本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術中植物組織培養(yǎng)的方法,具體地說,涉及一種中藥青藤的組培快繁方法。
背景技術:
中藥青藤(sinomeniumacutum),又名青風藤、尋風藤、扶風藤、楓風藤等,是防已科防已屬植物的干燥根莖,其富含具青藤堿、雙青藤堿、四氫表小粟堿、尖防己堿、土藤堿、木蘭堿、異青藤堿、尖防己定堿、白蘭花堿等,有通絡、止痛、祛風濕功效,常用于風濕及類風濕性關節(jié)炎、關節(jié)腫大、肢體疼痛、麻木等疾病的治療。作為一種具有獨特藥效的中藥,在民間應用青藤或其復方內服或外用治療風濕性疾病已有一千多年的歷史。由于其對風濕性疾病具有良好的療效,目前已將其應用于中成藥制劑,如正清風痛寧注射液、正清風痛寧緩釋片、風濕止痛藥酒、正清風痛寧片、芪麝頸康丸、追風活絡膠囊等。
目前青藤處于野生狀態(tài),但由于藥農(nóng)無序采挖,其野生資源銳減,因此人工栽培青藤顯得十分迫切!青藤可通過種子、扦插、壓條等方式繁殖,但均存在周期長、繁殖系數(shù)低下等缺點,限制了青藤種苗的生產(chǎn)。因此有必要建立青藤的組培快繁體系,為青藤的人工規(guī)?;N植提供優(yōu)質種苗。本發(fā)明選擇青藤帶節(jié)莖段為外植體,經(jīng)誘導、增殖、生根、煉苗以及移栽等步驟,建立了中藥青藤的組培快速繁殖體系。本發(fā)明具有周期短、成本低廉、繁殖系數(shù)高等特點,可直接用于青藤種苗的工廠化生產(chǎn),對于促進中藥青藤的植物資源開發(fā)具有重要的現(xiàn)實意義。
至目前為止,國內外尚未有青藤組織培養(yǎng)技術的報道,也未有青藤組培快繁專利的申請。
技術實現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的是提供一種中藥青藤的組培快繁方法,本發(fā)明選擇青藤帶節(jié)莖段為外植體,經(jīng)誘導、增殖、生根、煉苗以及移栽等步驟,其誘導率達到了89%以上,成活率達到了90%以上,實現(xiàn)了中藥青藤的組培快繁,從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
本發(fā)明提供的技術方案為:一種中藥青藤的組培快繁方法,包括依次進行的如下步驟:獲取青藤的外植體、外植體誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、移栽;
所述的外植體誘導培養(yǎng)操作的外植體誘導培養(yǎng)基包括:b5培養(yǎng)基、1.0~3.0mg/l6-ba、0.5~1.0mg/lnaa、0.05~0.1mg/lga3、25~30g/l蔗糖、3.5~4.0g/l瓊脂、0.5~1.0g/l活性炭,外植體誘導培養(yǎng)基ph為5.4~5.8。
在上述的中藥青藤的組培快繁方法中,所述的外植體誘導培養(yǎng)操作的方法為:將采集得到的作為外植體的青藤的帶節(jié)藤莖消毒后剪切成2.0~2.5cm的帶節(jié)藤莖并接種到誘導培養(yǎng)基中,置于25~28℃進行全暗培養(yǎng)40~60天即可誘導形成不定芽。
在上述的中藥青藤的組培快繁方法中,所述的增殖培養(yǎng)操作所用到的增殖培養(yǎng)基包括:ms培養(yǎng)基、ms培養(yǎng)基、3.0~5.0mg/l6-ba、0.5~1.0mg/lnaa、20~30g/l蔗糖、3.5~4.0g/l瓊脂、0.1~0.5g/l活性炭,增殖培養(yǎng)基ph為5.4~5.8。
在上述的中藥青藤的組培快繁方法中,所述的增殖培養(yǎng)操作具體為:將外植體誘導培養(yǎng)操作得到的不定芽切成長1.5~2.0cm的莖段并接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)30~40天即可實現(xiàn)不定芽的增殖。
在上述的中藥青藤的組培快繁方法中,所述的生根培養(yǎng)操作所用到的生根培養(yǎng)基包括:1/2ms培養(yǎng)基、0.5~1.0mg/lggr-5、0.5~1.0mg/liba、15~20g/l蔗糖、3.0~4.0g/l瓊脂、0.1~0.3g/l活性炭,生根培養(yǎng)基ph為5.4~5.8。
在上述的中藥青藤的組培快繁方法中,所述的生根培養(yǎng)操作的方法為:從基部切取所述的增殖培養(yǎng)操作得到的長2.0~3.0cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30~35天即能實現(xiàn)試管苗的生根。
