生物材料性能的保存和儲存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及儲存真核細(xì)胞生物材料（例如與材料和組織相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞）的方法， 同時降低或防止儲存相關(guān)的生物材料性能的損失。本發(fā)明還涉及在儲存期間維持生物材料 的（i)胞外基質(zhì)完整性（包括胞外基質(zhì)滲透性、水含量和糖胺聚糖含量）以及（ii)細(xì)胞活 力。
【背景技術(shù)】
[0002] 在過去的幾十年間，已開發(fā)了儲存方法和技術(shù)以保存真核組織和細(xì)胞。這些儲存 方法和技術(shù)涉及在工程改造的胞外基質(zhì)、工程改造的組織和天然組織中將各種真核細(xì)胞儲 存一段時間，儲存方式允許在之后使用這些儲存的組織，如用于植入或移植至患者或用于 藥物或化學(xué)篩選生物試驗。
[0003] 雖然這些儲存方法和技術(shù)廣泛地適用于基礎(chǔ)研宄和轉(zhuǎn)化研宄環(huán)境，但在儲存期間 維持生物材料性能（例如胞外基質(zhì)完整性和細(xì)胞活力）仍是一項挑戰(zhàn)。例如，使用現(xiàn)有技 術(shù)時觀察到了顯著降低的胞外基質(zhì)滲透性和組織細(xì)胞活力，且這些降低可導(dǎo)致從儲存中取 出后低效的生物材料功能。
[0004] 在一個示例中，使用多種儲存技術(shù)保存軟骨細(xì)胞和軟骨組織，隨后將其從儲存中 取出并用作骨軟骨同種異體移植物。該同種異體移植物可修復(fù)（1)外傷誘導(dǎo)的軟骨缺陷和 (2)由骨關(guān)節(jié)炎破壞的軟骨表面。使用軟骨細(xì)胞和軟骨作為骨軟骨同種異體移植物以治療 骨關(guān)節(jié)炎是重要的，因為預(yù)測骨關(guān)節(jié)炎目前在美國影響約2000萬人。因此，結(jié)果是，已產(chǎn)生 了一個巨大的產(chǎn)業(yè)用于提供整形外科植入物來治療因內(nèi)源性軟骨缺失或內(nèi)源性軟骨損傷 而導(dǎo)致具有缺陷型關(guān)節(jié)、骨質(zhì)疏松性骨折或背部疾病的人。
[0005] 雖然骨軟骨同種異體移植物顯示出治療軟骨相關(guān)醫(yī)療病癥的希望，但移植的關(guān)節(jié) 軟骨的軟骨細(xì)胞活力和胞外基質(zhì)完整性很大程度上決定了骨軟骨同種異體移植物移植的 結(jié)果（即成功的手術(shù)效果對比失敗的手術(shù)效果等）。目前的保存技術(shù)無法可接受地維持軟 骨的胞外細(xì)胞基質(zhì)完整性并在某些方面提高軟骨細(xì)胞活力。例如，常規(guī)的軟骨細(xì)胞和軟骨 低溫保存包括在包含二甲亞砜（DMSO)的溶液中冷凍這些細(xì)胞和組織，但這些技術(shù)導(dǎo)致關(guān) 節(jié)軟骨中80 - 100%的軟骨細(xì)胞死亡且胞外基質(zhì)因為冰的形成而受損。
[0006] 上述較差的低溫保存結(jié)果最終導(dǎo)致移植所謂"新鮮"關(guān)節(jié)部分（即軟骨細(xì)胞和/或 軟骨同種異體移植物）的實踐。例如，通常在供體死亡的24小時內(nèi)收獲供體來源的骨軟骨 組織移植物并在4°C下儲存最多42天以用于修復(fù)臨床軟骨缺陷。此外，將市售可得的新鮮 骨關(guān)節(jié)同種異體移植物儲存至少17天以允許在移植前進(jìn)行血清學(xué)和微生物學(xué)測試以最小 化受體中的潛在感染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 雖然骨軟骨同種異體移植物移植已經(jīng)是用于修復(fù)（1)外傷誘導(dǎo)的軟骨缺陷和（2) 由骨關(guān)節(jié)炎破壞的軟骨表面的有效治療方法，但對于在儲存期間維持軟骨的軟骨細(xì)胞活力 和胞外基質(zhì)完整性而言仍存在多項挑戰(zhàn)。最近的研宄表明，重要的是同時維持軟骨細(xì)胞活 力和胞外基質(zhì)完整性以促進(jìn)成功的同種異體移植物移植。例如，如果從儲存中取出期間或 之后細(xì)胞活力和/或基質(zhì)完整性降低，則成功移植的可能性也會降低。在工程改造或天然 的組織中的大多數(shù)真核細(xì)胞中都存在這些挑戰(zhàn)。因此，新的真核組織和細(xì)胞保存技術(shù)是有 用的。
