鳳陽產(chǎn)氣霉制劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物農(nóng)藥領(lǐng)域，尤其是提供一種內(nèi)生真菌制劑，更確切的說，是能夠產(chǎn) 生抑菌活性氣體的鳳陽產(chǎn)氣霉制劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 產(chǎn)氣霉（Muscodorspp.)(現(xiàn)在也稱麝香霉）是一類屬于炭角菌科的內(nèi)生真菌， 最早由Worapong等（2001)從肉桂樹分離所得，其顯著特征是能產(chǎn)生揮發(fā)性有機(jī)化合物 (volatileorganiccompounds，簡(jiǎn)稱VOCs)，這些VOCs具有廣泛的生物活性，能抑制或殺死 許多病原真菌、病原細(xì)菌和一些昆蟲。而后，人們利用其特有的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)方 面的特征及核糖體RNA的序列來尋找和鑒定新的產(chǎn)氣霉屬內(nèi)生真菌，越來越多的產(chǎn)氣霉種 被發(fā)現(xiàn)。由于產(chǎn)氣霉能產(chǎn)生有廣泛抑菌活性的VOCs，科學(xué)家們利用GC-MS等化學(xué)分析手段 分離鑒定了產(chǎn)氣霉產(chǎn)生的VOCs成分，發(fā)現(xiàn)不同菌株產(chǎn)生的VOCs成分不盡相同。
[0003] 生物制劑的開發(fā)中非常重要的環(huán)節(jié)是通過發(fā)酵規(guī)模化生產(chǎn)。發(fā)酵分為固體發(fā)酵和 液體發(fā)酵。固體發(fā)酵（solid-statefermentation，SSF)是在指不存在或幾乎沒有自由水 (基質(zhì)必須具有足夠的濕度支持微生物的生長(zhǎng)和代謝）的條件下進(jìn)行發(fā)酵。（Pandey等， 1992 ;1994 ;2000 ;2001)。從生物反應(yīng)過程的角度考慮，固態(tài)發(fā)酵是以氣相為連續(xù)相的生物 反應(yīng)過程，我們可以認(rèn)為固體發(fā)酵是一種在培養(yǎng)基為固體載體的基礎(chǔ)上進(jìn)行利用的一種發(fā) 酵手段（Mitchell等，2000)。
[0004]固體發(fā)酵與液體發(fā)酵相比有許多顯著的優(yōu)點(diǎn)：發(fā)酵原料成本低（經(jīng)常是農(nóng)業(yè)廢棄 物），能源消耗低，操作簡(jiǎn)單，較少的廢水產(chǎn)生；對(duì)無菌要求相對(duì)較低，不易發(fā)生大面積的污 染；單位體積的產(chǎn)量高，能用較小的反應(yīng)器進(jìn)行發(fā)酵；并且對(duì)環(huán)境友好，因?yàn)榇思夹g(shù)解決了 固體廢棄物的處置問題（Pandey等，2008 ;Matthew等，2009)。SSF由于發(fā)酵環(huán)境類似于微 生物的自然習(xí)慣，對(duì)于微生物來說，SSF十分適合其生長(zhǎng)并且能產(chǎn)生有價(jià)值的副產(chǎn)品。固體 發(fā)酵已經(jīng)成為一種應(yīng)用于生產(chǎn)微生物產(chǎn)品如飼料、燃料、工業(yè)化學(xué)品和醫(yī)藥產(chǎn)品的有潛力 的技術(shù)。
[0005] 關(guān)于固體發(fā)酵的發(fā)展可追溯至20世紀(jì)50年代。利用真菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)化類固醇，利用 SSF生產(chǎn)出霉菌毒素產(chǎn)物，固體發(fā)酵生產(chǎn)富含蛋白質(zhì)的牛飼料（此過程中包括了農(nóng)用工業(yè) 廢渣的利用，因此提供了對(duì)低成本廢渣增值的獨(dú)特工藝開發(fā)，Singhania等，2009);這一系 列固體發(fā)酵的成果引起了研宄者們對(duì)SSF的興趣，SSF取得了空前的發(fā)展（Singhania等， 2009)。關(guān)于SSF的基礎(chǔ)研宄、生物反應(yīng)器的發(fā)展、建模和生產(chǎn)不同的微生物產(chǎn)品（如食物、 飼料、不同的基礎(chǔ)和次級(jí)代謝產(chǎn)物以及如生物浸出、生物制漿、生物修復(fù)、生物選礦的生物 過程）等方面產(chǎn)生了大量研宄。