在上述的中藥青藤的組培快繁方法中,所述的移栽操作的具體方法為:將經(jīng)生根培養(yǎng)操作得到的根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗1~2天,洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、泥炭土混合基質中栽培成苗即得種苗。
在上述的中藥青藤的組培快繁方法中,增殖培養(yǎng)操作、生根培養(yǎng)操中培養(yǎng)條件均為:培養(yǎng)溫度為25~28℃,光照強度為2500~3000lx,光照時間為11~13小時/天。
有益效果:
本發(fā)明采用植物組織培養(yǎng)技術建立了中藥青藤的組培快速繁殖體系,本發(fā)明具有周期短、成本低廉、繁殖系數(shù)高等特點,可直接用于青藤種苗的工廠化生產(chǎn),對于促進中藥青藤的植物資源開發(fā)具有重要的現(xiàn)實意義。
具體實施方式
下面結合具體實施方式,對本發(fā)明的技術方案作進一步的詳細說明,但不構成對本發(fā)明的任何限制。
實施例一
(1)外植體采集:在野外選取生長健壯、無明顯病害的青藤植株中上部、向陽充實的帶節(jié)藤莖為外植體,采集后立即進行保水保濕處理并及時帶回實驗室。
(2)外植體誘導:當步驟(1)采集回實驗室外植體先在自來水下沖洗過夜,置于超凈工作臺中于75%的乙醇溶液中消毒10秒鐘,無菌水沖洗3次后用無菌濾紙吸干水分后,置于0.1%的升汞溶液中消毒20分鐘,無菌水沖洗5次后用無菌濾紙吸干水分后切成2.0~2.5cm左右的帶節(jié)藤莖并接種到誘導培養(yǎng)基中,置于25℃進行全暗培養(yǎng)40天即可誘導形成不定芽,誘導率為93.2%,污染率低于20%。所述的誘導培養(yǎng)基為:b5培養(yǎng)基+3.0mg/l6-ba+1.0mg/lnaa+0.1mg/lga3+25g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂+0.5g/l活性炭,ph為5.4。
(3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)誘導得到的不定芽切成長約1.5~2.0cm的莖段并接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天即可實現(xiàn)不定芽的增殖,增殖系數(shù)達到6.0倍。所述的增殖培養(yǎng)基為:ms培養(yǎng)基+5.0mg/l6-ba+1.0mg/lnaa+20g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂+0.1g/l活性炭,ph為5.4。
(4)生根培養(yǎng):從基部切取步驟(3)增殖得到的長約2.0~3.0cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天即能實現(xiàn)試管苗的生根,生根率為95.6%。所述的生根培養(yǎng)基為:1/2ms培養(yǎng)基+1.0mg/lggr-5(生根粉)+1.0mg/liba+15g/l蔗糖+3.0g/l瓊脂+0.1g/l活性炭,ph為5.4。
(5)移栽:將步驟(4)根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗1天,洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、泥炭土混合基質中栽培成苗即得種苗,移栽30天后成活率達到97%以上。
上述步驟(3)~(4)的培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為25℃,光照強度為2500lx,光照時間為11小時/天。
實施例二
(1)外植體采集:在野外選取生長健壯、無明顯病害的青藤植株中上部、向陽充實的帶節(jié)藤莖為外植體,采集后立即進行保水保濕處理并及時帶回實驗室。
(2)外植體誘導:當步驟(1)采集回實驗室外植體先在自來水下沖洗過夜,置于超凈工作臺中于75%的乙醇溶液中消毒13秒鐘,無菌水沖洗4次后用無菌濾紙吸干水分后,置于0.1%的升汞溶液中消毒25分鐘,無菌水沖洗6次后用無菌濾紙吸干水分后切成2.0~2.5cm左右的帶節(jié)藤莖并接種到誘導培養(yǎng)基中,置于27℃進行全暗培養(yǎng)48天即可誘導形成不定芽,誘導率為91.5%,污染率低于15%。所述的誘導培養(yǎng)基為:b5培養(yǎng)基+2.0mg/l6-ba+0.7mg/lnaa+0.08mg/lga3+27g/l蔗糖+3.7g/l瓊脂+0.8g/l活性炭,ph為5.6。
