專(zhuān)利名稱(chēng)：發(fā)酵制備l－半胱氨酸或l－半胱氨酸衍生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)發(fā)酵微生物而制備L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物的方法，以及適于該方法的微生物。
氨基酸L-半胱氨酸極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值。舉例言之，L-半胱氨酸用作食品添加劑(特別是焙烤食品工業(yè))，用作化妝品中使用的物質(zhì)，以及用作制備藥物活性化合物的起始原料(特別是N-乙酰半胱氨酸及S-羧甲基半胱氨酸)。
L-半胱氨酸衍生物均是含硫的代謝物，在它們的合成中，它們衍生自半胱氨酸，例如胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、生物素、噻唑烷、硫胺素、硫辛酸及輔酶A。
在細(xì)菌中，半胱氨酸的生物合成在兩種水平被調(diào)節(jié)(


圖1)1.在酶活性水平，絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶(cysE基因的產(chǎn)物)受L-半胱氨酸的終產(chǎn)物抑制。這意味著L-半胱氨酸的累積直接導(dǎo)致半胱氨酸生物合成的第一特定反應(yīng)的抑制，使進(jìn)一步的合成中止。2.在轉(zhuǎn)錄水平，調(diào)節(jié)蛋白CysB(由cysB基因編碼)起轉(zhuǎn)錄激活劑的作用并確保還原硫的提供受到調(diào)節(jié)。CysB需要N-乙酰絲氨酸作為誘發(fā)物，N-乙酰絲氨酸在還原硫?qū)-乙酰絲氨酸硫化氫解酶反應(yīng)而言不足時(shí)，于細(xì)胞內(nèi)由O-乙酰絲氨酸形成。因此，所有與硫的吸收、還原及摻入有關(guān)的基因均受CysB的控制。這些基因是操縱子cysPTWAM、cysDNC及cysJIH以及cysK基因。乙酰絲氨酸是CysB的誘發(fā)物，而硫化物及硫代硫酸鹽作為所謂“抗誘發(fā)物”具有負(fù)效應(yīng)，因?yàn)樗鼈兊拇嬖诒砻饔蠸H基可用。
在WO 97/15673(相應(yīng)于美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)SN 09/065104)中，詳細(xì)討論了有關(guān)獲得L-半胱氨酸及L-半胱氨酸衍生物的技術(shù)領(lǐng)域的狀況。WO 97/15673本身描述了發(fā)酵制備方法，所述制備方法使用抗反饋絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶。該申請(qǐng)還公開(kāi)了通過(guò)另外地在基因水平去調(diào)節(jié)(deregulate)調(diào)節(jié)蛋白CysB以使該基因組成型表達(dá)，可能獲得半胱氨酸收率的進(jìn)一步增加。
專(zhuān)利申請(qǐng)EP 885962 A1(相應(yīng)于美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)SN 09/097759)公開(kāi)了適于發(fā)酵制備L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰絲氨酸及噻唑烷衍生物的微生物，其特征在于，它們超量表達(dá)至少一種編碼直接適于將抗生素或?qū)ξ⑸镉卸镜钠渌镔|(zhì)分泌出細(xì)胞的蛋白質(zhì)的基因。
CysB屬于LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑(LTTR)族，它們中的100余種代表是已知的(Schell M.A.，1993，Annu.Rev.Microbiol.，47597-626)。它們的顯著特點(diǎn)是它們具有N-末端DNA結(jié)合域及C-末端誘發(fā)物結(jié)合域，該N-末端DNA結(jié)合域具有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基元。對(duì)CysB有許多詳細(xì)的DNA結(jié)合研究。再者，CysB是第一個(gè)晶體結(jié)構(gòu)已知的LTTR蛋白(Tyrell等，1997，Structure 51017-1032)。通常，LTTR蛋白質(zhì)起正基因調(diào)節(jié)劑的作用，其依賴(lài)于誘發(fā)物分子的存在。以前曾提出，僅與效應(yīng)物分子無(wú)關(guān)的高活性CysB變體(所謂組成型活性變體)使半胱氨酸生產(chǎn)增加，因?yàn)檫@種形式顯示恒定的高基因激活(Nakamori S.等，1998，Appl.Env.Microbiol.641607-1611)。