[0006] 至今，有許多人研宄影響固體發(fā)酵進(jìn)程的生物化學(xué)和工程學(xué)的因素（Mitchell 等，2000a，2000b;Pandey，2003)，雖然SSF中的許多技術(shù)細(xì)節(jié)仍未得到解決（HSIker等， 2004)，但SSF在生物技術(shù)中的運(yùn)用仍十分廣泛（Raimbault等，1998 ;Pandey等，2000a， 2001b)。毒素、細(xì)菌內(nèi)毒素、植物生長(zhǎng)因子、抗生素、免疫抑制藥物、生物堿，這些重要的生物 活性物質(zhì)已經(jīng)被廣泛報(bào)道通過SSF生產(chǎn)。工業(yè)酶，如淀粉酶，纖維素酶，木聚糖酶，蛋白酶， 植酸酶，脂肪酶等，有機(jī)酸如檸檬酸和乳酸等也已通過SSF大量生產(chǎn)（Krishna等，2005)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種鳳陽產(chǎn)氣霉制劑的制備方法。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種鳳陽產(chǎn)氣霉制劑的制備方法，包括以下 步驟：
[0009] 制備鳳陽產(chǎn)氣霉固體發(fā)酵產(chǎn)物：
[0010] 將鳳陽產(chǎn)氣霉的一級(jí)發(fā)酵種子（即液體發(fā)酵種子）按照10~20ml:100g(較佳為 20ml:100g)的用量比接種于發(fā)酵基質(zhì)上進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵工藝為：于24. 5~25. 5°C(較佳為 25°C)黑暗靜培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為8~10天；得固體發(fā)酵產(chǎn)物。該固體發(fā)酵產(chǎn)物能直接作為 鳳陽產(chǎn)氣霉制劑。
[0011] 作為本發(fā)明的鳳陽產(chǎn)氣霉制劑的制備方法的改進(jìn)：將固體發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)液包 衣并風(fēng)干：
[0012] 所述營(yíng)養(yǎng)液為以下任意一種：3%~5%的海藻糖水溶液、3%~5%的海藻酸鈉水 溶液、0. 1 %~0. 2%黃原膠水溶液、水（較佳），上述％均為質(zhì)量％ ;
[0013] 將固體發(fā)酵產(chǎn)物按照lg:0.9~I.Iml(較佳為lg:Iml)的固液比浸泡于滅菌后營(yíng) 養(yǎng)液中，浸泡時(shí)間為10~12小時(shí)（較佳為10小時(shí)）；
[0014] 備注說明：將營(yíng)養(yǎng)液經(jīng)常規(guī)滅菌（于121°C、1. 1個(gè)大氣壓滅菌20min)，得滅菌后 營(yíng)養(yǎng)液。
[0015] 將浸泡后所得的固體發(fā)酵產(chǎn)物風(fēng)干（超凈工作臺(tái)風(fēng)干）至含水率為6%~10% (較佳為8%，％為質(zhì)量％ );風(fēng)干后產(chǎn)物為鳳陽產(chǎn)氣霉制劑。
[0016] 作為本發(fā)明的鳳陽產(chǎn)氣霉制劑的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)：將鳳陽產(chǎn)氣霉制劑進(jìn)行 包裝處理；所述包裝處理包括抽真空和塑封處理。
