MP合成以及MMP活性。
[0055] 其他MMP抑制劑也可以是有效的，包括，例如，??ΜΡ、PCK3145 (對(duì)應(yīng)于前列腺分泌 蛋白94的氨基酸31-45的合成肽）和馬立馬司他（BB-2516)。在早期臨床研宄中，PCK3145 和馬立馬司他都是良好耐受的。還可能不需要以一周為間隔的溶液替換，但需要探索軟骨 質(zhì)量與溶液體積的比例。對(duì)于不進(jìn)行溶液替換的長(zhǎng)期儲(chǔ)存，可能需要高多西環(huán)素濃度。
[0056] 實(shí)駘設(shè)計(jì):
[0057] 獲得豬軟骨塞并將這些塞在4°C (低溫條件）下儲(chǔ)存于附加有0-300 μ M多西環(huán)素 的不含動(dòng)物產(chǎn)品的DMEM中。在某些樣品中，每周改變介質(zhì)，如先前研宄中那樣（圖1-3)， 且對(duì)于其他樣品，在儲(chǔ)存期間不改變介質(zhì)。比較這兩個(gè)樣品組（即（1)每周改變的介質(zhì)和 (2)無介質(zhì)改變）。在某些方面中，一旦將同種異體移植物置于儲(chǔ)存中后，需要最小化同種 異體移植物的操作需要。
[0058] 方法:
[0059] 從成年家養(yǎng)約克郡跨農(nóng)場(chǎng)豬（25Kg)中在死后獲取豬膝。獲取膝后，將膝置于含有 碘溶液的密封塑料袋中并在冰上轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室用于無菌解剖。使用無菌穿孔制備股骨頭軟 骨盤狀塞。將5個(gè)塞的各組置于無菌容器內(nèi)的儲(chǔ)存溶液中，每周替換或不替換基質(zhì)，持續(xù) 1-2 月。
[0060] 代謝活件:
[0061] 使用刃天青還原試驗(yàn)來評(píng)估對(duì)照和經(jīng)處理的軟骨塞的代謝活性[O' Brien，2000 ; Brockbank，2011]。將組織塞（η = 5/實(shí)驗(yàn)/供體）在2ml的DMEM+10% FBS培養(yǎng)基中孵育 一小時(shí)以進(jìn)行平衡，隨后在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件下添加20%刃天青還原試驗(yàn)溶液，持續(xù)3小 時(shí)。刃天青還原試驗(yàn)試劑是基于代謝活性檢測(cè)的熒光指示劑。在544nm的激發(fā)波長(zhǎng)和590nm 的發(fā)射波長(zhǎng)下通過多模式酶標(biāo)儀重復(fù)測(cè)量熒光量。每天進(jìn)行該評(píng)估并持續(xù)數(shù)天以對(duì)組織中 經(jīng)復(fù)溫的細(xì)胞進(jìn)行表征（圖2)。刃天青在所用濃度下不具有細(xì)胞毒性，因此可在多種情況 下測(cè)試相同的組織樣品。復(fù)溫后不久（第〇天）的結(jié)果顯示細(xì)胞活力，1-2天后的下降表明 因?yàn)榈蛲霎a(chǎn)生的細(xì)胞死亡，而上升測(cè)量細(xì)胞增殖。隨后干燥組織塞以獲得干重。對(duì)于各實(shí) 驗(yàn)組和未處理對(duì)照，細(xì)胞代謝活性表示為每mg干重或每個(gè)組織塞的相對(duì)熒光單位（RFU)。
[0062] 其他活力評(píng)估方法:
[0063] 上文所述代謝試驗(yàn)是主要的活力評(píng)估方法；然而，還可進(jìn)行其他的活力評(píng)估試 驗(yàn)。例如，可通過細(xì)胞的熒光活/死染色進(jìn)一步測(cè)定細(xì)胞活力。還可在通過酶消化從 組織塞中釋放細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)估并使用基于膜完整性的臺(tái)盼藍(lán)排除試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估 [Brockbank，2011]。還可將細(xì)胞在DMEM中培養(yǎng)至少一周以驗(yàn)證細(xì)胞（軟骨細(xì)胞）實(shí)際上 能夠在體外粘附并增殖。可對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和數(shù)碼成像分析。