CysB組成型活性形式的實(shí)例曾于鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)的情況中有描述。這些變體顯示高度活性，該活性完全與誘發(fā)物L(fēng)-乙酰絲氨酸及硫代硫酸鹽及硫化物的負(fù)效應(yīng)無(wú)關(guān)(ColyerT.E.，Kredich N.M.，1994，Mol.Microbiol.13797-805)。
本發(fā)明涉及微生物菌株，所述微生物菌株適于發(fā)酵制備L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物，其具有去調(diào)節(jié)的半胱氨酸代謝，該半胱氨酸代謝的去調(diào)節(jié)不基于CysB活性的改變，其特征在于，該菌株另外具有增加的CysB活性，且CysB活性具有野生型CysB典型的調(diào)節(jié)模式。
具有去調(diào)節(jié)的半胱氨酸代謝且其中這種去調(diào)節(jié)不是由于CysB活性的改變的微生物菌株是已知的。這些菌株是，具有修飾的cysE等位基因的菌株，例如，如WO 97/15673(該文獻(xiàn)引入本文作參考)或Nakamori S.等，1998，Appl.Env.Microbiol.641607-1611(該文獻(xiàn)引入本文作參考)中所述，或者外流基因已插入其中的菌株，例如，在EP 0885962 A1(相應(yīng)于美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)SN 09/097759(該文獻(xiàn)引入本文作參考))中所述，或者用非特異性誘變結(jié)合篩選半胱氨酸超量生產(chǎn)或降低的半胱氨酸分解的方法分離的菌株，例如，在WO97/15673或在Nakamori S.等，1998，Appl.Env.Microbiol.641607-1611中所述。
在本發(fā)明的含義內(nèi)，當(dāng)CysB活性比野生型菌株的高至少10％時(shí)，該活性是增加的。
優(yōu)選CysB活性至少高25％。
特別優(yōu)選CysB活性至少高50％。
在實(shí)施例2中描述了適于確定CysB活性的大腸桿菌菌株(MC4100∷λKZL300)。依照布達(dá)佩斯條約，該菌株于1999年6月23日，以保藏號(hào)DSM 12886保藏在DSMZ(德意志微生物保藏中心，D-38142，不倫瑞克)。此外，將各分別含有CysB的構(gòu)建體(construct)以已知的方式導(dǎo)入菌株MC4100∷λKZL300內(nèi)。
當(dāng)以硫代硫酸鹽生長(zhǎng)的細(xì)胞的CysB活性低于以硫酸鹽生長(zhǎng)的細(xì)胞的75％，及以半胱氨酸生長(zhǎng)的細(xì)胞的CysB活性低于以硫酸鹽生長(zhǎng)的細(xì)胞的20％時(shí)(參見(jiàn)實(shí)施例2)，與硫源無(wú)關(guān)，CysB活性顯示野生型CysB典型的調(diào)節(jié)模式。
本發(fā)明的微生物菌株分泌的L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物的量遠(yuǎn)大于半胱氨酸代謝被去調(diào)節(jié)而CysB活性不增加的微生物菌株所分泌的。
因此，本發(fā)明的微生物菌株是具有去調(diào)節(jié)的半胱氨酸代謝的微生物菌株，該半胱氨酸代謝的去調(diào)節(jié)不基于CysB活性的改變，且在該微生物菌株中，編碼具有野生型CysB典型的調(diào)節(jié)模式的CysB的同源或異源cysB基因的表達(dá)程度增加。
優(yōu)選的菌株是具有去調(diào)節(jié)的半胱氨酸代謝的大腸桿菌菌株，該半胱氨酸代謝的去調(diào)節(jié)不基于CysB活性的改變，且在該大腸桿菌菌株中野生型cysB基因超量表達(dá)。
特別優(yōu)選的菌株是具有去調(diào)節(jié)的半胱氨酸代謝的大腸桿菌菌株，該半胱氨酸代謝的去調(diào)節(jié)不基于CysB活性的改變，且在該大腸桿菌菌株中大腸桿菌野生型cysB基因的拷貝數(shù)增加而且該基因超量表達(dá)。
令人驚奇的是，如上述已有技術(shù)的公開(kāi)中所假定的，發(fā)現(xiàn)使用編碼組成型活性CysB調(diào)節(jié)蛋白的cysB等位基因增加半胱氨酸的產(chǎn)生，但是正相反，通過(guò)增加野生型cysB基因的表達(dá)，半胱氨酸的產(chǎn)生獲得增加。
