方法冷凍保存在液氮中。
[0041]實(shí)施例4豬胎兒成纖維細(xì)胞單細(xì)胞培養(yǎng)
[0042] 以300yL的微滴形式接種絲裂霉素處理過(guò)的小鼠成纖維細(xì)胞（MEF)即飼養(yǎng)層細(xì) 胞至90mm培養(yǎng)皿（corningcostar)，每個(gè)大皿加入12個(gè)小鼠成纖維細(xì)胞微滴，直徑約1 厘米，置37°C、5% 0)2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，貼壁24小時(shí)后的飼養(yǎng)細(xì)胞密度在微滴范圍內(nèi)達(dá)到 100 %匯合。
[0043] 飼養(yǎng)細(xì)胞完全貼壁后，換新的培養(yǎng)液。取3代以?xún)?nèi)的豬成纖維細(xì)胞，用含20%胎牛 血清的高糖DMEM稀釋每毫升5個(gè)細(xì)胞。然后將15mL含有稀釋后細(xì)胞的培養(yǎng)液，接種至含 有飼養(yǎng)層細(xì)胞的90mm培養(yǎng)皿。在38°C、5%C(Vg溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)8天后每一個(gè)單細(xì) 胞分化長(zhǎng)出一組新的克隆細(xì)胞，該克隆即為單細(xì)胞增殖克隆（圖1)。
[0044] 用倒置顯微鏡通過(guò)調(diào)整光照強(qiáng)度和角度，挑選可看到的細(xì)胞克隆。用標(biāo)記筆在培 養(yǎng)皿底部相應(yīng)位置畫(huà)一個(gè)圈圈住該克隆。選擇大小比較平均方便分離的克隆。移除培養(yǎng)液， 用不含鈣鎂的PBS沖洗平皿兩次，并移除懸浮起來(lái)的細(xì)胞。用無(wú)菌鑷子夾起一個(gè)克隆環(huán)，輕 輕的將克隆環(huán)底部粘上無(wú)菌甘油，然后快速垂直拿起。輕輕的將克隆環(huán)放在一個(gè)選定的克 隆之上，并用鑷子稍用力均勻按壓，壓力不均勻會(huì)導(dǎo)致克隆環(huán)底部不密封而漏液。在顯微 鏡下確認(rèn)克隆環(huán)的位置在選定的克隆之上，保證在克隆環(huán)密閉的區(qū)域內(nèi)沒(méi)有其他克隆。加 0. 2mL胰酶（0. 25% )到克隆環(huán)里。將培養(yǎng)皿在36. 5°C孵育5分鐘。每隔兩三分鐘在顯微 鏡下觀察一次細(xì)胞，細(xì)胞開(kāi)始變圓并脫離培養(yǎng)皿底部。加一兩滴培養(yǎng)液到克隆環(huán)中，并輕輕 用巴氏吸管或移液器吸出細(xì)胞。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至合適的培養(yǎng)器皿中并加適量的培養(yǎng)液。用12 孔或者24孔板，在38°C、5%C02恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0045] 實(shí)施例5豬胎兒成纖維細(xì)胞單細(xì)胞培養(yǎng)
[0046] 以400yL的微滴形式接種絲裂霉素處理過(guò)的小鼠成纖維細(xì)胞（MEF)即飼養(yǎng)層細(xì) 胞至90mm培養(yǎng)皿（corningcostar)，每個(gè)大皿加入11個(gè)小鼠成纖維細(xì)胞微滴，直徑約1 厘米，置37°C、5% 0)2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，貼壁24小時(shí)后的飼養(yǎng)細(xì)胞密度在微滴范圍內(nèi)達(dá)到 100 %匯合。
[0047] 飼養(yǎng)細(xì)胞完全貼壁后，換新的培養(yǎng)液。取3代以?xún)?nèi)的豬成纖維細(xì)胞，用含20%胎牛 血清的高糖DMEM稀釋每毫升8個(gè)細(xì)胞。然后將12mL含有稀釋后細(xì)胞的培養(yǎng)液，接種至含 有飼養(yǎng)層細(xì)胞的90mm培養(yǎng)皿。在38°C、5%C(Vg溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)10天后每一個(gè)單細(xì) 胞分化長(zhǎng)出一組新的克隆細(xì)胞，該克隆即為單細(xì)胞增殖克隆。
[0048] 用倒置顯微鏡通過(guò)調(diào)整光照強(qiáng)度和角度，挑選可看到的細(xì)胞克隆。用標(biāo)記筆在培 養(yǎng)皿底部相應(yīng)位置畫(huà)一個(gè)圈圈住該克隆。選擇大小比較平均方便分離的克隆。移除培養(yǎng)液， 用不含鈣鎂的PBS沖洗平皿兩次，并移除懸浮起來(lái)的細(xì)胞。用無(wú)菌鑷子夾起一個(gè)克隆環(huán)，輕 輕的將克隆環(huán)底部粘上無(wú)菌甘油，然后快速垂直拿起。輕輕的將克隆環(huán)放在一個(gè)選定的克 隆之上，并用鑷子稍用力均勻按壓，壓力不均勻會(huì)導(dǎo)致克隆環(huán)底部不密封而漏液。在顯微 鏡下確認(rèn)克隆環(huán)的位置在選定的克隆之上，保證在克隆環(huán)密閉的區(qū)域內(nèi)沒(méi)有其他克隆。加 0. 2mL胰酶（0. 25% )到克隆環(huán)里。將培養(yǎng)皿在36. 5°C孵育5分鐘。每隔兩三分鐘在顯微 鏡下觀察一次細(xì)胞，細(xì)胞開(kāi)始變圓并脫離培養(yǎng)皿底部。加一兩滴培養(yǎng)液到克隆環(huán)中，并輕輕 用巴氏吸管或移液器吸出細(xì)胞。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至合適的培養(yǎng)器皿中并加適量的培養(yǎng)液。用12 孔或者24孔板，在38°C、5%C02恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0049] 實(shí)施例6豬胎兒成纖維細(xì)胞單細(xì)胞培養(yǎng)