[0008] 本文描述了用于儲存生物材料的組合物和方法。在某些方面中，這些生物材料包 括真核細(xì)胞和真核組織，如軟骨細(xì)胞和軟骨。本文所述方法包括以降低或防止儲存期間或 從儲存中取出生物材料后生物材料性能（如胞外基質(zhì)滲透性和軟骨細(xì)胞活力）損失的方式 儲存這些生物材料。在某些方面中，將這些生物材料置于溶液中并隨后儲存以用于下次使 用，所述溶液包含動物來源的產(chǎn)物。在某些方面中，本文所述溶液含有防止或降低生物材料 性能損失的試劑，且在某些方面中，該試劑可包括至少一種酶的抑制劑。例如，該試劑可包 括天然或合成的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP)抑制劑，其包括但不限于內(nèi)源性金屬蛋白酶組織抑 制劑（TIMP)、調(diào)節(jié)TIMP合成的化合物或多西環(huán)素等。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)勢部分列于后文說明書中或可通過下文所述方面的實踐進(jìn)行了解。通 過所附權(quán)利要求中特別指出的要素和組合將會認(rèn)識和獲得下述優(yōu)點。應(yīng)當(dāng)理解，上述一般 描述和以下詳細(xì)描述僅僅是示例性和說明性的，而非限制性的。
【附圖說明】
[0010] 圖1比較軟骨細(xì)胞在四種不同溶液中儲存28天后的軟骨細(xì)胞活力和增殖。通過 測量各樣品的相對熒光單位（RFU)來定量活力和增殖。
[0011] 圖2顯示4種不同溶液中冷儲存期間高細(xì)胞活力與軟骨基質(zhì)滲透性和電導(dǎo)率損失 之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)（R 2)。如圖2所示，在4天的儲存后恢復(fù)組織培養(yǎng)期間，關(guān)聯(lián)系數(shù)從0. 78 升尚至〇. 90。
[0012] 圖3顯示低溫儲存對于軟骨滲透性的影響，其基于低滲鹽水中軟骨樣品的電導(dǎo) 率。
[0013] 圖4是用于定量軟骨機械性能（如蠕變壓縮）的壓縮室的示意圖。
[0014] 圖5顯示多種儲存間隔后多西環(huán)素濃度對于軟骨細(xì)胞活力的影響。
[0015] 圖6顯示在多種多西環(huán)素濃度中冷凍儲存一個月后對豬軟骨塞電導(dǎo)率的影響。
[0016] 實施方式詳沐
[0017] 通過參考以下特定實施方式的詳述、本文包含的實施例以及附圖及其描述，可以 容易地理解公開的方法和組合物。下文所述各方面不限于所述特定組合物和/或方法，其 當(dāng)然可以變化。
[0018] 本申請引用了多份出版物。這些出版物全文以及下文參考文獻(xiàn)列表中包含的出版 物的公開內(nèi)容在此通過引用全文納入本申請中以更完整地描述本申請所屬領(lǐng)域的狀態(tài)。所 公開的參考文獻(xiàn)還根據(jù)參考的特定部分單獨和特定地通過引用納入本文。
[0019] 可以以范圍的形式表示或給出濃度、數(shù)量和其它數(shù)值數(shù)據(jù)。應(yīng)該理解，使用這種范 圍形式只是為了方便和簡潔，因此，應(yīng)該靈活地將其解釋成不僅包括作為范圍界限明確列 舉的數(shù)值，而且包括所有包含在該范圍內(nèi)的單個數(shù)值或子范圍，就如同各數(shù)值和子范圍都 已明確列舉。例如，"約1至5"的數(shù)值范圍應(yīng)理解為不僅包括明確表示的約1至約5的數(shù) 值，還單獨地包括單個值（如2、3和4)和子范圍（如1-3、2-4和3-5等）以及1、2、3、4和 5。相同的原理適用于僅僅陳述了一個作為最小值或最大值的數(shù)值的范圍。此外，無論所描 述的范圍或特征的寬度如何，這種解釋都適用。