此項(xiàng)發(fā)現(xiàn)亦令人驚奇而且是未預(yù)期的，因?yàn)闆](méi)有已知的例子中來(lái)自L(fǎng)ysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑族的調(diào)節(jié)蛋白的增加的表達(dá)使代謝物超量表達(dá)產(chǎn)生。
因此，本發(fā)明還涉及來(lái)自L(fǎng)ysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑族的調(diào)節(jié)蛋白用于超量生產(chǎn)代謝物的用途，并涉及超量生產(chǎn)代謝物的方法，其特征在于，來(lái)自L(fǎng)ysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑族的調(diào)節(jié)基因在微生物內(nèi)超量表達(dá)并在該微生物內(nèi)導(dǎo)致增加的代謝物的產(chǎn)生。
舉例言之，可以通過(guò)以下方法增加微生物內(nèi)CysB活性，同時(shí)保留典型的調(diào)節(jié)模式1.在啟動(dòng)子的控制下，于微生物內(nèi)，增加編碼具有野生型CysB典型的調(diào)節(jié)模式的CysB的cysB基因的拷貝數(shù)，或者2.通過(guò)用更強(qiáng)的啟動(dòng)子代替調(diào)節(jié)野生型cysB基因表達(dá)的啟動(dòng)子，增加編碼具有野生型CysB典型的調(diào)節(jié)模式的CysB的cysB基因的表達(dá)。
已知cysB基因來(lái)自大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、產(chǎn)氣克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)及桃紅莢硫菌(Thiocapsaroseopersicina)。優(yōu)選cysB基因是其基因產(chǎn)物與大腸桿菌CysB蛋白顯示至少40％相同的基因。同源性值指用“Wisconsin Package Version9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，威斯康辛州”計(jì)算機(jī)程序獲得的結(jié)果。在這方面，用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)以“blast“子程序檢索數(shù)據(jù)庫(kù)。
此外，cysB基因是野生型cysB基因的等位基因，其基因產(chǎn)物的序列改變，而野生型CysB典型的調(diào)節(jié)模式并未失去。其實(shí)例是含有保守氨基酸置換的CysB變體。
舉例言之，本發(fā)明的微生物可以通過(guò)以下方法制備在具有去調(diào)節(jié)的半胱氨酸代謝的微生物菌株內(nèi)，該半胱氨酸代謝的去調(diào)節(jié)不基于CysB活性的改變，使用本領(lǐng)域已知的方法增加野生型cysB基因的拷貝數(shù)或增加編碼具有野生型CysB典型的調(diào)節(jié)模式的CysB的cysB基因的拷貝數(shù)，或者使用本領(lǐng)域已知的方法增加野生型cysB基因的表達(dá)，或增加編碼具有野生型CysB典型的調(diào)節(jié)模式的CysB的cysB基因的表達(dá)。
在下文中，術(shù)語(yǔ)“CysB”指“野生型CysB”及“具有野生型CysB典型的調(diào)節(jié)模式的CysB變體”。在下文中，術(shù)語(yǔ)“cysB基因”指“野生型cysB基因”及“編碼具有野生型CysB典型的調(diào)節(jié)模式的CysB的cysB基因”。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以用于增加微生物內(nèi)cysB基因的拷貝數(shù)。因此，舉例言之，可以將cysB基因克隆入質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體在每個(gè)細(xì)胞中以多個(gè)拷貝存在(例如pUC19、pBR322及pACYC184)并將其導(dǎo)入具有去調(diào)節(jié)的半胱氨酸代謝的微生物內(nèi)。或者，可以將cysB基因數(shù)次整合入具有去調(diào)節(jié)的半胱氨酸代謝的微生物的染色體中?？梢允褂玫恼戏椒ㄊ遣捎脺睾褪删w或整合質(zhì)粒的已知系統(tǒng)，或通過(guò)同源重組的整合(例如Hamilton等，1989，J.Bacteriol.1714617-4622)。
優(yōu)選通過(guò)在啟動(dòng)子的控制下將cysB基因克隆入質(zhì)粒載體而增加拷貝數(shù)。特別優(yōu)選通過(guò)將cysB基因克隆入pACYC衍生物，如pACYC184-LH(依照布達(dá)佩斯條約，于1995年8月18日，以保藏DSM 10172保藏于德意志微生物保藏中心)而增加拷貝數(shù)。