[0064] 水、蛋白聚糖和膠原含量：材料性能測(cè)量后，可將樣品凍干以測(cè)定水（孔隙）、 蛋白聚糖（S-GAG)和膠原（羥基脯氨酸）含量。基于阿基米德原理分析樣品的孔隙 度[Gu, 2004]，使用Farndale (1982)所述方法分析樣品的S-GAG并使用Bergman和 Loxley(1970)的方法分析樣品的羥基脯氨酸含量。
[0065] 電導(dǎo)率:
[0066] 使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備在零流體流動(dòng)條件下測(cè)量組織電導(dǎo)率[Gu 2002a ;2002b]，該設(shè)備 由置于含有各試樣的樹脂玻璃室周圍的電流和電壓電極組成。使用4導(dǎo)線方法和Keithley 源表的組合，在〇.〇15mA/cm2的非常低的電流密度下測(cè)量跨試樣的電阻（R)。電流傳感測(cè)微 計(jì)用于測(cè)量試樣尺寸，使用以下方程生成相應(yīng)的電導(dǎo)率：
[0067] X = h/ (RA) (1)
[0068] 其中A是橫截面面積，且h是組織試樣的厚度。在室溫（22°C )下在等滲或低滲磷 酸鹽緩沖鹽水（PBS，pH7. 4)中進(jìn)行電導(dǎo)率測(cè)量。
[0069] 溶質(zhì)擴(kuò)散率:
[0070] 在零流體流動(dòng)條件下，根據(jù)Maroudas (1968) NaCl溶液中組織的電導(dǎo)率（X )與Na+ 和Cl擴(kuò)散率（D α，α = +，-)相關(guān)：
[0071] X = Fc2<i)w(c+D++cTr)/RT， (2)
[0072] 其中F。是法拉第常數(shù)，#是水的體積分?jǐn)?shù)（孔隙度），c+是陽離子（Na+)濃度 且是陰離子（Cl 〇濃度，R是氣體常數(shù)，T是溫度?？墒褂锰颇戏匠蹋―onnan equation) [Maroudas, 1975]計(jì)算 c+和 c、
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種組合物，其包含置于溶液中的生物材料，所述溶液包含至少一種試劑，所述至少 一種試劑降低或防止生物材料性能損失，其中 所述溶液是不含動(dòng)物產(chǎn)品的溶液， 所述生物材料包括軟骨或胞外基質(zhì)中的軟骨細(xì)胞，且 所述至少一種試劑包括濃度范圍為1.0 nM-ImM的基質(zhì)金屬蛋白酶的酶抑制劑。
2. 如權(quán)利要求1所述的組合物，所述生物材料性能包括胞外基質(zhì)完整性、細(xì)胞活力或 其組合，其中，胞外基質(zhì)完整性包括胞外基質(zhì)滲透性、胞外基質(zhì)水含量、胞外基質(zhì)糖胺聚糖 含量或其任意組合。
3. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，所述溶液不包含胎牛血清。
4. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，所述不含動(dòng)物產(chǎn)品的溶液是等滲的胞外型 溶液，或者所述不含動(dòng)物產(chǎn)品的溶液是等滲的胞內(nèi)型溶液。
5. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，所述酶抑制劑最小化酶活性以降低或防止 生物性能損失，所述生物性能包括胞外基質(zhì)完整性。
6. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，所述基質(zhì)金屬蛋白酶包括一種或多種以下 物質(zhì)：MMPl、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、 MMP17、MMP19、MMP20、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27 和 MMP28〇
7. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，所述酶抑制劑選自多西環(huán)素、??ΜΡ、上調(diào)內(nèi) 源性 ??ΜΡ 的化合物、PCK3145、BB-2516 和 BB-94。
8. -種儲(chǔ)存生物材料的方法，包括制備前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，制 備權(quán)利要求1所述的組合物包括將所述生物材料置于溶液中，所述溶液包含至少一種降低 或防止生物材料性能損失的試劑。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，所述方法還包括在-25 °C至+35 °C范圍的溫度下在所述溶 液中儲(chǔ)存所述生物材料。