[0020] 在本說明書和后面的權(quán)利要求書中將提到許多術(shù)語，這些術(shù)語應(yīng)具有以下定義：
[0021] "不含動物產(chǎn)品"的溶液包括除下文所述生物材料外不包含動物產(chǎn)品或來源于動 物的任何產(chǎn)品的溶液。"動物產(chǎn)品"可包括胎牛血清（FBS)，其是包括生長因子的動物來源 的產(chǎn)品并通常用于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。因此，在一個示例中，"不含動物產(chǎn)品"的溶液可包括缺少 FBS的溶液。
[0022] 術(shù)語"生物材料"包括非植物、哺乳動物真核細(xì)胞和組織。
[0023] 本文描述了活生物材料和用于儲存這類生物材料的方法。在某些方面中，這些生 物材料包括工程改造和天然的組織中的真核細(xì)胞，且本文所述方法包括以降低或防止儲存 期間或從儲存中取出生物材料后生物材料性能損失（例如，降低或防止胞外基質(zhì)滲透性、 組織細(xì)胞活力或其組合的損失）的方式儲存這些生物材料。在某些方面中，將這些生物材 料置于溶液中，其可包括不含動物產(chǎn)品的溶液，含有至少一種降低或防止生物材料性能損 失的試劑。隨后，將置于含有至少一種試劑的溶液中的生物材料在特定溫度范圍下儲存直 至進(jìn)一步需要這些生物材料時。對至少一種試劑的濃度進(jìn)行優(yōu)化從而最大化生物材料性能 (如胞外基質(zhì)完整性和細(xì)胞活力）。
[0024] 在某些方面中，該生物材料可包括任何非植物、哺乳動物真核細(xì)胞和/或組織，包 括原代細(xì)胞（如非永生細(xì)胞和/或組織）和永生細(xì)胞。在某些方面中，該生物材料可包括 天然和工程改造的組織和細(xì)胞。天然和工程改造的生物材料的示例可包括但不限于：軟骨 細(xì)胞、軟骨、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨、組織塞（tissue plug)、同種異體移植物組織塞、軟骨 組織塞、角膜、心臟瓣膜、血管、輸尿管、腸、皮膚、牙齒、腫瘤活檢、椎間盤或椎間體、韌帶、肌 腱等。在至少一個方面中，該生物材料包括至少軟骨細(xì)胞、軟骨或其組合。在其他方面中， 該生物材料僅包括軟骨細(xì)胞、軟骨或其組合。在某些方面中，該生物材料包括自體移植物組 織、同種異體移植物組織和異種移植物組織。例如，對于合適的人移植物組織，同種異體組 織和/或組織塞可來源于人供體。異種移植物組織可來源于豬供體、牛供體、綿羊供體、馬 供體或任何其他物種以用于醫(yī)療目的。本文所述組織還可來源于相同物種中獸醫(yī)應(yīng)用的動 物物種；示例包括狗、貓、綿羊、奶牛和馬。
[0025] 在由本文所述組合物和方法使用本文所述組織和細(xì)胞時，一個目的是防止胞外基 質(zhì)完整性的損失和/或降低或防止細(xì)胞活力的損失。例如，可基于胞外膜滲透性、胞外膜水 含量、胞外膜糖胺聚糖含量或其組合來測定胞外基質(zhì)完整性。在某些方面中，在儲存生物材 料以防止或降低胞外基質(zhì)完整性損失時，一個目的是維持胞外膜滲透性、胞外膜水含量、胞 外膜糖胺聚糖含量或其組合中的至少一種。在測定生物材料的基質(zhì)完整性時，可使用本領(lǐng) 域已知的多種技術(shù)。這些技術(shù)包括測量滲透性、水含量和糖胺聚糖含量的基質(zhì)電導(dǎo)率試驗、 凹痕測試、壓力/應(yīng)變測試、彈性、拉曼光譜、各種顯微鏡方法（如具有二次諧波發(fā)生的激光 掃描顯微鏡）等。如上文進(jìn)一步說明的那樣，另一個目的是降低或防止生物材料細(xì)胞活力 的損失。在某些方面中，可使用本文所述組合物和方法來降低或防止多種類型的細(xì)胞死亡， 包括但不限于，壞死性細(xì)胞死亡、凋亡性細(xì)胞死亡、自噬性（II型）細(xì)胞死亡、失巢凋亡和壞 死性凋亡，并且在某些方面中，可通過使用下文進(jìn)一步描述的試劑來限制這些類型的細(xì)胞 死亡。此外，還可以使用代謝活性試驗（如刃天青試驗）、各種細(xì)胞染色技術(shù)（如過