基因的天然啟動(dòng)子及操縱基因區(qū)可以用作控制區(qū)以表達(dá)質(zhì)粒編碼的cysB基因。
但是，使用其他啟動(dòng)子也可以增加cysB基因的表達(dá)。適宜的啟動(dòng)子系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(Makrides S.C.，1996，Microbiol.Rev.60512-538)。這種構(gòu)建體可以以本領(lǐng)域已知的方式用在質(zhì)粒或染色體上。
舉例言之，cysB基因如下克隆入質(zhì)粒載體通過(guò)使用包含包括起動(dòng)子及操縱子序列的完整基因的特定引物的聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行特異性擴(kuò)增，然后連接到載體DNA片段上。
用以克隆cysB基因的優(yōu)選的載體是已經(jīng)含有用以去調(diào)節(jié)半胱氨酸代謝的遺傳因子的質(zhì)粒，例如，cysEX基因(WO 97/15673)及外流基因(EP 0885962 A1)。這種載體使得本發(fā)明的微生物菌株能夠自任何微生物菌株制備，因?yàn)檫@種載體也去調(diào)節(jié)微生物內(nèi)的半胱氨酸代謝。
因此本發(fā)明還涉及質(zhì)粒，其特征在于，其具有用以去調(diào)節(jié)半胱氨酸代謝的遺傳因子，這些遺傳因子并不導(dǎo)致CysB活性的任何改變，所述質(zhì)粒還含有在啟動(dòng)子控制下的cysB基因。
用現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化方法(例如電穿孔)將含有cysB的質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌，舉例言之，通過(guò)抗生素耐藥性將選擇包含(harbour)質(zhì)粒的克隆。
因此，本發(fā)明還涉及用以制備本發(fā)明的微生物菌株的方法，其特征在于，將本發(fā)明的質(zhì)粒導(dǎo)入微生物菌株內(nèi)。
本發(fā)明的微生物菌株用于以本領(lǐng)域已知的方法在發(fā)酵罐內(nèi)制備半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。舉例言之，所用碳源可以是葡萄糖或乳糖，或其他糖類(lèi)，而所用氮源可以是銨或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。舉例言之，所用硫源可以是硫化物、亞硫酸鹽、硫酸鹽或硫代硫酸鹽。在發(fā)酵期間形成的L-半胱氨酸可加以氧化而生成難溶的胱氨酸或與醛或酮縮合而生成噻唑烷(例如與丙酮酸生成2-甲基噻唑烷-2，4-二羧酸)。
因此，本發(fā)明還涉及制備L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物的方法，其特征在于，本發(fā)明的微生物菌株以本領(lǐng)域已知的方式用在發(fā)酵中，且將L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物自發(fā)酵混合物中分離。
以下實(shí)施例用以闡明本發(fā)明。實(shí)施例1克隆野生型cysB基因及cysB(T149M)等位基因使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)克隆大腸桿菌野生型cysB基因。將特定的寡核苷酸引物cysBP1(SEQ.ID.NO1)及cysBP2(SEQ.ID.NO2)(每種混合物20pmol)用于擴(kuò)增長(zhǎng)度為3107個(gè)堿基對(duì)的基因組DNA片段，所述片段包含(encompass)野生型cysB基因和側(cè)翼區(qū)，并分別具有末端EcoRI及SalI限制切割位點(diǎn)。5′-GTT ACG AGA TCG AAG AGG-3′(在3′-端的硫代磷酸酯鍵)(SEQ.ID.NO1)5′-GTC ACC GAG TGG TCA ATG-3′(在3′-端的硫代磷酸酯鍵)(SEQ.ID.NO2)使用Boehringer(Mannheim，德國(guó))Pwo DNA聚合酶并采用10ng基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。程序包括29個(gè)循環(huán)，退火溫度為56℃(每個(gè)循環(huán)30秒)，延伸溫度為72℃(每個(gè)循環(huán)30秒)，變性溫度為94℃(每個(gè)循環(huán)30秒)。然后用限制酶EcoRI及SalI處理DNA片段，并用制備凝膠電泳及Geneclean方法(GenecleanKitBI0101P.O.Box 2284，La Jolla，加利福尼亞州，美國(guó)，92038-2284)純化DNA片段。將該片段連接在Bio-Rad Laboratories(Hercules，加利福尼亞州，美國(guó))噬菌粒載體pTZ19U內(nèi)，該噬菌粒載體pTZ19U已經(jīng)用EcoRI/SalI切割并用磷酸酶處理，由此形成質(zhì)粒pTZ19U-CysB(圖2)。轉(zhuǎn)化之后，通過(guò)限制分析鑒定陽(yáng)性克隆(positive clone)。