[0050] 以500yL的微滴形式接種絲裂霉素處理過(guò)的小鼠成纖維細(xì)胞（MEF)即飼養(yǎng)層細(xì) 胞至90mm培養(yǎng)皿（corningcostar)，每個(gè)大皿加入10個(gè)小鼠成纖維細(xì)胞微滴，直徑約1 厘米，置37°C、5% 0)2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，貼壁24小時(shí)后的飼養(yǎng)細(xì)胞密度在微滴范圍內(nèi)達(dá)到 100 %匯合。
[0051] 飼養(yǎng)細(xì)胞完全貼壁后，換新的培養(yǎng)液。取3代以?xún)?nèi)的豬成纖維細(xì)胞，用含20%胎牛 血清的高糖DMEM稀釋每毫升10個(gè)細(xì)胞。然后將10mL含有稀釋后細(xì)胞的培養(yǎng)液，接種至含 有飼養(yǎng)層細(xì)胞的90mm培養(yǎng)皿。在38°C、5% 0)2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)11天后每一個(gè)單細(xì) 胞分化長(zhǎng)出一組新的克隆細(xì)胞，該克隆即為單細(xì)胞增殖克隆。
[0052] 用倒置顯微鏡通過(guò)調(diào)整光照強(qiáng)度和角度，挑選可看到的細(xì)胞克隆。用標(biāo)記筆在培 養(yǎng)皿底部相應(yīng)位置畫(huà)一個(gè)圈圈住該克隆。選擇大小比較平均方便分離的克隆。移除培養(yǎng)液， 用不含鈣鎂的PBS沖洗平皿兩次，并移除懸浮起來(lái)的細(xì)胞。用無(wú)菌鑷子夾起一個(gè)克隆環(huán)，輕 輕的將克隆環(huán)底部粘上無(wú)菌甘油，然后快速垂直拿起。輕輕的將克隆環(huán)放在一個(gè)選定的克 隆之上，并用鑷子稍用力均勻按壓，壓力不均勻會(huì)導(dǎo)致克隆環(huán)底部不密封而漏液。在顯微 鏡下確認(rèn)克隆環(huán)的位置在選定的克隆之上，保證在克隆環(huán)密閉的區(qū)域內(nèi)沒(méi)有其他克隆。加 0. 2mL胰酶（0. 25% )到克隆環(huán)里。將培養(yǎng)皿在36. 5°C孵育5分鐘。每隔兩三分鐘在顯微 鏡下觀察一次細(xì)胞，細(xì)胞開(kāi)始變圓并脫離培養(yǎng)皿底部。加一兩滴培養(yǎng)液到克隆環(huán)中，并輕輕 用巴氏吸管或移液器吸出細(xì)胞。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至合適的培養(yǎng)器皿中并加適量的培養(yǎng)液。用12 孔或者24孔板，在38°C、5%C02恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0053] 實(shí)施例7不同細(xì)胞插入基因拷貝數(shù)測(cè)定
[0054](一）細(xì)胞DNA的提取
[0055] 將等量實(shí)施例4獲得的細(xì)胞克?。?孔）（A組）與參考文獻(xiàn)（李秋艷.利用體細(xì) 胞核移植技術(shù)生產(chǎn)表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP)的轉(zhuǎn)人溶菌酶基因（HLY)的豬克隆胚 胎.自然科學(xué)進(jìn)展.2008，18(10):1157-1162)中所得口8(：1-111^-6??-呢0細(xì)胞克隆（6孔） (B組）分別接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在38°C、5%C02恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。72 小時(shí)后，加0. 5mLPBS洗滌細(xì)胞3遍次，分別加lmL胰酶（0. 25% )，將培養(yǎng)皿在36. 5°C孵育 5分鐘。每隔兩三分鐘在顯微鏡下觀察一次細(xì)胞，細(xì)胞開(kāi)始變圓并脫離培養(yǎng)皿底部。加入 lmL細(xì)胞培養(yǎng)液體，終止消化，通過(guò)活細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Countess?IIFL全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀， lifetechnology)，結(jié)果見(jiàn)表1，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，將A組細(xì)胞用培養(yǎng)液稀釋至1. 7X105/mL。 