10. -種組合物，其包含不含動(dòng)物產(chǎn)品的溶液，其中 所述溶液包含濃度范圍為1. ΟηΜ-1000 μM的至少一種基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑， 所述不含動(dòng)物產(chǎn)品的溶液是不包含細(xì)胞培養(yǎng)基的胞內(nèi)型溶液，且 所述基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑降低或抑制ΜΜΡ1、ΜΜΡ2、ΜΜΡ3、ΜΜΡ7、ΜΜΡ8、ΜΜΡ9、ΜΜΡ10、 ΜΜΡ11、ΜΜΡ12、ΜΜΡ13、ΜΜΡ14、ΜΜΡ15、ΜΜΡ16、ΜΜΡ17、ΜΜΡ19、ΜΜΡ20、ΜΜΡ21、ΜΜΡ23Α、ΜΜΡ23Β、 ΜΜΡ24、ΜΜΡ25、ΜΜΡ26、ΜΜΡ27、ΜΜΡ28或其任意組合中至少一種的酶活性。
11. 如權(quán)利要求11所述的組合物，所述至少一種基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑降低或抑制 ΜΜΡ1、ΜΜΡ8、ΜΜΡ9和ΜΜΡ13中至少兩種的酶活性，或者所述至少一種基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑 降低或抑制ΜΜΡ1、ΜΜΡ8、ΜΜΡ9和ΜΜΡ13中至少三種的酶活性。
12. 如權(quán)利要求10和11所述的組合物，所述至少一種基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑選自多西 環(huán)素、??ΜΡ、上調(diào)內(nèi)源性??ΜΡ的化合物、PCK3145、ΒΒ-2516和ΒΒ-94。
13. 如權(quán)利要求10-12所述的組合物，其中，多西環(huán)素是所述至少一種基質(zhì)蛋白酶抑制 劑且濃度為1.0 nM-1000 μ Μ。
14. 如權(quán)利要求10-13所述的組合物，所述胞內(nèi)型溶液還包含營(yíng)養(yǎng)混合物，所述營(yíng)養(yǎng) 混合物包含至少一種以下組分：D-葡萄糖、甘氨酸、L-精氨酸鹽酸鹽、L-半胱氨酸鹽酸鹽、 L-谷氨酰胺、L-組氨酸鹽酸鹽、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸鹽酸鹽、L-甲硫氨酸、 L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、膽堿、D-泛酸鈣、葉 酸、煙酰胺、吡哆醇、核黃素、硫胺、肌醇、其任何鹽或其任意組合。
15. -種包括在低溫溫度下在權(quán)利要求10-14所述的組合物中儲(chǔ)存生物材料的方法， 其中 所述組合物包含至少一種添加劑，所述添加劑促進(jìn)胞外基質(zhì)完整性和細(xì)胞活力的保 留，且 所述至少一種添加劑包括酶抑制劑、氨基酸、多種氨基酸、糖、多種糖、脂質(zhì)、多種脂質(zhì)、 維生素、多種維生素，或其任意組合。
【專利摘要】本文描述了增強(qiáng)的用于儲(chǔ)存生物材料的組合物和方法。在某些方面中，這些生物材料包括天然和工程改造的真核組織。本文所述方法包括以降低或防止儲(chǔ)存期間或從儲(chǔ)存中取出生物材料后生物材料性能(如胞外基質(zhì)完整性、細(xì)胞活力或其組合)損失的方式儲(chǔ)存這些生物材料。在某些方面中，可在含有防止或降低胞外基質(zhì)完整性損失的試劑的不含動(dòng)物產(chǎn)品的溶液中儲(chǔ)存這些生物材料。
【IPC分類】C12N5-077, A01N1-02
【公開號(hào)】CN104837339
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380063773
【發(fā)明人】K·G·M·布魯克班克
【申請(qǐng)人】生命線科學(xué)有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2013年10月18日
【公告號(hào)】EP2908630A1, US20140113273, WO2014063041A1