為了構(gòu)建組成型活性cysB等位基因，使用來(lái)自Bio-RadLaboratories(Hercules，加利福尼亞州，美國(guó))的“Mutagene In VitroMutagenesis”試劑盒，將野生型cysB基因的密碼子147突變(類(lèi)似于Colyer T.E.，Kredich N.M.，1994，Mol.Microbiol.13797-805所述的鼠傷寒沙門(mén)氏菌野生型cysB基因的突變)為甲硫氨酸密碼子。在本例中使用寡核苷酸CysBMut4(SEQ.ID.NO3)。加下劃線(xiàn)的堿基表示與野生型序列的不同。5′-TTC GCT ATC GCC ATGGAA GCG CTG CAT-3′(SEQ.ID.NO3)為了進(jìn)行活性測(cè)試(參見(jiàn)實(shí)施例2)，以EcoRI/SalI片段，在用Klenow處理后，將兩種cysB等位基因克隆入Ecl136II-切割、磷酸酶處理的載體pACYC184-LH。實(shí)施例2體內(nèi)測(cè)定CysB活性選擇報(bào)道基因以測(cè)定CysB活性。為此，將cysK基因的控制區(qū)融合至編碼酶β-半乳糖苷酶的lacZ基因。當(dāng)將該融合整合入缺乏內(nèi)源β-半乳糖苷酶的菌株時(shí)，該酶的形成與CysB活性無(wú)關(guān)，因此以β-半乳糖苷酶活性的形式，提供CysB活性的間接測(cè)定。將Simons等(Simons等，1987，Gene 5385-96)所述的系統(tǒng)用于構(gòu)建融合。通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)，利用寡核苷酸引物cysKP1(SEQ.ID.NO4)及cysKP3(SEQ.ID.NO5)及10ng大腸桿菌染色體DNA及Pwo聚合酶，首先擴(kuò)增cysK基因的啟動(dòng)子區(qū)，包含前15個(gè)密碼子，。5′-CCG GAA TTC CCG TTG CCG TTT CTG GCG-3′(SEQ.ID.NO4)5′-CGC GGA TCC GTG TGA CCG ATA GTC AGC-3′(SEQ.ID.NO5)條件相應(yīng)于實(shí)施例1中所述的條件。所得317個(gè)堿基對(duì)的產(chǎn)物依照制備商的說(shuō)明書(shū)用限制酶EcoRI及BamHI消化，并通過(guò)制備凝膠電冰及Geneclean方法純化。之后將該產(chǎn)物連接于載體pRS552(依照布達(dá)佩斯條約，于1999年9月14日，以保藏號(hào)DSM 13034保藏于德意志微生物保藏中心，不倫瑞克)，該載體pRS552同樣也已用EcoRI-BamHI消化并用磷酸酶處理。使用電穿孔，將菌株MC4100(ATCC 35695)用連接混合物轉(zhuǎn)化，通過(guò)限制分析鑒定陽(yáng)性克隆。這些陽(yáng)性克隆含有翻譯cysK-lacZ融合。依照Simons等的說(shuō)明，將所得質(zhì)粒與噬菌體λRS45(依照布達(dá)佩斯條約，于1999年9月14日，以保藏號(hào)DSM 13035保藏于德意志微生物保藏中心，不倫瑞克)重組，制得命名為λKZL300的重組噬菌體的均一溶胞產(chǎn)物。用該噬菌體感染Δlac菌株MC4100，通過(guò)卡那霉素選擇而鑒定現(xiàn)在可以用于測(cè)定CysB活性的溶原性克隆(MC4100∷λKZL300)。
為比較克隆入pACYC184-LH的多拷貝cysB基因的效果與cysB(T149M)基因的效果，將MC4100∷λKZL300用相應(yīng)的質(zhì)粒，即pACYC-CysB及pACYC-CysB(T149M)轉(zhuǎn)化。將菌株在含有不同硫源(各例均是1mM硫)且每升添加有15mg四環(huán)素的VB基本培養(yǎng)基(3.5g Na(NH4)HPO4/l；10g KH2PO4/l；2g檸檬酸×H2O/l；0.078gMgCl2/l；用NaOH將pH調(diào)節(jié)至6.5，5g葡萄糖/l；5mg維生素B1/l)內(nèi)培養(yǎng)。按照Miller(Miller J.H.，1972，Experiments in MolecularGenetics，Cold Spring Harbor，紐約，352-355)所述的方法測(cè)定β-半乳糖苷酶活性。