(3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)誘導得到的不定芽切成長約1.5~2.0cm的莖段并接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)35天即可實現(xiàn)不定芽的增殖,增殖系數(shù)達到5.3倍。所述的增殖培養(yǎng)基為:ms培養(yǎng)基+4.4mg/l6-ba+0.8mg/lnaa+25g/l蔗糖+3.7g/l瓊脂+0.3g/l活性炭,ph為5.6。
(4)生根培養(yǎng):從基部切取步驟(3)增殖得到的長約2.0~3.0cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)33天即能實現(xiàn)試管苗的生根,生根率達到93%以上。所述的生根培養(yǎng)基為:1/2ms培養(yǎng)基+0.75mg/lggr-5(生根粉)+0.7mg/liba+17g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂+0.2g/l活性炭,ph為5.6。
(5)移栽:將步驟(4)根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗1.5天,洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、泥炭土混合基質中栽培成苗即得種苗,移栽30天后成活率達到95%以上。
上述步驟(3)~(4)的培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為27℃,光照強度為2700lx,光照時間為12小時/天。
實施例三
(1)外植體采集:在野外選取生長健壯、無明顯病害的青藤植株中上部、向陽充實的帶節(jié)藤莖為外植體,采集后立即進行保水保濕處理并及時帶回實驗室。
(2)外植體誘導:當步驟(1)采集回實驗室外植體先在自來水下沖洗過夜,置于超凈工作臺中于75%的乙醇溶液中消毒15秒鐘,無菌水沖洗5次后用無菌濾紙吸干水分后,置于0.1%的升汞溶液中消毒30分鐘,無菌水沖洗7次后用無菌濾紙吸干水分后切成2.0~2.5cm左右的帶節(jié)藤莖并接種到誘導培養(yǎng)基中,置于28℃進行全暗培養(yǎng)60天即可誘導形成不定芽,誘導率為89%,污染率低于5%以下。所述的誘導培養(yǎng)基為:b5培養(yǎng)基+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+0.05mg/lga3+30g/l蔗糖+4.0g/l瓊脂+1.0g/l活性炭,ph為5.8。
(3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)誘導得到的不定芽切成長約1.5~2.0cm的莖段并接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)40天即可實現(xiàn)不定芽的增殖,增殖系數(shù)達到4.0倍。所述的增殖培養(yǎng)基為:ms培養(yǎng)基+3.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+20g/l蔗糖+4.0g/l瓊脂+0.5g/l活性炭,ph為5.8。
(4)生根培養(yǎng):從基部切取步驟(3)增殖得到的長約2.0~3.0cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)35天即能實現(xiàn)試管苗的生根,生根率達到90%以上。所述的生根培養(yǎng)基為:1/2ms培養(yǎng)基+0.5mg/lggr-5(生根粉)+0.5mg/liba+20g/l蔗糖+4.0g/l瓊脂+0.3g/l活性炭,ph為5.8。
(5)移栽:將步驟(4)根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗1~2天,洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、泥炭土混合基質中栽培成苗即得種苗,移栽30天后成活率達到90%以上。
上述步驟(3)~(4)的培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為28℃,光照強度為3000lx,光照時間為13小時/天。
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式,但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制,其它的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化,均應為等效的置換方式,都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。