[0017] 作為本發(fā)明的鳳陽產(chǎn)氣霉制劑的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述發(fā)酵基質(zhì)為麥粒固 體發(fā)酵培養(yǎng)基或低成本發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0018] 所述麥粒固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為：將麥粒放入水中浸泡7~9h，將浸泡 后所得的麥粒進(jìn)行滅菌（常規(guī)方式滅菌2次，S卩，具體為：于121°C、1. 1個(gè)大氣壓滅菌 40min)；
[0019] 所述低成本發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為：配制原料，所述原料由以下重量含量的成 分組成：40%麩皮、20%豆餅、30%玉米粒和10%米糠；將原料與去離子水按照Ig:1ml的 比例混合后進(jìn)行滅菌（常規(guī)方式滅菌2次，S卩，具體為：于121°C、I. 1個(gè)大氣壓滅菌40min)。
[0020] 作為本發(fā)明的鳳陽產(chǎn)氣霉制劑的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)：鳳陽產(chǎn)氣霉的一級(jí)發(fā)酵 種子（即液體發(fā)酵種子）的制備方法為：將ZJL024菌于PDB培養(yǎng)液中，200r/min、黑暗25°C 培養(yǎng)6天，得一級(jí)發(fā)酵種子。
[0021 ] 作為本發(fā)明的鳳陽產(chǎn)氣霉制劑的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述鳳陽產(chǎn)氣霉制劑的 保存溫度為4°C。
[0022] 本發(fā)明所述的鳳陽產(chǎn)氣霉為Muscodorsp.ZJLQ024 (亦名：Muscodor.fengyangensisZJLQ024)，在專利號(hào)為 200910153512. 0 的發(fā)明《Muscodorsp?屬植物內(nèi)生 真菌ZJLQ024及其用途和殺菌劑》中有明確告知，保藏號(hào)為CGMCCNo. 2863。
[0023] 產(chǎn)氣霉因其產(chǎn)生的VOCs對(duì)多數(shù)細(xì)菌、真菌及昆蟲具有抑制甚至殺死作用，其作為 生物防治制劑具有很大的應(yīng)用潛力，目前在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥及工業(yè)應(yīng)用上受到越來越多科技工 作者的重視。
[0024] 本發(fā)明所得的固體發(fā)酵產(chǎn)物，可直接使用；本發(fā)明所得的固體發(fā)酵產(chǎn)物僅僅用滅 菌后營(yíng)養(yǎng)液浸泡后，也可直接使用。滅菌后營(yíng)養(yǎng)液浸泡并風(fēng)干后的鳳陽產(chǎn)氣霉制劑，使用前 需：將無菌棉花鋪在無菌塑料瓶底部，加無菌水浸濕，加入上述鳳陽產(chǎn)氣霉制劑（滅菌后營(yíng) 養(yǎng)液浸泡并風(fēng)干后的鳳陽產(chǎn)氣霉制劑），再用水噴灑潤(rùn)濕表面，蓋蓋。于4°C保存，使用時(shí)， 即開即用。
[0025] 本發(fā)明的鳳陽產(chǎn)氣霉制劑實(shí)際使用時(shí)，在每10升容器內(nèi)放置30~80克的鳳陽產(chǎn) 氣霉制劑，就能對(duì)容器內(nèi)的物質(zhì)產(chǎn)生保鮮防腐殺菌的作用。
[0026] 本發(fā)明的鳳陽產(chǎn)氣霉制劑的制備方法為固體發(fā)酵方式，具有成本較低、工藝簡(jiǎn)潔、 保鮮防腐殺菌好的優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0027] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0028] 圖1 :鳳陽產(chǎn)氣霉ZJLQ024隨PDB搖床培養(yǎng)時(shí)間變化的生物量；
[0029] 圖2 :鳳陽產(chǎn)氣霉ZJLQ024不同初始接種量發(fā)酵不同時(shí)間的生物量；
[0030] 圖3 :鳳陽產(chǎn)氣霉ZJLQ024初始接種量為20ml的發(fā)酵成品圖；
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