結(jié)果如表1所示。在對(duì)照(MC4100∷λKZL300/pACYC184-LH)的情況中，取決于硫源，發(fā)現(xiàn)CySB活性的調(diào)節(jié)模式是野生型CysB典型的調(diào)節(jié)模式；以硫代硫酸鹽生長(zhǎng)的細(xì)胞的CysB活性低于以硫酸鹽生長(zhǎng)的75％，以胱氨酸生長(zhǎng)的細(xì)胞的CysB活性低于以硫酸鹽生長(zhǎng)的20％。在野生型cysB基因多拷貝(本發(fā)明實(shí)例MC4100∷λKZL300/pACYC-CysB)的存在下，在活性全面提升的水平，該模式保留。相比而言，cysB(T149M)等位基因?qū)е陆M成型高水平活性而失去典型的調(diào)節(jié)模式。表1包含染色體cysK-lacZ融合的菌株的β-半乳搪苷酶活性形式的CysB活性的測(cè)定
實(shí)施例3構(gòu)建本發(fā)明的質(zhì)粒本發(fā)明的微生物的特征在于去調(diào)節(jié)的半胱氨酸代謝，以及，例如以多拷貝存在的cysB基因。選擇質(zhì)粒(pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306)作為制備這些微生物的基本構(gòu)建體。該質(zhì)粒含有抗反饋cysE等位基因及外流基因作為去調(diào)節(jié)半胱氨酸代謝的因子。其在專(zhuān)利申請(qǐng)EP 0885962 A1(實(shí)施例2D)中有詳細(xì)描述。將cysB片段插入該構(gòu)建體cysEX等位基因與外流基因之間，該構(gòu)體已用限制酶SnaBI消化并用磷酸酶處理。通過(guò)用酶EcoRI及BstXI限制及隨后用Klenow酶整平(smooth)DNA末端，自質(zhì)粒pTZ19U-cysB獲得cysB片段(圖2)。該質(zhì)粒命名為pHC34。
本發(fā)明的微生物通過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株W3110(ATCC 27325；Bachmann B.J.，1996，inNeidhardt F.C.(ed.)Escherichia coli andSalmonellacellular and molecular biology(大腸桿菌及沙門(mén)氏菌細(xì)胞及分子生物學(xué))，American Society for Microbiology，Washington D.C.，第133章)而獲得。使用電穿孔進(jìn)行轉(zhuǎn)化。為了進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將0.1μg質(zhì)粒DNA加入冰冷10％甘油溶液內(nèi)的濃稠細(xì)胞懸浮液中，之后使懸浮液經(jīng)受2500V、200歐姆及12.5μF的電子脈沖。將混合物轉(zhuǎn)移入無(wú)菌LB培養(yǎng)基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl)中并在30℃培養(yǎng)一小時(shí)后，在含有15μg四環(huán)素/ml的LB瓊脂板上選擇包含質(zhì)粒的克隆。
為了比較野生型cysB基因的效果及組成型cysB(T149M)等位基因的效果，制備類(lèi)似的構(gòu)建體(pHC30)并同樣地導(dǎo)入菌株W3100。此外，在EP 885962 A1中描述的微生物W3100，經(jīng)用質(zhì)粒pACYC184/cysEX-GAPDH-orf306轉(zhuǎn)化，用作用于比較的基本構(gòu)建體，同時(shí)，用以與已有技術(shù)劃界限。
因?yàn)閃3110是野生型菌株，因此所有半胱氨酸的產(chǎn)生效果均歸功于質(zhì)粒編碼的基因。實(shí)施例4使用本發(fā)明的微生物制備半胱氨酸為了檢測(cè)半胱氨酸的產(chǎn)生，在發(fā)酵罐內(nèi)，以補(bǔ)料分批模式培養(yǎng)實(shí)施例3中所述的微生物，同時(shí)連續(xù)加入葡萄糖及硫代硫酸鹽。所用裝置是Braun Biotech(Melsungen，德國(guó))Biostat M設(shè)備，其最大培養(yǎng)物容量為21。