分別將相同細(xì)胞數(shù)的A組和B組細(xì)胞2mL接種至6孔板中，在38°C、5% 0)2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 72小時(shí)，后分別加lmLPBS洗滌細(xì)胞2遍次，分別加入0? 5mLDNAZOL?Reagent(life technology)，槍頭吹打混勾裂解。lOOOOrpm4°離心10分鐘。將粘稠的上清液轉(zhuǎn)移到 一個(gè)新的EP管，在上清中加入0.5mL無(wú)水乙醇。充分混勻后，在室溫沉淀1-3分鐘，然后 lOOOOrpm離心4分鐘，倒掉上清，用0. 7-lmL75%的乙醇顛倒洗絳兩次。倒掉多余的乙 醇，在空氣中30秒揮發(fā)乙醇。將沉淀溶解于100yL的TE(tris-EDTA)緩沖溶液中，通過(guò)nanodrop定量DNA濃度。結(jié)果如表1所示。
[0056] 表1不同方式獲得克隆的DNA濃度和純度
[0057]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種成纖維細(xì)胞的單細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟A :獲得成纖維細(xì)胞懸液和飼養(yǎng)層細(xì)胞； 步驟B :將所述飼養(yǎng)層細(xì)胞以微滴形式接種至培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至飼養(yǎng)層細(xì)胞密度在微滴 內(nèi)100%匯合，獲得飼養(yǎng)層細(xì)胞微滴； 步驟C :將所述成纖維細(xì)胞懸液接種至具有所述飼養(yǎng)層細(xì)胞微滴的培養(yǎng)皿，經(jīng)細(xì)胞培 養(yǎng)，獲得單細(xì)胞克隆。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述成纖維細(xì)胞懸液的細(xì)胞 濃度為5~10個(gè)/mL。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述成纖維細(xì)胞懸液的接種 量為10~15mL/皿。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟C中所述細(xì)胞培養(yǎng)為 38°C、5% 0)2恒溫培養(yǎng)8~11天。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述飼養(yǎng)層細(xì)胞的接種量為 300 ~500 μ L/微滴。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述飼養(yǎng)層細(xì)胞微滴在培養(yǎng) 皿中的密度為10~12個(gè)/皿。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟B中所述飼養(yǎng)層細(xì)胞的培 養(yǎng)條件為37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述成纖維細(xì)胞為3代以?xún)?nèi)的 成纖維細(xì)胞。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述成纖維細(xì)胞為豬胚胎成 纖維細(xì)胞。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備方法 為：取胚胎成纖維細(xì)胞，經(jīng)絲裂霉素 C處理2. 5h，去除絲裂霉素 C，加入胰酶消化液孵育，終 止消化，獲得飼養(yǎng)層細(xì)胞。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種豬胎兒成纖維細(xì)胞的單細(xì)胞培養(yǎng)方法。該單細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括：步驟A：獲得成纖維細(xì)胞懸液和飼養(yǎng)層細(xì)胞；步驟B：將飼養(yǎng)層細(xì)胞以微滴形式接種至培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至飼養(yǎng)層細(xì)胞密度在微滴內(nèi)100％匯合，獲得飼養(yǎng)層細(xì)胞微滴；步驟C：將成纖維細(xì)胞懸液接種至具有飼養(yǎng)層細(xì)胞微滴的培養(yǎng)皿，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，獲得單細(xì)胞克隆。本發(fā)明提供的單細(xì)胞培養(yǎng)方法獲得的克隆細(xì)胞基因組完全一致，有利于提高轉(zhuǎn)基因豬的特異性，有利于轉(zhuǎn)基因豬克隆效率的評(píng)價(jià)，以及特定均一轉(zhuǎn)基因豬品系的建立。
【IPC分類(lèi)】C12N5-02, C12N5-073
【公開(kāi)號(hào)】CN104830752
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510098217
【發(fā)明人】李秋艷, 張佳, 李志遠(yuǎn), 付怡靜
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年3月5日