接種20ml LB培養(yǎng)基(10g胰蛋白胨/l，5g酵母提取物/l，10gNaCl/l)，其另外含有15mg四環(huán)素/l)，作為預(yù)培養(yǎng)物，并于搖床內(nèi)，在30℃及150rpm下培養(yǎng)。7小時(shí)后，將全部混合物轉(zhuǎn)移入100ml SM1培養(yǎng)基(12g K2HPO4/l；3g KH2PO4/l；5g(NH4)2SO4/l；0.3g MgSO4×7H2O/l；0.015g CaCl2×2H2O/l；0.002g FeSO4×7H2O/l；1g Na3檸檬酸×2H2O/l；0.1g NaCl/l；1ml由0.15g Na2MoO4×2H2O/l；2.5gNaBO3/l；0.7g CoCl2×6H2O/l；0.25g CuSO4×5H2O/l；1.6g MnCl2×4H2O/l；0.3g ZnSO4×7H2O/l組成的補(bǔ)充有5g葡萄糖/l的微量元素溶液/l；0.5mg維生素B1/l及15mg四環(huán)素/l。隨后在30℃及150rpm下培養(yǎng)17小時(shí)。
該預(yù)培養(yǎng)物(在600nm處的光密度約為3)用于接種含有900ml發(fā)酵培養(yǎng)基(15g葡萄糖/l；10g胰蛋白胨/l；5g酵母提取物/l；5g(NH4)2SO4/l；1.5g KH2PO4/l；0.5g NaCl/l；0.3g MgSO4×7H2O/l；0.015g CaCl2×2H2O/l；0.075g FeSO4×7H2O/l；1g Na3檸檬酸×2H2O/l及每升1ml上述微量元素溶液，5mg維生素B1/l及15mg四環(huán)素/l，用25％氨水調(diào)節(jié)pH至7.0)的發(fā)酵罐。在發(fā)酵期間，溫度設(shè)定在30℃并通過(guò)計(jì)量加入25％氨水保持pH為7.0恒定。以1.5體積/體積/分鐘的速率，將無(wú)菌壓縮空氣通入培養(yǎng)物中并用攪拌器在轉(zhuǎn)速為200rpm下攪拌。氧飽和度降至50％后，用控制裝置將轉(zhuǎn)速提高至1200rpm以保持50％氧飽和度。
兩小時(shí)后，以3ml/h的速率將30％硫代硫酸鈉溶液計(jì)量加入。當(dāng)發(fā)酵器的葡萄糖含量由初始的15g/l降至約5-10g/l時(shí)，立即將葡萄糖從56％儲(chǔ)備液加入。添加葡萄糖的流速為8-14ml/h，試圖將葡萄糖濃度保持在約5-10g/l恒定。用YSI(Yellow Springs，俄亥俄州，美國(guó))的葡萄糖分析儀測(cè)定葡萄糖。
用Gaitonde試驗(yàn)(Gaitonde，M.K.(1967)，Biochem.J.104，627-633)以比色方式監(jiān)控L-半胱氨酸的產(chǎn)生。在這方面，必須考慮以下事實(shí)，該試驗(yàn)不能區(qū)分L-半胱氨酸與EP 0885962 A1中所述的L-半胱氨酸及丙酮酸的縮合產(chǎn)物(2-甲基噻唑烷-2，4-二羧酸)。由L-半胱氨酸氧化所形成的難溶的胱氨酸，經(jīng)溶解于8％鹽酸及隨后用二硫蘇糖醇(DTT)還原后，在pH 8.0的稀溶液內(nèi)同樣被檢測(cè)為L(zhǎng)-半胱氨酸。
表2所示是在EP 0885962 A1中描述的包含基本構(gòu)建體pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306的微生物發(fā)酵的制備過(guò)程，與本發(fā)明的包含質(zhì)粒pHC34的微生物的發(fā)酵的制備過(guò)程及包含含有編碼組成型活性cysB基因產(chǎn)物的cysB(T149M)等位基因的相應(yīng)的構(gòu)建體的微生物的發(fā)酵的制備過(guò)程比較。顯然，依照本發(fā)明，使用野生型cysB基因?qū)ιa(chǎn)性能產(chǎn)生正面影響，而組成型等位基因cysB(T149M)則顯示負(fù)面影響。表2使用本發(fā)明的pHC34構(gòu)建體及使用對(duì)照構(gòu)建體制備L-半胱氨酸
*有星號(hào)的值以是以難溶胱氨酸的氧化顯示存在的L-半胱氨酸的值。
序列表<110>電化學(xué)工業(yè)有限公司(國(guó)際)(Consortium fuer elektrochemische Industrie GmbH)<120>發(fā)酵制備L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物的方法<130>Co9905<140><141><160>5<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>1gttacgagat cgaagagg 18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>2gtcaccgagt ggtcaatg 18<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于體外誘變的寡核苷酸<400>3ttcgctatcg ccatggaagc gctgcat 27<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>4ccggaattcc cgttgccgtt tgtggcg 27<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>5cgcggatccg tgtgaccgat agtcagc 2權(quán)利要求
1.適于發(fā)酵制備L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物，且具有去調(diào)節(jié)的半胱氨酸代謝的微生物菌株，該半胱氨酸代謝的去調(diào)節(jié)不基于CysB活性的改變，其特征在于，該菌株另外具有增強(qiáng)的CysB活性，該CysB活性具有野生型CysB典型的調(diào)節(jié)模式。
2.適于發(fā)酵制備L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物，且具有去調(diào)節(jié)的半胱氨酸代謝的微生物菌株，該半胱氨酸代謝的去調(diào)節(jié)不基于CysB活性的改變，在該微生物菌株內(nèi)，編碼具有野生型CysB典型的調(diào)節(jié)模式的CysB的同源或異源cysB基因的表達(dá)程度增加。
3.如權(quán)利要求2所述的微生物菌株，其特征在于其是具有去調(diào)節(jié)的半胱氨酸代謝的大腸桿菌菌株，且在所述大腸桿菌菌株中，野生型cysB基因超量表達(dá)。
4.如權(quán)利要求3所述的微生物菌株，其特征在于其是具有去調(diào)節(jié)的半胱氨酸代謝的大腸桿菌菌株，且在所述大腸桿菌菌株中，大腸桿菌野生型cysB基因的拷貝數(shù)增加且該基因超量表達(dá)。
5.制備權(quán)利要求1至4之一的微生物的方法，其特征在于，在具有去調(diào)節(jié)的半胱氨酸代謝的微生物菌株內(nèi)，使用本領(lǐng)域已知的方法增加野生型cysB基因的拷貝數(shù)或編碼具有野生型CysB典型的調(diào)節(jié)模式的CysB的cysB基因的拷貝數(shù)，或者其特征在于，使用本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生野生型cysB基因的增加的表達(dá)或編碼具有野生型CysB典型的調(diào)節(jié)模式的CysB的cysB基因的增加的表達(dá)。
6.制備L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物的方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1至4之一的微生物菌株以本領(lǐng)域已知的方式進(jìn)行發(fā)酵，并自發(fā)酵混合物中分離L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物。
7.質(zhì)粒，其特征在于，其具有去調(diào)節(jié)半胱氨酸代謝的遺傳因子，這些遺傳因子不導(dǎo)致CysB活性的任何改變，且其還含有在啟動(dòng)子控制下的cysB基因。
8.制備權(quán)利要求1至4之一的微生物菌株的方法，其特征在于，將權(quán)利要求7的質(zhì)粒導(dǎo)入微生物菌株內(nèi)。
9.超量生產(chǎn)代謝物的方法，其特征在于，使來(lái)自L(fǎng)ysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子家族的調(diào)節(jié)基因在微生物內(nèi)超量表達(dá)，導(dǎo)致在該微生物內(nèi)代謝物的增加的生產(chǎn)。
10.來(lái)自L(fǎng)ysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子家族的調(diào)節(jié)基因用于超量生產(chǎn)代謝物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)微生物發(fā)酵制備L－半胱氨酸或L－半胱氨酸衍生物的方法,以及適于所述方法的微生物。適于發(fā)酵制備L－半胱氨酸或L－半胱氨酸衍生物的微生物菌株具有去調(diào)節(jié)的半胱氨酸代謝,所述半胱氨酸代謝不依賴(lài)于改變的CysB活性。所述微生物菌株的特征還在于增加的CysB活性,由此CysB活性具有野生型CysB典型的調(diào)節(jié)模式。
文檔編號(hào)C12R1/19GK1379823SQ00814272
公開(kāi)日2002年11月13日 申請(qǐng)日期2000年10月5日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月14日
發(fā)明者托馬斯·邁爾, 克里斯托夫·溫特哈爾特 申請(qǐng)人:電化學(xué)工業(yè)有限公司(國(guó)際)